UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Luis Felipe Baumotte Osorio
PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TRIPANOCIDA DE
NOVOS DERIVADOS NITROIMIDAZOLIL ÉTERES DE OXIMA SUBSTITUÍDOS
COMO POTENCIAIS AGENTES ANTICHAGÁSICOS
Rio de Janeiro
2013
Luis Felipe Baumotte Osorio
PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
TRIPANOCIDA DE NOVOS DERIVADOS NITROIMIDAZOLIL
ÉTERES DE OXIMA SUBSTITUÍDOS COMO POTENCIAIS
AGENTES ANTICHAGÁSICOS
Dissertação de Mestrado realizada no
Laboratório
de
Síntese
(Farmanguinhos/Fiocruz)
Orgânica
e
apresentada ao Programa de PósGraduação em Química, Instituto de
Química, Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em
Ciências (Química).
Orientador: Carlos Alberto Manssour Fraga (LASSBio/FF/UFRJ)
Coorientador: Edson Ferreira da Silva (Farmanguinhos/Fiocruz)
Rio de Janeiro
2013
ii
PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TRIPANOCIDA DE
NOVOS DERIVADOS NITROIMIDAZOLIL ÉTERES DE OXIMA SUBSTITUÍDOS
COMO POTENCIAIS AGENTES ANTICHAGÁSICOS
Luis Felipe Baumotte Osorio
Dissertação de Mestrado realizada no Laboratório de Síntese Orgânica
(Farmanguinhos/Fiocruz) e apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Química, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (Química).
Aprovada por:
______________________________________
Carlos Alberto Manssour Fraga (LASSBio-FF-UFRJ)
______________________________________
Edson Ferreira da Silva (Farmanguinhos-Fiocruz)
______________________________________
Márcia Paranho Veloso (FCF-UNIFAL)
______________________________________
Bárbara Vasconcellos da Silva (IQ-UFRJ)
______________________________________
Kelly Salomão (IOC-Fiocruz)
iii
O83
Osorio, Luis Felipe Baumotte.
Planejamento, síntese e avaliação da atividade tripanocida
de novos derivados nitroimidazolil éteres de oxima substituídos
como potenciais agentes antichagásicos / Luis Felipe Baumotte
Osorio. – Rio deJaneiro: UFRJ/IQ, 2013.
121 f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Química, Programa de PósGraduação em Química, 2013.
Orientador: Carlos Alberto Manssour Fraga.
Coorientador: Edson Ferreira da Silva.
1. Química medicinal. 2. Doença de Chagas. 3. Imidazol. 4.
Oxima. 5. Tripanocida. I. Fraga, Carlos Alberto Manssour. (Orient.).
II Silva, Edson Ferreira. (Coorient.).III. Universidade Federal do Rio
de Janeiro. Instituto de Química. Programa de Pós Graduação em
Química. IV. Título.
CDD: 615.19
iv
Esta dissertação é dedicada à minha família,
amigos
e
especialmente
à
minha
namorada
Andressa pelo amor, cumplicidade e paciência
mesmo à distância.
v
AGRADECIMENTOS

Agradeço aos professores Dr. Carlos Alberto Manssour Fraga e Dr. Edson
Ferreira da Silva pela orientação e oportunidade de aprender mais sobre esta
ciência.

Ao professor Alex Fabiano pela inspiração e pelo incentivo de cursar Química.

Aos professores Dra. Maria José Araújo Sales e Dr. Rafael Oliveira Rocha por
despertar o interesse pela pesquisa em Química Orgânica.

À Central Analítica de Farmanguinhos pela realização das análises de RMN,
EM, CG-MS, LC-MS e IV, especialmente à Eliane.

À Dra. Solange Lisboa de Castro e à Dra. Kelly Salomão por realizar os testes
farmacológicos.

Ao meu pai, Luis Carlos, à Mônica e sua família, por todo apoio e convivência
agradável ao longo desses dois anos, e ao meu irmão, Luis Henrique, pela
companhia e amizade.

Aos integrantes dos Laboratórios de Síntese 1 e 2, e da Planta Piloto:
Giulianna, Camila, Mayara, Raiane, Mônica Gomes, Débora, Liviane, Sandra,
Mônica Peralta, Shaiane, Maria, Jéssica, Felipe Azeredo, Luis, João Mafra,
Evanoel, D. Bruna, Elaine, Lúcia, Alcione, Fred, Rodolfo, Rita, Antônio,
Claudinha, Cristiane, Walcimar, Vitor, Wilson, Ivson, Alessandra, Sílvio,
Renato Carvalho, Daniele, e em especial ao Dr. Samir D’Aquino Carvalho e
sua aluna Natália por toda ajuda e convivência agradável no dia-a-dia do
laboratório.
vi

À Farmanguinhos por fornecer suporte técnico e financeiro para execução
deste trabalho.

Ao IQ/UFRJ e à CAPES pela bolsa de estudos.
E desde já, à banca examinadora por aceitar o convite.
vii
“Nada é tão perigoso para o progresso da
mente humana do que assumir que nossos
pontos de vista da ciência são definitivos, que
não há mistérios na natureza, que nossos
triunfus são completos e que não há novos
mundos para conquistar.”
(Sir Humprhy Davy)
viii
RESUMO
OSORIO, Luis Felipe Baumotte. PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE TRIPANOCIDA DE NOVOS DERIVADOS NITROIMIDAZOLIL ÉTERES
DE OXIMA SUBSTITUÍDOS COMO POTENCIAIS AGENTES ANTICHAGÁSICOS.
Rio de Janeiro 2013. Dissertação (Mestrado em Química). Instituto de Química
Universidade Federal do Rio de Janeiro.
A partir de uma linha de pesquisa que busca novos protótipos úteis no
combate a doenças tropicais negligenciadas, estão entre os objetivos deste trabalho:
o planejamento, a síntese e a avaliação da atividade tripanocida de um novo grupo
de derivados de éteres de oxima nitroimidazólicos substituídos.
Buscou-se, no planejamento estrutural destes derivados, explorar o conceito
de hibridação molecular entre dois potentes agentes tripanocidas, um nitrotiofeno
éter de oxima e um O-benzil éter de oxima, visando, dessa maneira, potencializar o
perfil de inibição dos compostos alvo e obter estes compostos com uma maior
alcance de atividade.
Neste trabalho, a metodologia sintética empregada para a obtenção da nova
família de derivados de éteres de oxima nitroimidazólicos substituídos mostrou-se
adequada, permitindo a obtenção dos compostos-alvos em rendimentos que
variaram de 55-89 %.
A atividade tripanocida foi investigada na forma infectiva tripomastigota e
comparada à atividade tripanocida do benzonidazol, que foi usado como substância
de referência, permitindo a identificação do (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2carbaldeído O-(4-nitrobenzil) oxima (30) como sendo o derivado mais ativo da série.
Palavras-chave: Imidazol, Tripanocida, Oxima
ix
ABSTRACT
OSORIO, Luis Felipe Baumotte. PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE TRIPANOCIDA DE NOVOS DERIVADOS NITROIMIDAZOLIL ÉTERES
DE OXIMA SUBSTITUÍDOS COMO POTENCIAIS AGENTES ANTICHAGÁSICOS.
Rio de Janeiro 2013. Dissertação (Mestrado em Química). Instituto de Química
Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Based on a research program that seeks new usefull prototypes in the
treatment of negleted tropical diseases, this study aims to: plan, synthesize and
avaluate the trypanocidal activity of a novel group of substituted nitroimidazole oxime
ehter derivatives.
During the derivatives structural planning it was attempted to explore the
concept of molecular hybridization of two potent trypanocidal agentes, a nitrothiofene
oxime ether and a O-benzyl oxime ether, to thereby enhance the inhibition profile of
the target compounds and to obtain compounds with a greater range of activity.
The results of this study allowed us to conclude that the synthetic approach
used to obtain the novel group of substituted nitroimidazole oxime ether derivatives
proved to be adequate, taking into consideration the determination of target
compounds in yields ranging between 55-89 %.
The target compounds trypanocidal activity was investigated in the
trypomastigote infective form and compared to benzonidazol trypanocidal activity,
which was used as a benchmark substance, allowing the identification of (E)-1methyl-5-nitro-1H-imidazole-2-carbaldehyde O-(4-nitrobenzyl) oxime (30) as the most
active derivative.
Keywords: Imidazole, Trypanocidal, Oxime
x
Este trabalho foi realizado no Laboratório de
Síntese
de
Farmanguinhos
-Fiocruz-
sob
a
orientação dos Professores Dr. Carlos Alberto
Manssour Fraga e Dr. Edson Ferreira da Silva.
xi
SUMÁRIO
Pág.
RESUMO
ix
ABSTRACT
x
Lista de figuras
xv
Lista de esquemas
xviii
Lista de tabelas
xix
Lista de abreviaturas e siglas
xx
Anexo de espectros
xxii
1. INTRODUÇÃO
1
1.1 Doença de Chagas
1
1.2 Quimioterapia da doença de Chagas
9
1.2.1 Compostos nitro-heteroaromáticos
10
1.2.1.1 Nifurtimox e Benzonidazol
10
1.2.1.2 Megazol
16
1.3 Novas estratégias farmacoterapêuticas para o tratamento
da Doença de Chagas
17
1.3.1 Tripanotiona Redutase (TR)
17
1.3.2 Cruzaína ou Cruzipaína
20
1.3.3 Biossíntese de Esteróis
23
1.3.3.1 Inibidores da Biossíntese de Esteróis (IBEs)
25
1.4 Éteres de Oxima
28
xii
2. OBJETIVOS
33
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
36
3.1 Planejamento estrutural da nova série de O-benzil éteres de
oxima nitroimidazólicos
36
3.2 Análise Retrossintética
36
3.3 Obtenção do Aldeído nitroimidazólico (37)
37
3.4 Síntese de Oxima nitroimidazólica (36)
39
3.5 Síntese dos novos derivados O-benzil éteres de oxima
Nitroimidazólicos (30 – 35)
42
3.6 Avaliação do perfil tripanocida
55
4. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
58
5. PARTE EXPERIMENTAL
59
5.1 Informações gerais
59
5.2 Metodologia Sintética
60
5.2.1 Síntese do derivado aldeído 1,2-dimetil-5-nitroimidazol (37)
60
5.2.2 Síntese de 1,2-dimetil-5-nitroimidazolil oxima (36)
61
5.2.3 Procedimento geral para síntese dos derivados éteres de
oxima nitroimidazólicos (30 - 35)
62
5.2.3.1 (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-nitrobenzil)
oxima (30)
63
5.2.3.2 (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-clorobenzil)
oxima (31)
64
xiii
5.2.3.3 (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-benzil
oxima (32)
65
5.2.3.4 (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-fluorobenzil)
oxima (33)
66
5.2.3.5 (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-bromobenzil)
oxima (34)
67
5.2.3.6 (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-metilbenzil)
oxima (35)
68
5.3 Protocolo Biológico
69
5.3.1 Avaliação da atividade tripanocida in vitro sobre a forma
tripomastigota de T. cruzi.
69
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
70
7. ANEXOS: ESPECTROS
79
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Pág.
Imagem do Triatoma infestans, o barbeiro, principal vetor da doença
2
de Chagas.
Figura 2
Ilustração do sinal de Romaña.
2
Figura 3
Coração com cardiopatia chagásica (A) e radiografia do tórax de um
3
paciente com esofagopatia chagásica (B).
Figura 4
Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi.
4
Figura 5
Distribuição geográfica de indivíduos infectados com a DCH pelo
7
mundo.
Figura 6
Distribuição geográfica da DCH no Brasil. A linha pontilhada
8
demarca a região endêmica em cinza escuro e em cinza claro estão
as áreas de transmissão via oral da doença.
Figura 7
Estrutura química da Nitrofurazona (1).
Figura 8
Estrutura química dos derivados nitro-heterocíclicos NFX (2) e BZN
9
10
(3).
Figura 9
Prováveis rotas de redução metabólica do grupo nitro nos derivados
14
nitro-heteroaromáticos (2) e (3).
Figura 10
Esquema geral de redução de nitrofuranos por nitroredutases do tipo
15
1 (WILKINSON, 2011).
Figura 11
Estrutura química do megazol (4)
16
Figura 12
Série de reações dependentes da TR e responsáveis pela
18
neutralização de EROs.
Figura 13
Estruturas químicas da T[S]2 (5) e da GSSG (6).
19
Figura 14
Estruturas químicas da tioridazina (7) e da clomepramina (8).
20
Figura 15
Representação esquemática dos principais subsítios do sítio
21
xv
catalítico da cruzaína.
Figura 16
Estrutura química de dois inibidores de cruzipaína: K-777 (9) e aril-
23
tiosemicarbazona (10).
Figura 17
Biossíntese de esteróis de parasitos na fase epimastigota de T. cruzi
24
(Adaptado de BUCKNER & URBINA, 2012).
Figura 18
Estrutura químicas do posaconazol (13) e do ravuconazol (14)
27
Figura 19
Estrutura química do Oxiconazol (17)
28
Figura 20
Estruturas químicas do 5-nitro-2-furaldoxima (18) e do metronidazol
29
(19).
Figura 21
Estrutura química do éter de oxima tricomonicida (20).
29
Figura 22
Estrutura química dos O-benzil éteres de oxima (21) e (22).
30
Figura 23
Estrutura da benzidril tropinona oxima (23).
30
Figura 24
Representação estrutural dos novos derivados éteres de oxima
33
nitroimidazólicos
Figura 25
Planejamento estrutural dos novos derivados éteres de oxima
34
nitroimidazólicos (30 - 35)
Figura 26
Novos derivados éter de oxima nitroimidazólicos planejados
35
estruturalmente (30 - 35).
Figura 27
Análise retrossintética dos novos derivados éteres de oxima
36
nitroimidazólicos (30 – 35). IGF= Interconversão de Grupos
Funcionais.
Figura 28
Espectro de IV da oxima nitroimidazólica (36) apresentando a banda
40
em 1400 cm-1 referente à deformação axial da ligação C=N .
Figura 29
RMN 1H da oxima nitroimidazólica (36) (400 MHz, DMSO-d6/TMS).
41
Figura 30
RMN 13C da oxima nitroimidazólica (36) (400 MHz, DMSO-d6/TMS).
42
xvi
Figura 31
Derivado O-benzil éter pirazólico obtido com 61% de rendimento por
44
Reis et al. (1999).
Figura 32
Imagem
do
espectro
de
IV
do
derivado
éter
de
oxima
48
Imagem do espectro de RMN 1H do novo derivado éter de oxima
51
nitroimidazólico (35).
Figura 33
nitroimidazólico (33) (400 MHz, DMSO-d6/TMS).
Figura 34
Ilustração do espectro de RMN
13
C do novo derivado éter de oxima
52
nitroimidazólico (33) (400 MHz, DMSO-d6/TMS).
Figura 35
Estrutura molecular do composto para bromado (34) obtida por
54
difração de raios X.
Figura 36
Diminuição do perfil de atividade em função da introdução de
56
diferentes substituintes no anel fenila dos derivados O-benzil éteres
de oxima imidazólicos (30 - 35).
