UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE ODONTOLOGIA
LUANA NASCIMENTO
SHEILA FOPPA ARZE TAMES
ESTUDO (IN VIVO) DO POTENCIAL OSTEOGÊNICO DA CHALCONA
EM FERIDA CRÍTICA DE CALOTA CRANIANA DE RATOS
Itajaí (SC) 2010
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LUANA NASCIMENTO
SHEILA FOPPA ARZE TAMES
ESTUDO (IN VIVO) DO POTENCIAL OSTEOGÊNICO DA CHALCONA
EM FERIDA CRÍTICA DE CALOTA CRANIANA DE RATOS
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
como requisito parcial para obtenção de créditos
da Disciplina de Metodologia Científica do Curso
de Odontologia da Universidade do Vale do
Itajaí.
Orientador: Prof. David Rivero Tames.
Itajaí (SC) 2010
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LUANA NASCIMENTO
SHEILA FOPPA ARZE TAMES
ESTUDO (IN VIVO) DO POTENCIAL OSTEOGÊNICO DA CHALCONA
EM FERIDA CRÍTICA DE CALOTA CRANIANA DE RATOS
O presente Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado como requisito parcial para
obtenção do título de cirurgião-dentista do Curso
de Odontologia da Universidade do Vale do
Itajaí, aos dezessete dias do mês de dezembro
do ano de dois mil e dez, é considerado
aprovado.
1. Prof. David Rivero Tames _______________________________________________
Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI)
2. Prof. Telmo José Mezadri _______________________________________________
Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI)
3. Profa. Maria Verônica D’Avila Pastor ______________________________________
Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI)
3
AGRADECIMENTOS
Gerais:
Agradecemos ao Professor David por ter nos orientado, por sempre estar pronto
para nos atender, pelo carinho, paciência, dedicação e respeito. Nosso muito obrigado!
Agradecemos também aos professores da banca avaliadora que aceitaram
nosso convite e a Equipe de Farmácia da UNIVALI pela participação tão importante na
manipulação do gel de chalcona.
Não podemos deixar de agradecer os professores do Setor de Apoio a Pesquisa
pelas correções e sugestões para deixar esse trabalho ainda melhor.
A todos nossos amigos de turma que juntos, acreditamos e conquistamos mais
este sonho.
A todos os funcionários do laboratório pela atenção e pela disposição para que
esta pesquisa fosse executada.
Luana:
Agradeço a Deus por iluminar meu caminho e me dar forças para seguir sempre
em frente.
Aos meus pais que em nenhum momento mediram esforços para realização dos
meus sonhos; que me guiaram pelos caminhos corretos; me ensinaram a fazer as
melhores escolhas e me ensinaram que devemos sempre lutar pelo que queremos.
Amo vocês.
A minha irmã e meu cunhado que me proporcionaram a felicidade de ser dinda
do Miguel e também por sempre irem fazer uma visitinha no meu quarto durante meus
estudos para falar besteiras ou levar uma tigela de pipoca. Obrigada!
A minha amiga Sheila que se tornou uma pessoa muito mais que especial em
minha vida. Quero lhe agradecer pelos momentos incríveis que passamos juntas
durante estes quatro anos e meio, agradecer pelo companheirismo, por me entender,
4
por agüentar meus momentos de loucuras e pelo incentivo de que sempre iríamos
chegar aqui juntas. Te amo muito.
As minhas amigas Marcela, Maria, Gladys, Days, Luiza e Bruna. Foi com vocês
que vivi momentos extremos, desde madrugadas de estudos até festas com muitas
histórias para contar. Meninas, amo muito vocês!
E a todos que de alguma forma direta ou indiretamente colaboraram para que eu
chegasse até aqui.
A todos meu carinho e muito obrigada!
Sheila:
Agradeço primeiramente a minha família. Uma família forte (muito forte), linda e
presente que me traz muito orgulho, alegrias e aprendizados. Vocês que me dão forças
para continuar crescendo e me inspiram cada dia mais. Amo vocês!
Agradeço aos verdadeiros amigos e amigas que fazem parte de mim e que
participam da minha vida.
Assim como agradeço as meninas da faculdade: Alia, Bruna, Days, Gladys,
Letícia, Luana, Luiza, Marcela e Maria Helena por me trazerem momentos de alegrias e
de conforto. Com certeza carregarei nossas lembranças, mas a vontade de tê-las por
perto vai ser sempre maior. Amo-as!
Agradeço ainda em separado a minha dupla Luana, que foi minha dupla não só
nas provas, trabalhos e clínicas, mas também nos apuros, nas confidências, nas
fofocas e risadas. Obrigada minha amiga por ser essa pessoa maravilhosa (e humilde)
e por sempre iluminar meus dias com o teu bom humor e alegria. Ainda vais ter que me
aturar muito!
E por fim, agradeço a todos que de forma ou indireta, participaram desse
trabalho e da minha vida!
