Dissertação de mestrado
1. INTRODUÇÃO
1.1 – O Arroz (Oryza sativa L.)
1.1.1 – Origem e importância do arroz
Diversos historiadores e cientistas apontam o sudeste da Ásia como o
local de origem do arroz (EMBRAPA ARROZ
E
FEIJÃO, 2008). Os dados que
culminaram em tal conclusão foram, inicialmente, publicados por NAKAGAHRA e
HAYASHI, em 1977. Neste trabalho, análises sobre variações nos genótipos de
isoenzimas em variedades nativas de arroz
mostraram que o centro da diversidade
genética encontrava-se na área de Assam, na
Índia, e Yunnan, na China (NAKAGAHRA e
HAYASHI, 1977). A figura ao lado ilustra a
origem e a possível rota de difusão dos
diferentes tipos de arroz presentes na Ásia,
baseado na Teoria Centro do Gene. Porém,
bem antes de qualquer evidência histórica, o
National Institute of Crop Science
(http://www.nics.go.kr/english/eng_index.htm)
arroz foi, provavelmente, o principal alimento e a primeira planta cultivada na Ásia.
As mais antigas referências ao arroz são encontradas na literatura chinesa, há cerca
de 5.000 anos. (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008).
Alguns autores apontam o Brasil como o primeiro país a cultivar esse
cereal no continente americano. Consta que integrantes da expedição de Pedro
Álvares Cabral, após uma peregrinação por cerca de 5 km em solo brasileiro,
traziam consigo amostras de arroz, confirmando registros de Américo Vespúcio que
trazem referência a esse cereal em grandes áreas alagadas do Amazonas. A prática
da rizicultura no Brasil, de forma organizada e racional, aconteceu em meados do
século XVIII e daquela época até a metade do século XIX, o país foi um grande
exportador de arroz (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008).
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Dissertação de mestrado
Atualmente, o arroz constitui uma das mais importantes culturas do
mundo, sendo a fonte primária de alimento para mais da metade da população
mundial. Para tanto, a rizicultura ocupa, anualmente, cerca de 154 milhões de
hectares, o que corresponde a 11% das terras cultivadas no mundo. Mais de 90% de
todo o arroz produzido no mundo é crescido e consumido na Ásia, onde vive 60% da
população do planeta (KHUSH, 2005).
De acordo com as estimativas da Organização das Nações Unidas (ONU),
a população mundial passará de 6 bilhões em 2000 para 8 bilhões em 2025 (KHUSH,
2005). Com o aumento populacional, a produção de arroz deverá aumentar 40% até
2030 para satisfazer a crescente demanda dos países consumidores do grão. Para
que seja alcançado o objetivo de produzir mais arroz, é necessária a obtenção de
variedades com um maior potencial de rendimento e melhor estabilidade do
rendimento. Em prol disso, várias estratégias têm sido empregadas, incluindo
hibridação convencional e procedimentos de seleção, criação de ideotipos, criação
de híbridos, e engenharia genética (KHUSH, 2005).
1.1.2 – O arroz na era da genômica
O início do século XXI marca a era da genômica funcional. Este evento é
devido, principalmente, ao enorme fluxo de informação gerado pela decodificação do
genoma de muitos organismos de vida livre (BERNAL et al., 2001). Haemophilus
influenzae foi o primeiro organismo cujo genoma foi completamente seqüenciado,
em 1995 (FLEISCHMANN et al., 1995). O impressionante progresso nessa área levou
Philip H. Abelson a chamar a genômica – a análise da estrutura do genoma e da
função do gene no contexto do conjunto genético completo de um organismo – de “a
terceira revolução tecnológica” (ABELSON, 1998). Até o início de 2006, o
seqüenciamento dos genomas de 216 organismos já havido sido concluído e
publicado, e outros 965 genomas completos estavam a caminho, sendo 524 de
organismos procariotos e 441 de eucariotos (AGRAWAL e RAKWAL, 2006).
O primeiro “rascunho” da seqüência do genoma do arroz foi anunciado
pela gigante empresa agrícola Monsanto em 2000 (BARRY, 2001). Em 2002, outra
conquista notável foi a conclusão das “seqüências-rascunho” do genoma de dois dos
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principais cultivares de arroz, o cultivar Nipponbare, do tipo japonica (GOFF et al.,
2002) e o cultivar 93-11, do tipo indica (YU et al., 2002).
O completo seqüenciamento do genoma do arroz foi concluído no ano de
2005 (INTERNATIONAL RICE GENOME SEQUENCING PROJECT, 2005), e a partir do
número total de loci expressos e clones de cDNAs inteiros (FL-cDNA) não mapeados
foi estimado que o número de genes de arroz seria de, aproximadamente, 32.000
(RICE ANNOTATION PROJECT, 2007). Entre esses genes, 28.540 são candidatos a
genes que codificam para proteínas. Cerca de 25% (7.189 loci) das potenciais
regiões abertas de leitura (ORFs), tiveram suas funções designadas por buscas
através de BLASTX (RICE ANNOTATION PROJECT, 2007). Porém abordagens
adicionais
são
necessárias
para
a
elucidação
das
funções
dos
genes
remanescentes (NAKAMURA et al., 2007).
Com o intuito de acelerar a identificação e a caracterização dos genes de
arroz com funções até agora desconhecidas, vários recursos têm sido produzidos
(LIN et al., 1998; EBITANI et al., 2005). A infra-estrutura para as análises de
bioinformática em arroz (revisada por SASAKI et al., 2005), incluindo bancos de
dados integrados como RAP-DB (TANAKA et al., 2008; OHYANAGI et al., 2006; RICE
ANNOTATION PROJECT, 2007), TIGR Rice Genome Annotation Database (OUYANG et
al., 2007), BGI-RIS (ZHAO et al., 2004) e MOsDB (KARLOWSKI et al., 2003), tem sido
continuamente desenvolvida e tais ferramentas encontram-se publicamente
disponíveis. Os FL-cDNAs, agrupados em 28.469 clones não-redundantes (RICE
FULL-LENGTH
CDNA
CONSORTIUM, 2003), e o banco de dados de proteômica em
arroz (KOMATSU, 2005) também apresentam grande potencial para promover a
descoberta e a elucidação da função gênica (NAKAMURA et al., 2007).
A
quantidade
de
informação
gerada
a
partir
destes
recursos,
inevitavelmente, levará a um ritmo sem precedentes (e eficiente) na análise e
dedução da função gênica em um curto período de tempo, no nível de transcrito
(transcriptômica: análise paralela da expressão do gene), proteína (proteômica:
análise do polipeptídeo complementar), e metabólito (metabolômica: análise paralela
dos metabólitos primários e secundários), que são os pilares integrais da genômica
funcional (AGRAWAL e RAKWAL, 2006).
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1.2 – Regulação gênica em resposta a estresses ambientais em
plantas
1.2.1 – Estresses abióticos
Estresses abióticos, tais como seca, salinidade, temperaturas extremas,
toxicidade química e estresse oxidativo, desencadeiam uma série de mudanças
moleculares, bioquímicas, fisiológicas e morfológicas que afetam negativamente o
crescimento e a produtividade das plantas (WANG et al., 2001). Por esse motivo, este
tipo de estresse ambiental é considerado grande ameaça para agricultura (GAO et
al., 2007), sendo responsável por reduzir em até 50% os rendimentos anuais
(BOYER, 1982; BRAY et al., 2000). Porém, durante a evolução, as plantas
desenvolveram sofisticados mecanismos para perceber sutis mudanças nas
condições de crescimento e desencadear respostas necessárias para sua
adaptação às diversas condições ambientais (GAO et al., 2007).
Seca, salinidade, temperaturas extremas e estresse oxidativo estão
geralmente interconectados, e devem induzir danos celulares similares. Por
exemplo, seca e/ou salinização são manifestados, inicialmente, como estresse
osmótico, resultando na interrupção da homeostase e da distribuição iônica na célula
(SERRANO et al., 1999; ZHU, 2001a). O estresse oxidativo, que freqüentemente está
associado aos estresses de alta temperatura, salinidade ou seca, deve causar
desnaturação
de
proteínas
funcionais
e
estruturais
(SMIRNOFF,
1998).
Conseqüentemente, esses diversos estresses ambientais ativam vias de sinalização
e respostas celulares similares (SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000; KNIGHT e
KNIGHT, 2001; ZHU, 2001b; ZHU, 2002), tais como a produção de proteínas de
estresse, indução de antioxidantes e acúmulo de solutos compatíveis (VIERLING e
KIMPEL, 1992; ZHU et al., 1997; CUSHMAN e BOHNERT, 2000). A figura 1 ilustra a
complexa resposta da planta ao estresse abiótico, que envolve muitos genes e
mecanismos bioquímicos e moleculares. Os mecanismos de controle molecular da
tolerância ao estresse abiótico são baseados na ativação e regulação de genes
específicos relacionados ao estresse (WANG et al., 2003). Esses genes englobam
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três principais categorias: (1) genes envolvidos nas cascatas de sinalização, tais
como MYC, MAP kinases e SOS kinase (SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 1997;
MUNNIK et al., 1999; ZHU, 2001b), fosfolipases (CHAPMAN, 1998; FRANK et al., 2000),
e fatores de transcrição como HSF, e as famílias CBF/DREB e ABF/ABAE
(STOCHINGER et al., 1997; SCHÖFFL et al., 1998; CHOI et al., 2000; SHINOZAKI e
YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000); (2) genes que funcionam diretamente na proteção de
membranas e proteínas, como proteínas heatshock (HSPs) e chaperonas, proteínas
LEA (late embryogenesis abundant) (VIERLING, 1991; INGRAM e BARTELS, 1996;
THOMASHOW, 1998; THOMASHOW, 1999; BRAY et al., 2000), osmoprotetores, e
removedores de radicais livres (BOHNERT e SHEVELEVA 1998); e (3) genes envolvidos
na absorção e transporte de água e íons, como aquaporinas e transportadores de
íons (MAUREL, 1997; SERRANO et al., 1999; TYERMAN et al., 1999; ZIMMERMANN e
SENTENAC, 1999; BLUMWALD, 2000).
Portanto, para manter o crescimento e a produtividade, as plantas devem
adaptar-se às condições do estresse ativando mecanismos específicos de
tolerância. Dessa forma, a modificação de plantas visando aumentar a tolerância
está baseada, principalmente, na manipulação desses genes, que protegem e
mantêm a função e a estrutura dos componentes celulares (WANG et al., 2003).
1.2.2 – Estresses bióticos
Estresses bióticos podem ser causados por uma vasta gama de potenciais
patógenos. Fungos, bactérias, nematódeos e insetos interceptam os produtos da
fotossíntese produzidos pelas plantas, e os vírus utilizam a maquinaria de replicação
a custo do hospedeiro. Porém ao longo da evolução, as plantas desenvolveram
sofisticados mecanismos para perceber tais ataques, e traduzir essa percepção em
uma resposta adaptativa (DANGL e JONES, 2001).
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Seca
Salinidade
Estresse secundário
Poluentes
químicos
Frio
Calor
Estresse osmótico
Estresse oxidativo
Rompimento da
homeostase iônica e
osmótica; danificação
de proteínas
funcionais e
estruturais e
membranas
Detecção, percepção e
transdução de sinal
Controle da
transcrição
Osmossensores, Enzimas de clivagem de
fosfolipídios, Mensageiros secundários, MAP
kinases, Sensores de Ca2+, Proteínas kinases
dependentes de cálcio.
Fatores de transcrição
(Ex.: CBF/DREB, ABF, HSF, bZIP, MYC/MYB)
Detoxificação
(SOD, PX)
Mecanismos de
resposta a estresse
Função chaperonas
(Hsp, SP1, LEA, COR)
Ativação de genes
Osmoproteção
(prolina, glicinabetaína)
Transporte de água e
íons (aquaporinas e
transportadores de íons)
Re-estabelecimento da homeostase celular,
proteção estrutural e funcional de proteínas e
membranas
Tolerância ao estresse ou Resistência
Figura 1. A complexidade da resposta da planta ao estresse abiótico. Estresses
primários, como seca, salinidade, frio, calor e poluição química, estão normalmente
interconectados, e causam dano celular e estresses secundários, como estresse oxidativo e
osmótico. Os sinais iniciais de estresse (por exemplo, efeitos osmóticos e iônicos, e
mudanças na fluidez da membrana) disparam um processo de sinalização em cadeia e
controles de transcrição que ativam mecanismos de resposta ao estresse a fim de
restabelecer a homeostase e proteger e reparar proteínas e membranas defeituosas. Uma
resposta inadequada a um ou muitos passos na sinalização e ativação do gene deve
resultar em mudanças irreversíveis de homeostase celular e na destruição de proteínas
funcionais e estruturais, e membranas, levando a morte celular. Adaptação de WANG et al.,
2003.
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A percepção envolve a detecção de moléculas do patógeno ou, algumas
vezes, da própria planta ferida. Essas moléculas, chamadas elicitores, são divididas
em dois grupos. O primeiro grupo corresponde aos elicitores intrínsecos do
organismo invasor, tais como os fragmentos de chitina da parede celular de fungos
ou a proteína flagelina que compõem a cauda flagelar de bactérias. Receptores para
esse tipo de elicitores estão presentes na membrana plasmática das plantas. O
segundo grupo corresponde aos produtos, geralmente proteínas, que são
codificadas por genes de avirulência (Avr) do patógeno. Esses produtos podem ser
secretados no espaço intercelular ou injetados diretamente na célula via um sistema
de secreção do tipo-III. Eles são reconhecidos por plantas que expressam o
correspondente gene de resistência a doença (gene R) (PECK, 2003).
Muitos dos mecanismos de defesa são ativados dentro de minutos após a
percepção e funcionam para matar o patógeno ou limitar sua dispersão na planta
(DANGL e JONES, 2001). A morte celular programada no local da invasão é um
mecanismo comum de defesa contra patógenos biotróficos e insetos sugadores, que
dependem de células vivas do hospedeiro para obter nutrientes. No entanto, a morte
celular é um pré-requisito para o crescimento de patógenos necróficos, uma vez que
estes se alimentam de tecidos mortos. É, portanto, essencial que as plantas ativem
a resposta de defesa apropriada de acordo com o tipo de patógeno (SPOEL e DONG,
2008). Nesse contexto, a resistência mediada por ácido salicílico (SA) é efetiva
contra biotrófos, enquanto respostas mediadas por ácido jasmônico (JA) ou etileno
(ET) são predominantemente contra necrótrofos ou insetos herbívoros (GLAZEBROOK,
2005).
De forma intrigante, alguns patógenos são capazes de induzir múltiplas
moléculas sinalizadoras e fitormônios. Em tais casos, a comunicação entre essas
vias de sinalização permite que a planta priorize a resposta de defesa em detrimento
de suas funções celulares normais (SPOEL e DONG, 2008). Como uma estratégia de
virulência, muitos patógenos desenvolveram mecanismos que mimetizam hormônios
e interferem na resposta imune do hospedeiro. As plantas, por sua vez, utilizam a
comunicação das vias como um mecanismo direto de defesa contra a perturbação,
desencadeada pelo patógeno, na sinalização hormonal (SPOEL e DONG, 2008).
Diversos estudos demonstraram que os fitormônios, tais como SA, JA, ET
e ácido abscísico (ABA), que são moléculas endógenas de baixo peso molecular,
participam na resposta contra ambos os estresses ambientais através de ações
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sinérgicas e antagônicas, sugerindo uma comunicação cruzada entre as vias de
sinalização dos estresses bióticos e abióticos (BOSTOCK, 2005; LORENZO e SOLANO,
2005; MAUCH-MANI e MAUCH, 2005). Adicionalmente, diversos resultados de análises
de transcriptoma em larga-escala utilizando a tecnologia de microarray de DNA
suportam, fortemente, a existência de uma comunicação cruzada entre as vias de
sinalização dos estresses bióticos e abióticos (SCHENK et al., 2000; CHEONG et al.,
2002; SEKI et al., 2002; NARUSAKA et al., 2003; DAVLETOVA et al., 2005). Nos dois
tipos de estresse ambiental, conjuntos de genes diferentes, porém sobrepostos, são
regulados. Dessa forma, as elaboradas vias de sinalização, com freqüentes pontos
de intersecção, permitem que as plantas regulem tanto a tolerância a estresses
bióticos quanto a resistência a doenças (FUJITA et al., 2006). A figura 2 ilustra os
pontos de convergência molecular entre as vias de sinalização dos estresses
bióticos e abióticos (FUJITA et al., 2006).
1.3 – Regulação gênica em resposta a estresses ambientais em
arroz
O arroz carrega características únicas de tolerâncias e susceptibilidades a
estresses abióticos quando comparados a outras culturas. O arroz é capaz de tolerar
solos encharcados e submersão em níveis que matariam outras culturas, é
moderadamente tolerante a salinidade e à acidez do solo, mas é altamente sensível
à seca e frio. Muito embora a resposta do arroz ao estresse seja superior à resposta
de outras culturas, contudo, muitos ambientes onde o arroz é cultivado demandam
ainda maiores níveis de tolerância que aqueles encontrados na maioria dos
germoplasmas (LAFITTE et al., 2004). Em regiões tropicais, o arroz é cultivado em
climas de monção, estando sujeito à submersão intermitente, seca e, em regiões
costeiras, salinidade. O arroz também é crescido nos trópicos, durante a estação
seca, onde a adequada irrigação está disponível, e a cultura fica exposta às baixas
temperaturas na germinação e altas temperaturas na época de floração. Nas regiões
temperadas, onde virtualmente todo o arroz é irrigado, a baixa temperatura é o
principal estresse abiótico que afeta a produção (LAFITTE et al., 2004). Já nos solos
não irrigados nos trópicos úmidos, a cultura é afetada pelo déficit de água, acidez do
solo, e deficiência de fósforo, nitrogênio e zinco (WHITE e ZASOSKI, 1999).