Figura 37
Diagrama de Craig (intercorrelação σ x π) em para-substituição
aromática (Adaptado de TAVARES, 2004).
xvii
57
LISTA DE ESQUEMAS
Pág.
Esquema 1
Esquema de síntese do aldeído nitroimidazólico
37
Esquema 2
Proposta mecanística para a síntese do aldeído nitroimidazólico.
38
Esquema 3
Esquema de síntese da oxima nitroimidazólica.
39
Esquema 4
Proposta mecanística para a síntese da oxima nitroimidazólica
39
Esquema 5
Esquema da síntese dos novos éteres de oxima nitroimidazólicos
43
(30 - 35).
Esquema 6
Proposta mecanística para a síntese dos éteres de oxima via SN2
(30 - 35).
xviii
43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Pág.
Características epidemiológicas da DCH nas Américas e outros
6
países do mundo
Tabela 2
Atividade antiparasitária seletiva da benzidril tropinona oxima
31
(23).
Tabela 3
Estudo de relação estrutura-atividade de análogos da benzidril-
32
tropinona oxima (23).
Tabela 4
Propriedades físico-químicas e rendimentos dos novos derivados
46
O-benzila éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35).
Tabela 5
Principais dados de EM-ESI e IV para os novos derivados éteres
47
de oxima nitroimidazólicos (30 - 35)
Tabela 6
Deslocamentos químicos em ppm dos hidrogênios da nova série
50
de O-benzil éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35).
Tabela 7
Deslocamentos químicos em ppm dos carbonos da nova série de
53
O-benzil éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35).
Tabela 8
Atividade tripanocida in vitro sobre a forma tripomastigota dos
novos O-benzil éteres de oxima imidazólicos (30 - 35).
xix
55
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
μM
Micromolar
ADME
Absorção, distribuíção, metabolismo e eliminação
Ar
Anel aromático
BZN
Benzonidazol
CCF
Cromatografia em camada fina
DMSO-d6
Dimetil Sulfóxido deuterado
DNA
Ácido desoxirribonucléico
e.g.
Por exemplo
EM
Espectrometria de massas
EROs
Espécies Reativas de Oxigênio
ERS
Espectroscopia de Ressonância de Spin
ESI
Ionização por eletrospray
g
Grama
CLAE
Cromatografia Liquída de Alta Eficiência
Hz
Hertz
i.e.
Isto é
IC50
Crescimento inibitório de 50 %
IGF
Interconversão de Grupos Funcionais
IV
Infravermelho
J
Constante de acoplamento
LAFEPE
Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco
mg
Miligrama
NADPH
nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reduzida
NFX
Nifurtimox
xx
NTR
Nitrorredutase
OMS
Organização Mundial de Saúde
OPAS
Organização Pan americana de Saúde
P.F.
Ponto de Fusão
P.M
Peso molecular
ppm
Partes por milhão
RMN 13C
Ressonância magnética nuclear de carbono treze
RMN 1H
Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
SOD
Superóxido dismutase
T. cruzi
Trypanosoma cruzi
T.brucei
Trypanosoma brucei
T[S]2
Tripanotiona disulfeto
T[SH]2
Tripanotiona ditiol
TbNTR
Nitrorredutases de Trypanosoma brucei
TcNTR
Nitrorredutases de Trypanosoma cruzi
UV
Ultra violeta
WHO
World Health Organization (Organização mundial da saúde)
Obs.: As abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho que não constam nesta
relação, encontram-se descritos no texto ou são convenções conhecidas.
xxi
ANEXO DE ESPECTROS
Pág.
E1
Espectro de massas da oxima nitroimidazólica (36).
1
E2
Espectro de IV da oxima nitroimidazólica (36).
1
E3
Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) da oxima nitroimidazólica
2
(36).
E4
Espectro
de
RMN
13
C
(400
MHz,
DMSO-d6)
da
oxima
2
(E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-
3
nitroimidazólica (36).
E5
Espectro
de
massas
de
carbaldeído O-(4-nitrobenzil) oxima (30).
E6
Espectro de IV de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-
3
(4-nitrobenzil) oxima (30).
E7
Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) de (E)-1-metil-5-nitro-1H-
4
imidazol-2-carbaldeído O-(4-nitrobenzil) oxima (30).
E8
Espectro de RMN
13
C (400 MHz, DMSO-d6) de (E)-1-metil-5-nitro-
4
1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-nitrobenzil) oxima (30).
E9
Espectro de CG de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-
5
(4-nitrobenzil) oxima (30).
E10
Espectro
de
massas
de
(E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-
6
carbaldeído O-(4-clorobenzil) oxima (31).
E11
Espectro de IV de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-
6
(4-clorobenzil) oxima (31).
E12
Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) de (E)-1-metil-5-nitro-1H-
7
imidazol-2-carbaldeído O-(4-clorobenzil) oxima (31).
E13
Espectro de RMN
13
C (400 MHz, DMSO-d6) de (E)-1-metil-5-nitro-
1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-clorobenzil) oxima (31).
xxii
7
E14
Espectro de CG de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-
8
(4-clorobenzil) oxima (31).
E15
Espectro
de
massas
de
(E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-
9
Espectro de IV de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-
9
carbaldeído O-benzil oxima (32).
E16
benzil oxima (32).
E17
Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) de (E)-1-metil-5-nitro-1H-
10
imidazol-2-carbaldeído O-benzil oxima (32).
E18
Espectro de RMN
13
C (400 MHz, DMSO-d6) de (E)-1-metil-5-nitro-
10
1H-imidazol-2-carbaldeído O-benzil oxima (32).
E19
Espectro de CG de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-
11
benzil oxima (32).
E20
E20: Espectro de massas de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-
12
carbaldeído O-(4-fluorobenzil) oxima (33).
E21
Espectro de IV de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-
12
(4-fluorobenzil) oxima (33).
E22
Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) de (E)-1-metil-5-nitro-1H-
13
imidazol-2-carbaldeído O-(4-fluorobenzil) oxima (33).
E23
Espectro de RMN
13
C (400 MHz, DMSO-d6) de (E)-1-metil-5-nitro-
13
1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-fluorobenzil) oxima (33).
E24
Espectro de CG de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-
14
(4-fluorobenzil) oxima (33).
E25
Espectro
de
massas
de
(E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-
carbaldeído O-(4-bromobenzil) oxima (34).
xxiii
15
E26
Espectro de IV de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-
15
(4-bromobenzil) oxima (34).
E27
Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) de (E)-1-metil-5-nitro-1H-
16
imidazol-2-carbaldeído O-(4-bromobenzil) oxima (34).
E28
Espectro de RMN
13
C (400 MHz, DMSO-d6) de (E)-1-metil-5-nitro-
16
1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-bromobenzil) oxima (34).
E29
Espectro de CG de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-
17
(4-bromobenzil) oxima (34).
E30
Espectro
de
massas
de
(E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-
18
carbaldeído O-(4-metilbenzil) oxima (35).
E31
Espectro de IV de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-
18
(4-metilbenzil) oxima (35).
E32
Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) de (E)-1-metil-5-nitro-1H-
19
imidazol-2-carbaldeído O-(4-metilbenzil) oxima (35).
E33
Espectro de RMN
13
C (400 MHz, DMSO-d6) de (E)-1-metil-5-nitro-
19
1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-metilbenzil) oxima (35).
E 34
Espectro de CG de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O(4-metilbenzil) oxima (35).
xxiv
20
1. INTRODUÇÃO
1.1 Doença de Chagas
Descoberta em 1909 pelo pesquisador brasileiro Carlos Ribeiro Justiniano
Chagas, a tripanossomíase americana, conhecida também como doença de Chagas
(DCH), é uma enfermidade causada pelo parasito protozoário hemoflagelado
Trypanosoma cruzi (T. cruzi) (WHO, 2013). A DCH é reconhecida pela Organização
Mundial da Saúde (WHO) como uma das 17 Doenças Tropicais Negligenciadas
(DTN), dentre as quais estão a dengue e leishmaniose (KOWALSKA et al., 2011).
Apesar de ser encontrada principalmente em áreas endêmicas de 21 países da
América Latina, dados da WHO indicam que de 8 a 10 milhões de pessoas do
mundo inteiro sejam vítimas da DCH (WHO, 2013).
A DCH pode ser transmitida a mais de 150 espécies de animais domésticos
e mamíferos silvestres, além de seres humanos. A transmissão da DCH em
humanos pode se dar por diferentes formas, como por exposição da pele ou
mucosas às dejeções do inseto infectado com o parasito, transfusão de sangue (1020% dos casos), via congênita (1-5% dos casos dependendo do país) e via oral, que
ultimamente tem se tornado comum em regiões onde a parasitose não é endêmica
(RASSI et al., 2010). Vale comentar que a transmissão por transfusão de sangue
ocorre apenas em países onde o controle e fiscalização de bancos de sangue é
deficiente. Devido a alguns surtos de doença de Chagas por via oral (DCHO) em
alguns países da América do Sul pela ingestão de alimentos contaminados, alguns
autores também consideram os alimentos como forma de transmissão (ROQUE et
al., 2013; PEREIRA et al., 2009).
Considerada a forma mais comum em humanos, a transmissão vetorial é
responsável pela contaminação em 80-90% das infecções de DCH. Nesse tipo de
transmissão, o vetor é um inseto triatomíneo hematófago. Apesar de existirem mais
de 130 espécies dessa subfamília, apenas alguns poucos podem ser vetores do T.
cruzi, entre eles estão Triatoma infestans (Figura 1), Rhodnius proxlixus e Triatoma
dimidiata (RASSI et al., 2010).
1
Figura 1: Imagem do Triatoma infestans, o barbeiro, principal vetor da doença de
Chagas. Fonte: http://www.saudicas.com.br/doenca-de-chagas.
A infecção ocorre quando o inseto deposita suas fezes ou urina, contendo o
T. cruzi, sobre a pele do indivíduo, que por sua vez coça a pele devido à irritação e,
assim, insere o parasito em seu organismo através do ferimento promovido pela
picada. Esse ferimento é chamado de chagoma. Quando a infecção ocorre na
conjuntiva ocular, o ferimento é conhecido como sinal de Romaña (MORTARA,
2005; LENT, 1962) (Figura 2).
Figura 2: Ilustração do sinal de Romaña.
Fonte: http://anotacoesdalua.blogspot.com.br/2010/12/doenca-de-chagas.html.
A doença de Chagas apresenta duas principais fases: uma aguda e uma
crônica. Na fase aguda há um período de incubação de 4 a 10 dias, que é o
suficiente para que ocorra o desenvolvimento de até duas gerações do parasito
2
(BRENER & ANDRADE, 1979). Cerca de 1-2% dos casos nesta fase apresentaram
sintomas como febre, mal-estar, inflamação e dor nos gânglios, aumento do baço e
do fígado e possuem duração de até 8 semanas. Como a febre e o mal-estar
desaparecem depois de algum tempo, o indivíduo, apesar de infectado, não
apresenta sintomas da doença.
Já a fase crônica é marcada por febres prolongadas, dores de cabeça,
edema de face ou membros, manchas na pele, aumento do fígado ou baço,
cardiopatia aguda e outros sintomas. Durante essa fase é possível que ocorram
lesões na musculatura do coração, intestino e esôfago. Devido a essas lesões
ocorrem doenças como a cardite chagásica, que leva ao aumento do coração e
anormalidade no ritmo cardíaco, o megacólon, que devido ao aumento do órgão
podem resultar em retenção das fezes, e o megaesôfago, que tem por principal
sintoma a regurgitação dos alimentos ingeridos (Figura 3) (COURA & BORGESPEREIRA, 2010).
A)
B)
Figura 3: Coração com cardiopatia chagásica (A) e radiografia do tórax de um
paciente com esofagopatia chagásica (B).
Fontes: (A) http://www.relampa.org.br/detalhe_artigo.asp?id=666.
(B) http://www.spenzieri.com.br/2012/04/29/megaesofago.
3
O T. cruzi apresenta diferentes estágios de desenvolvimento com alterações
morfológicas
bastante
evidenciadas
entre
si:
epimastigota,
amastigota
e
tripomastigota. A primeira forma é encontrada apenas no inseto, já as outras duas
formas são encontradas em humanos e são as responsáveis pela disseminação e
aumento da infecção nesse hospedeiro.
Na forma mais comum de transmissão um inseto vetor do parasito suga o
sangue de uma pessoa já infectada, se contaminando com a forma tripomastigota.
Em seguida, no tubo digestivo do inseto, o parasito atinge a forma epimastigota e
finalmente a forma tripomastigota metacíclica. O inseto contaminado, ao sugar o
sangue de outra pessoa, elimina suas dejeções infectadas com o parasito na forma
tripomastigota metacíclica. O indivíduo, por sua vez, coça o local da picada e insere
o parasito em seu organismo. No local de infecção, o parasito se transforma na
forma amastigota e inicia uma série de reproduções assexuadas, e que logo após se
transformam em tripomastigotas. O elevado número de parasitos e seu movimento
flagelar, promovem a lise da célula. As formas tripomastigotas liberadas podem
invadir novas células ainda no local da infecção ou cair no sistema circulatório,
podendo assim alcançar outros tecidos do hospedeiro. Dessa forma fecha-se o ciclo
de vida do parasito (Figura 4) (Revisto em MORTARA et al., 2005).
Figura 4: Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi (Revisto em MORTARA et al., 2005).
Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Chagas_ciclo_de_doen%C3%A7a.JPG.
4
A transmissão oral da DCH é uma forma incomum de transmissão do T.
cruzi e negligenciada por muitos agentes sanitários (BENCHIMOL-BARBOSA,
2009). No entanto, desde um dos primeiro surtos regionais no interior do Paraná em
1996, é um tipo de transmissão que vem se tornando cada vez mais frequente.
É possível agrupar a DCH em 5 séries de países, de acordo com suas
características epidemiológicas, ou seja, tipo de transmissão, vetores e programas
de controle de transfusão (Tabela 1). A distribuição geográfica da doença de Chagas
pode ser vista na Figura 5.
5
Tabela 1: Características epidemiológicas da DCH nas Américas e outros países do
mundoa.
PAÍSES
Argentina, Bolívia,
GRUPO I
Brasil, Chile, Equador,
Honduras, Paraguai,
Peru, Uruguai e
Venezuela
PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS
- Presença de ciclos domésticos e
peridomésticos;
- Predominância de doença de Chagas
crônica;
- Forma digestiva do T. cruzi praticamente
ausente acima da linha do Equador;
- Ciclo de vida selvagem presente em
ambientes naturais;
- Existência de programas de controle de
vetores e de transfusão;
Colômbia, Costa Rica e
GRUPO II
México
- Presença de ciclos domésticos e
peridomésticos com predominância de
doença de Chagas crônica;
- Doadores infectados;
- Existência de ciclos de vida selvagem;
- Falta de programas de controle;
El Salvador, Nicarágua,
GRUPO III
Guatemala e Panamá
- Ciclos de vida doméstico, peridoméstico e
selvagem presentes;
- Pouca informação sobre casos da doença
em humanos;
- Programas de controle ainda em estágio
inicial;
Antilhas, Bahamas,
GRUPO IV
Belize, Cuba, Guiana,
Guiana Francesa, Haiti,
Jamaica e Suriname
EUA, Canadá, Espanha,
GRUPO V
França, Suíça, Japão,
- Apresenta ciclo de vida selvagem
- Raros casos humanos;
- Pouca informação clínica;
- Ausência de programas de controle;
- São alvos de um novo problema
epidemiológico, econômico, social e político
Austrália e Países
devido à internacionalização da DCH
Asiáticos Emergentes
através da imigração legal ou ilegal;
a
Adaptado de COURA & DIAS, 2009
6
Figura 5: Distribuição geográfica de indivíduos infectados com a DCH pelo mundo.