5
ESTUDO (IN VIVO) DO POTENCIAL OSTEOGÊNICO DA CHALCONA EM FERIDA CRÍTICA
DE CALOTA CRANIANA DE RATOS
Luana NASCIMENTO e Sheila Foppa Arze TAMES
Orientador: Prof. David Rivero Tames
Resumo:
Embora existam numerosos indícios da utilização de plantas medicinais com propriedades
farmacológicas efetivas, não existem dados sobre a utilização de moléculas bioativas de origem
vegetal na estimulação do reparo ósseo, que é propósito deste estudo. Com esta finalidade,
foram utilizados 10 ratos Norvegicus albinus, fêmeas, com 60 dias de idade. Em todos os
animais sob anestesia, foram realizadas feridas únicas na calota craniana; depois, 05 foram
tratados com gel de Chalcona e 05 não foram tratados. Trinta dias após, foram sacrificados por
perfusão, sob anestesia, com paraformaldeído a 7% em tampão fosfato. Para mensuração da
área de ferida foi utilizado o programa imagetool. As calotas foram desmineralizadas com EDTA
e preparadas para inclusão em parafina e obtenção de cortes com 5µm de espessura e corados
com H.E. Os resultados obtidos mostraram que as feridas tratadas com chalcona tiveram uma
redução significantemente maior do que as feridas não tratadas. Os dados obtidos permitiram
concluir que a formulação farmacológica da chalcona utilizada neste estudo promove estímulo
do reparo ósseo demonstrado pela presença de osteoblastos ativos.
Palavras-chave: osteogênese, chalcona, reparo ósseo.
6
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ................................................................................ 07
2
REVISÃO DE LITERATURA ..........................................................
08
3
3.1
3.2
3.3
3.3.1
3.3.2
MATERIAIS E MÉTODOS ..............................................................
PROCEDIMENTOS CIRURGICOS ................................................
PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS ............................................
PROCEDIMENTOS DE ANÁLISE .................................................
ANÁLISE QUANTITATIVA ............................................................
ANÁLISE QUALITATIVA ...............................................................
19
19
21
22
22
23
4
4.1
4.2
RESULTADOS ................................................................................ 24
ANÁLISE QUANTITATIVA ............................................................ 24
ANÁLISE QUALITATIVA ............................................................... 25
5
DISCUSSÃO ................................................................................... 29
6
CONCLUSÃO .................................................................................
36
7
1 INTRODUÇÃO
A indução de osteogênese com a finalidade de ganhar volume ósseo tem sido
uma
das
preocupações
de
especialidades
odontológicas
como
periodontia,
implantodontia e cirurgia bucomaxilofacial.
Com esta finalidade são realizados inúmeros procedimentos, tais como
homeotransplante, heterotransplante, implantes de substâncias químicas inorgânicas
e/ou orgânicas7,18,19,21,25,26,29. Embora as investigações com plantas medicinais,
especialmente em relação a sua capacidade indutora de reparo, tenham sido relatadas
na literatura pertinente, se conhece pouco sobre seu uso no reparo de feridas ósseas24.
Neste
contexto,
as
propriedades
antibacterianas,
antitumorais,
antiulceras,
antihistamínicas, citotóxicas, antioxidantes e antiinflamatórias já divulgadas da
chalcona2-6,17 despertaram interesse na fitoterapia.
Chalconas são compostos da via de biossíntese dos flavonóides, importantes na
pigmentação de flores atraindo os insetos para a polinização e são extraídos de caules
e flores de algumas plantas. Mantendo-se o esqueleto da chalcona e mudando apenas
alguns radicais, tem se observado melhoria de algumas das propriedades
medicamentosas já citadas, permitindo sugerir também uma possível ação no reparo
tecidual. Entretanto, não existem dados sobre este potencial indutor e, portanto, se faz
necessário à realização de experimentos que confirmem ou não esta indicação30.
Um dos modelos mais utilizados para estudar o potencial indutor de reparo ósseo
é o da ferida crítica que consiste em promover uma ferida cujas dimensões não
permitem seu reparo espontâneo e completo11, assim, o modelo permite estudar, com
relativa segurança, a capacidade de substâncias orgânicas e/ou inorgânicas de induzir
o reparo ósseo quando implantadas dentro delas.
Desta forma, o estudo do potencial indutor de reparo ósseo em feridas críticas,
de calota craniana em ratos, poderá fornecer dados importantes para várias
especialidades da área de conhecimento da Odontologia. Por isso o objetivo deste
trabalho foi estudar o potencial osteogênico da chalcona e verificar o comportamento
celular, a qualidade do tecido ósseo formado e as prováveis reduções do tamanho da
ferida.
8
2 REVISÃO DE LITERATURA
Ripamonti e Reddi (1992) afirmaram que a matriz óssea desmineralizada tem a
capacidade de induzir a formação de novo osso em um sítio heterotópico de
implantação. Indicaram que neste mecanismo ocorre a ativação da cascata de
desenvolvimento ósseo incluindo: migração de células progenitoras por quimiotaxia,
condensação de células através da proliferação das células mesenquimais e
diferenciação de osteoblastos. Salientaram que a formação de novo osso é promovido
por vários fatores de crescimento.
Gómez et al. (2006) avaliaram o reparo ósseo em feridas críticas de 6mm em
calotas cranianas de 18 ratos, usando fator de crescimento derivado de fibroblastos
(FGF-1) contido numa membrana biodegradável de poly-L/D-lactide (PLDLA). Os
animais foram divididos em três grupos: 1) grupo controle sem tratamento, 2) só a
membrana e 3) membrana com FGF-1. Radiograficamente, a forma da ferida do grupo
controle mudou da forma redonda para oval e nos demais grupos esta se apresentou
redonda com bordas irregulares. Histologicamente, após 8 semanas, os exames
revelaram que nos grupos 1 e 2 houve pouco ou nenhum pré-osso, enquanto que no
grupo 3 houve pouca ou moderada formação de osso. Concluíram, portanto, que não
houve benefícios no reparo ósseo com a combinação do FGF-1.