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Figura 2. Pontos de convergência nas vias de sinalização dos estresses
bióticos e abióticos. O esquema simplificado ilustra as vias de sinalização
desencadeadas pelos estresses abióticos e bióticos, bem como os pontos de
comunicação entre estas vias. Tal comunicação permite que a planta regule
tanto a tolerância a estresse quanto a resistência a doenças. Figura adaptada de
FUJITA et al., 2006.
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Os conhecimentos acerca de como os genes de arroz respondem às
condições adversas vêm aumentando diariamente. Muitos estudos relataram
mudanças na expressão de genes individuais quando o arroz é desafiado tanto por
estresses bióticos quanto abióticos (LAFITTE et al., 2004). Tais mudanças incluem a
regulação de diversos genes, como MAP kinases (AGRAWAL et al., 2003), genes
DREB (DUBOUZET et al., 2003), proteína-kinase dependente de cálcio (SAIJO et al.,
2001), uma endo-1,3-beta-glucanase (AKIYAMA e PILLAI, 2001), um fator de
elongação da tradução (LI ZI e CHEN SHOU, 1999) e glutathiona redutase (KAMINAKA
et al., 1998). Estudos de transformação demonstraram que alterando a expressão de
diferentes genes de distintas vias a resposta do arroz ao déficit de água e
desidratação pode ser afetada. Tais genes incluem aqueles associados com
diversas funções, tais como absorção de água (aquaporinas) (MARTRE et al., 2002),
sinalização (kinases) (SAIJO et al., 2001; LIU et al., 2003), integridade da membrana
(proteínas LEA) (XU et al., 1996; ROHILA et al., 2002; BABU et al., 2004), e
metabolismo de carboidrato (TPS) (JANG et al., 2003). Adicionalmente, evidências
que se acumularam ao longo da última década mostraram que o arroz, assim como
outras plantas, sintetiza lectina(s) em resposta a situações de estresse como seca,
alta concentração de sal, ferimento, ou tratamento com alguns fitormônios (VAN
DAMME et al., 2008).
1.4 – O gene salT e a proteína SALT
Em 1990, CLAES e colaboradores identificaram e caracterizaram o gene
salT, bem como seu produto, a proteína SALT. Nesta ocasião, a SALT, uma proteína
de 145 resíduos de aminoácidos, ponto isoelétrico (pI) de 5.5 (CLAES et al., 1990), e
peso molecular de 14,5 kDa (CLAES et al., 1990; BRANCO et al., 2004),
foi
caracterizada como uma proteína induzida por estresse salino em arroz (CLAES et
al., 1990). Posteriormente, foi demonstrado que a expressão desta proteína não está
restrita a resposta a estresses ambientais, sugerindo, desta forma, sua participação
num mecanismo global de resposta da planta (DE SOUZA FILHO et al., 2003).
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Evidências bioquímicas demonstraram, ainda, que a proteína SALT exibe
atividade lectina de ligação à mannose. Adicionalmente, foi mostrado que a atividade
lectina é dependente de uma associação não-covalente de dois monômeros de 14,5
kDa (HIRANO et al., 2000; ZHANG et al., 2000). Por se tratar de uma lectina com
apenas um único domínio Jacalina, a proteína SALT pode ser considerada uma
hololectina (lectinas que contém apenas domínios de ligação ao carboidrato), mais
especificamente uma merolectina – lectinas compostas de um único domínio (VAN
DAMME et al., 2008), como mostra a figura 3.
Microarrays de DNA constituem uma das mais poderosas ferramentas
para analisar rapidamente a expressão gênica sob diversas condições ambientais,
bem como em diferentes tecidos de uma planta (SUDO et al., 2008). Com o início dos
projetos de seqüenciamento do arroz, surgiram diversos projetos de microarrays em
arroz e, até 2004, mais de 600 experimentos em 25 condições fisiológicas já haviam
sido realizados (TYAGI et al., 2004).
A proteômica, outra ferramenta de extrema importância, tornou-se uma
metodologia essencial para a análise em larga-escala de proteínas em muitos
campos da biologia de plantas (PANDEY e MANN, 2000). Assim, combinada à
disponibilidade de dados de seqüências do genoma, ela tem aberto enormes
possibilidades para identificar o grupo total de proteínas expressas, assim como
mudanças no perfil de expressão, durante o crescimento e desenvolvimento e em
resposta a estímulos bióticos e abióticos (YANG et al., 2005). Neste contexto,
diversos trabalhos têm se dedicado à construção de proteomas e caracterização
funcional das proteínas expressas em arroz, seja em tecidos, tais como
folha,embrião, endosperma, raiz, caule, broto e calos (KOMATSU et al., 1993; ZHONG
et al., 1997; KOMATSU et al., 1999a,b; TSUGITA et al., 1994; SHEN et al., 2002; IMIN et
al., 2001; KOLLER et al., 2002; TANAKA et al., 2004a), ou em organelas, como
complexo de Golgi, mitocôndria, e outros compartimentos celulares (MIKAMI et al.,
2001; HEAZLEWOOD et al., 2003; TANAKA et al., 2004b).
A expressão do gene salT e o acúmulo da proteína SALT puderam ser
detectados em inúmeros destes trabalhos, tanto naqueles de análise de microarray e
northern blotting, quanto nos de estudos proteômicos e western blotting, que
analisaram diversos cultivares de arroz sob diferentes condições fisiológicas e entre
diferentes tecidos. Sendo assim, a tabela 1 se refere aos trabalhos encontrados,
bem como os estresses e condições de cultivos, onde houve a expressão do gene
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
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Figura 3. Ilustração da lectina SALT e seu domínio Jacalina. O esquema, gerado
através do banco de dados de Domínio Conservado (Conserved Domain Database
(NCBI): MARCHLER-BAUER et al., 2007 – acessado em 2008) ilustra o único domínio
Jacalina presente na lectina SALT, caracterizando-a como uma merolectina de ligação à
mannose da família das Jacalinas.
salT, enquanto a tabela 2 lista os trabalhos, estresses e condições de cultivo onde a
lectina SALT foi encontrada. Juntas, as tabelas 1 e 2 reúnem todos os trabalhos
publicados até 2008 que apontam a expressão do gene salT, bem como o acúmulo
da lectina SALT, quando plantas de arroz são submetidas à diversos tipos de
estresses ambientais, tais como salinidade (sais MS, NaCl, KCl), seca, calor, frio,
metais pesados (arsênico, cobre), baixos níveis de nitrogênio, ferimentos,
fitormônios (ABA, JA, SA e ET), entre outros.
Em estudos acerca da região promotora do gene salT, GARCIA (1993) revelou
a presença de um íntron de 609 pb, nomeado íntron salT, situado entre 1117 pb e
1725 pb. Adicionalmente, foi detectada a presença de elementos de transposição
das famílias Castaway e Stowaway na região 5’ flanqueadora do gene salT.
Somente nove pares de bases separam tais transposons, presentes na região
promotora deste gene (BUREAU e WESSLER, 1994; NELSON et al., 1994; BUREAU et al.,
1996). Desta forma, entre o elemento móvel Stowaway e o íntron salT encontra-se
uma região que compreende 256 pb. A Figura 4 mostra um esquema ilustrativo do
promotor do gene salT.
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Castaway
1
332
Stowaway
695 705
860
Região 256 pb
Íntron salT
1116
1725
Figura 4. Esquema ilustrativo do promotor do gene salT. A região de 256 pb está
compreendida entre 861 pb e 1116 pb e o íntron salT localiza-se entre 1117 pb e 1725
pb. Castaway e Stowaway são elementos de transposição presentes na região
promotora salT.
Uma característica predominante na regulação da transcrição é a ligação de
proteínas regulatórias, os chamados fatores de transcrição, a sítios de ligação ao
DNA conhecidos como sítios de ligação de fatores de transcrição ou elementos
regulatórios. A identificação computacional desses sítios de ligação ao DNA através
da análise de seqüências de DNA em banco de dados tem sido, na última década, a
principal técnica utilizada na elucidação de vias regulatórias da transcrição
(THOMPSON et al., 2003).
Os elementos regulatórios são pequenos motivos conservados de
aproximadamente 5 a 20 nucleotídeos. A detecção desses motivos no promotor não
é precisa, porque estatisticamente espera-se encontrar essas pequenas seqüências
aleatoriamente a cada poucas centenas de pares de bases. Portanto, o principal
problema consiste em distinguir os elementos regulatórios falsos dos verdadeiros
(BLANCHETTE & SINHA, 2001). Comparada aos motivos desconhecidos, a detecção de
motivos conhecidos é mais favorável e consiste no rastreamento de seqüências de
DNA em bancos de dados especializados como TRANSFAC (WINGENDER et al.,
1996) e TFD (GHOSH, 2000), bem como em bancos de dados específicos para
plantas como OSIRIS (MORRIS et al., 2008), PLACE (HIGO et al., 1999) e PlantCARE
(LESCOT et al., 2002).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
13
Dissertação de mestrado
O OSIRIS (http://www.bioinformatics2.wsu.edu/cgi-bin/Osiris/cgi/home.pl),
escolhido para as análises realizadas nesse trabalho, é um banco de dados
integrados de promotores exclusivamente de O. sativa que contém, além de
diversas outras informações, seqüências de promotores, baseadas na anotação do
genoma do arroz, e sítios de ligação para fatores de transcrição já previamente
descritos. Com a integração de diversas ferramentas, o website OSIRIS fornece
uma compreensiva plataforma para análises de promotores, permitindo ao usuário
visualizar sítios de ligação para fatores de transcrição em múltiplos promotores, além
de outros tipos de análises (MORRIS et al., 2008). Portanto, análises in silico têm
demonstrado ser uma alternativa privilegiada de aumentar o conhecimento sobre o
promotor de forma mais rápida e com menores custos, especialmente em plantas
(ROMBAUTS et al., 2003). Nesse sentido, a análise in silico da região promotora do
gene salT torna-se de extrema relevância na elucidação dos possíveis elementos
regulatórios em cis presentes na mesma.
Além disso, outro ponto fundamental no estudo da regulação gênica
consiste em avaliar a influência do íntron do gene salT na regulação da transcrição,
já que vários trabalhos sugerem a participação de íntrons na expressão de genes.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
14
Dissertação de mestrado
Tabela 1. Expressão do gene salT em plantas de arroz em relação às condições e
tempo de estresse, idade, tecido e cultivar utilizado.
Sais MS
NaCl
NaCl +
CaCl2
NaCl +
GA3
KCl
1% de sais MS, 3 dias. Bainha de arroz. Indica cv. Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
1% de sais MS, 3 dias. Raízes de arroz. Indica cv. Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
1% de sais MS, 6 h, 2 dias e 4 dias. Bainha de arroz. Indica cv.
Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
1% de NaCl, 7 dias. Lâmina foliar de plântulas de arroz. Indica cv.
Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
1% de NaCl, 7 dias. Bainha de plântulas de arroz. Indica cv.
Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
100, 125 e 200 mM de NaCl, 24 h. Raízes de plantas com 12 dias.
Indica cv. Taichung Native 1.
MOONS et al., 1997
100, 125 e 200 mM de NaCl, 24 h. Bainha de plantas com 12 dias.
Indica cv. Taichung Native 1.
MOONS et al., 1997
1% de NaCl, 10 dias. Segmentos de 1 cm da base da bainha de
plantas com 14 dias. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1998
1% de NaCl, 10 dias. Folhas jovens, em expansão, de plantas com
14 dias. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1998
1% de NaCl, 3 dias. Folhas completamente expandidas de plantas
com 6 semanas. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1998
1% de NaCl, 3 dias. Folhas jovens de plantas com 3 semanas. cv.
Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1998
0.5% de NaCl, 3 dias. Cultura de células de arroz em suspensão.
Indica cv. Pelita I/I.
GARCIA et al., 1998
0.5% de NaCl, 1 semana. Bainha de plantas com 4 semanas. cv.
Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1998
250 mM de NaCl, 1, 2, 5, 10 e 24 h. Plantas com 2 semanas. cv.
Nipponbare.
RABBANI et al., 2003
150 mM de NaCl, 24 h. Raízes de plantas com 6 a 7 dias. cv. Pokkali
e cv. PB 1.
SAHI et al., 2003
250 mM de NaCl, 2, 4, 8 e 12 h. Cultura de células de arroz em
suspensão. cv. Jinheung.
KIM et al., 2004
140 mM de NaCl, 20 min, 3 h, 24 h. Plantas com 12 dias. Indica cv.
Nona Bokra (salt-tolerant) e IR28 (salt-susceptible).
CHAO et al., 2005
NaCl e CaCl2 (5:1 M), 3 dias. Plantas com 9 a 10 dias antes da iniciar
a formaçao da panícula. Indica cv. IR29.
WALIA et al., 2007
0.5% de NaCl + 1,5 ou 10 μM de GA3, 1 semana. Bainha de plantas
com 4 semanas. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1998
0.5% de NaCl + 5 ou 10 μM GA3, 1 semana. Lâmina foliar de plantas
com 4 semanas. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1998
1% de KCl, 7 dias. Bainha de plântulas. Indica cv. Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
15
Dissertação de mestrado
Tabela 1. (continuação)
Desidratação (ar), 0.5, 1 e 4 h. Raízes. cv. Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
Desidratação (ar), 3.5 h. Bainha. Indica cv. Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
Desidratação (5% de PEG), 3 dias. Bainha. Indica cv.
Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
Desidratação (ar), 3.5 h. Raízes. Indica cv. Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
Desidratação (5% de PEG), 3 dias. Raízes. Indica cv.
Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
Desidratação, 2, 5, 10 e 24 h. Plantas com 2 semanas. cv.
Nipponbare.
RABBANI et al., 2003
Desidratação (15% de PEG), 9 h. Folhas. cv. IRAT109
(resistente a estresse hídrico).
WANG et al., 2007
Choque térmico de 24°C para 37°C, 3 dias. Lâmina foliar. cv.
Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
Choque térmico de 24°C para 37°C, 3.5 h e 3 dias. Bainha, cv.
Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
Choque térmico de 24°C para 37°C, 3.5 h e 3 dias. Raízes. cv.
Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
33°C para 28°C. Grãos de 10 dias após florescimento.
Japonica cv. Nipponbare.
YAMAKAWA et al., 2007
4°C, 1, 2, 5, 10 e 24 h. Plantas com 2 semanas. cv.
Nipponbare.
RABBANI et al., 2003
10°C, 24 h. Brotos de plantas com 8 a 10 dias. Japonica cv.
CT6748-8-CA-17 (tolerante a frio).
CHENG et al., 2007
Escuro
Plantas mantidas no escuro por 3 a 4 dias (senescência
induzida por escuridão). Folhas. Japonica cv. Tainong 67.
LEE et al., 2001
Nitrogênio
(baixo nível)
1,44 mM de NH4NO3 (controle) e 0.24 mM de NH4NO3
(tratamento), 20 min, 1 h e 2 h. Raízes. Indica cv. Minghui 63.
LIAN et al., 2006
Ácido
ascórbico
20 mM de Ácido ascórbico, 3 dias. Plantas com 10 a 14 dias.
cv. Nipponbare.
TOKUNAGA e ESAKA,
2007
Falta de
sacarose
Meio de cultura sem sacarose, 2 dias. Cultura de células de
arroz em suspensão com 5 dias. cv. Tainan 5.
TSENG et al., 1995
Cobre
10 μM, 45 μM e 130 μM de CuCl2, 24–30 h. Plantas com 6-7
semanas. cv. Nipponbare.
SUDO et al., 2008
Seca
Calor
Frio
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
16
Dissertação de mestrado
Tabela 1. (continuação)
Prolina
Prolina (+
NaCl)
Etileno
ABA
1, 5 e 10 de mM prolina, 10 dias. Plantas com 4 dias. cv.
Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1997
50, 100 e 200 mM de prolina, 10 dias. Bainha de plantas com 4
dias. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1997
100 e 200 mM de prolina, 10 dias. Lâmina foliar de plantas com
4 dias. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1997
10 mM de prolina (+ 1% de NaCl), 10 dias. Bainha de plantas
com 4 semanas. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1997
5 mM de prolina (+ 1% de NaCl), 10 dias. Lâmina foliar de
plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1997
1, 5 e 10 mM de prolina (+ 1% de NaCl), 10 dias. Lâmina foliar
de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1997
5 e 10 mM de proline (+ 1% de NaCl), 10 dias. Bainha de
plantas com 4 semanas. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1997
1, 5 e 10 mM de proline (+ 1% de NaCl), 10 dias. Bainha de
plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1997
50, 100 e 200 mM de proline (+ 1% de NaCl), 10 dias. Bainha
de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1997
100 e 200 mM de proline (+ 1% de NaCl), 10 dias. Lâmina foliar
de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1997
1 mM de ethephon (precursor de etileno), 1, 2, 4, 8 e 12 h.
Cultura de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung.
KIM et al., 2004
20 μM de ABA, 3 dias. Bainha. Indica cv. Taichung Native 1.
CLAES et al., 1990
0,4 e 20 μM de ABA, 3 dias. Raízes. Indica cv. Taichung Native
1.
CLAES et al., 1990
3, 9, 10, 20 e 40 μM de ABA, 24 h. Bainha de plantas com 12
dias. Indica cv. Taichung Native 1.
MOONS et al., 1997
3 e 9 μM de ABA, 24 h. Raízes de plantas com 12 dias. Indica
cv. Taichung Taichung Native 1.
MOONS et al., 1997
9 μM de ABA, 4 e 8 h. Raízes de plantsa com 12 dias. Indica
cv. Taichung Native 1.
MOONS et al., 1997
10 μM de ABA, 3 dias. Cultura de células de arroz em
suspensão. Indica cv. Pelita I/I.
GARCIA et al., 1998
10 μM de ABA, 1 semana. Bainha de plantas com 4 semanas.
cv. Taichung Native 1.
GARCIA et al., 1998
100 μM de ABA, 1, 2, 5, 10 e 24 h. Plantas com 2 semanas. cv.
Nipponbare.