Fonte: RASSI et al., 2010.
No dia 9 de junho de 2006, o Brasil recebeu o certificado de área livre da
DCH transmitida pelo principal vetor, o Triatoma infestans, pela Organização PanAmericana de Saúde (OPAS) em conjunto com a WHO (COURA & CASTRO, 2002).
Apesar disso, no mesmo ano, mais 94 casos de DCH transmitida via oral surgiram.
No ano seguinte, foram reportados oficialmente cerca de 10 casos de DCH via oral
por mês, ou seja, um aumento médio anual de 2,2 casos por mês. Devido às
dificuldades de acesso às regiões onde a maioria dos casos ocorre, muitos são
subestimados. Diferentemente de outros surtos regionais, a regularidade de casos
de DCH via oral na região amazônica, por exemplo, se mostra como um relevante
indicador regional. Foi liberado pelo Ministério da Saúde uma cartilha dando
instruções ao departamentos regionais responsáveis a tomar as medidas
preventivas necessárias.
A distribuição geográfica da DCH via oral também deve ser levada em conta
(Figura 6). Percebe-se que as áreas nas quais a DCH relacionada ao triatomíneo era
predominante, não se superpõem às áreas da DCH via oral. Isso mostra que o ciclo
de vida selvagem do parasito ainda está ativo onde a doença não havia sido
erradicada. A medida que o homem avança em direção à Amazônia, é possível que
se torne parte do ciclo selvagem da DCH (BENCHIMOL-BARBOSA, 2009).
7
Figura 6: Distribuição geográfica da DCH no Brasil. A linha pontilhada demarca a
região endêmica em cinza e em laranja estão as áreas de transmissão via oral da
doença. Fonte: BENCHIMOL-BARBOSA, 2009.
Benchimol-Barbosa (2009) defende que um estudo de sobrevivência do T.
cruzi pode auxiliar no combate e na prevenção da DCH via oral. Descobriu-se que o
parasito sobrevive até 9 horas após a contaminação na fruta de Açaí. A utilização de
hipoclorito não leva à morte imediata do parasito. No entanto, em temperaturas de
até 5° C, o T. cruzi sobrevive até 12 horas, e em temperaturas a partir de -20° C o
parasito não resiste 2 horas. Logo, o uso de técnicas de pasteurização podem ser
eficazes para inativar o parasito.
De maneira geral no Brasil, os resultados epidemiológicos dos últimos anos
têm se mostrado bastante satisfatórios. Programas de controle da transmissão
transfusional e da transmissão vetorial foram implementados, e como dito
anteriormente, o país recebeu o certificado OPAS/WHO de eliminação da DCH pelo
Triatoma infestans, representando um alto impacto na redução dos casos de
morbidade e mortalidade relacionados à doença.
Apesar da considerável melhoria no controle da transmissão e da infecção,
muitas pessoas ainda estão infectadas e outras expostas à uma possível
contaminação. Por isso, ainda se torna necessário não só a extensão e a melhoria
de estratégias de controle, como também a busca de novos quimioterápicos
alternativos para o tratamento da DCH, uma vez que os fármacos hoje disponíveis
no mercado são pouco eficazes ou seguros (COURA & CASTRO, 2002).
Devido ao alto custo e complexidade na pesquisa e desenvolvimento de
novos fármacos, as grandes indústrias farmacêuticas vem mudando seu foco, a
8
favor do desenvolvimento de fármacos para o tratamento prolongado de doenças
crônicas (PROJAN, 2003). Neste contexto, se incluem as doenças tropicais
negligenciadas. De acordo com Pedrique et al. (2013), de 850 novos fármacos
desenvolvidos entre 2000 e 2011, apenas 4% foram destinados ao tratamento de
doenças tropicais. Este panorama indica a importância
de investimentos
Governamentais para que instituições de pesquisa de locais acometidos com estas
doenças, possam desenvolver novos candidatos a fármacos potentes e seguros
para o controle destas doenças (CARVALHO, 2011).
1.2 Quimioterapia da Doença de Chagas
Historicamente, a quimioterapia da doença de Chagas pode ser dividida em
três partes, sendo que a primeira vai desde a sua descoberta em 1909 por Carlos
Chagas até 1935, ano da publicação do “Manual de Doenças Tropicais e
Infectuosas”. Esse período não foi marcado por grandes descobertas e avanços no
que diz respeito à quimioterapia da doença. Na segunda fase, que se estende de
1936
a
1960,
muitos
resultados
controversos
foram
gerados
devido
à
experimentação empírica de diversos compostos no combate à doença. Apesar
destes esforços empíricos, a DCH permaneceu sem algum tratamento eficaz por
muitas décadas desde a sua descoberta (COURA & CASTRO, 2002). Somente a
partir de 1961, inicia-se a terceira fase da quimioterapia da doença de Chagas, na
qual foi possível observar estudos que comprovavam claramente a eficácia de
substâncias como a nitrofurazona (1) (5-nitro-furaldeido-semicarbazona), que foi
utilizada em modelos experimentais (URBINA & DOCAMPO, 2003) de infecção com
T. cruzi em camundongos. No entanto, a alta atividade antiparasitária da
Nitrofurazona (1) (Figura 7) estava fortemente relacionada a uma alta citotoxicidade,
de forma que os pacientes não suportavam os efeitos colaterais nas doses e tempos
necessários para a cura. (SILVA, 2011).
Figura 7: Estrutura química da Nitrofurazona (1). Fonte: Elaborada pelo autor.
9
1.2.1 Compostos Nitro-heteroaromáticos
Apesar dos resultados negativos obtidos com a nitrofurazona (1), essa
substância abriu as portas para um novo campo na pesquisa de fármacos com
melhor perfil de atividade anti-T. cruzi e menor toxicidade, para serem utilizados no
tratamento da doença de Chagas. Desde então, compostos contendo um grupo nitro
ligado a um anel heteroaromático, uma herança da nitrofurazona (1), têm sido
utilizados no tratamento da DCH devido à sua notável contribuição na atividade
antiparasitária, tanto in vitro quanto in vivo.
1.2.1.1 Nifurtimox e Benzonidazol
Esforços dos pesquisadores, no final da década de 60 e início da década de
70, levaram à descoberta dos dois compostos que já foram um dos mais utilizados
até hoje: nifurtimox (NFX) (2) e o benzonidazol (BZN) (3) (Figura 8). O primeiro (3metil-4-(5’-nitrofurfurilidenoamina)tetraidro-4H-1,4-tiazina-1,1-dióxido),
comercializado sob o nome de Lampit®(Bayer), apresentou a maior atividade dentre
os derivados da mesma classe testados. Já o segundo (N-benzil-2-nitroimidazol-1acetamida), é um derivado 2-nitroimidazólico com destacada atividade in vitro e in
vivo . No início, as duas substâncias tinham como objetivo o tratamento da DCH na
fase aguda, porém apenas o benzonidazol (3) permanece até hoje como sendo o
único fármaco disponível para o tratamento específico da infecção por T. cruzi
(URBINA, 2010). Atualmente o benzonidazol (3) está sendo comercializado pelo
Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco (LAFEPE).
Figura 8: Estrutura química dos derivados nitro-heterocíclicos NFX (2) e BZN (3).
Fonte: Elaborada pelo autor.
Com cerca de 80% de cura, ambas substâncias apresentaram alta atividade
antiparasitária na fase aguda da doença. Apesar dessa alta porcentagem de cura,
10
Kirchhoff (1999) mostrou que uma variação na eficácia do tratamento ocorre devido
à localização geográfica. Isso acontece, pois diferentes cepas do parasito, que estão
em
diferentes
regiões,
possuem
diferentes
suscetibilidades
aos
fármacos
(CANÇADO, 1999).
Ainda não é claro se algum desses fármacos apresenta atividade
antiparasitária no início da fase crônica. Um estudo com adolescentes de 14 anos
infectados, e já no estágio crônica da doença, foi realizado por diversos
pesquisadores, que obtiveram resultados díspares. Alguns apresentaram resultados
positivos com 60-70% de cura parasitológica (ANDRADE et al. 2004). Já outros não
conseguiram repetir a taxa de eficácia obtida anteriormente (YUN et al., 2009).
Sendo mais de 80% dos casos de DCH caracterizados na fase crônica, a
descoberta de terapias eficazes nesta fase ainda representa o maior desafio para os
pesquisadores da área. Tanto o NFX (2) quanto o BZN (3) apresentam pouca ou
nenhuma atividade anti-T. cruzi nessa fase (CANÇADO, 1999, 2002). Apesar de
ainda não estar claro o porquê da diferença de atividade destes fármacos nas fases
aguda e crônica, Urbina & Docampo (2003) defendem que isso tenha relação com
propriedades farmacocinéticas desfavoráveis, como a penetração limitada em
tecidos, a qual é essencial na fase crônica, já que, nesse estágio, o parasito adentra
muito mais o tecidos do hospedeiro e se multiplica de maneira mais lenta.
Apesar destes resultados, recentemente, no ano de 2011, foi implementado
o projeto de uso pediátrico do BZN (3), pelo DNDi juntamente com o LAFEPE. Até
então não se tinha um tratamento eficaz, com medicamentos nas doses corretas,
sobre o parasito da doença em crianças. A formulação pediátrica foi liberada pela
ANVISA em dezembro de 2011. Os resultados do uso do medicamento na
formulação pediátrica devem ser disponibilizados neste ano (HOTEZ, P.J. et al.,
2013).
De acordo com alguns estudos, pacientes acometidos com a DCH crônica e
tratados com BZN (3), apesar de não terem sido curados por completo,
apresentaram uma diminuição de disfunções cardíacas e uma melhoria em seu
quadro clínico geral (VIOTTI & VIGLIANO, 2007). Tais resultados poderiam ser
explicados pelo efeito que o fármaco tem sobre a redução do número de parasitos,
11
que resulta em uma diminuição do processo inflamatório dos tecidos atingidos
(TARLETON et al., 2007). Em contrapartida, outras publicações não confirmaram
essa melhoria nas condições clínicas destes pacientes (SOSA-ESTANI & SEGURA,
2006). A incerteza da eficácia nestes estudos se deve a falta de marcadores
biológicos confiáveis, que possam indicar com mais precisão se o paciente foi ou
não curado, uma vez que na fase crônica da doença os níveis de parasito no sangue
são tão pequenos que nem o método de detecção mais sensível, PCR (Polymerase
Chain Reaction que quer dizer Reação em Cadeia da Polimerase em português),
pode ser capaz de identifica-los (MARTINS et al., 2008). A sorologia convencional,
além de pouco sensível ao parasito, é muito demorada na apuração da infecção em
hospedeiros crônicos. É isso que faz com que a fase crônica da doença se torne um
dos maiores obstáculos na pesquisa por novos candidatos a fármacos no combate
ao parasito (TARLETON et al., 2007).
Muitas vezes, a descontinuação do tratamento com estes fármacos está
ligada aos efeitos adversos. No caso do NFX (2) estes efeitos são a perda de peso
devido à náuseas e vômito, insônia, irritabilidade e polineuropatia periférica. Já para
o BZN (3), os efeitos colaterais indesejados são síndromes gastrointestinais,
dermopatia
alérgica,
depressão
da
medula
óssa,
agranulocitose,
púrpura
trombocitopênica, parestesia, e polineurite de nervos periféricos (RASSI et al.,
2009). A região em que o paciente vive, sua idade e a qualidade do tratamento são
variáveis associadas à ocorrência dos efeitos adversos acima citados.
Apesar de terem sido registrados e usados em tratamentos clínicos de
pacientes acometidos com a DCH, os mecanismos de ação de ambos NFX (2) e
BZN (3) não estavam totalmente elucidados, uma vez que seus desenvolvimento e
descoberta foram feitos de maneira empírica. Estudos realizados nos anos 80
proporcionaram o entendimento básico de sua atividade farmacológica e toxicidade
(URBINA, 2010).
Demonstrou-se, com base na diferença dos mecanismos de detoxificação de
parasitos e humanos, que o mecanismo de ação antiparasitária do NFX (2) estava
relacionado ao estresse oxidativo, ou seja, com a formação de espécies reativas de
oxigênio (EROs), resultantes da reação do oxigênio com metabólitos reduzidos do
grupo 5-nitrofuranila. A maior parte dos tripanosomatídeos apresenta baixa ou
12
nenhuma atividade de enzimas como a superóxido dismutase (SOD), glutationa
peroxidase (GPx) e catalase (CAT), usualmentete envolvidas na detoxificação de
EROs em seres humanos. Sendo assim, as estratégias de detoxificação do parasito
tem como base
as reações metabólicas da enzima tripanotiona redutase (TR)
(KRAUTH-SIEGEL, COMINI, & SCHLECKER, 2007).
Atualmente, um dos mecanismos de ação mais aceito é aquele no qual
derivados nitro-heterocíclicos, com estrutura básica R-NO2 (III, Figura 9), são
inicialmente reduzidos por uma nitroredutase (NTR) do tipo I, a NADPH-citocromo
P450 redutase. Considerando condições aeróbias, o nitro-ânion radical R-NO2•- (IV,
Figura 9) formado, reage com o oxigênio molecular (O2), regenerando R-NO2 (III,
Figura 9) e formando o ânion superóxido (O2•-), que em seguida é transformado em
peróxido de hidrogênio (H2O2) pela SOD. O excesso da última espécie obtida, na
presença do íon Fe2+, leva a formação, através da reação de Haber-Weiss, do
radical hidroxila (OH•) (HABER & WEISS, 1932; KOPPENOL, 2002). Estas ERO’s
formadas se ligam às macromoléculas do parasito provocando danos às suas
estruturas moleculares (DÍAZ DE TORANZO, 1988). Quando células infectadas com
o parasito foram tratadas com o NFX (2), foi observado a presença do nitro-ânion
radical (III, Figura 9) por Ressonância de Spin Eletrônico, consumo de O 2, liberação
de H2O2 e produção de O2•-. A administração deste fármaco gerou, em adultos, um
efeito de inibição da reprodução do T. cruzi na mesma concentração sérica após
dose única de 15 mg/Kg (DOCAMPO & MORENO, 1984). Além disso, MAYA et al.
(1997) observou também uma diminuição nos níveis de tióis necessários ao
parasito.