Kneser et al. (2006) explicaram que, em feridas críticas de calota craniana de
ratos tratados com enxerto de discos de osso esponjoso bovino, recobertos com gel de
fibrina contendo osteoblastos (em um grupo) ou sem osteoblastos (em outro grupo) e
não-tratadas (grupo controle), os espécimes obtidos no dia 0, 2 e 4 meses após,
analisados histológica e morfométricamente, mostraram em um mês neoformação
óssea limitada apenas a pequenas áreas periféricas de todas as feridas tratadas. Dois a
4 meses depois, nestas feridas, ocorreu uma neoformação óssea significativa, áreas de
reabsorção do enxerto, bem como a sua integração a osso neoformado; nas feridas
não-tratadas não houve formação significante de osso. Estatisticamente, o potencial
osteogênico dos enxertos de osso utilizados nestas feridas (com e sem osteoblastos)
não apresentou diferenças significantes, indicando que o osso esponjoso preparado de
9
bovinos é um biomaterial promissor para a reconstrução de feridas críticas de calota
craniana.
Werkman et al. (2006) utilizaram 84 ratos, com três meses de idade, separados
em 4 grupos de 21 animais, sendo 3 grupos submetidos à castração e 1 grupo a falsa
cirurgia (“Sham”); em todos os animais foram realizadas feridas críticas na tíbia. Os
tratamentos experimentais foram iniciados de acordo com os seguintes grupos:
castrado/risedronato(CR); castrado/Calcarea-phosphorica-6CH(CCp); castrado/placebo
(CP) e "sham"/placebo (SP). Os animais foram sacrificados aos 7, 14 e 28 dias após o
início do tratamento e as tíbias foram removidas. Observaram que radiograficamente, a
densidade do grupo CR apresentou um crescimento progressivo. O grupo CCp mostrou
alta densidade até o 14o dia, diminuindo no 28o dia. O grupo CP mostrou uma
densidade estável durante todo o experimento e no grupo SP a densidade diminuiu do
7º dia até o 28º dia. Concluíram que no grupo tratado com risedronato houve grande
quantidade de osso, porém, esse osso formado continuou com um aspecto trabeculado,
enquanto que o tratamento com Calcarea phosphorica 6CH mudou de um aspecto
trabeculado inicial para um osso lamelar ao final do experimento. Mesmo assim,
sugeriram a necessidade de realizar mais pesquisas para avaliar a resistência e
qualidade do osso neoformado.
Campos-Buzzi et al. (2007) compararam a atividade analgésica de chalconas
sintéticas com a do ácido acetilsalicílico e acetaminofen, drogas analgésicas
tradicionais no uso da medicação contra dores e foi observado que as chalconas
inibiram as manifestações de dor em níveis de 84 a 94% contra 35 e 38% das drogas
conhecidas.
Kamakura et al. (2007) implantaram discos de fosfato octacálcio + esponja
colágena porcina (OCP/Col), fosfato beta-tricálcio + compósito colágeno (beta-TCP/Col)
e hidroxiapatita + compósito colágeno (HA/Col) em feridas críticas em calotas cranianas
de ratos que foram sacrificados 4 e 12 semanas depois da implantação destes. Através
de análises histomorfométricas, histológicas e radiográficas relataram que a formação
de osso novo foi mais significante no grupo com OCP/Col do que nos grupos betaTCP/Col ou HA/Col. Em contrapartida, os grânulos remanescentes em OCP/Col foram
significantemente menores do que nos grupos com beta-TCP/Col ou HA/Col. A
10
regeneração óssea pelo OCP/Col foi baseada em colágeno calcificado, enquanto isso a
regeneração óssea induzida por beta-TCP/Col ou HA/Col foi iniciada por colágeno
pobremente calcificado e osteoconduzida pelo beta-TCP ou HA. Com esses resultados
concluíram que o OCP/Col regenerou mais osso do que o beta-TCP/Col e HA/Col.
Estudando o mecanismo da atividade antiinflamatória de chalconas sintéticas,
Kim et el. (2007) identificaram que muitas delas, inibem a atividade do óxido nítrico
sintetase durante a produção do óxido nítrico sugerindo a possibilidade da utilização
destas chalconas no desenvolvimento de novas formulações medicamentosas
antiinflamatórias.
Marzouk et al. (2007) estudaram o potencial osteogênico de microesferas de vinil
estireno como agente carregador de fator de crescimento derivado de plaquetas. Para
tanto, feridas críticas na calota craniana de 73 ratos foram realizados e os animais
foram divididos em quatro grupos: grupo controle, grupo com microesferas de vinil
estireno (VSM), grupo com fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB), e
grupo com VSM e PDGF-BB. Os animais foram sacrificados 2, 4 e 16 semanas após a
cirurgia. Nas feridas tratadas somente com as microesferas ou misturadas com fator de
crescimento derivado de plaquetas, houve um preenchimento estatisticamente maior da
ferida do que os grupos sem VSM em todos os tempos pós-cirurgia. Nas análises
radiográficas, o grupo VSM/PDGF mostrou menor volume ósseo quando comparado
com os outros grupos, exceto quando comparada com a quarta semana do grupo VSM.