RABBANI et al., 2003
0,2 mM de ABA, 2, 4, 8 e 12 h. Folhas e cultura de células de
arroz em suspensão. cv. Jinheung.
KIM et al., 2004
0,05, 0,1 e 0,2 mM de ABA, 4 h. Cultura de células de arroz em
suspensão. cv. Jinheung.
KIM et al., 2004
100 μM de ABA, 24 h. Broto de plantas com 8-10 dias.
Japonica cv. CT6748-8-CA-17 (tolerante a frio).
CHENG et al., 2007
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
17
Dissertação de mestrado
Tabela 1. (continuação)
Ácido jasmônico
Elicitor fúngico
Inoculação com
microrganismo
Condição
Fisiológica
1, 3 e 9 μM de JA, 24 h. Raízes de plantas com 12 dias.
Indica cv. Taichung Native 1.
MOONS et al., 1997
3 e 9 μM de JA, 24 h. Bainha de plantas com 12 dias. Indica
cv. Taichung Native 1.
MOONS et al., 1997
9 μM de JA, 6 e 8 h. Raízes de plantas com 12 dias. Indica
cv. Taichung Native 1.
MOONS et al., 1997
0,2 mM de JA, 0.5, 1 e 2 h. Folhas de plantas com 2
semanas. Japonica cv. Drew.
XIONG et al., 2001
0,25 mM de JA, 2, 4, 8 e 12 h. Folhas e cultura de células de
arroz em suspensão. cv. Jinheung.
KIM et al., 2004
1 μg/mL N-acetilchitooctaose, 2 h. Cultura de células de
arroz em suspensão. cv. Nipponbare.
AKIMOTO-TOMIYAMA et
al., 2003
50 μg/mL de micélio do fungo Magnaporthe grisea race
KJ401 (avirulento ao cultivar Jinheung), 2, 4, 8 e 12 h.
Cultura de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung.
KIM et al., 2004
Pyricularia grisea (fungo), 1, 2, 3 e dias após infecção.
Folhas de plantas com 2 semanas. Japonica cv. Drew.
XIONG et al., 2001
Striga hermonthica (parasita de raiz), 2, 4 e 11 dias após
infecção. Plantas com 21 dias. Japonica cv. IAC 165.
SWARBRICK et al., 2008
Cultura de células de arroz em suspensão, entrando na fase
logarítmica de crescimento. Indica cv. Pelita I/I.
GARCIA et al., 1998
Cultura de células de arroz em suspensão, fase
estacionária. Indica cv. Pelita I/I.
GARCIA et al., 1998
Cultura de células de arroz em suspensão, 3 e 5 dias. Indica
cv. Pelita I/I.
GARCIA et al., 1998
Plantas com 5 dias. cv. Sasanishiki
MATSUMURA et al.,
1999
Anteras de arroz. cv. Hayayuki.
YAMAGUCHI et al., 2004
Pistilos, 0–5 h após polinização. cv. Indica.
LAN et al., 2004
Anteras de arroz. cv. Hayayuki.
YAMAGUCHI et al., 2007
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
18
Dissertação de mestrado
Tabela 2. Acúmulo da proteína SALT em plantas de arroz em relação às condições e
tempo de estresse, idade, tecido e cultivar utilizado.
Sais MS
1% de sais MS, 4 dias. Raízes de plantas com 8 semanas.
Indica, cv. Taichung native 1.
CLAES et al., 1990
175 mM de NaCl, 60 h. Raízes de plantas com 12 dias. Indica
cv. Taichung Native 1.
MOONS et al., 1997
170 mM de NaCl, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias. cvs.
Taichung Native 1, IAC 4440, IAC 201, Pesagro 104, Cica 08,
Metica 01, Norin Mochi, Mogami chicanari, Guarani, Tomeo
Mochi and Araguaia.
DE
SOUZA FILHO et al., 2003
NaCl
KCl
Seca
170 mM de NaCl, 24 h. Bainha. cv. Taichung Native 1.
BRANCO et al., 2004
150 mM de NaCl, 10 h. Raízes de plantas com 20 dias. cv.
Nipponbare.
CHITTETI e PENG, 2007
150 mM de NaCl, 24 h. Raízes de plantas com 20 dias. cv.
Nipponbare.
CHITTETI e PENG, 2007
170 mM de KCl, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias.
DE
SOUZA FILHO et al., 2003
Desidratação, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias.
DE
SOUZA FILHO et al., 2003
Desidratação, 24 h. Bainha. cv. Taichung Native 1.
BRANCO et al., 2004
Desidratação, 2, 4, 5, e 6 dias. Bainha de plantas com 2
semanas. cv. Nipponbare.
ALI e KOMATSU, 2006
Desidratação (300 mM de manitol), 2 dias. Bainha de plantas
com 2 semanas. cv. Nipponbare.
ALI e KOMATSU, 2006
Desidratação, 2 dias. Folhas de plantas com 2 semanas. cv.
Nipponbare.
ALI e KOMATSU, 2006
Calor
42°C, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias.
Arsênico
50 e 100 mM de arsenato de sódio (Na2HAsO4.7H2O), 4 dias.
Raízes de plantas com 2 semanas. cv. Dongjin.
AHSAN et al., 2008
20 e 40 μM de ABA, 60 h. Raízes de plantas com 12 dias.
Indica cv. Taichung Native 1.
MOONS et al., 1997
20 μM de ABA, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias.
ABA
DE
DE
SOUZA FILHO et al., 2003
SOUZA FILHO et al., 2003
100 μM de ABA, 12 h. Raíz e parte aérea de plantas com 2
semanas. cv. Nipponbare.
HASHIMOTO et al., 2004
50 μM de ABA, 48 h. Parte aérea de plantas com 2 semanas.
cv. Nipponbare.
RAKWAL e KOMATSU, 2004
10 μM de ABA, 48 h. Segmentos de raiz de plantas com 12
dias. cv Nipponbare.
KONISHI et al., 2005
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
19
Dissertação de mestrado
Tabela 2. (continuação)
Ácido
jasmônico
10 e 20 μM de JA, 60 h. Raízes de plantas com 12
dias. cv. Taichung Native 1.
MOONS et al., 1997
250 mM de JA, 24 e 48 h. Cultura de células de arroz
em suspensão. cv. Jinheung.
KIM et al., 2003
100 μM de JA, 3 dias. Raízes de plantas com 20 dias.
Indica cv. IR36.
MICHÉ et al., 2006
100 μM de JA, 3 dias. Raízes de plantas com 20 dias.
Indica cv. IR42.
MICHÉ et al., 2006
Ferimento (vários pontos de lesão mecânica ao longo
da lâmina foliar e bainha), 24 h. Bainha de plantas com
14 dias.
Ferimento
Elicitor
fúngico
SOUZA FILHO et al., 2003
Ferimento (lesão mecânica na parte aérea da planta),
12, 24 e 48 h. Parte aérea de plantas com 2 semanas.
cv. Nipponbare.
SHEN et al., 2003
50 mg/mL de micélio de Magnaporthe grisea, cepa
KJ401 (avirulenta ao cv. Jinheung), 24 e 48 h. Cultura
de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung.
KIM et al., 2003
Magnaporthe grisea cepa 70-15 (fungo), 48 h.
Plântulas de arroz. cv. Nipponbare.
KIM et al., 2001
Magnaporthe grisea cepa KJ401 (fungo), 24 e 48 h
após infecção. Cultura de células de aroz em
suspensão. cv. Jinheung.
KIM et al., 2003
Magnaporthe grisea cepa KJ401 (fungo), 48 h após
infecção. Inoculação de tecido vascular de folhas. cv.
Jinheung.
KIM et al., 2004
Inoculação
com
Rice yellow mottle virus (RYMV), 7 dias após infecção.
microrganismo Cultura de células de arroz em suspensão. Indica cv.
IR64 (susceptível a RYMV).
Condição
Fisiológica
DE
VENTELON-DEBOUT et al., 2004
Azoarcus sp. cepa BH72 (BHGN3.1). Inoculação
bacteriana em raízes de plantas com 20 dias. Indica cv.
IR36 (susceptível).
MICHÉ et al., 2006
Azoarcus sp. strain BH72 (BHGN3.1). Bacterial
inoculation of 20-day-old rice roots. Indica cv. IR42
(moderately resistant).
MICHÉ et al., 2006
Parte aérea com 3 cm de comprimento (bainha e folha)
de plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare.
SHEN et al., 2002
Sementes com 7, 12, 18, 24 e 35 dias após
florescimento.
DE
SOUZA FILHO et al., 2003
Parte aérea de plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare
KOMATSU et al., 2003
Sementes com 0, 12, 24, 48 e 72 h após inibição da
germinação. Indica cv. 9311.
YANG et al., 2007
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
20
Dissertação de mestrado
1.5 – A influência de íntrons na regulação da expressão gênica
A habilidade de íntrons em aumentar a expressão de genes tem sido bem
documentada em vários organismos, incluindo mamíferos (BUCHMAN e BERG, 1988;
CHUNG e PERRY, 1989), insetos (MEREDITH e STORRI, 1993), nematóides (OKKEMA et
al., 1993) e plantas (CALLIS et al., 1987; LUEHRSEN e WALBOT, 1991; ROSE e LAST,
1997). Esse efeito é conhecido como aumento da expressão de genes mediado por
íntron (IME, do inglês “intron-mediated enhancement”) (MASCARENHAS et al., 1990).
Em plantas, estima-se que cerca de 80% dos genes nucleares contém
íntrons (GOODALL et al., 1991; INITIATIVE et al., 2000; REDDY, 2001), e já foi mostrado
que diversos deles aumentam a expressão gênica (SAMADDER et al., 2008). A
eficiência do IME difere em espécies de monocotiledôneas e dicotiledôneas (KOZIEL
et al., 1996). Sabe-se que íntrons que estimulam a expressão em monocotiledôneas
incluem os íntrons dos genes de milho Adh1, Sh1, Bz1, Hsp82, actina e GapA1
(CALLIS et al., 1987; LUEHRSEN e WALBOT, 1991; MAAS et al., 1991; SINIBALDI e
METTLER, 1992; DONATH et al., 1995) e de arroz salT, Act1 e tpi (MCELROY et al.,
1990; XU et al., 1994; RETHMEIER et al., 1997). Similarmente, íntrons de
dicotiledôneas que elevam a expressão incluem os íntrons dos genes SSU301 de
petúnia rbcS (DEAN et al., 1989), ST-LS1 de batata (LEON et al., 1991) e os genes de
Arabidopsis UBQ3, UBQ10, PAT1, atpk1, A1 EF-1α, e At eEF-1β (CURIE et al., 1993;
NORRIS et al., 1993; ZHANG et al., 1994; GIDEKEL et al., 1996; ROSE e LAST, 1997). A
intensidade do IME pode ser maior que 100 vezes (MAAS et al., 1991; ZHANG et al.,
1994), porém é mais comum na faixa entre 2 e 10 vezes e é tipicamente maior em
monocotiledôneas que em dicotiledôneas (SIMPSON e FILIPOWICZ, 1996; ROSE e
BELIAKOFF, 2000; CLANCY e HANNAH, 2002; ROSE, 2002). Em plantas, a inclusão de
um ou mais íntrons em construções genéticas, geralmente, acarreta o aumento do
acúmulo de mRNA e proteínas comparado a construções similares onde faltam
íntrons (KOZIEL et al., 1996; SIMPSON e FILIPOWICZ, 1996).
Estudos em células animais revelaram que o aumento mediado por íntron
é alcançado através de um mecanismo combinatório que aumenta a transcrição, o
acúmulo de mRNA e a tradução (FURGER et al., 2002; NOTT et al., 2003, 2004) mas
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
21
Dissertação de mestrado
que, por outro lado, não afeta substancialmente a estabilidade do mRNA (NOTT et
al., 2003; SAMADDER et al., 2008). Sabe-se que o IME é dependente tanto da posição
quanto da seqüência do íntron (BOURDON et al., 2001; CLANCY e HANNAH, 2002;
ROSE, 2002, 2004), porém, muito pouco é conhecido sobre o mecanismo de tal
aumento, e diferentes íntrons devem afetar a expressão por diferentes maneiras
(ROSE e BELIAKOFF, 2000).
Evidências sugerem que os íntrons atuam pós-transcricionalmente,
aumentando o nível de mRNA por facilitar a maturação e aumentar a estabilidade de
transcritos nascentes (ROSE, 2004). Uma sugestão para essa função póstranscricional é provido pelos achados que os íntrons devem estar contidos dentro
de seqüências transcritas e na orientação apropriada para elevar a expressão do
gene (CALLIS et al., 1987; MASCARENHAS et al., 1990; CLANCY et al., 1994; DONATH et
al., 1995; DEAN et al., 1989; ROSE e LAST, 1997), diferentemente dos enhancers
transcricionais, que geralmente são independentes de posição e orientação (CALLIS
et al., 1987; MASCARENHAS et al., 1990; SNOWDEN et al., 1996).
Alguns trabalhos sugerem que o IME requer o splicing do íntron, porém,
esta ainda é uma questão a ser esclarecida (SINIBALDI e METTLER, 1992; SULLIVAN e
GREEN, 1993; LUEHRSEN e WALBOT, 1994; ROSE e BELIAKOFF, 2000). Outros autores
tentam explicar o mecanismo de IME avaliando características necessárias ao
íntron. Desta forma, a partir de deleções feitas em sua seqüência, foi visto que a
maioria das seqüências dos íntrons é dispensável para o IME (CLANCY et al., 1994;
LUEHRSEN e WALBOT, 1994; ROSE e BELIAKOFF, 2000). Percebe-se assim, que são
inúmeros os trabalhos que sugerem, de alguma forma, uma importante participação
de íntrons na regulação da expressão gênica. Portanto, para uma avaliação mais
acurada acerca da regulação do gene salT, torna-se interessante analisar o grau de
influência que íntron salT exerce sobre a atividade do promotor do gene salT. Para
tanto, faz-se necessário uma comparação entre os níveis de expressão
apresentados pelo íntron salT e por outro íntron cuja capacidade de aumentar a
expressão já foi amplamente caracterizado na literatura, como o íntron Act1 de
arroz.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
22
Dissertação de mestrado
2. OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo geral caracterizar funcionalmente
a região regulatória e estudar a influência do íntron salT na regulação do gene salT
de arroz (Oryza sativa L.). Para tanto, foram concluídos os seguintes objetivos
específicos:
2.1 – Estudo da influência dos elementos de transposição Castaway e Stowaway
sobre a atividade do promotor do gene salT de O. sativa. Foram determinados quais
os cultivares possuíam tais inserções, e o nível de indução do gene salT na bainha
destes cultivares foi mensurado através de ensaios de PCR em Tempo Real.
Adicionalmente, foi avaliado o perfil de acúmulo da proteína SALT nos diferentes
cultivares através de western blotting.
2.2 – Identificação de sítios de ligação para fatores de transcrição presentes na
região de 256 pb do promotor do gene salT através de análises in silico no banco de
dados de promotores de arroz OSIRIS.
2.3 – Construção de três vetores de expressão em plantas induzidos por estresses
ambientais contendo as fragmentos “Região de 256 pb”, “Região de 256 pb + Íntron
salT” e “Região de 256 pb + Íntron Act1”.
2.4 – Estudo da influência do íntron salT sobre a atividade promotora da região de
256 pb através da análise de expressão transiente do gene GUS em tecido foliar de
Arabidopsis thaliana.
2.5 – Análise do perfil transcricional do gene salT em diferentes tecidos de O. sativa
através de ensaios de microarrays desenvolvidos pelo banco de expressão da
Universidade de Yale. O perfil transcricional do gene salT em tecidos e tipos
celulares de embrião, broto, lâmina foliar e raiz foi avaliado por Northern eletrônico.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
23
Dissertação de mestrado
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – Materiais Utilizados
- Para obtenção da seqüência completa do gene salT de arroz foi utilizado o banco
internacional de seqüências NCBI (National Center for Biotechnology Information,
www.ncbi.nlm.nih.org). Para a demonstração do domínio Jacalina, foi utilizado o
Banco de Dados de Domínios Conservados do NCBI (Conserved Domain Database,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml). A identificação de sítios de
ligação de fatores de transcrição foi realizada utilizando o banco de dados OSIRIS
(http://www.bioinformatics2.wsu.edu/cgi-bin/Osiris/cgi/home.pl)
e
o
perfil
transcricional do gene salT foi analisado em diversos tecidos e tipos celulares de
arroz através do Centro Virtual da Universidade de Yale para o Perfil de Expressão
Celular em Arroz (Yale Virtual Center for Cellular Expression Profiling of Rice Yale
Project, http://bioinformatics.med.yale.edu/riceatlas/overview.jspx);
- As plantas de arroz (O. sativa) utilizadas nos ensaios de extração de DNA
genômico, RNA e proteína, foram germinadas e cultivadas na casa de vegetação do
Laboratório de Biotecnologia (CBB/UENF). Foram utilizadas sementes dos cultivares
Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native
1 (TN1). Todas as sementes foram gentilmente cedidas pelo Centro Nacional de
Pesquisa Arroz e Feijão – EMBRAPA (Goiânia, GO, Brasil);
- As plantas de Arabidopsis thaliana L. (Heyn), ecótipo Wassilewskija, utilizadas nos
ensaios de expressão transiente do gene GUS foram germinadas e cultivadas em
câmara de cultivo no Laboratório de Biotecnologia (CBB/UENF). As sementes
utilizadas foram obtidas em colaboração com INRA-Versailles (França);
- A bactéria Escherichia coli linhagem DH5α foi utilizada nos trabalhos de
transformação e clonagem dos fragmentos de DNA;
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
24
Dissertação de mestrado
- A bactéria Agrobacterium tumefaciens linhagem LBA 4440 foi utilizada nos ensaios
de eletroporação e transformação transiente de tecido foliar de Arabidopsis thaliana;
- Vetor utilizado como base para a construção dos vetores de expressão foi o
plasmídeo pA19-GUS, gentilmente cedido pelo Dr. Gilberto Sachetto Martins, do
Laboratório de Genética Molecular Vegetal – Departamento de Genética, Instituto de
Biologia, Centro de Ciências e Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro
(UFRJ).