Apesar do mecanismo apresentado acima ser bastante aceito, um estudo
mostrou uma baixa detecção dos níveis de consumo de oxigênio durante a redução
do fármaco utilizado no tratamento. Este mesmo estudo também mostrou que ao se
tratar uma série de células que apresentavam altas taxas de peroxidases, os
resultados foram similares aos encontrados em células que não possuíam estas
enzimas de maneira tão expressiva (WILKINSON et al., 2000). Ocorre que as
nitroredutases podem ser de diferentes tipos (Figura 9), podendo catalisar a reação
de redução tanto em meio aeróbio quanto em meio anaeróbio. Neste estudo
mostrou-se que houve a abertura do anel furano do NFX (2) com a formação de um
13
composto que se mostra tóxico em células parasitárias e mamíferas (WILKINSON et
al., 2011).
Neste contexto, um outro provável mecanismo de ação pode ser considerado
para o NFX (2), no qual a redução do grupo nitro é uma reação que envolve a
participação da NTR do tipo 1 e de 4 elétrons, formando primeiramente o
intermediário nitroso (I, Figura 9) e em seguida o derivado hidroxilamino (II, Figura
9), ao invés do nitro-ânion radical (III, Figura 9). A formação do intermediário nitroso
(I, Figura 9) também explica a redução nos níveis de tióis, uma vez que são
compostos eletrofílicos (VIODÉ et al., 1999). A metabolização do derivado
hidroxilamino (II, Figura 9) pode levar à formação do íon nitrênio, da amina, da nitrila
insaturada, já mencionada anteriormente, e da nitrila saturada, como ilustra a Figura
10.
Figura 9: Prováveis rotas de redução metabólica do grupo nitro nos derivados nitroheteroaromáticos (2) e (3). Fonte: Adaptada de SILVA, 2011.
14
Figura 10: Esquema geral de redução de nitrofuranos por nitroredutases do tipo 1.
Fonte: WILKINSON, 2011.
Já o mecanismo de ação do BZN (3) envolve uma séria de reações de
redução que promovem a modificação covalente de macromoléculas (DOCAMPO,
1990). Desconsiderou-se o ciclo oxidativo como mecanismo para este fármaco, pois
nas concentrações necessárias para inibir a forma epimastigota do parasito não foi
observada a produção de O2•- e de H2O2, e apenas com concentrações superiores à
10 mM detectou-se a presença do nitro-ânion radical (IV) (DOCAMPO & MORENO,
1984; MORENO et al., 1982).
Urbina (2010) relacionou esta diferença nos mecanismos de fármacos com
estruturas parecidas devido à diferença de potencial redox de cada um, -260 mV
para o NFX (2) e -380 mV para o BZN (3).
15
1.2.1.2 Megazol
Muitos outros derivados nitrofurânicos e nitroimidazólicos foram testados no
tratamento da DCH, apresentando atividades consideráveis contra as formas
epimastigota e tripomastigota. No entanto, poucos fármacos sintetizados mostraram
efeitos tão destacados quanto o megazol (4), [2-amino-5- (1-metil-5-nitro-2-imidazol2-il)1,3,4 tiadiazol] (Figura 11). Este derivado 1,3,4-tiadiazolil nitroimidazólico
apresentou grande eficácia quando administrada em camundongos infectados com
cepas de T. cruzi Y* e colombiana* quando comparada com o tratamento padrão
utilizando NFX (2) e BZN (3). O megazol (4) além de apresentar atividade contra
diferentes cepas do parasito, mostrou-se eficaz no tratamento da fase crônica da
Doença do Sono em macacos (CHAUVIERE et al., 2003). O mecanismo de ação
deste fármaco está relacionado a formação de EROs, e também à redução dos
níveis de tióis no organismo do parasito. No entanto, o seu mecanismo de ação
também é a causa de efeitos colaterais indesejáveis no organismo do hospedeiro.
As EROs formadas interagem com o DNA do hospedeiro
induzindo a
mutagenicidade, que é um grave limitante do uso clínico desta substância
(FERREIRA & FERREIRA, 1986; POLY et al., 2002; NESSLANY et al., 2004).
Figura 11: Estrutura química do megazol (4). Fonte: Elaborada pelo autor.
* O T. cruzi constitui-se de cepas ou subespécies com comportamentos e origens diferentes. A cepa
Y, originária do Brasil, pertence ao grupo T. cruzi II e apresenta mediana virulência (MENEZES,
1968). Já a cepa Colombiana, que tem origem na Colômbia, pertece ao grupo de T. cruzi I e
apresenta parasitemia de evolução lenta e resistência ao tratamento com Benzonidazol e Nifurtimox
(ANDRADE et al., 2000).
16
1.3 Novas estratégias farmacoterapêuticas para o tratamento da Doença de
Chagas
O estudo de fármacos já aprovados para o tratamento de outras doenças e a
elucidação de princípios ativos da plantas utilizadas na medicina popular se
constituem interessantes estratégias para a identificação de novos quimioterápicos
antiparasitários.
Nas últimas duas décadas, novas abordagens na quimioterapia específica
para a doença de Chagas tem sido feitas, uma vez que os atuais tratamentos
disponíveis apresentam muitas limitações de eficácia e segurança, principalmente
no caso de pacientes acometidos com a doença na fase crônica (URBINA, 2010). A
identificação de alvos específicos em vias metabólicas importantes para o
tripanosomatídeo foi possível na medida em que estudos dos aspectos biológicos,
genéticos e evolucionários do parasito avançaram. A luz desses estudos diferentes
grupos de pesquisa vem identificando compostos capazes de atuar em potenciais
alvos de T. cruzi, através da modulação de diferentes enzimas que participam de
importantes vias metabólicas (SOEIRO & CASTRO, 2009).
1.3.1 Tripanotiona Redutase (TR)
Partindo de propostas e abordagens diferentes, muitos grupos de pesquisa
identificaram como potenciais alvos quimioterapêuticos, as enzimas relacionadas à
síntese e ao metabolismo redox da tripanotiona ([N1, N8-bis(glutationil)-espermidina)
(SCHMIDT & KRAUTH-SIEGEL, 2002; PAULINO et al., 2005). Seu uso no lugar da
glutationa e glutationa redutase
como principal sistema de redução de tióis
intracelulares é uma característica particular de parasitos da ordem dos
Kinetoplastidos, da qual faz parte o T. cruzi, tornando essa rota bioquímica um
potencial alvo na quimioterapia antiparasitária (URBINA & DOCAMPO, 2003).
Os genes das enzimas presentes nesta via bioquímica foram clonados,
expressados e validados, e as estruturas 3D de suas proteínas foram obtidas por
cristalografia de raios X, incluindo a Tripanotiona Redutase (TR) e a Tripanotiona
Sintase (TS) (SCHMIDT & KRAUTH-SIEGEL, 2002). Por isso, nos últimos 15 anos,
o desenvolvimento específico de inibidores desta via metabólica tem sido um dos
principais alvos dos grupos de pesquisa, resultando na identificação de
17
muitos
compostos que apresentavam atividade tripanocida in vitro através da inibição da TR
(CZECHOWICZ & WILHELM, 2007).
O parasito usa a TR como mecanismo de defesa sobre o estresse oxidativo
(Figura 13), uma vez que a enzima catalisa a redução da tripanotiona dissulfeto
(T[S]2) (10) a tripanotiona ditiol (T[SH]2), numa reação NADPH-dependente, levando
a uma série de reações com o objetivo de neutralizar EROs. Nos mamíferos, o ciclo
redutivo da glutationa é similar ao da tripanotiona e é o principal sistema de defesa
contra o estresse oxidativo. Neste caso, a Glutationa Redutase (GR), uma
flavoenzima NADPH-dependente, reduz a Glutationa Dissulfeto (GSSG) (11) à
Glutationa (GSH).
Figura 12: Série de reações dependentes da TR e responsáveis pela neutralização
de EROs. Fonte: SILVA, 2011.
A principal diferença na estrutura molecular da T[S] 2 (5) e da GSSG (6) é a
presença do resíduo de poliamina na primeira (Figura 13), além de diferenças no
tamanho, carga e distribuição de sítios hidrofílicos e hidrofóbicos na molécula. Essas
diferenças são as razões pelas quais a TR é um dos alvos de estudo quando se
trata do planejamento de fármacos no combate à DCH. Quando comparada ao
metabólito da GR, o sítio ativo da TR acomoda melhor grupos volumosos devido à
presença de resíduos carregados negativamente e de regiões hidrofóbicas,
possibilitando não apenas interações eletrostáticas, como é o caso da GR, mas
também interações de van der Waals com o substrato (OLIVEIRA et al., 2008).
18
Figura 13: Estruturas químicas da GSSG (5) e da T[S]2 (6). Fonte: Elaborada pelo
autor.
Dois conhecidos protótipos inibidores in vitro da TR, a tioridazina (7) e a
clomepramina (8) (Figura 14), quando testados em camundongos infectados na
fase aguda da DCH, mostraram redução da taxa de parasitos, aumentaram a taxa
de
sobrevivência,
além
de
evitarem
danos
ao
coração
e
alterações
eletrocardiográficas dos animais utilizados no modelo (LOPRESTI et al., 2004;
RIVAROLA et al., 2005). No entanto, a seletividade de ambos os fármacos para a
19
TR não foi cofirmada pelos estudos e não houve cura completa dos animais
testados.
Sendo assim, apesar de ter sido amplamente demonstrado que a síntese e o
metabolismo da tripanotiona são essenciais para o funcionamento do organismo do
parasito, ainda não se pode dizer com clareza qual enzima desta via metabólica
apresenta um verdadeiro potencial
para o desenvolvimento de
fármacos
antiparasitários. Ainda falta comprovação da seletividade e eficácia, in vitro ou in
vivo, de fármacos sintetizados com intuito de inibir a TR. Urbina (2010) considera
que uma alternativa à TR seja a tripanotiona sintase (TS), já que esta apresenta uma
atividade enzimática muito menor em relação à TR e suas características
moleculares são mais favoráveis, por exemplo uma ampla cavidade hidrofóbica no
seu sítio ativo.
Figura 14: Estruturas químicas da tioridazina (7) e da clomepramina (8). Fonte:
Elaborada pelo autor
1.3.2 Cruzaína ou Cruzipaína
Presente em todo o ciclo metabólico do T. cruzi, a cruzaína (Cz) ou
GP57/51, análoga à papaína, é uma das principais enzimas proteolíticas deste
parasito. Nos diferentes estágios do ciclo de vida do parasito, a Cz é expressa de
diferentes
maneiras,
sendo
sua
seletividade
maior
na
fase
epimastigota
(CAMPETELLA et al., 1992).
Apesar de existirem isoformas da enzima associadas à membrana
plasmática e algumas excretadas no meio, a maioria delas é lisossomal. No caso da
forma epimastigota do T. cruzi, a Cz se localiza em organelas pré-lisossomais
chamadas reservosomos. A Cz é uma endoproteinase responsável pela nutrição do
20
T. cruzi, podendo digerir proteínas como a caseína, a hemoglobina e a albumina. Ela
também está relacionada à evasão dos mecanismos de defesa do hospedeiro, à
remodelação da célula hospedeira e ao bloqueio de substratos cromogênicos e
fluorogênicos (CAZZULO, 2002).
A análise da estrutura da Cz (Figura 15) mostra que substratos com resíduos
de arginina (Arg) e lisina (Lys) são melhores aceitos na posição P1 e que resíduos
mais hidrofóbicos ou carregados positivamente são preferíveis na posição P2.
Peptídeos com grupos hidrofóbicos volumosos são melhores acomodados nas
posições P2 e P3, como é o caso das cadeias oxidadas A e B da insulina, nas quais
os resíduos de arginina não são os únicos hidrolisados. Outros estudos mostram
uma alta especificidade da posição P2’ para resíduos de prolina (Pro). Já as
posições P1’ e P3 reconhecem um leque maior de opções de resíduos de
aminoácidos, com alguma preferência por resíduos com cargas positivas. Estudos
apontaram que o uso de substratos fluorogênicos com diferentes resíduos de
aminoácidos, conservando-se apenas a posição P1 com um resíduo de arginina,
mostrou que, na posição P2, a enzima tinha preferência por leucina (Leu) > tirosina
(Tyr) > fenilalanina (Phe) > valina (Val) (HARRIS et al., 2000). Essa especificidade
de substratos encontrada em Cz tem muito a ver com a presença de um resíduo de
glutamato (Glu205) na posição 205 da enzima, localizado no topo da bolsa S2 (LIMA
et al., 1992), uma importante característica no auxílio ao desenvolvimento de
inibidores seletivos.
Figura 15: Representação esquemática dos principais subsítios do sítio catalítico da
cruzaína. Fonte: SILVA, 2011.
21
Derivados peptídicos e os peptideomiméticos funcionalizados, apresentando
grupamentos eletrofílicos vinil sulfona, fluorometilcetona e vinilcetona, foram os
primeiros a serem utilizados nos estudos de inibição da cruzaína.
A N-metil-piperazina-ureia-F-hF-vinil-sulfona-fenil, também conhecida como
CRA-3316 ou K-777 (9) (Figura 16), é um potente inibidor da Cz. Em ensaios in vitro,
o K-777 (9) impediu não só a proliferação das formas epimastigotas e amastigotas
como também a ocorrência da
metaciclogênese i.e. a transformação de
epimastigotas em tripomastigotas metacíclicas. Quando testou-se o o K-777 (9) em
cobaias infectadas com ambas fases aguda e crônica, percebeu-se uma diminuição
considerável nos níveis de parasitos e um aumento do tempo de vida dos animais
(ENGEL et al., 1998). Barr et al. (2005) apresentou um estudo no qual, apesar de
não terem sido completamente curados quando tratados com K-777 (9), cães
infectados com o parasito tiveram significativas reduções nos danos cardíacos
causados pelo parasito. Este composto foi anunciado no ano de 2002 como uma
nova terapia para a DCH pelo Instituto para Uma Saúde Mundial (IOWH-Institute for
One World Health) e o Instituto Nacional de Saúde (National Institute of Health). No
entanto, 3 anos depois o projeto foi desativado devido à hepatoxicidade e
dificuldades na produção da substância. Os custos das próximas etapas de
implementação do K-777 no mercado estão estimados em $ 2,5 milhões de dólares
(Disponível
em
http://oneworldhealth.org/diseases/chagas.php
acessado
em
04/07/2013).
Nos últimos anos, novos potenciais inibidores da Cz, com atividade in vitro
contra
T.
cruzi
tiosemicarbazonas
tem
e
sido
identificados.
semicarbazonas,
Baseados
inibidores
em
esqueletos
não-peptídicos
tem
de
sido
identificados, como o derivado (10) (Figura 16) (URBINA, 2010). Outros
pesquisadores descreveram estudos de síntese e caracterização de macrociclos
apresentando o grupo vinil-sulfona, os quais se mostraram bastante ativos contra Cz
e rodesaína, uma cisteinil protease semelhante à Cz (CHEN et al., 2008). Acil e
alquil-oximetil cetonas foram identificadas por Brak et al. (2008) como sendo
inibidores de Cz, sendo capazes de eliminar, sem efeitos indesejados para as
células hospedeiras, o parasita intracelular. O desenvolvimento estrutural, a síntese
e a atividade tripanocida de quinoxalina-N-acilidrazonas foi feita por Romeiro et al.