E o grupo PDGF mostrou possuir o maior volume ósseo, menos quando comparado
com a quarta semana do grupo VSM, mostrando que o VSM com PDGF não é capaz de
melhorar a capacidade de regeneração óssea quando comparada com o VSM sozinho.
Nyan et al. (2007) mostraram a possibilidade de utilizar moléculas bioativas e
biomateriais com a finalidade de melhorar o reparo ósseo. Assim, em 45 ratos com
feridas críticas de 8mm de diâmetro, observados com radiografias e tomografias
computadorizadas, 2, 4 e 8 semanas após as cirurgias, mostraram que a sinvastatina,
em combinação com o sulfato de cálcio promove uma inflamação intensa nos períodos
iniciais do reparo e osteogênese mais acentuada nos períodos tardios.
Pripatnanont et al. (2007) realizaram experimentos com dez coelhos, cada um
com duas feridas críticas, que foram sacrificados após 8 semanas da cirurgia. Quatro
11
desses coelhos foram usados como controle e um de seus defeitos foi preenchido com
osso autógeno, enquanto que o outro foi deixado vazio. Nos outros seis coelhos, com o
total de 12 feridas críticas, foram divididas igualitariamente em três grupos: preenchidas
com hidroxiapatita sinterizadas a 800°C (HA 800), a 1200°C (HA 1200), e a 1350°C (HA
1350). Os resultados da densitometria óptica e histomorfometria indicam que a
sinterese da hidroxiapatita em temperaturas altas, aumenta o reparo ósseo, e a
sinterizada a 1200°C tende a proporcionar maior formação óssea quando comparada
com as outras duas hidroxiapatitas.
Ascherman et al. (2008) tiveram como objetivo analisar dois defeitos críticos de
10mm de diâmetro a cada lado da linha média no osso parietal de 20 coelhos brancos.
Em 10 desses animais, o defeito esquerdo foi preenchido somente com cemento de
hidroxiapatita de presa rápida (Mimix) e os outros 10 tiveram seu defeitos preenchidos
com uma placa reabsorvível na base do defeito antes de colocar o Mimix. Os defeitos
do lado direito serviram como controle em todos os animais e foram mantidos sem
qualquer material no seu interior. Observou-se que 6 meses após, não houve
inflamação ao redor da ferida ou junto à duramáter e nem qualquer outra reação
histológica negativa em ambos os grupos. Em todas as feridas houve um crescimento
ósseo na periferia da ferida, porém nas feridas não tratadas, houve reparo maior com
osso primário em remodelamento. Nas feridas tratadas somente com Mimix houve
osteogênese em área pequena das bordas da ferida e a parte central preenchida com
tecido fibroso. Não houve qualquer tipo de deslocamento do Mimix em todos os
defeitos.
Chiaradia et al. (2008) quando a atividade inibitória do óxido nítrico sintetase
induzido de algumas chalconas sintéticas é comparado com o composto 1400W, um
inibidor altamente seletivo desta enzima, constataram que o potencial inibitório foi igual
ou superior ao do composto 1400W.
Hong et al. (2008) com a finalidade de avaliar o efeito biológico de uma
membrana de alginato e cálcio, realizaram em 45 coelhos adultos, junto a cada ângulo
mandibular, feridas críticas com 5mm de diâmetro cobertas com: membrana de alginato
e cálcio (grupo experimental), membrana convencional de colágeno ou deixados vazios
(grupos controles). Os animais foram sacrificados 1, 2, 4, 6, e 8 semanas após as
12
cirurgias e preparadas para avaliação morfológica e morfométrica em microscopia. Os
resultados mostraram que o reparo ocorre centripetamente. A análise histométrica
revelou que houve uma formação significantemente maior de osso novo nas feridas
cobertas com membrana de alginato e cálcio comparado com as cobertas com
membrana convencional de colágeno e as vazias no período de 2 a 6 semanas. No
período de 6 a 8 semanas as feridas cobertas com membrana de alginato e cálcio
mostraram presença significantemente maior de osso lamelar maduro que o coberto
com membrana convencional de colágeno. As feridas vazias mostraram, 8 semanas
após, reparo incompleto.
Honma et al. (2008) explicaram que uma ferida óssea que não é reparada
completamente é denominada de defeito sem união ou defeito de tamanho crítico e o
mecanismo biológico que regula este processo não é conhecido. Estudo realizado com
este modelo, em calota craniana, comparando o comportamento celular osteoblástico e
de osteócitos, sugere que resultados obtidos neste modelo de estudo, podem
proporcionar dados importantes para a pesquisa clínica sobre reparo ósseo. Em feridas
críticas (8,8mm diâmetro) e não-críticas (3,8mm diâmetro), em calota craniana de ratos,
foi observado que a formação de osso reparador cessa dentro de 24 semanas em
ambas as feridas (críticas e não-críticas), ou seja, osteoblastos e osteócitos cessam a
formação óssea, bem como a diferenciação dos osteoblastos de células progenitoras.
Além disso, a reparação óssea procede do periósteo, localizado em ambos os lados do
osso parietal, mas não a partir da superfície do rebordo ósseo ao redor do defeito
original.