3.2 – Metodologia
3.2.1 – Avaliação dos elementos de transposição Castaway e Stowaway sobre
a atividade do promotor do gene salT de O. sativa
3.2.1.1 – Detecção dos transposons Castaway e Stowaway na região do gene salT em
diferentes cultivares de arroz através de amplificação por PCR
3.2.1.1.1 – Cultivo das plantas de arroz e realização do estresse
Sementes de arroz dos cultivares Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440,
Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 foram germinadas e cultivadas em
substrato embebido em solução nutritiva pH 5,8 (YOSHIDA, 1976). A germinação e o
crescimento das plantas ocorreram a 27°C, com fotoperíodo de 16 h de luz e 8 h no
escuro, durante 21 dias. As plantas de arroz, utilizadas para a extração de RNA total
e proteínas, foram transferidas, e permaneceram por 24 h, em potes de vidro
contendo 100 mL da solução nutritiva acrescida, ou não, do agente estressante,
NaCl 1% (170 mM).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
25
Dissertação de mestrado
3.2.1.1.2 – Extração de DNA genômico de plantas de arroz
Folhas de arroz dos cultivares Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 foram maceradas em nitrogênio líquido.
Em seguida, aproximadamente 0,1 g dos materiais foi transferido para um tubo de
microcentrífuga, onde foi adicionado 1 mL do tampão de extração (100 mM NaCl; 10
mM Tris-HCl pH 7.5; 1 mM EDTA pH 8.0; 1% SDS). Após, as amostras foram
agitadas vigorosamente e centrifugadas por 2 min a 12.000 x g. As fases aquosas
(sobrenadantes) foram coletadas, divididas em dois tubos e a cada um foi
adicionado igual volume de fenol:clorofórmio, seguido de agitação. Os tubos foram
centrifugados por 5 minutos a 10.000 x g e a fase aquosa de cada tubo foi
transferida para outro tubo, no qual foi adicionado 0,1 volume de acetato de sódio
pH 5,2 3 M. As amostras foram misturadas por inversão e, imediatamente após, a
cada tubo foram adicionados 2 volumes de etanol absoluto gelado (ou 1 volume de
isopropanol). Depois de misturados por inversão, os tubos foram incubados por 1 h à
-20°C ou 30 min à -70°C e então centrifugados por 10 min a 12.000 x g. Os
sobrenadantes foram descartados, os sedimentos lavados duas vezes com etanol
70% gelado e, em seguida, os tubos foram centrifugados por 2 min a 12.000 x g. Os
sobrenadantes foram descartados e os sedimentos de DNA secos em estufa a 37°C.
Após secos, os materiais foram ressuspensos em 200 µL de TE-RNAse e incubados
por 1 h a 37°C. As amostras obtidas foram quantificadas usando o sistema Qubit™
(Invitrogen), segundo recomendação do fabricante.
3.2.1.1.3 – Ensaios de amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR)
Os ensaios de amplificação por PCR foram utilizados na amplificação de
fragmentos correspondentes ao promotor salT inteiro e à região de 256 pb,
adicionada do íntron ou não, com a finalidade de detectar em quais cultivares havia
a presença dos elementos de transposição na região promotora do gene salT.
Adicionalmente, a técnica de PCR foi utilizada para a obtenção dos fragmentos
utilizados na construção dos vetores de expressão.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
26
Dissertação de mestrado
Desta forma, para o ensaio de PCR foram utilizados 20 ng de DNA
genômico, tampão para enzima Taq DNA Polimerase (10 mM de Tris-HCl pH 9,0 e
50 mM de KCl), 1,5 mM de cloreto de magnésio, 0,4 mM de dNTP, 20 pmoles de
cada oligonucleotídeo seguindo a combinação descrita na tabela 3, 1U de Taq DNA
Polimerase e água ultra pura q.s.p. 25 µL. As condições de amplificação foram: 95°C
por 1 min, 42°C por 1 min e 72°C por 90 seg (1 ciclo) e 95°C por 1 min, 55°C por 1
min e 72°C por 90 seg (39 ciclos). A combinação de primers utilizado em cada
reação está indicada na tabela 3.
Para facilitar a clonagem dos fragmentos obtidos por PCR no vetor pA19GUS digerido, foram desenhados iniciadores contendo sítios para enzimas de
restrição. A tabela 4 mostra a seqüência dos iniciadores, e o destaque em azul
corresponde ao sítio de restrição. O iniciador “Gus 5’ Rev” foi utilizado apenas nas
reações de amplificação para a confirmação da clonagem dos insertos nos vetores.
Tal iniciador anela na extremidade 5’ do gene repórter GUS e, dessa forma, o
fragmento amplificado confirma a clonagem do inserto na porção 5’ do gene GUS. A
figura 5 ilustra o local de anelamento e a direção de cada primer no promotor do
gene salT.
Tabela 3. Combinações de primers utilizados nos ensaios de PCR.
Sítios de
Restrição
Fragmento
Par de primers utilizados no PCR
Promotor salT
inteiro
Bea 01 e Bea 04 Bam
----
Região de 256 pb
Pro 250 Eco e Bea 02 Bam
EcoRI e BamHI
Região de 256 pb
Pro 250 Eco e Bea 02 Xho
EcoRI e XhoI
Região de 256 pb
+ íntron salT
Pro 250 Eco e Bea 04 Bam
EcoRI e BamHI
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
27
Dissertação de mestrado
Tabela 4. Seqüência dos iniciadores contendo sítios de enzimas de restrição.
Primer
Seqüência de nucleotídeos
Enzimas
Bea 01
5’ – GAA GAT CTG TAA CGC GTG GTC TTT C – 3’
-
Bea 02 Bam
5’ – CGG GAT CCA CTC TTC GTG GTC GCT TAA AT – 3’
BamHI
Bea 02 Xho
5’ – CCG CTC GAG ACT CTT CGT GGT CGC TTA AAT – 3’
XhoI
Bea 04 Bam
5’ – CGG GAT CCA CTC TGT TTA GTA AAT AC – 3’
BamHI
Pro 250 Eco
5’ – GGA ATT CTA GAG TAG CAT CAC CAG CT – 3’
EcoRI
Gus 5’ Rev
5’ – GAT TTC ACG GGT TGG GGT TTC TA – 3’
-
Castaway
1
332
Bea 01
Região 256 pb
Stowaway
695 705
860
Pro 250
Íntron salT
1116
1725
Bea 02
Bea 04
Figura 5. Local de anelamento e direção de cada primer no promotor do gene salT. O
esquema ilustrativo mostra a região de anelamento de cada primer utilizado. A combinação
de primers Bea 01 / Bea 04 amplifica o promotor salT inteiro, a combinação Pro 250 / Bea
02 amplifica a Região de 256 pb, e o par Pro 250 / Bea 04 amplifica a Região de 256 pb +
Íntron salT.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
28
Dissertação de mestrado
3.2.1.2 – Análise do nível de indução do gene salT em cultivares de O. sativa expostos
ao estresse salino através de RT-PCR e western blotting
3.2.1.2.1 – Obtenção de RNA total de bainhas de plantas de arroz para
ensaios de RT-PCR
Bainhas de plantas normais e estressadas (NaCl 1%) dos cultivares
Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1
foram maceradas em nitrogênio líquido e as amostras foram utilizadas para extração
de RNA total. Para tanto, 300 mg de tecido foram utilizados para extração de RNA
com o reagente Trizol (Invitrogen), de acordo com as recomendações do fabricante.
As amostras obtidas foram quantificadas usando o sistema Qubit™ (Invitrogen),
segundo recomendação do fabricante.
3.2.1.2.2 – Síntese de cDNA e ensaio de RT-PCR
Para síntese de cDNA foram utilizados 1 μg de RNA total, 100 pmoles de
poli-T e 250U da enzima SuperScript III (Invitrogen). A reação ocorreu à 50ºC
durante 1 h.
Ensaios de RT-PCR foram realizados utilizando o kit Power SYBR Green
(Applied Biosystems), 3 pmoles de cada oligonucleotídeo, 1 ng de cDNA (obtidos a
partir do RNA total) e 7 μg de BSA (New England Biolabs) em um volume final de 10
μL. As reações foram realizadas em capilares na máquina LightCycler 1.0 (Roche).
Em tais ensaios foram analisado a expressão dos seguintes genes: salT
(SalT-Fw: 5’ – CAG ATC CAT TGC CTT CAA CT – 3’ e SalT-Rev: 5’ – AGA TCA
TAG ACT GGG CCA TG – 3’) e 18S (Rice18s-Fw: 5’ – ATG ATA ACT CGA CGG
ATC GC – 3’ e Rice18s-Rev: 5’ – CTT GGA TGT GGT AGC CGT TT – 3’). O gene
18S foi utilizado como controle interno para normalização da quantidade de amostra
utilizada em cada reação. Os ensaios de RT-PCR foram realizados em dupicada.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
29
Dissertação de mestrado
3.2.1.2.3 – Obtenção de extrato protéico de bainhas de plantas de arroz
Bainhas de plantas normais e estressadas (NaCl 1%) dos cultivares Cica
8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1
foram maceradas, inicialmente, em nitrogênio líquido e logo depois maceradas
novamente com 500 μL de solução PBS 1x pH 7,2 (0,13 M NaCl; 5 mM Na2HPO4) e
0,1 mM PMSF. As amostras foram transferidas para tubos de microcentrífuga e
centrifugadas a 12000 x g por 10 min. Os sobrenadantes foram transferidos para
novos tubos e estocados a -20°C. As amostras obtidas foram quantificadas usando o
sistema Qubit™ (Invitrogen), segundo recomendação do fabricante.
3.2.1.2.4 – Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-glicina
Os extratos protéicos foram separados em SDS-PAGE 12,5% (LAEMMLI,
1970). A eletroforese ocorreu durante 2 h a 100 V em 12,5% SDS-PAGE. Os géis
obtidos foram corados pelo método de Azul de Commassie. Para a remoção do
corante não ligado à proteína, os géis foram incubados em solução descorante sob
agitação constante.
3.2.1.2.5 – Ensaios de western blotting
Os extratos protéicos foram separados em SDS-PAGE 12,5% (LAEMMLI,
1970). Em seguida, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose,
que foi então bloqueada durante 1 h em tampão TS-20 (10 mM Tris-HCl pH 7,4; 150
mM NaCl; 0,05% Tween-20), contendo 0,3% de leite desnatado, sob agitação. Após
3 lavagens de 5 min com TS-20, a membrana foi incubada durante 1 h em tampão
TS-20, contendo 0,1% de leite desnatado e o anticorpo anti-SALT, na diluição 1:500.
Em seguida, a membrana foi novamente lavada 3 vezes, por 5 min, em TS-20. A
membrana foi incubada durante 2 h em tampão TS-20 contendo 0,1% de leite
desnatado e o anticorpo secundário, anti-coelho IgG conjugado à proteína A
peroxidase, na diluição 1:2000. Após 3 lavagens de 5 min, com a solução TS-20, o
ensaio foi revelado através da incubação da membrana com o tampão de revelação
por DAB (6,5 mL ácido acético 0,1 M; 7,9 mL Na2HPO4 0,2 M; 5,0 mL H2O2 30v
(30% v/v); H2O q.s.p. 25 mL; OPD (orto-fenil-diamina) 10 mg). O anticorpo anti-SALT
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
30
Dissertação de mestrado
foi produzido no Laboratório de Biotecnologia do Centro de Biociências e
Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro pelo
aluno Marcos Vinícius Viana de Oliveira.
3.2.1.3 – Identificação de sítios regulatórios presentes na Região de 256 pb do
promotor do gene salT através de análises in silico
O locus correspondente ao gene salT de arroz foi submetido às análises
de visualização de elementos em cis do banco de dados de promotores de arroz
OSIRIS. As regiões para ligação de proteínas regulatórias identificadas dentro da
região de 256 pb do promotor salT foram avaliadas, uma a uma, e as informações
obtidas foram organizadas em uma tabela.
3.2.2 – Avaliação da influência do íntron salT na regulação do gene salT
3.2.2.1 – Construção de vetores de expressão em plantas
3.2.2.1.1 – Cultivo das plantas de arroz.
Metodologia descrita no item 3.2.1.1.1.
3.2.2.1.2 – Extração de DNA genômico de plantas de arroz
Ensaios descritos no item 3.2.1.1.2.
3.2.2.1.3 – Ensaios de amplificação dos fragmentos de interesse por PCR
Ensaios descritos no item 3.2.1.1.3.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
31
Dissertação de mestrado
3.2.2.1.4 – Restrição enzimática dos fragmentos obtidos por PCR com as
enzimas EcoRI + BamHI e EcoRI + XhoI
Os três fragmentos amplificados nas reações de PCR foram digeridos com
as enzimas de restrição específicas para abrir os sítios de restrição e permitir a
clonagem dos mesmos em seus vetores correspondentes. Sendo assim, os
fragmentos obtidos foram digeridos com as seguintes enzimas: (1) Região de 256
pb – EcoRI e BamHI; (2) Região de 256 pb – EcoRI e XhoI; (3) Região de 256 pb +
Íntron SalT – EcoRI e BamHI. Para reação de digestão dos fragmentos foram
utilizados aproximadamente 300 ng de DNA para 2,5U de cada enzima de restrição,
tampão da enzima para uma concentração final de 1X (33 mM Tris-acetato pH 7,9;
10 mM acetato de magnésio; 66 mM acetato de potássio; 0,1 mg/mL BSA) e água
ultra pura para um volume final de 80 µL. As amostras foram misturadas com auxílio
de uma micropipeta e incubadas em banho à 37ºC durante 1 h.
3.2.2.1.5 – Extração do plasmídeo PA19-GUS de bactérias Escherichia
coli DH5α
Uma colônia isolada de uma placa foi inoculada em 10 mL de meio LB (5 g
de extrato de levedura; 10 g de NaCl; 10 g de triptona; q.s.p. 1 L de água) contendo
50 μg/mL de ampicilina e mantida sob agitação durante 16 h à 37°C. Transcorrido
esse período as células foram coletadas através de centrifugação. O material foi
ressuspenso em 200 μL solução I gelada (50 mM de glicose; 25 mM de Tris-HCl pH
8,0; 10 mM de EDTA pH 8,0) e transferido para um tubo de microcentrífuga. Em
seguida, para lise das células, 400 μL de solução II (0,2 N de NaOH e 1% de SDS)
foram adicionados à amostra e a mesma foi agitada gentilmente por 30 segundos.
Posteriormente, foram adicionados 300 μL de solução III gelada (acetato de potássio
3 M pH 5,2) ao tubo. A amostra foi homogeneizada e incubada em gelo durante 5
min. O material foi centrifugado a 12.000 x g durante 15 min e 600 µL do
sobrenadante transferido para um tubo novo. A esse foram acrescentados 600 μL de
fenol:clorofórmio (1:1), agitado vigorosamente e centrifugado a 12.000 x g durante 2
min. A fase superior foi coletada e o DNA precipitado com igual volume de
isopropanol durante 10 min a temperatura ambiente. O material foi centrifugado a
12.000 x g por 5 min, o sobrenadante descartado e o sedimento lavado com etanol
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
32
Dissertação de mestrado
70%. A amostra foi novamente submetida à centrifugação a 12.000 x g durante 3
min e a fase líquida descartada. Em seguida o DNA foi seco em estufa a 37°C,
ressuspenso em TE-RNase e incubado a 37°C por 1 h. Após esse período a
amostra foi armazenada a -20°C.
3.2.2.1.6 – Restrição enzimática do vetor pA19-GUS com as enzimas
EcoRI + BamHI e EcoRI + XhoI
Para as reações de digestão do plasmídeo pA19-GUS foram utilizados
aproximadamente 300 ng de DNA para 2,5U de cada enzima de restrição, tampão
da enzima (33 mM Tris-acetato pH 7,9; 10 mM acetato de magnésio; 66 mM acetato
de potássio; 0,1 mg/mL BSA) e água ultra pura para um volume final de 80 µL.
O plasmídeo foi digerido com combinações distintas de enzimas de
restrição. Na primeira combinação, o DNA foi tratado simultaneamente com as
enzimas EcoRI e BamHI. Utilizando essa combinação o promotor CaMV 35S e o
íntron Act1 foram liberados, dando origem ao plasmídeo pA19-GUS-1. Na segunda
abordagem, somente o promotor CaMV 35S foi retirado do plasmídeo pA19-GUS, e
para tal, o DNA plasmidial foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e XhoI,
dando origem ao plasmídeo PA19-GUS-2. As amostras foram misturadas com
auxílio de uma micropipeta e incubadas em banho à 37ºC durante 1 h.
3.2.2.1.7 – Ligação dos fragmentos ao vetor de clonagem
Para reação de ligação foi utilizado o vetor de clonagem pA19-GUS
tratado previamente com enzimas de restrição visando produzir extremidades
compatíveis com os insertos, conforme descrito anteriormente. Dessa forma, foram
feitos três ensaios de ligação: (1) Região de 256 pb EcoRI/BamHI + pA19-GUS
EcoRI/BamHI, (2) Região de 256 pb com íntron salT EcoRI/BamHI + pA19-GUS
EcoRI/BamHI e (3) Região de 256 pb EcoRI/XhoI + pA19-GUS EcoRI/XhoI. O ensaio
foi realizado utilizando a proporção de 1:3 de plasmídeo e fragmento a ser inserido,
tampão de reação da enzima T4 DNA Ligase para uma concentração final de 1X
(300 mM Tris-Hcl pH 7,8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT e 10 mM ATP) e 3U da
enzima T4 DNA Ligase. O volume da reação foi ajustado para 10 µL com água ultra
pura e a amostra incubada por 16 h à 16ºC.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
33
Dissertação de mestrado
3.2.2.1.8 – Produção de células competentes de E. Coli DH5α utilizando
cloreto de rubídio
Uma colônia de bactéria isolada de uma placa recente de LB foi inoculada
em 10 mL de meio SOB líquido sem antibiótico (20 g/L de triptona; 5 g/L de extrato
de levedura; 0,585 g/L de NaCl; 0,186 g/L de KCl. Corrigir o pH para 7,0 com KOH).