22
(2009) e apresentada como sendo inibidoras da cruzipaína. No entanto, os testes
foram feitos usando formas epimastigotas, que são extracelulares, e tem menor
relevância no tratamento da DCH.
Figura 16: Estrutura química de dois inibidores de cruzipaína: K-777 (9) e ariltiosemicarbazona (10). Fonte: Elaborada pelo autor.
De maneira geral, a cruzipaína pode ser indicada como um alvo para a
quimioterapia sobre o T. cruzi, uma vez que, tanto os trabalhos citados
anteriormente quanto patentes descrevendo inibidores desta enzima já registradas,
suportam essa hipótese. No entanto, ainda há incertezas referentes à atividade de
inibidores peptídicos, enquanto que inibidores não-peptídicos ainda estão nos
primeiros estágios de pesquisa (URBINA, 2010).
1.3.3 Biossíntese de Esteróis
Os esteróis são substâncias de natureza lipídica com importante papel
estrutural na membrana plasmática de células eucarióticas. Além disso, são
essenciais na regulação de propriedades físico-químicas da membrana, como por
exemplo permeabilidade e fluidez. Também se fazem presentes na regulação do
ciclo celular e no metabolismo aeróbico da célula (DAUM et al., 1998).
Em células eucarióticas de mamíferos, o produto final da biossíntese de
esteróis é o colesterol, enquanto que fungos, plantas e protozoários produzem, com
pequenas diferenças entre eles, 24-alquil esteróis. A Figura 17 mostra a via
biossintética de esteróis na fase epimastigota de T. cruzi, tendo como
23
produtos finais o ergosterol e seu análogo apresentando o grupo etila em C24. Já no estágio amastigota de T. cruzi, os esteróis mais produzidos são o
fungisterol (11) e seu análogo etilado em C-24 (12) (LIENDO et al., 1998, 1999).
Figura 17: Biossíntese de esteróis de parasitos na fase epimastigota de T. cruzi
(Adaptado
de
BUCKNER
&
URBINA,
2012).
*Esta etapa da biossíntese de esteróis ocorre mediante uma sequência de 3 oxidações , iniciando-se
com o eburicol, e tendo como catalisadores a CYP51 e NADPH, que promovem a retirada do
grupamento 14α-metila.
24
O parasito no estágio amastigota, ou seja, dentro das células do hospedeiro
mamífero, se aproveita da biossíntese de esteróis do mamífero, incorporando alguns
destes esteróis à sua membrana. Apesar disso, seu metabolismo tem necessidade
de síntese de novo de esteróis para sua sobrevivência em todos os estágios de seu
ciclo de vida (URBINA et al., 1998).
Na biossíntese de esteróis tanto em animais (colesterol) quanto em fungos,
plantas e protozoários (24-alquil-esteróis), é necessário que ocorra a remoção do
grupo 14α-metila dos esteróis precursores. A enzima esterol C14-demetilase
(CYP51), pertencente à família das citocromos P450, é quem catalisa esta reação
(BUCKNER & URBINA, 2012). Ela pode ter uma alteração no seu nome quando se
trata de mamíferos e fungos, podendo ser chamada de lanosterol 14α-demetilase,
uma vez que seu substrato é o lanosterol. No entanto, de acordo com estudos
recentes (LEPESHEVA et al., 2006) no caso do T. cruzi, o substrato mais adequado
é o eburicol (Figura 17).
A remoção da metila C14 do esqueleto do esterol se dá através de uma
sequência de 3 oxidações, levando à descarboxilação e à liberação de ácido fórmico
(FISCHER et al., 1989). A redução (Fe3+ inativo para Fe2+ ativo) do ferro presente no
sítio ativo heme é feita por uma enzima P-450 redutase, que utiliza NADPH no
processo. A cada ciclo, por meio da transferência de elétrons do oxigênio e sua
inclusão no substituinte C14 do substrato do esterol, o estado de oxidação do átomo
de ferro é regenerado (LEPESHEVA et al., 2011).
1.3.3.1 Inibidores da Biossíntese de Esteróis (IBEs)
Um potencial alvo farmacoterapêutico que tem sido estudado contra parasitos
tripanosomatídeos são as vias biosintéticas de lipídeos. O efeito de inibidores da
biossíntese do ergosterol (IBEs), tem sido investigados no combate à doença de
Chagas, uma vez que para sua sobrevivência e crescimento, o T. cruzi necessita de
esteróis endógenos (SILVA et al., 2006).
25
Desde os anos 70, derivados azólicos, que apresentavam atividade seletiva
para inibição da CYP51, tem sido utilizados como fármacos antifúngicos. A partir dos
anos 80, com o trabalho de Docampo et al. (1981) relatando que estes fármacos
eram capazes de inibir o T. cruzi, muitos outros trabalhos surgiram abordando o uso
da mesma estratégia terapêutica(BUCKNER & URBINA, 2012).
O primeiro grupo de substâncias, que possuíam os grupos farmacofóricos
imidazola (e.g. cetoconazol (15)) e triazola (e.g. itraconazol (16)), apresentaram
significativa atividade in vitro. Contudo estas moléculas não foram bem sucedidas
quando testadas in vivo (BUCKNER, 2008). O mecanismo de ação destes azóis em
T. cruzi
está diretamente relacionado à interrupção da biossíntese de esteróis,
provavelmente pela ligação destas moléculas à CYP51 do parasito (URBINA et al.,
1996, 1998; LIENDO et al., 1999).
A medida que novos fármacos fungicidas eram lançados no mercado
farmacêutico, vários eram também testados sobre o T. cruzi. Desses
estudos
resultou a identificação do posaconazol (15) (Noxafil®, Merck) (MOLINA et al., 2000)
e do ravuconazol (16) (Eisai Co., Tóquio, Japão), os quais apresentam potência e
seletividade adequadas sobre o T. cruzi (DINIZ et al., 2010).
26
Figura 18: Estruturas químicas do posaconazol (15) e do ravuconazol (16).
Apresentando um amplo perfil de ação antifúngica e adequado perfil de
segurança, o posaconazol (15) foi clinicamente aprovado para venda em 2006.
Sendo assim, com o objetivo de evitar os custos e riscos de se desenvolver uma
nova substância, testou-se o posaconazol (15) contra T. cruzi (BUCKNER &
URBINA, 2012).
O posaconazol (15) apresenta uma alta porcentagem de cura em animais
infectados com o parasito e também uma potente atividade contra cepas de T. cruzi
resistentes ao nifurtimox (2) e ao benzonidazol (3). Além de estabilizar a estrutura
terciária da proteína, as interações com os aminoácidos de cadeia lateral do sítio
ativo da CYP51 e com a parte hidrofóbica do canal de acesso ao substrato, são
provavelmente os motivos pelos quais o posaconazol (15) apresenta uma potente
atividade contra T. cruzi (CHEN et al., 2010). Apesar disso, considerando as
condições financeiras dos pacientes infectados, existe uma preocupação quanto a
disponibilização deste fármaco no mercado, uma vez que o posaconazol (15)
apresenta um alto custo de produção (URBINA, 2011).
27
Com uma alta atividade in vitro contra cepas de T. cruzi (MIC= 1 nM contra a
forma amastigota intracelular), o ravuconazol (16) apresenta mais um efeito
supressor da doença que curativo, quando utilizado no tratamento de camundongos
e cães. Isso se deve provavelmente ao seu tempo de meia vida no organismo
destes animais, i.e. 4,5 e 8,8 horas, respectivamente. Já em humanos esse tempo
de meia vida aumenta consideravelmente, podendo ser de até 8 dias. Combinando o
dado anterior a um maior volume de distribuição, é possível atingir a cura em
humanos pela alta taxa exposição dos tecidos ao fármaco (BUCKNER & URBINA,
2012). Como se trata de uma molécula de menor tamanho e mais simples que o
posaconazol (15), o ravuconazol (16) se torna um candidato mais acessível no
combate à doença de Chagas, de maneira que testes de fase II com um pró-farmaco
desta substância já estão sendo realizados (CLAYTON, 2010).
1.4 Éteres de Oxima
Ao longo dos anos, muitos estudos mostraram que éteres de oxima são
eficazes no combate a infecções causadas por microrganismos. Dentre elas se
destacam doenças causadas por fungos e bactérias (PARTHIBAN et al., 2005). Um
dos fármacos mais conhecidos no tratamento de doenças causadas por fungos é o
oxiconazol (17) (Figura 19), que possui uma subunidade O-benzil ligada a grupos
azola e arila. Partindo-se deste fármaco, outros trabalhos mostraram que análogos
do oxiconazol (17), contendo uma variedade de anéis heterociclos, também se
apresentaram eficazes antifúngicos e antibactericidas (BHANDARI et al., 2009;
PARTHIBAN et al., 2009).
Figura 19: Estrutura química do Oxiconazol (17)
28
Sabe-se que compostos contendo preferencialmente nitroimidazóis e
nitrofuranos apresentam atividade antiparasitária (DORÉ et al., 1987). Dentro deste
grupo de compostos, o composto 5-nitro-2-furaldoxima (18) exibiu importante
atividade anti-tricomonal e muitos derivados 5-nitroimidazol aldoximas apresentaram
maior atividade tricomonicida que o metronidazol (19) (Figura 20), além de
resultados positivos in vivo contra Entamoeba histolytica (WINKELMANN et al.,
1977).
Figura 20: Estruturas químicas do 5-nitro-2-furaldoxima (18) e do metronidazol (19).
Em 1993, Delmas e colaboradores demonstraram que éteres de oxima
ligados a um anel tiofeno, como o derivado (20) (Figura 21), apresentaram boa
atividade contra E. histolytica, sendo até 5 vezes mais potentes que o metronidazol
(18), usado como substância de referência (Figura 20).
Figura 21: Estrutura química do éter de oxima tricomonicida (20).
Com o objetivo de encontrar novos compostos ativos contra doenças
parasitárias, um estudo realizado por Goebel e colaboradores (2008) no qual foram
sintetizados derivados de piperidinas, mostrou que um dos produtos obtidos, um éter
de oxima, era ativo contra plasmódios e tripanossomas. O interessante nesse estudo
é que dois derivados O-benzil éteres de oxima (21 e 22) foram testados, sendo que
apenas um deles apresentou atividade, i.e. o composto 22. A diferença entre eles
29
consiste em apenas um carbono espaçador (Figura 22) e a maior natureza
eletrofílica de 22
que é uma aldoxima. Apesar de ter apresentado atividade
significativa sobre os parasitos testados, o composto também apresentou uma alta
citotoxicidade, que, de acordo com os autores, pode ser reduzida modificando-se o
padrão de substituição (GOEBEL et al., 2008).
Figura 22: Estrutura química dos O-benzil éteres de oxima (21) e (22).
Em 2010, Holloway e colaboradores demonstram a alta seletividade de
alguns éteres de oxima contra cepas de T. cruzi. Neste estudo, os autores mostram
que os inibidores da TR, por eles sintetizados, são tóxicos aos tripanosomatídeos,
como por exemplo a benzidril-tropinona oxima 23 (Figura 23) (HOLLOWAY et al,
2007; HOLLOWAY et al., 2009). Apesar dessa alta toxicidade, os autores
perceberam que esse composto era altamente seletivo para T. cruzi, quando
comparado com outros tripanosomatídeos (Tabela 2).
Figura 23: Estrutura da benzidril-tropinona oxima (23).
30
Tabela 2: Atividade antiparasitária seletiva da benzidril-tropinona oxima (23)a.
a
Ensaio
EC50 (μM)
TR (T. cruzi)
35
P. falciparum
7,5
L. donovani
>30
T. cruzi
0,11
T. brucei
3
Citotoxicidade
36
Adaptado de HOLLOWAY et al., 2010
Após um estudo da relação estrutura-atividade
de diversos
compostos derivados da benzidril-tropinona oxima (23), os autores chegaram
a conclusão de que os grupos arila e o anel tropano são importantes na
atividade deste composto. Também demonstraram que a introdução de uma
cadeia carbônica entre o grupo aril e o grupo oxima levava à uma diminuição
da atividade tripanocida e que a restrição dos anéis levava à total perda desta
atividade (HOLLOWAY et al., 2010). Sendo assim os autores decidiram
substituir o átomo cloro ligado ao anel aromático por outros átomos de
halogênio, como o bromo, flúor e o iodo, e o resultado foi positivo, com um
aumento na atividade desses compostos quando comparados a benzidril
tropinona oxima (23) (Tabela 3) (HOLLOWAY et al., 2010).
31
Tabela 3: Estudo de relação estrutura-atividade de análogos da benzidril-tropinona
oxima (23)a
Composto
EC50 (μM)
R
T.
Citotoxicidadeb
cruzi
23
Cl
0,07
15
24
F
0,8
50
25
Br
0,04
40
26
I
0,04
39
27
Me
0,3
51
28
CN
0,4
53
29
CF3 0,03
35
a
Adaptado de HOLLOWAY et al., 2010
b
Cepas L-6 de células do mioblasto esquelético de ratos; podofilotoxina foi usada
como controle. EC50 14nM
32
2 . OBJETIVOS
No âmbito de uma linha de pesquisa que visa obter novos padrões
moleculares úteis no tratamento de doenças tropicais, em especial a Doença de
Chagas, este trabalho teve os seguintes objetivos:
- Planejar uma nova série de O-benzil éteres de oxima nitroimidazólicos
aplicando os conceitos de hibridação molecular e isosterismo de anéis;
- Sintetizar 6 novos derivados O-benzil éteres de oxima nitroimidazólicos (30
- 35) (Figura 24), utilizando rotas sintéticas viáveis, seguras e reprodutivas;
- Avaliar sua atividade tripanocida, in vitro, em uma das formas de relevância
clínica, tripomastigota, utilizando metodologias consolidadas na literatura;
Figura 24: Representação estrutural dos novos O-benzil éteres de oxima (30 - 35).
33
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Planejamento estrutural da nova série de O-benzil éteres de oxima
nitroimidazólicos
Os novos derivados derivados O-benzil éteres de oxima nitroimidazólicos
foram planejados estruturalmente, explorando o conceito de hibridação molecular
(BARREIRO & FRAGA, 2008; VIEGAS-Jr et al., 2007) de dois potentes
antiprotozoários, o 5-nitrotiofenil éter de oxima tricomonicida 20 (DELMAS et al.,
1993) e o derivado O-benzil éter de oxima tripanocida 22 (GOEBEL et al., 2008)
(Figura 25).
Figura 25: Planejamento estrutural dos novos derivados éteres de oxima
nitroimidazólicos (30 - 35)
34
Os novos derivados éteres de oxima (30 – 35) foram planejados como
híbridos moleculares de dois éteres de oxima (20) e (22), com a intenção de atingir
dois possíveis alvos moleculares distintos do T. cruzi. (BARREIRO & FRAGA, 2008)
Na Figura 25 podemos observar que a subunidade contendo o anel 5nitrotiofeno (A) sofreu uma troca bioisostérica pelo anel nitroimidazólico. Já os
grupamentos nitro e oxima foram mantidos, visto que são de fundamental
importância para o perfil de atividade sobre o T. cruzi.