Intini et al. (2008) usou 25 ratos que foram divididos em cinco grupos, cujas
feridas críticas foram tratadas com: osso descalcificado e liofilizado (DFDBA); proteínas
derivadas de matriz de esmalte (EMD); proteína morfogenética de osso humano
recombinante-2 (rhBMP-2) carregado em colágeno (controle positivo); sem nenhum
material implantado (controle negativo); e um grupo com a calota intacta. Todos os
animais foram sacrificados 8 semanas após a cirurgia e as feridas foram avaliadas
microscopicamente. O grupo controle negativo e o grupo EMD não mostraram formação
óssea no centro da ferida, mas mostraram reparação na sua margem. No grupo
DFDBA, grãos do DFDBA ainda estavam presentes na oitava semana, e uma pequena
13
quantidade de osteoindução foi vista no centro do defeito. Diferente do rhBMP-2 que
mostrou regeneração óssea por todo a ferida, o DFDBA e EMD mostraram ter uma
habilidade limitada para formar osso, não sendo portanto, efetivos na regeneração
óssea.
Issa et al. (2008a) usaram 56 ratos machos Wistar, com feridas críticas no corpo
da mandíbula, que foram divididos em 2 grupos, considerando 2 períodos de tempo.
Depois, cada grupo foi dividido em 4 novos grupos com 7 animais cada e tratadas suas
feridas da seguinte maneira: O grupo 1 com proteína morfogenética de osso humano
recombinante-2 (rhBMP-2), grupo 2 com rhBMP-2 + colágeno, grupo 3 com rhBMP-2 +
poloxamer e o grupo 4 com rhBMP-2 + poloxamer + colágeno. Duas e 4 semanas
depois os animais foram sacrificados e as respectivas hemiarcadas foram removidas
para análise histológica. Observou-se uma diferença significante entre todos os grupos
analisados e entre o período de tempo desde a cirurgia. Com este estudo foi possível
concluir que o rhBMP-2 foi capaz de induzir a regeneração óssea e teve sua ação
potencializada quando combinada com os carregadores utilizados no experimento,
sendo a reparação óssea dependente do tempo.
Issa et al. (2008b) avaliaram a quantidade e qualidade do novo osso formado
estimulado pela proteína morfogenética de osso humano recombinante-2 (rhBMP-2) em
combinação com monoolein ou gel chitosan como veículos colocados em feridas
críticas criadas em 56 mandíbulas de ratos Wistar., divididos em 2 grupos (N=28)
(sacrificadas 2 e 4 semanas após cirurgia). As feridas críticas foram preenchidas com:
rhBMP-2 em solução aquosa, rhBMP-2 sol. Aquosa + esponja de colágeno, rhBMP-2
combinado com gel de poloxamer, rhBMP-2 combinado com gel de poloxamer +
colágeno; em cada grupo foram sacrificados 7 animais em cada tempo pós-operatório
(2 e 4 semanas). Os resultados mostraram que o rhBMP-2 utilizado foi capaz de induzir
o reparo ósseo e que sua ação é otimizada quando combinado ao uso de carregadores,
sendo o reparo ósseo dependente do tempo.
Khojasteh et al. (2008) utilizaram 22 ratos com dois buracos de 5mm de diâmetro
preparados no osso parietal e divididos em dois grupos. No primeiro grupo, a ferida da
esquerda foi preenchida com Bio-Oss + PRP (plasma enriquecido com plaquetas) e da
direita preenchido com células-tronco mesenquimais cultivadas com Bio-Oss. O mesmo
14
foi feito no segundo grupo, porém o Bio-Oss foi substituído por Kasios. Os animais
foram sacrificados 6 semanas depois da cirurgia. Observou-se que em ambos os
grupos, células-tronco mesenquimais revelaram uma porcentagem maior de formação
óssea do que os grupos com PRP, e que o substituto ósseo Kasios, combinado com
células-tronco, pode reforçar a regeneração óssea mais do que o substituto ósseo
tradicional (Bio-Oss).
Kramer et al. (2008) trataram buracos críticos na calota de quatro carneiros, com
distração bifocal colocando segmentos transportadores osteogênicos constituídos de
osso autógeno ou de biomaterial de osso esponjoso bovino desproteinizado. Após um
período de latência de 5 dias a distração (1mm/dia) foi realizada durante 28 dias.
Através de radiografias e exames histológicos observaram que em ambos os grupos, o
transporte osteogênico resultou em formação óssea, indicando que o biomaterial pode
contribuir para a regeneração óssea no transporte bifocal osteogênico com sucesso,
evitando uma segunda intervenção para obter osso autólogo. No entanto, este novo
osso formado apresenta volume e espessura menor.
Messora et al. (2008) utilizaram trinta e dois ratos que foram divididos em dois
grupos: grupo controle e grupo plasma rico em plaquetas. Em ambos os grupos, um
buraco crítico com 8mm de diâmetro foi realizado em suas calotas cranianas, e os
animais foram sacrificados depois de 4 e 12 semanas. Após análises histológicas e
histométricas observou-se que em nenhum dos casos houve uma regeneração óssea
completa, mesmo assim o grupo plasma rico em plaqueta obteve melhor formação,
mostrando que o plasma rico em plaquetas aumentou o processo de cicatrização
óssea, porém o osso neoformado é mais delgado que o normal.