A cultura foi incubada por 16 h à 37°C sob agitação moderada (250 x g). Após este
período, 1 mL desta cultura foi transferido para 100 mL de meio SOB líquido fresco e
incubado à 37°C sob agitação moderada (250 x g) até atingir densidade celular de
aproximadamente 5 x 107 células/mL (DO600 nm para bactéria DH5α de 0,45 – 0,55
Abs). Após atingir a densidade desejada, a cultura foi transferida para dois tubos de
centrífuga com volume de 50 mL e resfriado por 10 min em gelo. Os tubos foram
centrifugados à 1.500 x g durante 10 min à 4°C e o sobrenadante descartado.
Posteriormente, em cada tubo foi acrescentado 16 mL de solução RF1 gelada (30
mM de acetato de potássio; 100 mM de cloreto de rubídio; 50 mM de cloreto de
manganês; 100 mM de cloreto de cálcio; 15% de glicerol (m/v). Ajustar o pH para 5,8
com ácido acético 0,2 M e esterilizar com filtro de 0,22 µm). A amostra foi agitada
gentilmente à 4ºC até total e uniforme ressuspensão do precipitado. Os tubos foram
novamente centrifugados a 1.500 x g por 10 minutos à 4°C e o sobrenadante
descartado. As células foram ressupensas lentamente em 4 mL de solução RF2 (10
mM de MOPS (3-[N-morpholino] propane-sulfonic acid), 10 mM de cloreto de
rubídio, 75 mM de cloreto de cálcio e 15% de glicerol (m/v). Ajustar o pH para 6,8
com NaOH 2 N e esterilizar com filtro de 0,22 µm) à 4°C até obter-se uma aparência
homogênea. Os tubos foram deixados em gelo por 15 min e alíquotas de 200 µL
foram distribuídas em tubos de 1,5 mL, congeladas em nitrogênio líquido e
armazenadas à -70°C. Todo o processo foi conduzido em condições estéreis.
3.2.2.1.9 – Transformação de E. coli linhagem DH5α
Tubos contendo alíquotas de 200 µL de E. coli DH5α competentes,
armazenadas em freezer à -70ºC, foram mantidas em gelo por 10 min. Em seguida
foram acrescentados, em ambiente esterilizado, 10 µL da reação da ligação. As
mesmas foram agitadas lentamente e submetidas a um choque térmico de 5 min em
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
34
Dissertação de mestrado
gelo, 90 seg à 42ºC e imediatamente transferidas para gelo e mantidas por 3 min.
Posteriormente, foram adicionados 800 µL de meio SOC à amostra (20 g/L de
triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 0,585 g/L de NaCl, 0,186 g/L de KCl e 20 mM
de glicose. Corrigir o pH para 7,0 com KOH) e esta incubada por 30 min à 37ºC.
Após este período, 200 µL da cultura de bactérias foram plaqueadas em meio LB
sólido (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl e 15 g/L de
ágar. Corrigir o pH para 7,4 com NaOH) contendo 60 µg/mL de ampicilina. As placas
de cultura foram colocadas invertidas em estufa à 37ºC e mantidas por
aproximadamente 16 h.
3.2.2.2 – Expressão transiente do gene GUS em tecido foliar de A. thaliana
Todos os experimentos desta etapa foram conduzidos em colaboração
com a aluna de iniciação científica Fernanda Barbosa Bueno.
3.2.2.2.1 – Cultivo de plantas de A. thaliana selvagem
As sementes de Arabidopsis thaliana foram resfriadas por pelo menos 48
h em a 4ºC. Em seguida, estas foram hidratadas por 1 h em água esterilizada com
moderadas agitações para uniformizar a embebição. Posteriormente, as sementes
foram desinfetadas através de duas lavagens de 15 min, utilizando 15% hipoclorito
de sódio (v/v) diluído em água esterilizada. Posteriormente, para eliminar o excesso
de hipoclorito de sódio, as sementes foram lavadas 6x com água esterilizada em
ambiente estéril. Ao final do processo, as sementes foram distribuídas em Jiffy Pellet
reutilizado hidratado com água destilada e autoclavado. As plantas foram cultivadas
em câmara de cultivo apropriada a 19°C, com intensidade luminosa de 120 μmol m2
.s-1, e hidratadas de 15 em 15 dias com solução nutritiva de Hoagland (OSTREM et
al., 1987).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
35
Dissertação de mestrado
3.2.2.2.2 – Preparação de células eletrocompetentes de A. tumefaciens
linhagem LBA 4440
As bactérias A. tumefaciens que seriam utilizadas nos ensaios de
transformação transiente de tecido foliar de A. thaliana deveriam conter os vetores
de expressão construídos. Para tanto, foi necessário preparar células de A.
tumefaciens eletrocompetentes. Brevemente, 50 mL de células foram cultivadas em
erlenmeyer com chicana (500 mL) até alcançar o meio da fase exponencial em meio
YEB (OD600 nm: 0,6 Abs) e então coletadas por centrifugação a 4°C sob 2.880 x g. As
células foram lavadas 6 x com 40 mL de água ultra pura, sendo mantidas sempre a
4°C. Ao final, as células foram ressuspensas em água ultra-pura em um volume
equivalente a 20x o volume de células obtido.
3.2.2.2.3 – Eletroporação de bactérias A. tumefaciens
Células de A. tumefaciens LBA 4440 eletrocompetentes (50 μL) e 1 μL dos
vetores de expressão (~100 ng) foram misturados, mantidos por 30 minutos a 4°C e,
em seguida, eletroporados a 1,5 kV por 5 ms, usando TransPorator Plus (BTX) em
uma cubeta 0,1 cm (Epicentre). Meio YEB sem antibiótico foi adicionado
imediatamente após o pulso e as células foram incubadas a 28ºC sob agitação
constante. Após 2 h, as células foram plaqueadas em meio YEB sólido,
suplementado com rifampicina (100 μg mL-1) e incubadas à 37°C por 24 h para
seleção dos transformantes. Foram feitos diferentes ensaios de eletroporação para
cada um dos três vetor utilizados.
3.2.2.2.4 – Detecção da expressão do gene GUS em A. tumefaciens
As cepas de A. tumefaciens, contendo as três construções e o plasmídeo
original pA19-GUS, que seriam utilizadas nos ensaios de transformação transiente
de tecido foliar de A. thaliana foram testadas quanto à capacidade de expressar o
gene GUS. Para tanto, foram inoculados 150 μL de cada cepa de A. tumefaciens em
20 mL de meio YEB contendo os antibióticos rifampicina (100 μg mL-1) e ampicilina
(50 μg mL-1), e os frascos foram colocados sob agitação a1500 RPM, a 28°C por 48
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
36
Dissertação de mestrado
h. Após esse tempo, 1 mL de cada cultura crescida foi transferido para tubos de
microcentrífugas e os tubos foram centrifugados a 1000 RPM por 2 min. O
sobrenadante foi descartado e o material precipitado foi ressuspenso em 1 mL do
tampão x-gluc (0,1 mM Fosfato de sódio pH 7,0; 10 mM EDTA pH 8,0; 0,1% (v/v)
Triton X-100; 1 mM K3Fe(CN)6; 2 mM X-gluc; água ultra-pura). Os tubos foram
centrifugados a 1000 RPM durante 2 min, o material precipitado foi novamente
ressuspenso no tampão x-gluc (sem adicioná-lo outra vez) e os mesmos foram
incubados em temperatura ambiente por 24 h.
3.2.2.2.5 – Infecção das diferentes cepas de A. tumefaciens em folhas de
A. thaliana
Para os ensaios que tiveram como objetivo analisar a influência do íntron
salT sobre a atividade do promotor salT foram utilizadas folhas de A. thaliana
infectadas com diferentes cepas de A. tumefaciens. Para tanto, foram inoculados
150 μL de cada cepa de A. tumefaciens em 20 mL de meio YEB contendo os
antibióticos rifampicina (100 μg mL-1) e ampicilina (50 μg mL-1), e os frascos foram
colocados sob agitação a1500 RPM, a 28°C até que a DO600
nm
atingisse 1.5. De
cada cultura crescida, 5 mL foram transferidos para tubos estéreis de 15 mL e
centrifugados a 1000 RPM por 10 min. O sobrenadante foi descartado, o material
precipitado de cada tudo foi ressuspenso em 5 mL de Solução de Infecção fresca
(10 mM MgCl2; 10 mM MES; 20 μM Acetoseringona; água ultra pura), e os tubos
foram incubados a 25°C por 3 h. As folhas escolhidas para infecção pertenciam à
parte inferior de plantas de A. thaliana com 28 dias, e foram selecionadas segundo
tamanho e localização semelhantes. Apenas uma folha em cada planta foi utilizada.
A inoculação de 1 mL da solução de infecção ocorreu ao longo da região abaxial da
folha, partindo da ponta até o final do limbo, pressionando a folha contra uma
seringa de 5 mL sem agulha contendo a solução. As plantas com as folhas
infectadas permaneceram isoladas por 48 h, à 25°C. Após este tempo, as folhas
infectadas foram cortadas das plantas e imediatamente submetidas a tratamento
com tampão x-gluc.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
37
Dissertação de mestrado
3.2.2.2.6 – Detecção da expressão do gene GUS em tecido foliar de A.
thaliana
As folhas infectadas foram cortadas das plantas e imediatamente
transferidas para tubos de 1,5 mL contendo 1 mL de tampão x-gluc fresco (0,1 mM
Fosfato de sódio pH 7.0; 10 mM EDTA pH 8.0; 0,1% (v/v) Triton X-100; 1 mM
K3Fe(CN)6; 2 mM X-gluc; água ultra-pura). Os tubos foram incubados em estufa a
37°C por 20 h. Após isto, as folhas foram retiradas dos tubos e fotografadas.
3.2.2.3 – Análise do perfil transcricional do gene salT em diferentes tecidos de O.
sativa através de northern eletrônico
As análises do nível de transcrição do gene salT em diversos tecidos e
tipos celulares de arroz foi realizada através do Centro Virtual da Universidade de
Yale para o Perfil de Expressão Celular em Arroz (do Yale Virtual Center for Cellular
Expression
Profiling
of
Rice
Yale
Project,
http://bioinformatics.med.yale.edu/riceatlas/overview.jspx). O locus correspondente
ao gene salT de arroz foi submetido ao campo de procura disponibilizado no website
do banco de dados. As informações geradas pelo banco foi organizada em tabelas,
que receberam cores de acordo com a intensidade do nível de transcrição do gene
no local indicado.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
38
Dissertação de mestrado
4. RESULTADOS
4.1 – Estudo da influência dos elementos de transposição Castaway e
Stowaway sobre a atividade do promotor do gene salT de O. sativa
4.1.1 – Detecção dos transposons Castaway e Stowaway na região promotora do gene
salT dos diferentes cultivares de arroz através de amplificações por PCR
A presença de elementos de transposição na região promotora do gene
salT pode ser sugerida a partir de diferenças no tamanho dos promotores de
diferentes cultivares. Desta forma, a amplificação através de PCR do promotor
inteiro, e de partes dele, consiste em uma eficiente estratégia para avaliar e
comparar esta região promotora de cada cultivar.
Com tal finalidade, os ensaios iniciais dedicaram-se à germinação e cultivo
de plantas dos cultivares de arroz Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1,
Minami Hata Mochi e Taichung Native 1. Posteriormente, foi realizada a extração do
DNA genômico dos diferentes cultivares. As amostras obtidas foram quantificadas
usando o sistema Qubit™ (Invitrogen) e sua integridade foi avaliada em gel de
agarose 1% (dados não mostrados). Os fragmentos correspondentes ao promotor
do gene salT inteiro e à “região de 256 pb + íntron salT” foram amplificados por
PCR, em todos os cultivares, utilizando o DNA genômico extraído como molde e
uma combinação específica de oligonucleotídeos previamente deduzidos. A tabela 3
(Materiais e Métodos) mostra o par de primers utilizado em cada amplificação por
PCR e a figura 5 (Materiais e Métodos) indica o local de anelamento e a direção de
cada primer no promotor do gene salT.
As amostras foram avaliadas em gel de agarose 1%. A figura 6 apresenta
o resultado da análise do promotor salT inteiro. Através desta análise foi possível
verificar que os cultivares de arroz Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440 e Metica-1
possuem promotor salT com tamanho em torno de 1200 pb, e que os cultivares
Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 possuem promotores de maior tamanho,
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
39
Dissertação de mestrado
com cerca de 1700 pb, sugerindo a presença dos elementos de transposição nos
dois cultivares cujo promotor apresenta maior tamanho. Com o intuito de certificar
que a diferença no tamanho dos promotores não é inerente a diferenças em outras
regiões do mesmo, foi realizada a amplificação do fragmento que corresponde a
“região de 256 pb + íntron salT”. A figura 7 mostra que todos os cultivares de arroz
analisados possuem tal região com o mesmo tamanho.
1
2
3
4
5
6
7
M
2 Kb
1.650 pb
1 Kb
Figura
6.
Visualização
eletroforética
do
resultado
da
amplificação por PCR do promotor do gene salT nos diferentes
cultivares de arroz. O fragmento correspondente ao promotor salT
foi amplificado a partir do DNA molde dos sete cultivares. 1 – Cica
8; 2 – Guarani; 3 – IAC 201; 4 – IAC 4440; 5 – Metica-1; 6 – Minami
Hata Mochi; 7 – Taichung Native 1. M – Marcador de peso
molecular 1 kb Plus DNA Ladder™ (Invitrogen). Todos os géis de
agarose mostrados no presente trabalho foram corados com
brometo de etídio e correspondem à imagens negativas.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
40
Dissertação de mestrado
M
1
2
3
4
5
6
7
850 pb
650 pb
Figura
7.
Visualização
eletroforética
do
resultado
da
amplificação por PCR da região de 256 pb + íntron salT nos
diferentes cultivares. O fragmento correspondente à região de
256 pb + íntron salT foi amplificado a partir do DNA molde dos sete
cultivares. 1 – Cica 8; 2 – Guarani; 3 – IAC 201; 4 – IAC 4440; 5 –
Metica-1; 6 – Minami Hata Mochi; 7 – Taichung Native 1. M –
Marcador de peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder™ (Invitrogen).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
41
Dissertação de mestrado
4.1.2 – Análise do nível de indução do gene salT em cultivares de arroz expostos ao
estresse salino através de ensaios de PCR em Tempo Real
Para avaliar se a atividade do promotor salT, no que diz respeito à sua
capacidade de induzir a transcrição do gene, possui alguma relação com a
presença/ausência dos elementos de transposição na sua região promotora, o nível
de indução deste gene em bainhas de plantas em condições normais e de estresse
salino foi avaliado através de PCR em Tempo Real (RT-PCR).
Com tal finalidade, os ensaios iniciais dedicaram-se à germinação e cultivo
de plantas de arroz dos cinco cultivares sem os transposons no promotor salT – Cica
8, Guarani, IAC 201, IAC 4440 e Metica-1 – e dos dois cultivares com transposons –
Minami Hata Mochi e Taichung Native 1. Com 21 dias de idade, metade das plantas
de cada cultivar foi submetida ao estresse salino (NaCl 1%) durante 24 h. As
amostras de RNA total extraídas da bainha de plantas em condição normal
(controle) e estressadas foram quantificadas usando o sistema Qubit™ (Invitrogen) e
sua integridade foi avaliada em gel de agarose 1% (dados não mostrados), e
posteriormente, tais amostras serviram de molde para a síntese de cDNA.
Adicionalmente, para a realização do RT-PCR são necessários pares de primers
específicos, previamente deduzidos, para a amplificação do gene salT e do gene
18S, cuja expressão não é alterada em diferentes condições fisiológicas (controle
interno). Tais pares de primers foram submetidos a um teste de especificidade a fim
de garantir a ausência de amplificações inespecíficas (dados não mostrados).
O resultado apresentado pela figura 8 demonstra que os cultivares de
arroz que não possuem a inserção de elementos móveis no promotor salT – IAC
201, IAC 4440 e Metica-1 – e os cultivares que possuem tal inserção – Minami Hata
Mochi e Taichung Native 1 – apresentaram diferentes níveis transcricionais do gene
salT em condições de estresse porém, aparentemente, não há correlação entre a
presença dos elementos de transposição e o perfil transcricional do gene salT em
tais condições. Adicionalmente, foi possível observar que os cultivares, cujos
resultados puderam ser avaliados, apresentam diferentes níveis basais de
transcrição do gene salT, indicando a transcrição deste gene mesmo na ausência do
fator estressante. O cultivar Guarani não apresentou indução da transcrição na
situação de estresse, porém apresentou um alto nível transcricional na situação
normal, e o cultivar Cica 8 foi desconsiderado do presente ensaio devido à um
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
42
Dissertação de mestrado
aparente erro nas amostras-controle do controle interno (18S) de uma das réplicas
que inviabilizou tal análise neste cultivar.