A partir deste planejamento foram sintetizados diferentes derivados éteres
de oxima nitroimidazólicos com variação dos substituintes fenila, buscando avaliar
como o efeito estereoeletrônico dos diferentes substituintes poderia influenciar o
perfil antiparasitário desta nova série de compostos nitroimidazólicos (30 - 35)
(Figura 26).
Figura 26: Novos derivados de éter de oxima nitroimidazólicos planejados
estruturalmente (30 - 35).
35
3.2 Análise Retrossintética
A metodologia sintética proposta para a preparação da nova série de Obenzil éteres de oximas nitroimidazólicos foi baseada na análise retrossintética
descrita na figura 27 abaixo.
Figura 27: Análise retrossintética dos novos derivados éteres de oxima
nitroimidazólicos (30 – 35). IGF= Interconversão de Grupos Funcionais.
Pela desconexão da ligação O‒C (etapa a, Figura 27) foi possível evidenciar
a oxima nitroimidazólica (36) como composto chave na preparação dos derivados
nitro-imidazólicos alvos (30 - 35), explorando a reação de substituição nucleofílica
com os correspondentes cloretos de benzila substituídos.
O aldeído nitroimidazólico foi identificado como precursor da oxima
nitroimidazólica, por meio da interconversão de grupos funcionais (IGF) (etapa b,
Figura 27), explorando a reação de adição nucleofílica à carbonila seguida de
eliminação.
Por fim, através da desconexão da ligação C=O do aldeído nitroimidazólico
(etapa c, Figura 27), pudemos identificar o composto de partida 1,2-dimetil-5-nitro-
36
imidazol (38) como precursor, explorando a oxidação quimiosseletiva da metila
“pseudo-benzílica”.
3.3 Obtenção do aldeído nitroimidazólico (37)
O aldeído nitroimidazólico (37) foi obtido através da reação de oxidação
quimiosseletiva do derivado 1,2-dimetil-5-nitro-imidazol (38), via reação de fusão
com SeO2 (Esquema 1) (VANELLE & MALDONADO et al., 1990). Essa reação é
peculiar ao selênio e se assemelha bastante às reações pericíclicas. Ela se inicia
com a formação de um ácido selênico pseudo-alílico (I) (Esquema 2). Devido à fraca
ligação N‒Se neste intermediário, ocorre a decomposição ao álcool pseudo-alílico
correspondente (II). A oxidação deste derivado continua até a formação do aldeído
correspondente (37) (Revisto em CLAYDEN et al., 2007).
Esquema 1: Esquema de síntese do aldeído nitroimidazólico
37
Esquema 2: Proposta mecanística para a síntese do aldeído nitroimidazólico (37).
(CLAYDEN et al., 2007)
No entanto, o rendimento observado para esta reação foi baixo (ca 40%), as
condições operacionais descritas na referência são imprecisas e o produto obtido
apresenta muitos subprodutos complexados ao Se(II). A reação é efetuada sem
solvente à 140° C, temperatura de fusão de 1,2-dimetil-5-nitro-imidazol com
quantidades estequiométricas de SeO2. A obtenção do aldeído nitroimidazólico
utilizando este método tem como vantagem a rapidez de execução, que após a
fusão dos reagentes, mantendo à temperatura constante à 140° C, dura apenas 5
minutos. Uma temperatura mais alta e um tempo de reação mais prolongado podem
acarretar na descarbonilação do aldeído (VANELLE & MALDONADO et al., 1990).
O aldeído intermediário foi isolado, no entanto suas propriedades físicoquímicas e suas análises por RMN, espectrometria de massas e IV não foram
38
realizadas devido as condições de reação, ou seja, formação de muitos subprodutos
indesejáveis, e à
instabilidade do composto, que sob atmosfera oxidativa,
rapidamente se transforma em ácido carboxílico.
3.4 Síntese da Oxima Nitroimidazólica (36)
A síntese da oxima nitroimidazólica (36) (Esquema 3) foi realizada a partir da
adição nucleofílica da hidroxilamina à carbonila do aldeído, formando um
intermediário tetraédrico instável, que após etapas de protonação do oxigênio,
transferência de próton e desprotonação do nitrogênio da alquilhidroxilamina, resulta
na formação do produto insaturado desejado (LIU et al., 2007)(Esquema 4).
Esquema 3: Esquema de síntese da oxima nitroimidazólica.
Esquema 4: Proposta mecanística para a síntese da oxima nitroimidazólica (36).
A formação da oxima (36) pode ser observada pela absorção na região do
Infravermelho (IV), uma vez que o aldeído imidazólico apresenta uma frequência de
39
vibração de aproximadamente 1710 cm-1, relativa à deformação axial da ligação
C=O. Já o produto não apresenta mais essa banda no espectro de IV, mas sim uma
frequência de vibração de aproximadamente 1400 cm-1, relativo à deformação axial
da ligação C=N (Figura 28).
Figura 28: Espectro de IV da oxima nitroimidazólica (36) apresentando a banda em
~1400 cm-1 referente à deformação axial da ligação C=N.
É importante perceber que é o átomo nitrogênio, o mais nucleofílico da
hidroxilamina, e não o átomo de oxigênio, que realiza o ataque inicial à carbonila do
aldeído. Isso pode ser explicado pela diferença de eletronegatividade desses
átomos, na qual o nitrogênio é menos eletronegativo que o oxigênio, e portanto,
seus pares de elétrons não-ligantes estão mais disponíveis para o ataque à
carbonila que os pares de elétrons não-ligantes do oxigênio.
A oxima (36) apresentou em seu espectro de RMN de hidrogênio (Figura 29)
assinalamentos referentes ao hidrogênio do grupo OH da oxima em 12,29 ppm e
referentes ao hidrogênio ligado ao carbono imínico em 8,16 ppm (Figura 29). A
presença de um único sinal referente ao hidrogênio imínico de 36 é um indicativo da
formação diastereosseletiva do isômero geométrico, apresentando configuração
40
relativa (E), em função de sua menor energia de repulsão estereoeletrônica. Este
perfil é suportado por resultados previamente publicados, que relatam a formação
diastereosseletiva de (E)-aldoximas. (CHEN et al., 2012)
Figura 29: RMN 1H da oxima nitroimidazólica (36), (400 MHz, DMSO-d6/TMS).
O espectro de RMN de carbono da oxima (36) (Figura 30) apresentou
deslocamentos do átomo de carbono imínico da oxima em 159,92 ppm (Figura 30),
um valor menor que o do deslocamento do átomo de carbono de uma carbonila
nitroimidazólica, ca 185 ppm. Aliados à análise por espectrometria de massas
(EM/ESI (m/z) = 170,13), esses resultados confirmam que a oxima nitroimidazólica
(36), composto chave na preparação dos compostos alvo deste trabalho, foi obtida.
41
Figura 30: RMN 13C da oxima nitroimidazólica (36), (400 MHz, DMSO-d6/TMS).
3.5 Síntese dos Novos Derivados O-benzil éteres de oxima nitroimidazólicos
(30 – 35)
Os O-benzil éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35), compostos alvo
deste trabalho, foram obtidos pelo ataque nucleofílico do ânion da oxima (36) ao
carbono sp3 dos cloretos de benzila correspondentes (Esquema 5). Inicialmente
ocorre a desprotonação da OH da oxima nitroimidazólica pela base utilizada na
reação, formando o ânion (I), que é o nucleófilo que irá atacar o cloreto de benzila,
para formar o estado de transição (II). Em seguida ocorre com a liberação do grupo
de saída, o cloreto, é obtida o éter de oxima nitroimidazólico, composto alvo da
reação (Esquema 6).
42
Esquema 5: Esquema da síntese dos novos éteres de oxima nitroimidazólicos (30 35).
Esquema 6: Proposta mecanística para a síntese dos éteres de oxima via SN2 (30 35).
Apesar do mecanismo representador ser do tipo SN 2, o mecanismo desta
reação vai depender do substituinte ligado na posição para do anel fenila, podendo
ser mais SN1 ou mais SN2. Por exemplo, se o substituinte for o grupo nitro (-NO2), o
mecanismo da reação será via SN2, uma vez que o grupo nitro, por ser retirador de
elétron, não deixará o intermediário carbocátion (I) ser estabilizado por ressonância.
Por outro lado, se o substituinte for o grupo CH3, o a reação ocorrerá principalmente
via SN1. Outro fator que irá influenciar o mecanismo da reação é a escolha do
solvente para a reação. O uso de um solvente polar prótico irá favorecer a reação
via SN1, uma vez que a etapa rápida nesta reação envolve a formação de íons, ou
seja, o estado de transição é mais polar que os reagentes no início da reação e é,
43
portanto, estabilizado pelo solvente polar. Já um solvente menos polar irá favorecer
a ocorrência da reação via SN2, onde o estado de transição é menos polar que o
nucleófilo usado, uma vez que a carga está deslocalizada entre dois átomos.
Inicialmente a metodologia proposta por Reis et al. (1999) para a alquilação
da oxima nitroimidazólica (36) foi explorada e consistiu no uso de THF anidro.
Entretanto, a despeito da metodologia resultar na obtenção dos O-benzil éteres
pirazólicos, objeto daquele estudo, em bons rendimentos (Figura 31), sua aplicação
não logrou êxito na obtenção dos compostos-alvo de nosso estudo. Além disso, esta
metodologia exigia o uso de solvente anidro e atmosfera inerte.(*)
Figura 31: Derivado 1,3-benzodioxólico obtido com 61% de rendimento por Reis et
al. (1999).
Um grande obstáculo evidenciado nestas condições, diz respeito à
dificuldade de solubilização do material de partida, a oxima nitroimidazólica (36), no
solvente selecionado para a reação, o THF. A oxima não se solubilizava por
completo e durante a reação, acompanhada por CCF, não foi possível observar a
formação de produto algum.
Sendo assim, após um estudo de solubilidade da oxima nitroimidazólica (36)
em diversos solventes, optou-se pelo uso de outra metodologia, que consistia na
utilização de uma mistura de DMSO/H (8:2) como solvente e de KOH como base (LI
et al., 2002). Usando DMSO, ocorria a solubilização completa do material de partida,
e a água atuava apenas para melhorar e aumentar a velocidade de solubilização da
base. A despeito de se observar a formação de produto com o uso desta
metodologia alternativa, através da análise por CCF, após o isolamento da reação,
evidenciamos que esta não se completava, permanecendo resquícios do
* Alternativamente, empregamos KOH como base em THF (LI et al., 2002) sob condições não anidras,
sem entretanto ter sucesso na obtenção dos éteres de oxima (30 – 35)
44
material de partida, do cloreto de benzila correspondente e aparecimento de
subprodutos da reação.
Uma provável explicação para este perfil reside no fato da base utilizada
estar competindo com o nucleófilo formado no meio reacional, impedindo que este
alcançasse o sítio eletrofílico do cloreto de benzila, e fazendo com que quantidades
expressivas do álcool benzílico
correspondente se formassem. A solução
encontrada foi a troca da base, KOH, por uma base menos nucleofílica, o t-BuOK,
usando apenas DMSO como solvente, uma vez que o uso da mistura DMSO/H2O
poderia levar à formação de t-BuOH e –OH pela reação da nova base com a água.
Com a nova metodologia foi possível obter os novos compostos (30 – 35. A
Tabela 4 ilustra as propriedades físico-químicas e os rendimentos dos novos
derivados O-benzil éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35) obtidos por meio da
metodologia acima citada.
45
Tabela 4: Propriedades físico-químicas e rendimentos dos novos derivados Obenzila éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35).
Composto
R
Fórmula
Peso
Rendimento
Ponto de
Tempo de
Molecular
Molecular
(%)
Fusão (º C)
Reação
(horas)
30
NO2
C12H11N5O5
305,25
89
ND
28
31
Cl
C12H11ClN4O3
294,69
55
127,8 ± 1,6-
20
134,8 ± 0,8
32
H
C12H12N4O3
260,25
89
101,8 ± 0,5-
24
106,8 ± 0,6
33
F
C12H11FN4O3
278,24
74
100,3 ± 0,3-
24
103,1 ± 0,3
34
Br
C12H11BrN4O3
339,14
65
141,3 ± 0,5-
22
144,1 ± 0,8
35
CH3
C13H14N4O3
274,28
80
116,4 ± 0,3-
24
117,5 ± 0,4
Os novos derivados éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35) foram
analisados por espectrometria de massas (EM), utilizando a técnica de eletrospray
(ESI), e por espectroscopia na região do infravermelho (IV), como ilustrado na
Tabela 5.
46
Tabela 5: Principais dados de EM-ESI e IV para os novos derivados éteres de oxima
nitroimidazólicos (30 - 35)
-1
IV – Pastilha de KBr – ν (cm )
Composto
EM-ESI (m/z)
30
328,1 (M [Na ], 100%)
+
+
1602 (ν C=N); 1514 e 1343 (ν NO2);
1130 (ν CH2‒O)
31
+
+
317,1 (M [Na ], 100%)
1614 (ν C=N); 1524 e 1346 (ν (NO2);
1136 (ν CH2‒O)
+
+
1607 (ν C=N); 1523 e 1370 (ν NO2)
+
+
1598 (ν C=N); 1537 e 1367 (ν NO2);
32
282,8 (M [Na ], 100%)
33
301,1 (M [Na ], 100%)
1131 (ν CH2‒O)
34
+
+
361,1 (M [Na ], 100%)
1612 (ν C=N); 1524 e 1369 (ν NO2);
1137 (ν CH2‒O)
35
+
+
296,9 (M [Na ], 100%)
1615 (ν C=N); 1525 e 1371 (ν NO2);
1134 (ν CH2‒O)
No espectro na região do IV (Figura 32) para a nova série de O-benzil éteres
de oxima nitroimidazólicos (30 – 35) sintetizados notou-se a presença da banda em
~1615 cm-1, correspondente ao estiramento da ligação C=N da oxima. Vale destacar
ainda a banda em ~1130 cm-1, referente ao estiramento da ligação O‒CH2 do grupo
funcional éter presente na molécula, e as banda em ~1520 e 1350 cm-1 referentes
ao estiramento assimétrico e simétrico, respectivamente, das ligações N-O do
grupamento nitro ligado ao anel imidazólico presente nos compostos alvo deste
estudo.
47
Figura 32: Imagem do espectro de IV do derivado éter de oxima nitroimidazólico
(35) (Pastilha de KBr).