Oliveira et al. (2008) estudaram, em feridas críticas com 8mm de diâmetro em
calota craniana de 50 ratos, o potencial reparador do osso bovino desmineralizado
(DBB) e de osso autógeno (AB) implantadados nas feridas, em períodos de 7, 14, 21,
30 e 90 dias pós-cirurgia. A análise histológica mostrou cicatrização total dos defeitos
em 90 dias no grupo AB, sem alterações marcantes durante os períodos experimentais
e com melhor neoformação óssea. No grupo DBB ocorreu a substituição do biomaterial
por tecido fibrótico no período experimental de 21 dias, uma rápida reabsorção do
material implantado e um reparo incompleto das feridas.
15
Em modelo de estudo com fratura de tíbias de coelhos, Öztürk et al. (2008)
observaram que a utilização de fitoestrogênios contidos em extratos de Vitex agnuscastusL. (Verbenaceae), administrados intramuscularmente (0,75mg/ a cada 2 dias),
promove melhoria na resposta do reparo ósseo nos primeiros períodos, 7 e 14 dias pósfratura, e que em períodos tardios, 25 dias, não apresenta nenhuma modificação.
Park et al. (2008) efetuaram um buraco crítico de 8mm de diâmetro na calota de
75 ratos. Estes foram divididos em 4 grupos experimentais e um grupo controle (sem
tratamento). As feridas dos grupos experimentais foram preenchidas com partículas de
dentina de porco (grupo 1), o grupo 2 com uma mistura de partícula de dentina e gesso
Paris, o grupo 3 com partícula de dentina e chitosan e o grupo 4 só com chitosan. Os
animais foram sacrificados 2, 4 e 8 semanas depois da cirurgia. Todos os grupos
experimentais mostraram maior formação óssea quando comparada com o grupo
controle. Todos os grupos exibiram crescimento maior na 8o semana do que na 4o
semana. Concluiu-se que as feridas tratadas com a mistura de partícula de dentina com
chitosan apresentam um excelente efeito na regeneração óssea.
Por et al. (2008) avaliaram a melhor combinação de biomateriais com proteína
morfogenética de osso humano recombinante-2 (rhBMP-2) e plasma enriquecido com
plaquetas (PRP), para obter o reparo de defeitos ósseos críticos na calota craniana de
18 cães. As feridas divididas em 6 grupos foram tratadas com: matriz óssea
desmineralizada e cromo-cobalto; matriz óssea desmineralizada combinado com PRP e
metal; matriz óssea desmineralizada combinada com PRP e placa reabsorvível; matriz
óssea desmineralizada combinada com BMP-2 e metal; matriz óssea desmineralizada
combinada com BMP-2, PRP e metal; matriz óssea desmineralizada combinada com
BMP-2 e placa reabsorvível, o reparo foi avaliado 3 meses após as cirurgias. Os dados
obtidos
através
de
avaliação
macroscópica,
tomografia
computadorizada
e
microscopicamente, sugeriram que as combinações com BMP-2 promovem um reparo
mais acentuado e as combinações com PRP não tem efeito significativo no reparo.
Sakakura et al. (2008) avaliaram a influência do tratamento homeopático com
comfrey
sobre
a
densidade
óssea
em
torno
de
implantes de titânio. Quarenta e oito ratos foram divididos em dois grupos: um grupo
controle e um grupo teste (SO). Cada animal recebeu um microimplante de titânio
16
colocado na tíbia. O grupo SO foi submetido a 10 gotas de comfrey 6CH misturadas na
água potável todo dia. Oito animais de cada grupo foram sacrificados aos 7, 14 e 28
dias pós-cirurgia. A comparação das imagens de radiografias digitalizadas e
padronizadas, obtidas no dia do implante e nos dias de sacrifício, mostraram que o
comfrey promoveu uma maior densidade óssea, ao redor do implante, no 14° dia e o
volume ósseo foi maior que o controle somente no 7° dia. Demonstrando assim que o
comfrey promove aumento da densidade radiográfica em torno dos implantes nos
períodos iniciais do reparo.
Develioglu et al. (2009) criaram defeitos no osso parietal de 14 ratos. O defeito
direito foi preenchido com xenograft (Unilab Surgibone®), enquanto que o esquerdo foi
usado para controle. Trinta dias pós-cirurgia, observou-se tecido colágeno na ferida
controle, enquanto que na ferida experimental observou-se partículas de xenograft
cercadas por uma camada de tecido fibroso. Concluiu-se que o material é
biocompatível, podendo ser usado como um material para preencher defeitos ósseos.
Tran et al. (2009) mostraram que algumas modificações na molécula de
chalconas pode especificar uma das suas atividades biológicas, assim as chalconas
que sintetizaram, se mostraram mais efetivas como anti-inflamatórios, inibindo a
produção de prostaglandina-2, do que sua atividade citotóxica. Apesar das várias
atividades biológicas, das chalconas sintéticas, relatadas na literatura consultada, não
se encontra nenhuma relacionada com a atividade osteogênica.