Controle
Estresse (NaCl 1%)
540
480
Nível de Indução
420
360
300
240
180
120
60
0
Guarani
IAC 201
IAC 4440 Metica-1
Minami
Hata
Mochi
Taichung
Native 1
Figura 8. Análise do nível de indução transcricional do gene salT de arroz através de
PCR em Tempo Real das bainhas de diferentes cultivares de arroz. Guarani, IAC 201,
IAC 4440 e Metica-1 – Cultivares cujo promotor do gene salT não possui a inserção dos
elementos de transposição Castaway e Stowaway. Minami Hata Mochi e Taichung Native
1 – Cultivares que não possuem tais elementos de transposição. Os cultivares apresentaram
diferentes níveis transcricionais do gene salT em condições de estresse, mostrando a não
correlação entre a presença dos transposons e o perfil transcricional do gene em estudo.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
43
Dissertação de mestrado
Parte dos tecidos macerados – bainhas foliares de plantas dos diferentes
cultivares de arroz, na situação controle e estresse (NaCl 1%) – que seriam
utilizados para a extração do RNA total, foi reservada para a obtenção de extrato
protéico total. Após quantificação usando o sistema Qubit™ (Invitrogen), as amostras
de proteína foram utilizadas em ensaios de western blotting com a finalidade de
detectar o nível de acúmulo da proteína SALT nas mesmas amostras utilizadas para
a análise de indução da transcrição do gene salT. Interessantemente, os resultados
obtidos (figura 9) demonstram claramente que os níveis basais (controle) e finais
(estresse) da proteína SALT não refletem os níveis de transcrição do gene salT nas
mesmas situações.
1
7
8
2
3
4
5
6
9
10
11
12
13
14
Figura 9. Ensaio de western blotting utilizando anticorpo monoclonal contra a proteína
SALT de diferentes cultivares de arroz. 1, 3, 5, 7, 9, 11 e 13 – Amostras controles dos
cultivares Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung
Native 1. 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 14 – Amostras estressadas por NaCl 1% dos cultivares Cica 8,
Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1. O anticorpo
anti-SALT foi produzido no LBT/CBB/UENF pelo aluno Marcos Vinícius Viana de Oliveira.
‘
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
44
Dissertação de mestrado
4.2 – Identificação de sítios regulatórios presentes na região de 256 pb do
promotor do gene salT através de análises in silico
Com o objetio de analisar a região de 256 pb quanto à presença de
possíveis elementos regulatórios em cis, o nome referente ao gene salT, baseado no
Projeto de Anotação do Arroz, foi submetido ao banco de dados OSIRIS, que reúne
e analisa promotores contidos no genoma de O. sativa (MORRIS et al., 2008). O fato
relevante inicialmente observado foi a detecção da presença do elemento TATA Box
nesta região na posição indicada pela figura 10. Para fins de confirmação deste
importante dado, a mesma seqüência foi submetida a outros bancos de dados de
elementos regulatórios encontrados em promotores de plantas, PlantCARE (LESCOT
et al., 2002) e PLACE (HIGO et al., 1999), que confirmaram a presença de tal sítio na
posição indicada pelo OSIRIS (dados não mostrados).
De acordo com essa informação, os 53 nucleotídeos a partir do sítio de
início da transcrição foram desconsiderados para análise pelo banco e, desta forma,
somente a seqüência de 203 pb que precede o sítio de início da transcrição foi
analisada. O resultado da análise in silico desta região de 203 pb através do banco
de dados OSIRIS revelou a presença de 10 diferentes potenciais sítios de ligação
para fatores de transcrição, como ilustra a figura 10. Dentre estes, foi possível
observar a presença de regiões conservadas para a ligação de proteínas
regulatórias relacionadas à resposta de plantas a estresses ambientais, tais como os
elementos em cis MYB1AT, MYCATERD1, MYCATRD22, MYBCORE (relacionados
à resposta ao estresse provocado pela desidratação), AGC Box (relacionado à
resposta ao etileno) e ACGT Box (sitio de ligação de proteínas bZIP, que participam
de diversos processos nas plantas, como sinalização de estresses). Nenhum
potencial sítio regulatório foi encontrado entre o TATA Box e o ponto inicial da
transcrição. Informações adicionais sobre os sítios de ligação de fatores de
transcrição presentes na seqüência de 203 nucleotídeos, encontrados pelo banco de
dados OSIRIS, são descritos na tabela 5.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
45
Dissertação de mestrado
TAGCACTCACCAGCTTGTCAAAAACCAAGGCTTGGTGACGGCGGCT
TCAGAATGAAGGATAGATGGATAAATGTCTAGAATATTATAAAGTCC
AACAAAAGATGGAGCACATGCATGAAAGATTACGTACACGAATG
CAGGTGATACAGTGGATGTTAGGCATAAGAAGCACTATAAATAGAG
GGTGCAATCCCCATTGCCCTACACAACTACACAAGCCGACTATCATC
ACAAGAAAATTTAAGCGACCACGAAG
Figura 10. Identificação in silico de diferentes sítios de ligação para fatores de
transcrição através banco de dados OSIRIS. Os dez sítios para proteínas regulatórias
encontrados na região de 203 pb (até a região sublinhada) estão representados por caixas
coloridas. A relação dos sítios é apresentada na tabela 5. O TATA Box encontra-se na
região circulada. A seta vermelha indica o sítio de início da transcrição e, por isso, a
seqüência sublinhada foi desconsiderada na análise de sítio de fatores de transcrição.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
46
Dissertação de mestrado
Tabela 5. Descrição dos sítios de ligação para fatores de transcrição identificados na
região de 203 pb através de análises in silico no banco de dados OSIRIS.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
47
Dissertação de mestrado
Tabela 5. (continuação)
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
48
Dissertação de mestrado
4.3 – Construção de vetores de expressão induzidos por estresses ambientais
As análises in silico da região de 256 pb do promotor do gene salT,
através do banco de dados OSIRIS, revelaram a presença de sítios de ligação para
fatores de transcrição envolvidos com resposta de plantas a estresses ambientais,
sugerindo sua regulação. Outra forma de regulação, que tem sido sugerida em
diversos trabalhos, é o aumento da expressão gênica mediado por íntrons. Neste
contexto, é possível que a presença de um íntron na porção 5’ do gene salT esteja
envolvida, de alguma forma, na regulação de sua expressão.
Com a finalidade de avaliar esta possível influência do íntron na regulação
do gene salT, portanto, tornou-se interessante a construção dos seguintes vetores
de expressão em plantas – o primeiro contendo somente a Região de 256 pb e o
segundo contendo a Região de 256 pb seguida do Íntron salT. Adicionalmente, um
terceiro vetor foi construído utilizando a Região de 256 pb seguida do íntron Act1,
amplamente caracterizado como ativador de expressão gênica em vetores deste
tipo. Tal abordagem permitiu, além de avaliar o grau de influência que o íntron salT
exerce sobre a atividade promotora da região de 256 pb, comparar os níveis de
expressão obtidos com o vetor que possui tal íntron e com outro que possui um
íntron com atividade já descrita na literatura. Essa avaliação foi realizada através da
detecção da atividade da enzima β-glucuronidase codificada pelo gene repórter
GUS, tornando-se, então, essencial a presença desse gene no vetor.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
49
Dissertação de mestrado
4.3.1 – Obtenção dos fragmentos utilizados na construção dos vetores de expressão
em plantas
A etapa inicial dos estudos que tiveram como objetivo avaliar a influência
do íntron salT sobre a atividade promotora da região de 256 pb consistiu no
desenvolvimento de três vetores de expressão em plantas “Região de 256 pb”,
“Região de 256 pb + Íntron salT” e “Região de 256 pb + Íntron Act1”. Tais
construções moleculares utilizaram como “base” o plasmídeo pA19-GUS. Como
ilustrado pela figura 11A, este plasmídeo comporta em sua estrutura o gene repórter
GUS, o gene Amp que confere resistência ao antibiótico ampicilina e sítios para
diversas enzimas de restrição. Além disso, a presença do íntron Act1 do gene da
actina de arroz na porção 5’ do gene GUS foi decisiva na escolha desse plasmídeo
para “base” dos vetores.
Desta forma, o DNA plasmidial foi extraído de bactérias E. coli DH5α, e,
após sua integridade ter sido avaliada em gel de agarose 1% (dados não
mostrados), o material obtido foi submetido ao tratamento com enzimas de restrição
para a liberação dos fragmentos correspondentes a região promotora 35S e a região
promotora 35S mais o íntron Act1. O primeiro tratamento consistiu na utilização das
enzimas de restrição EcoRI e BamHI para liberar um fragmento de 855 pb contendo
o promotor 35S e o íntron Act1. Tal procedimento resultou na linearização do
plasmídeo pA19-GUS sem a região regulatória do gene repórter. Tal vetor linear foi
denominado pA19-GUS-1. O segundo tratamento consistiu na utilização das
enzimas de restrição EcoRI e XhoI para liberar um fragmento 350 pb correspondente
apenas ao promotor 35S. Esse procedimento resultou na linearização do plasmídeo
pA19-GUS, e a conservação do íntron Act1 na porção 5’ do gene repórter. O vetor
linearizado contendo o íntron Act1 foi denominado pA19-GUS-2 (figura 11B).
Os dois plasmídios lineares obtidos foram utilizados em diferentes
abordagens. O plasmídeo pA19-GUS-1 foi utilizado para a clonagem do fragmento
correspondente a região de 256 pb do promotor do gene salT, e nessa condição foi
chamado de plasmídeo pA19-GUS-1A. Dessa forma, será possível avaliar a
funcionalidade dessa região, que regulará a expressão do gene repórter GUS. Numa
segunda abordagem, foi feita a ligação do mesmo plasmídeo linear ao fragmento
correspondente a região de 256 pb acompanhada do íntron salT, e nessa condição
foi chamado de pA19-GUS-1B. Assim, será avaliada a possível influência do íntron
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
50
Dissertação de mestrado
salT na ativação da região de 256 pb do promotor salT. Foi realizada ainda a ligação
do fragmento correspondente a região de 256 pb do promotor do gene salT ao
plasmídeo pA19-GUS-2. Como este comporta o íntron Act1 na porção 5’ do gene
GUS, será possível analisar a influência desse íntron na atividade da região de 256
pb, bem como a análise comparativa com a expressão obtida pelo vetor contendo o
íntron salT.
A)
B)
M
1
2
3
10 kb
1 kb
750 pb
500 pb
250 pb
Figura 11. Esquema ilustrativo e visualização eletroforética do resultado da restrição
enzimática do plasmídeo pA19-GUS. Em (A) Esquema do plasmídeo pA19-Gus. Em (B)
Linearização do plasmídeo pA19-GUS através de restrição enzimática. 1 – plasmídeo pA19GUS não digerido (indicado pela seta vermelha). 2 – plasmídeo pA19-GUS digerido com as
enzimas EcoRI e BamHI. A seta vermelha indica o plasmídeo linear pA19-GUS-1 e a seta
azul indica o fragmento liberado correspondente ao promotor 35S + Act1. 3 – plasmídeo
pA19-GUS digerido com as enzimas EcoRI e XhoI. A seta vermelha indica o plasmídeo
linear pA19-GUS-2 e a seta azul indica o fragmento liberado correspondente ao promotor
35S. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder™ (Fermentas).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
51
Dissertação de mestrado
Os fragmentos de interesse que seriam utilizados para a construção de
tais vetores de expressão foram amplificados a partir de DNA genômico,
previamente extraído de folhas de arroz do cultivar IAC 4440 (dados não
mostrados),
utilizando
combinações
específicas
de
primers.
O
fragmento
correspondente a região de 256 pb que seria clonado no vetor pA19-GUS-1A foi
amplificado utilizando os primers Pro 250 Eco e Bea 02 Bam. Como os primers
possuíam sítios de restrição, os fragmentos gerados com essa abordagem tiveram
extremidades coesivas com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI, compatíveis
com as extremidades do vetor linear onde foram clonados. Outra abordagem utilizou
os primers Pro 250 Eco e Bea 04 Bam. Essa combinação amplificou o fragmento
correspondente a região de 256 pb acompanhada do íntron salT. Os fragmentos
gerados por esta abordagem também tiveram sítios de restrição compatíveis com as
enzimas EcoRI e BamHI, e assim, foram clonados no vetor linear pA19-GUS-1B.
Adicionalmente, o fragmento correspondente à região de 256 pb foi amplificado
utilizando os primers Pro 250 Eco e Bea 02 Xho. O resultado dessa amplificação
foram fragmentos com extremidades compatíveis com as enzimas EcoRI e XhoI, que
puderam ser então clonadas no plasmídeo linear pA19-GUS-2. A tabela 3 (Materiais
e Métodos) mostra o par de primers utilizado em cada amplificação e os sítios de
restrição gerados nos fragmentos, e a figura 5 (Materiais e Métodos) indica o local
de anelamento e a direção de cada primer no promotor do gene salT.
Após a amplificação por PCR, as amostras foram tratadas com as enzimas
de restrição correspondentes aos primers utilizados, no intuito de gerar
extremidades coesivas, e os materiais foram avaliados em gel de agarose 1%.
Como demonstrado na figura 12, os fragmentos de interesse foram eficientemente
amplificados. Embora tenha ocorrido amplificação inespecífica, a eficácia do
procedimento é verificada pela intensidade dos fragmentos alvos. As bandas foram,
então, isoladas diretamente do gel e o DNA purificado para posteriores ensaios de
clonagem.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
52
Dissertação de mestrado
M
1
2
3
1 kb
750 pb
500 pb
250 pb
Figura 12. Visualização eletroforética da amplificação por PCR dos fragmentos de
interesse. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder™ (Fermentas); 1 –
Fragmento de 256 pb EcoRI/BamHI; 2 – Fragmento de 256 pb EcoRI/XhoI; 3 – Fragmento
256 pb + íntron salT EcoRI/BamHI. As setas vermelhas indicam a posição dos fragmentos
amplificados em cada raia.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
53
Dissertação de mestrado
4.3.2 – Ligação dos insertos aos seus respectivos vetores de clonagem e
transformação de E. coli DH5α
O primeiro ensaio de ligação foi realizado utilizando o plasmídeo pA19GUS-1A, digerido com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI, e o fragmento
correspondente a região de 256 pb do promotor salT com as extremidades
compatíveis EcoRI e BamHI. Em seguida, bactérias E. coli competentes linhagem
DH5α foram transformadas com o DNA obtido e plaqueadas. Foi observado o
crescimento de 31 colônias nas placas, e tais colônias foram, então, analisadas
quanto à presença do clone “pA19-GUS-1 + 256 pb EcoRI / BamHI” pela
amplificação do inserto através de PCR, onde a combinação de primers utilizada foi
Pro 250 Eco e Gus 5’ Rev e as próprias colônias da bactéria transformada foram
utilizadas como DNA molde. A figura 13 mostra que das 31 colônias obtidas, 11
colônias tiveram o inserto amplificado, indicando que receberam o clone.
A construção do segundo vetor de expressão seguiu as mesmas etapas.
Foi utilizado o plasmídeo pA19-GUS-1B, digerido com as enzimas de restrição
EcoRI e BamHI. O fragmento correspondente a região de 256 pb do promotor salT,
seguida do íntron salT, também foi digerido com as mesmas enzimas. Após a
ligação e transformação de E. coli DH5α foi observado o crescimento de 177
colônias nas placas, das quais 39 foram escolhidas aleatoriamente para serem
analisadas quanto à presença do clone “pA19-GUS-1 + 256 pb + íntron salT EcoRI /
BamHI” pela amplificação do inserto utilizando a mesma combinação de primers da
construção anterior. A figura 14 mostra que 28 colônias tiveram o inserto
amplificado, indicando que receberam o clone.
O terceiro vetor foi construído utilizando a mesma abordagem, porém com
uma pequena modificação. A ligação foi realizada utilizando o plasmídeo pA19-GUS2, digerido com as enzimas de restrição EcoRI e XhoI, e o fragmento
correspondente a região de 256 pb do promotor salT com as extremidades
compatíveis EcoRI e XhoI. Após a ligação e transformação de E. coli DH5α foi
observado o crescimento de diversas colônias, das quais 65 foram escolhidas
aleatoriamente para serem analisadas quanto à presença do clone “pA19-GUS +
256 pb EcoRI / XhoI” pela amplificação do inserto utilizando a mesma combinação
de primers das construções anteriores. Os resultados mostraram 45 colônias
apresentaram resultado positivo, indicando que receberam o clone. Porém, neste
caso, o fragmento amplificado corresponde a região de 256 pb + íntron Act1 (figura
15).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
54
Dissertação de mestrado
M
1
M
14
2
3
4
5
6
7
8
9
19
20 21 22
10
11 12
13
500 pb
250 pb
15 16
17 18
23 24 25 26
500 pb
250 pb
27
28
29
30
31
M
500 pb
250 pb
Figura 13. Confirmação da clonagem do inserto “256 pb EcoRI/BamHI” através de
PCR das 31 colônias crescidas. As posições 5, 6, 7, 9, 14, 19, 24, 26, 27, 28 e 29 indicam
as colônias positivas. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder™ (Fermentas). 1 –
Controle negativo (ausência de fita molde). As setas vermelhas indicam o inserto
amplificado.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
55
Dissertação de mestrado
M
1
2
3
4
M
14
15 16
M
27
28 29 30
5
6
7
8
9
10 11 12
13
1 kb
750 pb
500 pb
250 pb
17 18
19 20
21 22 23 24
25 26
1 kb
750 pb
500 pb
250 pb
31 32
33 34 35 36
37 38 39
1 kb
750 pb
500 pb
250 pb
Figura 14. Confirmação da clonagem do inserto “256 pb + íntron salT EcoRI/BamHI”
através de PCR de 39 colônias formadas. As posições 10 a 30 e 33 a 39 indicam as
colônias positivas. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder™ (Fermentas). 1 –
Controle negativo (ausência de fita molde). As setas vermelhas indicam o fragmento
amplificado.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
56
Dissertação de mestrado
M
1
2
3
4
5
15 16
17
M
6
7
8
9
10 11 12
1 kb
750 pb
500 pb
250 pb
M
13 14
M
26
18 19
20 21
22 23
24 25
32 33 34
35 36
37 38
1 kb
750 pb
500 pb
250 pb
27 28
29 30 31
1 kb
750 pb
500 pb
250 pb
Figura 15 (1ª parte).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
57
Dissertação de mestrado
M
39
40 41
M
52
53
M
64
42 43 44
45 46 47
48 49
50 51
1 kb
750 pb
500 pb
250 pb
54
55
56
57
58 59
60
61
62
63
1 kb
750 pb
500 pb
250 pb
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
1 kb
750 pb
500 pb
250 pb
Figura 15 (continuação). Confirmação da clonagem do inserto “256 pb EcoRI/XhoI”
através de PCR de 65 colônias crescidas. Os fragmentos amplificados correspondem ao
“256 pb + íntron Act1”. Muito embora 45 colônias tenham sido positivas, as posições 10, 15,
16, 18, 19, 22, 25, 27, 29, 30, 31, 34, 38, 40, 42, 44, 48, 49, 52, 61, 64, 65, e 74 indicam as
colônias com as melhores amplificações. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA
Ladder™ (Fermentas). 1 a 5 – Controles negativos (ausência de fita molde). As posições 6,
13, 26 e 39 são amostras erradas que foram carregadas no gel, não fazendo, portanto, parte
das colônias positivas. As setas vermelhas indicam os produtos amplificados.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
58
Dissertação de mestrado
4.4 – Estudo da influência do íntron salT através da análise de expressão
transiente do gene GUS em tecido foliar de Arabidopsis thaliana
Com o intuito de avaliar a influência do íntron salT sobre a atividade
regilatória da região de 256 pb do promotor do gene salT, bem como comparar os
níveis de expressão obtidos com a presença dos diferentes íntrons, os três vetores
de expressão em plantas previamente construídos – “Região de 256 pb”, “Região de
256 pb + Íntron salT” e “Região de 256 pb + Íntron Act1” – foram extraídos das
bactérias E. coli DH5α, tiveram sua integridade avaliada em gel de agarose 1%
(dados não mostrados) e, posteriormente, tais moléculas foram eletroporados em A.
tumefaciens LBA 4440. O plasmídeo original pA19-GUS, utilizado como “base” para
a construção dos vetores, também foi inserido por eletroporação em A. tumefaciens.