Os derivados O-benzil éteres de oxima nitroimidazólicos (30 – 35) também
foram caracterizados por RMN 1H e seus respectivos espectros mostraram que os
hidrogênios N-CH3, H-C=N, H4, O-CH2- apresentaram deslocamentos químicos
praticamente iguais, com exceção do derivado 30, que apresentou deslocamento
dos hidrogênios H4 e O-CH2- em campo mais baixo que o encontrado para os outros
derivados. Esse resultado pode ser explicado pela presença do grupamento nitro no
anel aromático do composto 30, que acaba promovendo a desblindagem destes
hidrogênios por efeito indutivo, o que acaba resultando no aumento do valor de
deslocamento químico destes hidrogênios neste composto. No composto 35, os três
hidrogênios da metila ligada na posição para do anel benzênico, aparecem em
campo alto, i.e. 2,30 ppm. Todos estes hidrogênios aparecem como singletos em
seus respectivos espectros.
Os hidrogênios do anel fenila dos compostos 30, 34 e 35 apresentaram o
tipo padrão de deslocamento de anéis aromáticos para substituídos, aparecendo
como um par de dubletos com constantes de acoplamento iguais a 8,72 , 8,32 e 7,92
48
Hz, respectivamente. Esses valores estão dentro do valor esperado para este tipo de
acoplamento entre hidrogênios com relação orto em anéis aromáticos, que é de 8
Hz, podendo variar entre 6 – 10 Hz (PAVIA, D. L.; LAPMAN, G.M & KRIZ, G. S.,
2010).
O espectro de RMN 1H do derivado 31, apresentou um singleto em 7,45
ppm, relativo aos quatro hidrogênios do anel fenila, o que significa que estes
hidrogênios são magneticamente equivalentes, ou seja, o efeito do substituinte cloro
na posição para se iguala ao efeito do restante da estrutura ligada ao anel. O
composto 32, não substituído no anel fenila, apresentou um multipleto entre 7,44 e
7,34 ppm, relativo aos 5 hidrogênios ligados ao anel fenila. Uma vez que o átomo de
flúor tem um número de spin igual a ½, o acoplamento entre hidrogênio e flúor segue
a mesma regra de multiplicidade que o acoplamento entre hidrogênios, ou seja, o
átomo de flúor é visto como se fosse um átomo de hidrogênio. Tendo em vista o
acoplamento H-F, o composto 33 apresentou dois tripletos com J = 8,8 Hz, devido
ao acoplamento entre os hidrogênios e o átomo flúor na posição para do anel fenila.
Os valores dos deslocamentos químicos do hidrogênios da nova série de O-benzil
éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35), podem ser encontrados na Tabela 6
descrita a seguir.
49
Tabela 6: Deslocamentos químicos em ppm dos hidrogênios da nova série de Obenzil éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35) nos espectros de RMN 1H*.
Compostos
-R
para-CH3
N-CH3
O-CH2-
N=C-H
H4
H-Fenila
30
NO2
-
4,03
5,43
8,16
8,50
8,26-8,24 (d) e 7,70-7,68 (d)
31
Cl
-
4,04
5,26
8,16
8,41
7,45 (s)
32
H
-
4,04
5,27
8,16
8,41
7,44 – 7,34 (m)
33
F
-
4,04
5,25
8,16
8,40
7,50-7,47(t) e 7,24 e 7,19 (t)
34
Br
-
4,03
5,25
8,16
8,41
7,60-7,58 e 7,40-7,38 (d)
35
CH3
3,20
4,04
5,21
8,15
8,37
7,32-7,30(t) e 7,20-7,18 (d)
*Determinado à 400 MHz, usando DMSO-d6/TMS como solvente
50
Figura 33: Imagem do espectro de RMN 1H do novo derivado éter de oxima
nitroimidazólico (33) (400 MHz, DMSO-d6/TMS).
Os derivados O-benzil éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35) também
foram caracterizados por espectroscopia de RMN
13
C (Figura 34), técnica pela qual
foi possível verificar que os deslocamentos químicos dos carbonos N-CH3, C5, C4 e
O-CH2- de todos os derivados permaneceu praticamente constante. Já os outros
carbonos tiveram variações em seus deslocamentos de acordo com o efeito
eletrônico do substituinte R ligado à fenila (Tabela 7).
Merece destaque a análise do espectro de RMN
13
C do derivado 33 (Figura
33), que devido à presença do flúor como substituinte, ocorre o acoplamento deste
halogênio com os carbonos da fenila, desdobrando seus sinais na forma de dois
dubletos (J2 = 86,4 e J3 = 14,2). Além disso, percebe-se que quando comparado aos
51
outros compostos da série, os carbonos C2 e C=N do composto 33 (Figura 34)
sofrem um aumento em seus valores de deslocamentos químicos, devido à
desblindagem destes átomos em razão do efeito indutivo do átomo de flúor ligado à
fenila.
Figura 34: Ilustração do espectro de RMN
nitroimidazólico (33) (400 MHz, DMSO-d6/TMS).
52
13
C do derivado éter de oxima
Tabela 7: Deslocamentos químicos em ppm dos carbonos da nova série de O-benzil
éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35), nos espectros de RMN 13C*.
Composto
-R
N-
C5
C4
C2
C=N
CH3
O-
C1’
C2’ e C6’
C3’ e C5’
C4’
CH2-
CH3Fenila
30
NO2
34,4
140,1
133,0
144,8
147,1
75,0
142,7
129,0
123,5
141,4
-
31
Cl
34,4
140,1
132,7
141,1
142,8
75,5
135,9
130,3
128,3
133,0
-
32
H
34,3
140,0
128,1
140,9
142,9
76,5
136,7
128,3
128,4
133,0
-
33
F
34,4
142,9
133,0
160,7
163,1
75,7
141,0
130,88-
115,32-
140,1
-
130,80(d)
115,10(d)
34
Br
34,4
136,3
133,0
141,2
142,8
75,5
131,5
130,6
131,3
129,5
-
35
CH3
34,4
140,0
133,0
140,7
143,0
76,4
133,0
128,6
128,9
137,4
20,7
*Determinado à 400 MHz, usando DMSO-d6 como solvente.
A partir dos resultados de RMN 1H e
13
C anteriormente apresentados, os
compostos da série 30 - 35 foram obtidos na forma de um único isômero geométrico
ao nível da dupla ligação imínica do grupo oxima. A conclusão a respeito de qual
isômero havia sido formado foi obtida após a confirmação da estrutura por estudos
de difração de raios X, como ilustrado na Figura 35. O derivado para-bromado (34)
foi eleito para o estudo em tela como modelo para os demais derivados da série de
O-benzil éteres de oxima nitroimidazólicos (30 – 35).
53
Este estudo confirmou inambiguamente que os derivados 30 – 35 foram
obtidos como um único diastereoisômero, apresentando a configuração relativa (E),
como antecipado anteriormente para a oxima precursora (36).
Figura 35: Estrutura molecular do composto para bromado (34) obtida por difração
de raios X. (Realizado por Dr. James Wardell e Dra. Solange Wardell)
54
3.6 Avaliação do perfil tripanocida
A avaliação do perfil de atividade tripanocida dos novos derivados O-benzil
éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35) sobre formas tripomasigota de T. cruzi,
está descrita na Tabela 8. A análise do perfil anti-T. cruzi demonstrou que o mais
ativo foi o para-NO2 (30), seguido dos derivados para-Br (34), para-F (33) e nãosubstituído (32), os quais apresentaram atividades equivalentes.
Tabela 8: Atividade tripanocida in vitro sobre a forma tripomastigota dos novos Obenzil éteres de oxima imidazólicos, usando benzonidazol como substância de
referência (30 - 35).
R
IC50*
πx
logP médio**
(μM)
(Teórico)
(Teórico)
***
σp****
30
NO2
12,7 ± 1,6
2,24
-0,28
+0,78
31
Cl
>500
2,96
0,71
+0,23
32
H
31,4 ± 7,1
2,34
0
0
33
F
31,4 ± 5,9
2,50
0,14
+0,06
34
Br
30,7 ± 2,3
3,10
0,86
+0,26
35
CH3
43,4 ± 7,0
2,74
0,56
-0,17
3 (BZN)
-
0,122
-
-
-
*Ensaio realizado sobre as formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi
(Realizado pela Dra. Kelly Salomão)
**Calculado usando o programa ACDLABS.
***Constante de hidrofobicidade de Hansch (πx = logPx – logPH)
****Coeficiente de Hammett, obtido de COSTA, FERREIRA, VASCONCELLOS &
ESTEVES, 2005
55
A utilização de um substituinte polar, retirador de elétrons como o 4-NO2, foi
de grande importância na atividade tripanocida, provavelmente devido à sua
capacidade de ser reconhecido pelo biorreceptor alvo, através de interações
dipolares ou como aceptor de ligações de hidrogênio. Por outro lado, a presença de
substituintes halogenados (F e Br) na posição para do anel fenila dos derivados Obenzil éteres de oxima nitroimidazólicos
resultou na diminuição da atividade
tripanocida, com valores estatisticamente equivalentes ao derivado não substituído
(32). A introdução de um grupo menos polar e doador de elétrons, como é o caso do
para-CH3, resultou numa maior diminuição do potencial tripanocida desta nova série
de compostos (Figura 36).
Figura 36: Diminuição do perfil de atividade em função da introdução de diferentes
substituintes no anel fenila dos derivados O-benzil éteres de oxima imidazólicos (30 35).
Provavelmente, o perfil de atividade tripanocida evidenciado para os
derivados halogenados (33 e 34), pode estar relacionado ao melhor perfil de
lipofilicidade que o derivados apresentam, como ilustra o Log P teórico descrito na
Tabela 7. No entanto, o derivado 35 apresentou um Log P teórico próximo a 3 e
mesmo assim não obteve um perfil de atividade tripanocida considerável quando
comparado aos compostos da série. Isso indica que a atividade destes compostos
não está relacionada apenas com seu coeficiente de partição. O derivado 30, que
apresentou o melhor perfil de atividade devido ao fato do grupamento nitro
apresentar menor constante de hidrofobicidade de Hansch (πNO2= - 0,128) e maior
56
valor da constante de Hammet (σNO2 = +0,78) indicou que um maior efeito
mesomérico do substituinte contribuiu para aumentar a atividade tripanocida do
composto em questão. Curiosamente, o derivado substituído com um átomo de cloro
(31) apresentou um resultado errático com relação ao seu perfil tripanocida (IC50 >
500 μM), que foi confirmado após ensaios de diferentes lotes do composto.
O perfil de correlação dos parâmetros de lipofilicidade (πx) e eletrônico (σp)
dos substituintes dos derivados O-benzil éteres de oxima nitroimidazólicos (30 – 35)
com a atividade tripanocida permite inferir que o melhor padrão de substituição
segue o perfil π- e σ+, segundo o diagrama de Craig (Figura 37) (TAVARES, 2004).
Este perfil pode auxiliar a decisão de escolha de novos substituintes, visando a
otimização estrutural de protótipos anti-T. cruzi descobertos neste estudo.
Figura 37: Diagrama de Craig (intercorrelação σ x π) em para-substituição
aromática (Adaptado de TAVARES, 2004).
57
4. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos neste trabalho nos permitiram concluir que a
metodologia sintética empregada para a obtenção da nova família de derivados
éteres de oxima nitroimidazólicos mostrou-se adequada, permitindo a preparação
dos compostos alvo em rendimentos que variam entre 55-89%.
O planejamento estrutural empregado na construção da série de compostos
éteres de oxima nitroimidazólicos (30 - 35) foi bem sucedido, dado os resultados
obtidos nos ensaios farmacológicos realizados, permitindo a identificação do
derivado 30, que se mostrou mais ativo sobre a forma tripomastigota do T. cruzi com
IC50= 12,7 μM.
A análise do diagrama de Craig nos aponta como perpectivas a síntese de
derivados
exibindo
diferentes
substituintes
que
apresentem
correlação
de
propriedades de lipofilicidade e eletrônicas como o grupo nitro (π-, σ+), como por
exemplo os grupos CN, NH2, CONH2, COOH.
Como perspectivas, serão feitos ensaios específicos para avaliar se o
mecanismo de ação envolvido na atividade antiprotozário apresentada pelos
derivados mais ativos desta série de compostos está relacionada com a inibição da
biosíntese de esteróis. Serão realizados também ensaios ADME (absorção,
distribuição, metabolismo e excreção) e testes de mutagenicidade comparativos com
outros fármacos nitroheterocíclicos, e será avaliado o perfil de citotoxicidade dos
derivados mais ativos da série obtida.
58
5. PARTE EXPERIMENTAL
5.1 Informações Gerais
As reações foram monitoradas por cromatografias de camada fina (CCF) e
foram utilizadas cromatofolhas de alumínio recobertas com gel de sílica 60 F254 com
espessura de 0,25 mm (MERCK). A visualização das substâncias em CCF foi feita
em lâmpada de UV (254 e 366 nm). Os reagentes e solventes empregados foram de
grau analítico, obtidos do laboratório de Farmanguinhos/Fiocruz, das marcas Merck
e Sigma-Aldrich.
Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e
13
C foram
obtidos em espectrômetro AC-200A (Farmanguinhos), operando de 400 a 500 MHz.
Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em parte por milhão (ppm) a partir
do padrão interno tetrametil-silano (TMS). As áreas dos picos foram obtidas por
integração eletrônica e suas multiplicidades foram descritas do seguinte modo: ssingleto; d- dubleto; dd- duplo dubleto; t- tripleto; m-multipleto.
Os espectros no infravermelho (IV) foram obtidos em um espectrômetro por
transformada de Fourrier, modelo Magna IR 760. As amostras foram examinadas
sob a forma de pastilhas de brometo de potássio (KBr). Os valores de absorção
foram pulsados em número de onda, utilizando como unidade o centímetro recíproco
(cm-1).
Os espectros de massas de baixa resolução (E.M.) foram obtidos por elétronspray negativo/positivo com inserção direta LC/MS utilizando metanol (100%) como
diluente e injetando diretamente no probe a um fluxo de 64 ~10 μM/min em um
aparelho LC/MS micromass ZQ 4000, com representação automática por
computador (programa Masslynx). Os fragmentos descritos com relação entre
unidade de massa atômica e a carga do mesmo (m/z) e a abundância relativa,
expressa em cada fragmento, em percentagem (%).
Os pontos de fusão (P.F.) foram determinados em um aparelho BÜCHI (B545).
59
5.2. Metodologia Sintética
5.2.1 Síntese do derivado aldeído 1,2-dimetil-5-nitroimidazol (37)
Em um balão de 250 mL foram adicionados 8,46 g (0,06 mol; 1 equiv.) de 1,2dimetil-5-nitroimidazol (38) e 13,32 g (0,12 mol; 2 equiv.) de dióxido de selênio sob
agitação. Colocou-se o balão em um banho de óleo e elevou-se a temperatura até
140 °C. Após a fusão de ambos os reagentes, deixou-se a reação sob refluxo por
cerca de 5 minutos. Em seguida, ainda sob agitação, o meio reacional foi levado à
temperatura ambiente. Adicionou-se 200 mL de CH2Cl2 e filtrou-se a mistura.
Evaporou-se o solvente e o derivado aldeído (37) obtido foi deixado sob vácuo.