Bandgar et al. (2010a) prepararam chalconas sintéticas e avaliaram seu
potencial anticancerígeno contra 5 tipos celulares de câncer; anti-inflamatória e antioxidante. Observaram a inibição das células cancerosas humanas com uma eficiência
semelhante ou maior às obtidas por compostos conhecidos como flavopiridol e
gemcitabine; a atividade anti-inflamatória foi também promissora comparando a
capacidade inibitória de TNF-ά e IL-6, com anti-inflamatórios conhecidos como a
dexametasona; também foi obtida atividade antioxidante.
Bandagar et al. (2010b) observaram que outras chalconas sintetizadas
mostraram atividade antiinflamatória inibindo efetivamente a atividade das enzimas:
ciclooxigenase-2, tripsina e ß-glucoronidase; sua capacidade antioxidante foi moderada.
17
Batovska et al. (2010) afirmaram que as chalconas são um grupo de compostos
que são intermediários ou produtos finais na biosíntese de flavonóides. Funcionam
como substâncias defensivas, participando nas inter-relações planta/insetos e
contribuem com o potencial medicinal das plantas. Estudos farmacológicos de várias
chalconas isoladas de plantas têm mostrado potencial medicamentoso para tratamento
de câncer, desordens virais e cardiovasculares ou como ingredientes de preparados
cosméticos. As chalconas sinteticamente derivadas podem conter um ou mais aryl
substituintes; muitos desses grupos funcionais influenciam em certo grau atividades
biológicas específicas. Porém, as cetonas insaturadas-ά,ß são consideradas como os
maiores farmacóforos uma vez que sua remoção total ou parcial leva à perda de sua
bioatividade, desta forma, novas moléculas tem sido sintetizadas por introdução de άsubstituintes. Os esforços das sínteses das chalconas têm como finalidade principal
desenvolver novas drogas eficientes sobre um esqueleto de chalconas, modificando
apenas alguns radicais. Entre as atividades medicamentosas destas chalconas
sintetizadas estão relacionas as atividades: antioxidantes, antiinflamatórias, citotóxicas
contra a atividade de células cancerosas, quimiopreventiva para câncer, antibacteriana,
antifúngica, antiviral, antiparasitária, analgésicas, e outros.
Harvey (2010) estudou complexos de controle de crescimento, especificamente o
complexo formado por Bunched e Madm. Sugere que este complexo tenha a função
semelhante ao Fator Transformador do Crescimento TGF-ß, controlando o crescimento
tecidual, porém a via de ação ainda não está totalmente determinada.
Uprety et al. (2010) perceberam que a etnobotânica contribui para a descoberta
de drogas e desenvolvimento socioeconômico e, que existe poucos estudos
comparando e relatando a bioeficácia do uso de plantas indígenas com propriedades
fitoquímicas e farmacológicas. Neste estudo relatam que em Rasuwa, distrito do Nepal
Central, documentaram um total de 60 formulações medicinais de 56 espécies de
plantas, a maioria sendo usadas para distúrbios gastrointestinais, febre e dor de
cabeça. A fonte primária entre as plantas medicinais foram ervas (57%) e árvores
(23%). Observaram uma alta fidelidade de informação no tratamento de problemas
oftalmológicos,
renais,
distúrbios
menstruais
e
dor
de
dente;
as
espécies
tradicionalmente usadas para tratar esses distúrbios que estão sendo pesquisados para
18
detectar os compostos bioativos são: Astilbe rivularis, Berberis asiatica, Hippophae
salicifolia,
Juniperus
recurva,
e
Swertia
multicaulis.
Foi
encontrada
uma
correspondência de 90% entre o uso de plantas locais e a composição química e
propriedades farmacológicas relatadas de 30 plantas medicinais. Estas observações
permitiram
concluir
que
a
população
estudada
tem
um
rico
conhecimento
etnofarmacológico e que possuem muitas plantas com alto valor medicinal o que indica
um alto potencial para o desenvolvimento socioeconômico através da coleta autosustentável e industrialização de produtos farmacológicos.
Whited e Tabin (2010) afirmaram que desde os primeiros dias de estudo da
regeneração celular, um dos principais objetivos é a caracterização celular e molecular
da natureza das células do blastema. O blastema é a estrutura que se desenvolve na
extremidade cortada de um membro amputado em alguns vertebrados, a partir do qual
o membro se regenera. Embora as células do blastema sejam como células-tronco,
estas são células progenitoras com a potencialidade de originar um tipo de tecido e não
conseguem promover a substituição da complexidade estrutural de um membro
perdido. Recentemente, um protocolo para a obtenção de células-tronco pluripotentes,
células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCSs), a partir de células diferenciadas,
através da expressão de apenas um punhado de genes, tem sido desenvolvido. Entre
as células do blastema, “células pluripotentes embrionárias de referência” (da mesma
espécie), e iPSCSs (obtido in vitro), provavelmente tem mais semelhança, do ponto de
vista de expressão gênica, do que as células do blastema. Talvez isso não seja
inesperado, pois se sabe que as células embrionárias pluripotentes de referência e os
iPSCSs tem mais potencial de desenvolvimento que as células do blastema, isto é, uma
célula do blastema não pode substituir naturalmente um organismo inteiro, enquanto
que um rato inteiro pode ser clonado a partir de um iPSCSs.
19
3 MATERIAIS E MÉTODOS
O projeto recebeu aprovação da Comissão de Ética em Pesquisa da UNIVALI,
sob o nº 155/09.