A presença do promotor constitutivo CaMV 35S dirigindo a expressão do gene GUS
em tal plasmídeo permitiu sua utilização como controle positivo nos ensaios
posteriores.
Inicialmente, as quatro cepas transformadas com os vetores de expressão
(três construções e o plasmídeo original), bem como a Agrobacterium tumefaciens
selvagem, foram submetidas à análise de detecção da expressão do gene GUS
através da reação enzimática da β-glucuronidase com seu substrato x-gluc. A figura
16 demonstra que apenas a cepa de A. tumefaciens contendo o plasmídeo pA19GUS apresentou a coloração azul, indicando a expressão do gene GUS. Se as
cepas contendo cada um das três construções fossem capazes de expressar o gene
GUS, a análise histoquímica em A. thaliana seria inviável, pois implicaria em um
resultado falso-positivo.
Os experimentos in vivo foram conduzidos utilizando folhas da parte
inferior de plantas de Arabidopsis thaliana com 28 dias de idade. As soluções de
infecção, contendo as cepas transformadas, foram injetadas em diversos pontos da
superfície abaxial dos tecidos foliares de A. thaliana com o auxílio de uma seringa.
Após dois dias de infecção, as folhas que tiveram as cepas injetadas foram
excisadas das plantas de origem e incubadas durante 20 h em tampão contendo o
substrato x-gluc. Como demonstrado na figura 17, a análise histoquímica da
expressão transiente do gene GUS em tecidos foliares de Arabidopsis thaliana
revelou, através da coloração azul, a expressão deste gene repórter nas folhas
transformadas com as cepas de A. tumefaciens contendo os vetores com o íntron
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
59
Dissertação de mestrado
salT e o íntron Act1. Aparentemente, não houve expressão do gene GUS na folha
infectada com a cepa que possuía o vetor “Região de 256 pb”.
1
2
3
4
5
Figura 16. Detecção da expressão do gene GUS em diferentes cepas de
Agrobacterium tumefaciens. A expressão da enzima β-glucuronidase (GUS) foi
mensurada através do tratamento das cepas com tampão contendo seu substrato, xgluc. 1 – A. tumefaciens transformada com o plasmídeo original pA19-GUS, que contém o
promotor 35S dirigindo a expressão do gene repórter (controle positivo); 2 – A. tumefaciens
selvagem (não transformada); 3 – A. tumefaciens contendo o vetor de expressão “Região de
256 pb”; 4 - A. tumefaciens contendo o vetor “Região de 256 pb + Íntron salT”; 5 – A.
tumefaciens contendo o vetor “Região de 256 pb + Íntron Act1”.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
60
Dissertação de mestrado
1
2
3
4
Figura 17. Análise histoquímica da expressão transiente do gene GUS em tecidos
foliares de Arabidopsis thaliana. As folhas infectadas com as cepas transformadas foram
excisadas das plantas de origem e submetidas ao tratamento com tampão contendo o
substrado x-gluc. A intensidade da cor azul está relacionada ao nível de expressão do gene
repórter GUS. 1 – Folha injetada com a cepa de A. tumefaciens contendo o vetor plasmidial
pA19-GUS (controle positivo); 2 – Folha transformada com a A. tumefaciens contendo a
construção “Região de 256 pb”; 3 – Folha transformada com a A. tumefaciens contendo a
construção “Região de 256 pb + Íntron salT”; 4 – Folha transformada com a A. tumefaciens
contendo a construção “Região de 256 pb + Íntron Act1”.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
61
Dissertação de mestrado
4.5 – Análise do perfil transcricional do gene salT em diferentes tecidos de O.
sativa através de northern eletrônico
A identificação, através de análise in silico, do sítio “RY Repeat” na região
de 256 pb do promotor do gene salT sugeriu uma possível participação deste gene
em processos que ocorrem nas sementes. Poranto, com a finalidade de investigar o
perfil de expressão deste gene nos diferentes tecidos desta parte da planta, foi
utilizado o Projeto de Arroz da Universidade de Yale (Yale Rice Project). Tal projeto
tem como objetivo a construção, ainda em andamento, de um banco de dados do
perfil transcricional de todo o genoma de arroz em diversos tipos de células e tecidos
isolados por micro dissecação, o Centro Virtual da Universidade de Yale para o Perfil
de Expressão Celular em Arroz (Yale Virtual Center for Cellular Expression Profiling
of Rice Yale Rice Project: http://bioinformatics.med.yale.edu/riceatlas/overview.jspx).
A figura 18 mostra os resultados obtidos pelos ensaios de microarray
desenvolvidos pelo banco da Universidade de Yale para o perfil transcricional do
gene salT em cinco diferentes tecidos do embrião de sementes, em três momentos –
semente seca (0h) e 12 h e 24 h após a embebição. Os valores expressos dentro
das células representam a intensidade do sinal, após a normalização dos dados, e
determinam os níveis de transcrição do gene. Segundo os dados gerados, o gene
salT possui alto nível de transcrição nas células do escutelo, coleóptilo, epiblasto e
radícula após 12 h, e baixo nível transcricional nas células da plúmula de sementes.
Adicionalmente, foram realizadas análises dos níveis de transcrição do
gene salT em outros tecidos de plantas. De acordo com os dados gerados pelo
banco da Universidade de Yale, mostrados na figura 19, o gene salT apresenta alto
nível de transcrição somente em amostras de folha inteira e na raiz inteira.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
62
Dissertação de mestrado
Figura 18. Perfil transcricional do gene salT em cinco diferentes tecidos do embrião
de sementes. Análises de microarray de escutelo, coleóptilo, epiblasto, plúmula e radícula
em três momentos [semente seca (0hr), 12 h e 24 h após embebição] desenvolvidos pelo
banco de expressão da Universidade de Yale (Yale Virtual Center for Cellular Expression
Profiling of Rice Yale Rice Project). Acima é fornecida uma chave mostrando a abundância
relativa de RNA, sendo a cor amarela para baixas concentrações e vermelho e marrom para
altas concentrações.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
63
Dissertação de mestrado
Figura 19. Perfil transcricional do gene salT em tecidos de plantas de arroz. Análises
de microarray de diversos tecidos e tipos celulares de broto, folha e raiz de plantas de arroz
desenvolvidos pelo banco de expressão da Universidade de Yale (Yale Virtual Center for
Cellular Expression Profiling of Rice Yale Rice Project). Acima é fornecida uma chave
mostrando a abundância relativa de RNA, sendo a cor amarela para baixas concentrações e
vermelho e marrom para altas concentrações.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
64
Dissertação de mestrado
5. DISCUSSÃO
5.1 – Estudo da influência dos elementos de transposição Castaway e
Stowaway sobre a atividade da região regulatória do gene salT de arroz
Em trabalho prévio de comparação de seqüências em bancos de dados
(NCBI – GenBank), BUREAU e colaboradores (1996) analisaram a ocorrência de
elementos de transposição em genes já seqüenciados de A. thaliana e O. sativa.
Nesta ocasião, foi detectada a presença de transposons pertencentes às famílias
Castaway e Stowaway, os quais encontram-se separados por apenas nove pares de
bases, na região promotora do gene salT de arroz. Elementos de transposição são
seqüências capazes de se replicar e se mover dentro do genoma (FESCHOTTE,
2008), e além do gene salT, diversos outros genes de arroz tiveram relatada a
presença de tais elementos em suas regiões regulatórias 5’ flanqueadoras (BUREAU
et al., 1996). Estas inserções, muitas vezes conservadas entre diferentes
organismos, impulsionaram diversos estudos acerca de suas possíveis funções
regulatórias (FESCHOTTE, 2008).
Nas tabelas 1 e 2, previamente apresentadas, foi possível observar que
diversos cultivares de arroz foram utilizados em análises de diferentes estresses,
porém não há informações a cerca da presença/ausência dos elementos de
transposição no promotor salT de tais cultivares. Tal constatação despertou o
interesse sobre uma possível correlação entre presença de tais transposons com a
atividade do promotor salT, que até então não havia sido relatada. Portanto, com a
finalidade de determinar se a presença dos elementos móveis afetam de alguma
forma a transcrição do gene salT, mediante resposta ao estresse provocado por
salinidade, foi necessário, inicialmente, determinar quais cultivares de arroz
apresentavam tais inserções na região promotora através de amplificações por PCR.
Uma vez que o promotor salT inteiro (com os dois elementos de
transposição) consiste de 1725 pb (GARCIA et al., 1998; NCBI – acesso n° Z25811),
e os transposons Castaway e Stowaway juntos (sem os nove pares de bases que os
separam) correspondem a 520 pb, a região promotora sem os elementos de
transposição deveria corresponder a 1205 pb. Sendo assim, o resultado de
amplificação por PCR sugeriu a presença dos transposons apenas nos cultivares
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
65
Dissertação de mestrado
Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 (figura 6). Adicionalmente, foi demonstrado
que a região de 256 pb + íntron salT possui exatamente o mesmo tamanho em todos
os cultivares (figura 7), o que corrobora a idéia que a diferença no tamanho dos
fragmentos correspondentes aos promotores nos diferentes cultivares é devido à
presença dos elementos de transposição. Tomados juntos, então, os resultados
obtidos pelo presente trabalho indicaram a presença dos elementos de transposição
Castaway e Stowaway no promotor salT somente dos cultivares Minami Hata Mochi
e Taichung Native 1, enquanto que Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440 e Metica-1
não apresentaram tais inserções.
A detecção dos transposons tanto em cultivares da subespécie Japônica,
como Guarani e Minami Hata Mochi, quanto em cultivares da subespécie Indica,
como IAC 4440, Metica 1 e TN1, indicou que a inserção de tais elementos de
transposição ocorreu, na escala evolutiva, em algum ponto antes da diferenciação
em subespécies, permanecendo conservada em ambas. Visto que teorias recentes
têm postulado que a persistência evolucionária de alguns elementos de transposição
deve-se ao papel chave que tais elementos vêm exercendo sobre a evolução da
regulação gênica (FESCHOTTE, 2008), torna-se ainda mais interessante a análise de
uma possível participação dos transposons Castaway e Stowaway na regulação do
gene salT.
Tem sido amplamente mostrado que os transposons são capazes de
influenciar diretamente, de forma benéfica ou não, a regulação da expressão de
genes localizados fisicamente próximos a eles, tanto em níveis transcricionais
quanto pós-transcricionais (MASIDE et al., 2002; SILVA et al., 2003; SCHLENKE et al.,
2004; CHUNG et al., 2007; FESCHOTTE et al., 2007). No nível transcricional, elementos
de transposição inseridos na região 5’ flanqueadora de um gene podem influenciar
sua expressão de três diferentes formas – inserindo seqüências promotoras e
introduzindo um sítio alternativo de inicio da transcrição; interrompendo seqüências
que compreendiam importantes elementos regulatórios em cis; ou introduzindo
novos elementos em cis, tais como sítios de ligação para fatores de transcrição
(FESCHOTTE, 2008).
Uma vez que o promotor de um gene compreende os sítios de ligação a
fatores de transcrição, a inserção dos transposons nesta região regulatória implica
em um possível distanciamento de 520 pb entre potenciais sítios e o ponto de início
da transcrição, e portanto, tal inserção poderia afetar negativamente a transcrição do
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
66
Dissertação de mestrado
gene. Porém, a partir da determinação de cultivares de arroz com e sem a inserção
de transposons e posteriores ensaios conduzidos através de RT-PCR em bainhas
de plantas em condições normais e submetidas a estresse salino, foi mostrado que
as inserções não prejudicaram a habilidade do promotor salT em induzir a
transcrição do gene salT (figura 8). Contudo, muito embora tenha ficado claro que a
inserção dos elementos de transposição não afeta negativamente a transcrição do
gene, o pequeno número de cultivares analisados neste trabalho não permite afirmar
que a presença de tais elementos possua função benéfica na regulação do gene
salT. Apenas análises moleculares mais apuradas, como a identificação in silico de
elementos regulatórios em cis e a utilização de vetores repórteres, contendo tais
transposons, em ensaios de expressão, poderão fornecer maiores informações
sobre a participação dos elementos de transposição na regulação gênica e confirmar
possíveis funções benéficas.
Adicionalmente, os resultados obtidos nos ensaios de western blotting,
demonstraram que o acúmulo da proteína SALT, nas mesmas condições, não
refletem os níveis de transcrição do gene salT (figura 9). O fato de haver grande
discrepância entre o acúmulo de transcritos e de proteínas, como mostrada pelo
cultivar Minami Hata Mochi, sugere fortemente uma intensa regulação póstraducional da proteína SALT.
5.2 – Estudo dos potenciais sítios regulatórios identificados na região de 256
pb do promotor do gene salT através de análises in silico
A diversidade de respostas apresentadas pelo gene salT de arroz pode
estar relacionada à presença de diferentes sítios para ligação de fatores de
transcrição na sua região promotora. Visto que os resultados obtidos pelos ensaios
de PCR em Tempo Real demonstraram que a inserção dos elementos de
transposição não influencia a atividade do promotor quanto à sua capacidade de
induzir a transcrição do gene salT, foi possível inferir que os potenciais sítios de
ligação para fatores de transcrição estejam situados na região de 256 pb do
promotor salT. Tendo em vista que uma das aplicações da bioinformática consiste
em localizar possíveis sítios para proteínas regulatórias em seqüências de DNA, e a
identificação de regiões conservadas pode sugerir os possíveis meios de regulação
do gene em estudo, a análise in silico da região de 256 pb do promotor salT tornouLourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
67
Dissertação de mestrado
se de extrema relevância na elucidação dos possíveis elementos regulatórios em cis
presentes na mesma.
Tal análise, realizada no trabalho aqui apresentado, consistiu na
submissão do nome referente ao gene salT de arroz, baseado no Projeto de
Anotação do Arroz (RAP-DB: TANAKA et al., 2008), no banco de dados OSIRIS, que
reúne e analisa promotores contidos no genoma de O. sativa (MORRIS et al., 2008).
Este banco de dados gera uma imagem da região promotora do gene submetido,
bem como os sítios de ligação para fatores de transcrição presentes no mesmo.
Inicialmente, tal abordagem permitiu a confirmação da presença do TATA Box nesta
região. O TATA Box é uma seqüência de DNA (elemento regulatório em cis)
encontrada na região promotora da maioria dos genes de eucariotos. Considerado a
seqüência essencial do promotor, é geralmente encontrado como sítio de ligação da
RNA polimerase II, responsável por dar início ao complexo processo de transcrição
25 pares de bases após o seu sítio de ligação. A presença deste elemento em cis
nesta posição já havia sido relatada por GARCIA e colaboradores (1998), porém,
através do avanço tecnológico das ferramentas de bioinformática, do acúmulo de
informações in vivo e da utilização combinada de três diferentes banco de dados de
elementos regulatórios encontrados em promotores de plantas – OSIRIS (MORRIS et
al., 2008), PlantCARE (LESCOT et al., 2002) e PLACE (HIGO et al., 1999) – foi
possível afirmar de forma mais consistente tratar-se do elemento TATA Box.
De acordo com os dados obtidos pelo OSIRIS, os 53 nucleotídeos a partir
do sítio de início da transcrição fazem parte do transcrito primário e, desta forma,
não houve análise quanto à presença de sítios de fatores de transcrição nesta
seqüência. Somente os 203 pb precedentes ao sítio inicial da transcrição são
considerados pelo banco. O resultado da análise in silico desta região de 203 pb
através do banco de dados OSIRIS revelou a presença de 10 diferentes potenciais
sítios de ligação para de proteínas regulatórias. Dentre estes, pelo menos seis
elementos em cis – MYB1AT, MYCATERD1, MYCATRD22, MYBCORE, AGC Box e
ACGT Box – referem-se a regiões conservadas para a ligação de proteínas
regulatórias relacionadas à resposta de plantas a estresses ambientais.