60
5.2.2 Síntese de 1,2-dimetil-5-nitroimidazolil oxima (36)
Ao derivado aldeído (37) obtido na etapa anterior ( 6,07 g, 39 mmol, 1,0 eqiv.)
foram adicionados 3,61 g (52 mmol; 1,32 eq.) de cloridrato de hidroxilamina em 6 mL
de água e em seguida, gota a gota, 2,63 g (24 mmol; 0,63 eq.) de carbonato de
sódio em 9 mL de água. O meio reacional foi aquecido a 100 °C por um tempo
adicional de 1 hora. Após este período, a reação foi levada à temperatura ambiente.
Adicionou-se água ao balão, o precipitado formado foi filtrado em funil de Büchner, e
lavado com água. Em seguida, o produto bruto obtido foi recristalizado em etanol. O
precipitado obtido foi então filtrado em um funil de Büchner e colocado para secar a
vácuo, fornecendo 5,6 g de oxima nitroimidazólica (36) (85 % de rendimento) na
forma de um sólido amarelo.
EM-ESI (m/z): 169,6 (M+ -H, 100%) (anexo de espectros p. 1)
IV (KBr) νmáx cm-1: 1400,46 (ν C=N); 1533 e 1372 (ν NO2) (anexo de espectros p. 1)
RMN 1H (400 MHz, DMSO d6 / TMS (δ-ppm): 4,09 (3H; s; H4, H5, H6); 8,16 (1H; s;
H2); 8,22 (1H; s; H1); 12,29 (1H; s; H3) (anexo de espectros p. 2).
RMN
13
C (100 MHz, DMSO d6/ TMS (δ-ppm): 34,5 (C1); 133,1 (C3); 140,3 (C2);
144,2 (C4); 159,9 (C5); (anexo de espectros p. 2).
61
5.2.3 Procedimento geral para síntese dos derivados éteres de oxima
nitroimidazólicos (30 - 35)
Em um balão de 50 mL adicionou-se 0,3 g (1,76 mmol; 1 equiv.) de oxima
nitroimidazólica (36), 0,22 g (1,93 mmol; 1,1 equiv.) de t-BuOK e 10 mL de DMSO.
Esperou-se que toda base fosse dissolvida e em seguida adicionou-se, gota a gota,
2,11 mmol (1,2 equiv.) do cloreto de benzila correspondente (39 – 44). O
acompanhamento do meio reacional por CCF indicou o término da reação. Então,
verteu-se o meio reacional sobre água e gelo. Finalmente, o precipitado foi filtrado
em funil de Büchner, lavado com água e colocado para secar sob vácuo, resultando
na obtenção dos compostos 30 – 35 como descrito a seguir.
62
5.2.3.1 (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-nitrobenzil) oxima (30)
Este derivado foi obtido em 89 % de rendimento, como um sólido amarelo
pálido.
EM-ESI (m/z): 328,1 (M+ [Na+], 100%) (anexo de espectros p. 3)
IV (KBr) νmax cm-1: 1602 (ν C=N); 1514 e 1343 (ν NO2); 1130 (ν CH2‒O); (anexo de
espectros p. 3).
RMN 1H (400 MHz, DMSO d6 / TMS (δ-ppm): 4,03 (3H; s; N-CH3); 5,43 (2H; s; OCH2); 8,26-8,24 (2H; d; H3’ e H5’) e 7,70-7,68 (2H; d; H2’ e H6’); 8,16 (1H; s; HC=N); 8,50 (1H; s; H4) (anexo de espectros p. 4).
RMN
13
C (100 MHz, DMSO d6/ TMS (δ-ppm): 34,40 (N-CH3); 75,00 (O-CH2); 133,08
(C4); 129,02(C2’ e C6’); 123,53 (C3’ e C5’); 141,43 (C4’); 142,73 (C1’); 140,16 (C5);
144,89 (C2); 147,14 (C=N); (anexo de espectros p. 4).
63
5.2.3.2 (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-clorobenzil) oxima
(31)
Este derivado foi obtido em 55 % de rendimento, como um sólido amarelo
com ponto de fusão 127,8 – 134,8 °C.
EM-ESI (m/z): 317,1 (M+ [Na+], 100%) (anexo de espectros p. 6)
IV (KBr) νmax cm-1: 1614 (ν C=N); 1524 e 1346 (ν NO2); 1136 (ν CH2‒O); (anexo de
espectros p. 6).
RMN 1H (400 MHz, DMSO d6 / TMS (δ-ppm): 4,04 (3H; s; N-CH3); 5,26 (2H; s; OCH2); 7,45 (4H; s; H2’; H3’; H5’; H6’); 8,16 (1H; s; H-C=N); 8,41 (1H; s; H4) (anexo
de espectros p. 7).
RMN
13
C (100 MHz, DMSO d6/ TMS (δ-ppm): 34,4 (N-CH3); 75,5 (O-CH2); 132,77
(C4); 130,3 (C2’ e C6’); 128,3 (C3’ e C5’); 133,0 (C4’); 135,9 (C1’); 140,1 (C5); 141,1
(C2); 142,8 (C=N); (anexo de espectros p. 7).
64
5.2.3.3 (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-benzil oxima (32)
Este derivado foi obtido em 89 % de rendimento, como um sólido amarelo
pálido, com ponto de fusão 101,8 – 106,8 °C.
EM-ESI (m/z): 282,8 (M+ [Na+], 100%) (anexo de espectros p. 9)
IV (KBr) νmax cm-1: 1607 (ν C=N); 1523 e 1370 (ν NO2); (anexo de espectros p. 9).
RMN 1H (400 MHz, DMSO d6 / TMS (δ-ppm): 4,05 (3H; s; N-CH3); 5,27 (2H; s; OCH2); 7,35 – 7,45 (5H; m; H2’; H3’; H4’; H5’; H6’); 8,16 (1H; s; H-C=N); 8,41 (1H; s;
H4) (anexo de espectros 10).
RMN
13
C (100 MHz, DMSO d6/ TMS (δ-ppm): 34,38 (N-CH3); 76,54 (O-CH2); 128,11
(C4); 128,37(C2’ e C6’); 128,49 (C3’ e C5’); 133,07 (C4’); 136,77 (C1’); 140,09 (C5);
140,91 (C2); 142,97 (C=N); (anexo de espectros p. 10).
65
5.2.3.4 (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-fluorobenzil) oxima
(33)
Este derivado foi obtido em 74 % de rendimento, como um sólido amarelo
com ponto de fusão 100,3 – 103,1 °C.
EM-ESI (m/z): 301,1 (M+ [Na+], 100%) (anexo de espectros p. 12)
IV (KBr) νmax cm-1: 1598 (ν C=N); 1537 e 1369 (ν NO2); 1131 (ν CH2‒O); (anexo de
espectros p. 12).
RMN 1H (400 MHz, DMSO d6 / TMS (δ-ppm): 4,04 (3H; s; N-CH3); 5,25 (2H; s; OCH2); 7,50-7,47 (2H; t; H2’ e H6’); 7,24-7,19 (2H; t; H3’ e H5’); 8,16 (1H; s; H-C=N);
8,40 (1H; s; H4) (anexo de espectros p. 13).
RMN
13
C (100 MHz, DMSO d6/ TMS (δ-ppm): 34,42 (N-CH3); 75,70 (O-CH2); 133,09
(C4); 130,86-130,80 (d; C2’ e C6’); 115,32-115,10 (d; C3’ e C5’); 140,13 (C4’);
141,04 (C1’); 142,96 (C5); 160,76 (C2); 163,19 (C=N); (anexo de espectros p. 13).
66
5.2.3.5 (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-bromobenzil) oxima
(34)
Este derivado foi obtido em 65 % de rendimento, como um sólido amarelo
com ponto de fusão 141,3 – 144,1 °C.
EM-ESI (m/z): 361,1 e 362,1 (M+ e M+1 [Na+], 100%) (anexo de espectros p. 15)
IV (KBr) νmax cm-1: 1612 (ν C=N); 1525 e 1367 (ν NO2); 1137 (ν CH2‒O); (anexo de
espectros p. 15).
RMN 1H (400 MHz, DMSO d6 / TMS (δ-ppm): 4,03 (3H; s; N-CH3); 5,25 (2H; s; OCH2); 7,60 - 7,58 (2H; d; H2’ e H6’) e 7,40 - 7,38 (2H; d; H3’ e H5’); 8,16 (1H; s; HC=N); 8,41 (1H; s; H4) (anexo de espectros p.16).
RMN
13
C (100 MHz, DMSO d6/ TMS (δ-ppm): 34,41 (N-CH3); 75,57 (O-CH2); 133,08
(C4); 130,63 (C2’ e C6’); 131,33 (C3’ e C5’); 129,59 (C4’); 131,55 (C1’); 136,33 (C5);
141,21 (C2); 142,88 (C=N); (anexo de espectros p. 16).
67
5.2.3.6 (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-metilbenzil) oxima (35)
Este derivado foi obtido em 80 % de rendimento, como um sólido amarelo
com ponto de fusão 116,4 – 117,5 °C.
EM-ESI (m/z): 296,9 (M+ [Na+], 100%) (anexo de espectros p. 18)
IV (KBr) νmax cm-1: 1615 (ν C=N); 1525 e 1371 (ν NO2); 1134 (ν CH2‒O); (anexo de
espectros p. 18).
RMN 1H (400 MHz, DMSO d6 / TMS (δ-ppm): 2,30 (3H; s; Ph-CH3) 4,04 (3H; s; NCH3); 5,21 (2H; s; O-CH2); 7,32 - 7,30 (2H; d; H2’ e H6’); 7,20 - 7,18 (2H; d; H3’ e
H5’); 8,15 (1H; s; H-C=N); 8,37 (1H; s; H4) (anexo de espectros p. 19).
RMN
13
C (100 MHz, DMSO d6/ TMS (δ-ppm): 20,73 (Ph-CH3); 34,40 (N-CH3); 76,46
(O-CH2); 133,08 (C4); 128,64 (C2’ e C6’); 128,92 (C3’ e C5’); 137,46 (C4’); 133,01
(C1’); 140,09 (C5); 140,79 (C2); 143,02 (C=N); (anexo de espectros p. 19).
68
5.3 Protocolo Biológico
5.3.1 Avaliação da atividade tripanocida in vitro sobre a forma
tripomastigota de T. cruzi. (SALOMÃO et al., 2004)
As
soluções
estoque
dos
derivados
O-benzil
éteres
de
oxima
nitroimidazólicos (30 – 35) foram preparadas em dimetilsulfóxido (DMSO) na
concentração de 100 mM/mL. Formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi (cepa
Y) foram isoladas de camundongos infectados e ressuspendidas em meio Eagle
modificado por Dulbecco (DME) suplementado com 10 % de soro fetal bovino. Os
ensaios com tripomastigotas foram realizados em placa de 96 poços e em cada
poço foram adicionados 0,1 mL de cada derivado imidazólico 2,4,5-trissubstituido,
previamente preparadas no dobro das concentrações desejadas, para uma diluição
seriada 1:2. O tratamento foi analisado na faixa que variou de 2 a 500 μg/mL, com
concentração final do solvente nunca superior a 0,5 %. A seguir, foram
acrescentados 100 μL de suspensão de tripomastigotas numa concentração final de
5 x 106 parasitos/mL, na ausência de sangue. Após incubação por 24 h, a 37 °C, os
parasitos foram quantificados em câmara de Neubauer e o valor de IC50 calculado.
69
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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7. ANEXOS: ESPECTROS
E1: Espectro de massas da oxima nitroimidazólica (36).
E2: Espectro de IV da oxima nitroimidazólica (36).
1
E3: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6/TMS) da oxima nitroimidazólica (36).
E4: Espectro de RMN 13C (400 MHz, DMSO-d6/TMS) da oxima nitroimidazólica (36).
2
E5: Espectro de massas de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4nitrobenzil) oxima (30).
E6: Espectro de IV de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4-nitrobenzil)
oxima (30).
3
E7: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6/TMS) de (E)-1-metil-5-nitro-1Himidazol-2-carbaldeído O-(4-nitrobenzil) oxima (30).
E8: Espectro de RMN 13C (400 MHz, DMSO-d6/TMS) de (E)-1-metil-5-nitro-1Himidazol-2-carbaldeído O-(4-nitrobenzil) oxima (30).
4
E9: Espectro de CG de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4nitrobenzil) oxima (30).
5
E10: Espectro de massas de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4clorobenzil) oxima (31).
E11: Espectro de IV de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4clorobenzil) oxima (31).
6
E12: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6/TMS) de (E)-1-metil-5-nitro-1Himidazol-2-carbaldeído O-(4-clorobenzil) oxima (31).
E13: Espectro de RMN 13C (400 MHz, DMSO-d6/TMS) de (E)-1-metil-5-nitro-1Himidazol-2-carbaldeído O-(4-clorobenzil) oxima (31).
7
E14: Espectro de CG de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4clorobenzil) oxima (31).
8
E15: Espectro de massas de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-benzil
oxima (32).
E16: Espectro de IV de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-benzil oxima
(32).
9
E17: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6/TMS) de (E)-1-metil-5-nitro-1Himidazol-2-carbaldeído O-benzil oxima (32).
E18: Espectro de RMN 13C (400 MHz, DMSO-d6/TMS) de (E)-1-metil-5-nitro-1Himidazol-2-carbaldeído O-benzil oxima (32).
10
E19: Espectro de CG de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-benzil
oxima (32).
11
E20: Espectro de massas de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4fluorobenzil) oxima (33).
E21: Espectro de IV de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4fluorobenzil) oxima (33).
12
E22: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6/TMS) de (E)-1-metil-5-nitro-1Himidazol-2-carbaldeído O-(4-fluorobenzil) oxima (33).
E23: Espectro de RMN 13C (400 MHz, DMSO-d6/TMS) de (E)-1-metil-5-nitro-1Himidazol-2-carbaldeído O-(4-fluorobenzil) oxima (33).
13
E24: Espectro de CG de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4fluorobenzil) oxima (33).
14
E25: Espectro de massas de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4bromobenzil) oxima (34).
E26: Espectro de IV de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4bromobenzil) oxima (34).
15
E27: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6/TMS) de (E)-1-metil-5-nitro-1Himidazol-2-carbaldeído O-(4-bromobenzil) oxima (34).
E28: Espectro de RMN 13C (400 MHz, DMSO-d6/TMS) de (E)-1-metil-5-nitro-1Himidazol-2-carbaldeído O-(4-bromobenzil) oxima (34).
16
E29: Espectro de CG de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4bromobenzil) oxima (34).
17
E30: Espectro de massas de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4metilbenzil) oxima (35).
E31: Espectro de IV de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4metilbenzil) oxima (35).
18
E32: Espectro de RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6/TMS) de (E)-1-metil-5-nitro-1Himidazol-2-carbaldeído O-(4-metilbenzil) oxima (35).
E33: Espectro de RMN 13C (400 MHz, DMSO-d6/TMS) de (E)-1-metil-5-nitro-1Himidazol-2-carbaldeído O-(4-metilbenzil) oxima (35).
19
E34: Espectro de CG de (E)-1-metil-5-nitro-1H-imidazol-2-carbaldeído O-(4metilbenzil) oxima (35).
20