MYB1AT e MYCATRD22 são sítios de reconhecimento das proteínas
regulatórias MYB e MYC encontrados nos promotores dos genes rd22, e de muitos
outros genes de A. thaliana, e funciona como elemento em cis na expressão
induzida por ABA e seca de tais genes (ABE et al., 1997, 2003, BUSK e PAGES, 1997).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
68
Dissertação de mestrado
O fitormônio ABA é produzido sob condições de estresse hídrico, o que causa
fechamento do estômato e tolerância a seca, e estresse salino (BRAY, 1997; BUSK e
PAGES, 1998; SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000) estando, portanto,
relacionado a uma variedade de processos fisiológicos, incluindo respostas aos
estresses provocados pela seca e pela salinidade (ABE et al., 2003). MYBCORE
também funciona como sítio de reconhecimento para proteínas MYB de Arabidopsis,
funcionando, portanto, da mesma forma (URAO et al., 1993), e MYCATERD1 foi
descrito como sítio necessário para a expressão do gene erd1 de Arabidopsis, que
participa dos processos de resposta à desidratação (TRAN et al., 2004) e à
senescência induzida pelo escuro (SIMPSON et al., 2003) em Arabidopsis. Juntos,
esses dados apontam a presença de elementos em cis relacionados ao estresse
provocado pela desidratação e ABA e, uma vez que diversos trabalhos relataram a
expressão do gene salT sob condições de seca e ABA, é possível que tais sítios
regulatórios sejam funcionais na regulação do gene salT.
O elemento AGC Box consiste na seqüência de ligação para fatores
AtERFs de Arabidopsis, que são fatores que se ligam a elementos responsivos à ET
(FUJIMOTO et al., 2000). Tal elemento é também encontrado em genes de defesa
cuja transcrição é induzida por ET (OHME-TAKAGI et al., 2000) e em genes cujos
promotores são induzidos por patógenos e ferimentos (RUSHTON et al., 2002). O fato
da expressão do gene salT ter sido induzida por ET (KIM et al., 2004), por patógenos
(XIONG et al., 2001; AKIMOTO-TOMIYAMA et al., 2003; KIM et al., 2001, 2003, 2004;
VENTELON-DEBOUT et al., 2004; MICHÉ et al., 2006; SWARBRICK et al., 2008) e por
ferimento (DE SOUZA FILHO et al., 2003; SHEN et al., 2003) indica a possível influência
do elemento AGC Box na regulação do gene salT. Já o sítio ACGT Box ligam
proteínas regulatórias da família bZIP. Em plantas, os fatores de transcrição bZIP
regulam diversos processos, tais como defesa de patógenos, sinalização de
estresse e luz, maturação de sementes e desenvolvimento da flor.
O motivo conservado RY Repeat consiste em um elemento em cis
presente em genes de proteínas de estoque de sementes. Está envolvido na
regulação gênica específica em sementes (DICKINSON et al., 1988; BÄUMLEIN et al.,
1992; HATTORI et al., 1992). O fato de este ter sido o único sítio tecido-específico
encontrado na região de 256 pb levou à posterior análise do perfil transcricional do
gene salT tecido-específica. Nenhum potencial sítio regulatório foi identificado pelo
banco de dados OSIRIS entre o TATA Box e o ponto inicial da transcrição.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
69
Dissertação de mestrado
A regulação gênica ocorre em todas as etapas que constituem este
complexo processo, e muitos são os fatores envolvidos em cada um destes cruciais
pontos da regulação. Nesse contexto, diversos trabalhos sugerem uma importante
participação de íntrons na regulação da expressão gênica. Uma vez que o gene salT
possui um íntron na sua porção 5’, tornou-se interessante analisar se a presença
deste íntron influencia, de alguma forma, a expressão gênica do gene em estudo.
5.3 – Estudo da influência do íntron salT sobre a atividade promotora da região
de 256 pb através da análise de expressão transiente do gene GUS em tecido
foliar de A. thaliana
A expressão de qualquer gene é regulada por sua seqüência promotora
através da interação desta com fatores de transcrição específicos, permitindo que o
gene responda a vários estímulos, dependendo do gene em questão. Em 1987,
JEFFERSON e colaboradores utilizaram o gene β-glucuronidase (GUS) de E. coli como
uma fusão de gene marcador para análise de expressão gênica em plantas
transformadas, e até o ano de 2003 mais de 3500 trabalhos já citavam a utilização
do sistema repórter GUS para tal finalidade (VAIN, 2007). Seqüências promotoras
têm sido testadas mensurando a expressão deste gene repórter uidA, que codifica a
enzima β-glucuronidase (GUS). Tal enzima é facilmente mensurada utilizando o
substrato x-gluc para produzir uma cor azul no ensaio histoquímico e o substrato 4methyllumbelliferyl-glucuronide (MUG) que produz um composto fluorescente no
ensaio sensitivo quantitativo in vitro (INABA et al., 2007).
Diversos trabalhos avaliaram seqüências promotoras através da análise
histoquímica da expressão transiente do gene GUS em tecidos de plantas e,
adicionalmente, estudos que demonstraram a influência de íntrons sobre promotores
utilizaram a mesma abordagem (LU et al., 2008). Portando, com o intuito de avaliar a
atividade da região de 256 pb do promotor do gene salT e a influência do íntron salT
sobre a regulação deste gene, foram construídos três vetores de expressão em
plantas contendo fragmentos correspondentes à “Região de 256 pb”, “Região de 256
pb + Íntron salT” e “Região de 256 pb + Íntron Act1” regulando a expressão do gene
GUS. Adicionalmente, tornou-se possível uma análise comparativa dos níveis de
expressão obtidos pelos vetores contendo o íntron salT e o íntron Act1 do gene da
actina de arroz.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
70
Dissertação de mestrado
A transferência gênica mediada por Agrobacterium tem sido amplamente
utilizada como uma poderosa ferramenta para análise de genomas e melhoramento
de culturas (POTRYKUS, 1990; HOOYKAAS e SCHILPEROORT, 1992; TZFIRA e CITOVSKY,
2006; CITOVSKY et al., 2007; DAFNY-YELIN et al., 2008), e durante os últimos 30 anos,
a transformação mediada por Agrobacterium constitui o principal sistema de
transferência de DNA para novas tecnologias de obtenção de transgênicos (VAIN,
2007). Sendo assim, cada uma das construções obtidas pelo presente trabalho foi
introduzida em A. tumefaciens linhagem LBA 4440 via eletroporação. Visto que o
protocolo de transformação da planta modelo A. thaliana foi estabelecido na década
de 80 (ZAMBRYSKI et al., 1983) e desde então é amplamente utilizado (VAIN, 2007),
as diferentes cepas de A. tumefaciens foram infiltradas na superfície abaxial de
folhas de A. thaliana com o auxílio de seringas sem agulhas. Acredita-se que os
ferimentos gerados no processo de infecção poderiam induzir as vias de resposta a
estresses ambientais nas plantas, e desta forma, o promotor salT seria ativado.
Após a infecção, as plantas foram mantidas em câmara de cultivo por dois dias,
quando as folhas infectadas foram excisadas das plantas de origem e incubadas
com tampão x-gluc para a detecção da atividade do gene GUS.
A análise histoquímica da expressão transiente do gene GUS em tecidos
foliares de A. thaliana revelou a expressão deste gene repórter nas folhas
transformadas com as cepas de A. tumefaciens que portavam os vetores com o
íntron salT e o íntron Act1. Visto que a intensidade da cor azul está relacionada ao
nível de expressão do gene, os dados obtidos sugeriram que a região de 256 pb
sozinha não induziu a expressão do gene GUS, pelo menos não em níveis
detectáveis pelos ensaios histoquímicos. Os resultados sugeriram, ainda, que o
íntron salT exerce forte influência sobre a atividade promotora da região de 256 pb,
uma vez que sua presença na porção 3’ desta região ativou a expressão do gene
repórter (figura 17).
O efeito do aumento da expressão gênica mediado por íntrons (IME) já foi
demonstrado para diversos íntrons de plantas (SAMADDER et al., 2008), porém a
eficiência do IME difere em espécies de monocotiledôneas e dicotiledôneas (KOZIEL
et al., 1996). Íntrons que estimulam a expressão em monocotiledôneas incluem os
íntrons dos genes de milho Adh1, Sh1, Bz1, Hsp82, actina e GapA1 (CALLIS et al.,
1987; LUEHRSEN e WALBOT, 1991; MAAS et al., 1991; SINIBALDI e METTLER, 1992;
DONATH et al., 1995) e de arroz salT, Act1 e tpi (MCELROY et al., 1990; XU et al.,
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
71
Dissertação de mestrado
1994; RETHMEIER et al., 1997). Similarmente, íntrons de dicotiledôneas que elevam a
expressão incluem os íntrons dos genes SSU301 de petúnia rbcS (DEAN et al.,
1989), ST-LS1 de batata (LEON et al., 1991) e os genes de Arabidopsis UBQ3,
UBQ10, PAT1, atpk1, A1 EF-1α, e At eEF-1β (CURIE et al., 1993; NORRIS et al.,
1993; ZHANG et al., 1994; GIDEKEL et al., 1996; ROSE e LAST, 1997). Em plantas, a
inclusão de um ou mais íntrons em construções genéticas, geralmente, acarreta o
aumento do acúmulo de mRNA e proteínas comparado a construções similares onde
faltam íntrons (KOZIEL et al., 1996; SIMPSON e FILIPOWICZ, 1996).
Particularmente, o aumento da expressão gênica mediado pelo íntron salT
foi avaliado por RETHMEIER e colaboradores, em 1997. Nesta ocasião, o mecanismo
de IME foi estudado em milho utilizando os genes cat (chloramphenicol acetyl
transferase synthase gene) e bar (bialaphos resistence gene), flanqueados por
seqüências regulatórias idênticas. A inclusão do primeiro íntron do gene salT de
arroz na região 5’ não traduzida de ambos os genes, estimulou a expressão apenas
do gene cat. A presença do íntron salT não aumentou os níveis de proteína e do
mRNA codificados pelo gene bar, indicando que o aumento da expressão mediada
pelo íntron é um processo dependente do gene. Adicionalmente, seus resultados
mostraram que o processo de IME não tem um componente traducional, não tendo
efeito na estabilidade citoplasmática do mRNA de cat em células de milho
cultivadas, sugerindo que o IME atua no núcleo (RETHMEIER et al., 1997). Portanto,
os resultados apresentados pelo presente trabalho, corroboram os estudos prévios,
indicando que o íntron salT possui a habilidade de aumentar a expressão gênica.
Adicionalmente, a partir dos dados gerados pela expressão transiente do
gene GUS em tecidos foliares de A. thaliana tornou-se possível a análise
comparativa dos níveis de expressão obtidos pelos íntrons salT e Act1. Tais estudos
revelaram que o íntron salT apresenta maior capacidade de aumentar a expressão
gênica quando comparado ao íntron da actina de arroz, Act1. Porém, para que tais
hipóteses sejam confirmadas, será necessária a utilização de técnicas mais
sensíveis, como PCR em Tempo Real. Outra abordagem interessante será a
utilização de tecidos foliares de O. sativa para o estudo da expressão do gene GUS.
Desta forma, a identificação da melhor região regulatória consistirá em um sistema
de expressão induzível apropriado para a utilização em engenharia genética de
plantas, a fim de se obter plantas transgênicas tolerantes a estresses abióticos.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
72
Dissertação de mestrado
5.4 – Análise do perfil transcricional do gene salT em diversos tipos de células
e tecidos de O. sativa através de northern eletrônico
O estudo acerca dos sítios de ligação para fatores de transcrição
presentes na região de 256 pb, realizado através de análises in silico utilizando o
banco de dados OSIRIS, revelou a presença de 10 diferentes possíveis locais para
ligação de elementos regulatórios nesta região do promotor salT. Dentre este
resultado, que sugere a forma pela qual o gene é regulado, foi possível observar a
presença de uma única seqüência conservada relacionada à expressão tecidoespecífica. Tal sítio, conhecido como “RY Repeat”, tem sido caracterizado em genes
cuja expressão é regulada especificamente em sementes e, portanto, o motivo RY
Repeat é considerado tecido-específico (DICKINSON et al., 1988; BÄUMLEIN et al.,
1992; HATTORI et al., 1992).
O Projeto de Arroz da Universidade de Yale (Yale Rice Project) tem como
objetivo a construção, ainda em andamento, de um banco de dados do perfil
transcricional de todo o genoma de arroz em diversos tipos de células e tecidos
isolados por micro dissecação, o Centro Virtual da Universidade de Yale para o Perfil
de Expressão Celular em Arroz (Yale Virtual Center for Cellular Expression Profiling
of Rice Yale Rice Project: http://bioinformatics.med.yale.edu/riceatlas/overview.jspx).
Uma vez que foi identificada a presença do elemento RY Repeat na região
promotora do gene salT, tornou-se interessante a utilização desta ferramenta de
bioinformática para a análise do perfil transcricional do gene salT nos tecidos de
semente de arroz.
Segundo os resultados obtidos pelos ensaios de microarray desenvolvidos
pelo banco da Universidade de Yale, o gene salT apresenta alto nível de transcrição
em quatro tecidos de embrião de sementes, 12 h após a embebição – escutelo,
coleóptilo, epiblasto e radícula (figura 18). Nas células da plúmula o nível
transcricional do gene salT é baixo. Juntos, o escutelo (que absorve nutrientes do
tecido nutritivo) e o coleóptilo (que envolve e protege a plúmula) formam o
cotilédone, cuja função é transferir reservas alimentares do endosperma da semente
para o embrião até que as raízes e folhas estejam formadas, dando início aos
processos de fotossíntese e respiração. O epiblasto é uma formação de pequenas
dimensões em sementes, tida como um segundo cotilédone rudimentar, e a radícula
é o primórdio da raiz embrionária. O banco ainda não disponibilizou informações
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
73
Dissertação de mestrado
para as outras partes da semente (casca e endosperma), porém, este estudo
preliminar permitiu sugerir que a transcrição do gene salT ocorre em tecidos de
reserva e meristemáticos.
Muito embora o banco ainda não esteja completo, já encontram-se
disponíveis publicamente informações acerca do perfil transcricional em alguns
tecidos e células de plantas de arroz. Sendo assim, foram analisados os microarrays
de diferentes tipos celulares provenientes de brotos, folhas e raízes. Os dados
gerados mostraram que o gene salT apresenta alto nível de transcrição na folha
inteira e na raiz inteira (figura 19). A folha de monocotiledôneas, como o arroz,
compreende os tecidos do limbo (lâmina foliar) e bainha. Então, muito embora não
sejam fornecidas informações no website do banco sobre o que consistem as
amostras de folha inteira, é possível que correspondam aos tecidos da lâmina e
bainha foliar. Uma vez que nenhum nível significante de transcrição foi detectado
nos tecidos da lâmina foliar, este dado pode sugerir que o alto nível transcricional do
gene salT encontrado na folha seja proveniente dos tecidos da bainha, que
corresponde à porção basal alargada, que une a lâmina foliar ao caule. Além disso,
os resultados obtidos nos ensaios de PCR em Tempo Real, anteriormente
apresentados pelo presente trabalho, que demonstraram que mesmo em situações
normais os tecidos da bainha foliar possuem elevados níveis de transcrição do gene
salT, corroboram tal hipótese. Desta forma, a presença de células meristemáticas na
região basal da bainha foliar (MATSUKURA et al., 1998) sugere, mais uma vez, que a
transcrição do gene salT pode ocorrer em tecidos meristemáticos. Porém, não se
deve descartar a possibilidade da transcrição deste gene ocorrer em algum tipo
celular específico presente nesta parte da folha.
O mesmo fato pôde ser observado nos resultados para raiz. O gene salT
apresentou um forte nível de transcrição somente nas amostras de raiz inteira, mas
como os tecidos meristemáticos não foram avaliados, pode ser que a sua
transcrição ocorra de forma mais intensa neste tipo de tecido. Além disso, o elevado
nível de transcrição observado na radícula de sementes, que possui tecido
meristemático na sua extremidade, corrobora tal hipótese.
As hipóteses aqui apresentadas só poderão ser confirmadas quando as
informações
sobre
o
perfil
transcricional
nestes
tecidos
da
raiz
forem
disponibilizadas pelo banco, ou através de ensaios de PCR em Tempo Real.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
74
Dissertação de mestrado
6. CONCLUSÕES
6.1 – Foi detectada a presença dos elementos de transposição Castaway e
Stowaway na região promotora do gene salT dos cultivares Minami Hata Mochi e
Taichung Native 1. Em contrapartida, os cultivares Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC
4440 e Metica-1 não possuem tais inserções;
6.2 – A transcrição do gene salT ocorre na bainha de plantas de arroz mesmo na
ausência do fator estressante;
6.3 – Não há correlação entre a presença dos elementos de transposição Castaway
e Stowaway e o perfil transcricional do gene salT em condições de estresse, o que
indica que tais inserções não afetam negativamente a atividade do promotor salT;
6.4 – Os níveis basais (controle) e finais (estresse) da proteína SALT não refletem
os níveis de transcrição do gene salT nas mesmas situações, sugerindo uma intensa
regulação pós-traducional de tal proteína;
6.5 – Foram identificados 10 potenciais sítios de ligação para fatores de transcrição
na região de 256 pb do promotor do gene salT através de análise in silico utilizando
o banco de dados OSIRIS;
6.6 – Foram construídos três plasmídios vetores repórteres contendo a “região de
256 pb + GUS”, “região de 256 pb + íntron salT + GUS” e “região de 256 pb + íntron
Act1 + GUS”;
6.7 – Somente a cepa de Agrobacterium tumefaciens contendo o plasmídeo original
pA19-GUS foi capaz de expressar o gene GUS, excluindo a possibilidade de
resultados falso-positivos nos tecidos de plantas;
6.8 – As análises de expressão transiente do gene GUS em tecido foliar de
Arabidopsis thaliana demonstraram a capacidade do íntron salT em aumentar a
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
75
Dissertação de mestrado
expressão gênica, e mostrou, ainda, que tal capacidade é superior àquela obtida
pelo íntron Act1;
6.9 – A análise do perfil transcricional do gene salT no banco de expressão da
Universidade de Yale mostrou que tal gene é preferencialmente transcrito em
tecidos do embrião de semente. Adicionalmente, sugeriu-se sua intensa transcrição
na bainha das folhas e nos tecidos meristemáticos de raiz.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF
76
Dissertação de mestrado
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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