A composição molecular da chalcona sintética utilizada para realização deste
trabalho (Figura 1), com a finalidade de avaliar o estímulo a reparação de tecido ósseo,
foi manipulada em gel pela equipe da Farmácia da Universidade do Vale do Itajaí.
Figura 1. Composição molecular da chalcona sintética.
Previamente ao experimento definitivo, foi executado um experimento piloto,
utilizando 05 ratos Novergicus albinus fêmeas com 60 dias de idade, com a finalidade
de padronizar a metodologia cirúrgica e as colorações dos tipos de tecido de reparo
ósseo (primário e secundário).
Para o experimento definitivo, foram utilizados 10 ratos fêmeas Novergicus
albinus com 60 dias de idade, divididas igualitariamente em 2 grupos: experimental,
tratados com gel de chalcona (N=5) e controle, não-tratados (N=5).
3.1 Procedimentos cirúrgicos
Os animais foram anestesiados com Cloridrato de Ketamina 10mg/kg e logo
após foi feita uma incisão na linha média da calota craniana. O local cirúrgico foi lavado
com soro fisiológico e foi selecionada a região que serviu de padrão para a realização
de todos os buracos críticos: sutura interparietal e interociptal, lado direito. (Figura 2)
20
Figura 2: A região entre a sutura interparietal e interociptal (seta) foi o local escolhido
como padrão para realização das feridas críticas.
Os planos cutâneo e periosteal foram rebatidos a fim de obter uma área de osso
sem revestimento e neste, com uma trefina cirúrgica de 5mm de diâmetro, removeu-se
um disco ósseo contendo as corticais ósseas e o osso esponjoso subjacente,
permitindo a obtenção da ferida crítica. Sobre o halo cirúrgico dos ratos do grupo
experimental, foi aplicada um composto de chalcona a 10% em vaselina (0,5mg de
Chalcona e 4,5mg de vaselina). (Figuras 3, 4 e 5)
B
D
Figura 3: Broca Trefina para perfuração da calota craniana Figura 4: Remoção do disco de 5mm (D).
21
Figura 5: Aplicação do gel de chalcona sobre o halo cirúrgico (seta).
O periósteo foi, então, reposicionado e com uma agulha de 16mm de
comprimento com corte reverso e com um fio absorvível Cat Gut simples, o tecido foi
suturado.
Antes de terminar o procedimento cirúrgico, foi administrado, por via subcutânea,
Bupremorfina 0,05mg/kg e repetidos essa administração a cada 12 horas durante 2
dias. Durante todo o período experimental os animais foram observados diariamente a
fim de identificar prováveis reações colaterais como infecções e mensurar o diâmetro da
ferida com auxílio de um paquímetro para acompanhar o grau de fechamento da ferida;
se identificadas às reações colaterais, os animais respectivos seriam tratados e
eliminados do estudo, o que não precisou ser feito, pois nenhum rato apresentou
alguma reação colateral.
3.2 Procedimentos histológicos
Transcorridos 30 dias da intervenção cirúrgica, todos os animais foram
anestesiados e sacrificados por perfusão com paraformaldeído a 7% em tampão fosfato
para melhor fixação e então, se retirou a área da ferida critica a ser analisado.
O material coletado foi fixado mais uma vez por imersão em paraformaldeído a
7% em tampão fosfato, pH 7,4 por 72 horas. Após a fixação, iniciou-se o processo de
desmineralização com EDTA a 10% em tampão fosfato, analisando semanalmente sua
eficácia, utilizando uma ponta de agulha e a facilidade ou não de sua penetração no
osso.
22
Após a desmineralização o material foi desidratado com álcoois de concentração
crescente (70, 90 e 100%), clareados com xilol e incluídos em parafina.
Deste material foram obtidos cortes semisseriados 1:10 com espessura de 7µm
e corados pela Hematoxilina e Eosina.
3.3 Procedimento de análise
3.3.1 Análise quantitativa
Para avaliar e mensurar os tamanhos de todas as feridas críticas, para explicitar
valores fornecidos macroscopicamente e para comparar as distâncias entre as bordas
do tecido ósseo do reparo, foi utilizado o programa Image Tool. Foi a partir deste
mesmo programa que se definiu uma média de 18.413,00 como total de pixels para
uma área de 5mm (Figura 6), para posterior comparação com os demais resultados. Os
dados quantitativos obtidos foram analisados estatisticamente usando o método de
Tukey.
Figura 6: Programa Image Tool. Ferida crítica com 5mm de diâmetro e sua conversão para
pixels.
23
3.3.2 Análise qualitativa
As lâminas foram analisadas em microscopia de luz transmitida, onde se
observou a qualidade dos tecidos ósseos formados (primário e secundário) e os tipos
celulares envolvidos no processo de reparo. Sabe-se para tanto que no início, o osso
formado é chamado de Osso Primário que é menos denso, e que apresenta muitos
osteócitos desorganizados. Com o passar do tempo, vai ocorrendo à reabsorção desse
osso primário e a formação do Osso Secundário, que é mais denso e seus osteócitos
se encontram em menor número, porém, mais organizados.
24
4 RESULTADOS
4.1 Análise quantitativa
Analisando a área da ferida 30 dias após a cirurgia dos animais, observou-se que
a média das feridas do grupo experimental foi menor do que a média das feridas do
grupo controle, sendo que a análise estatística através do teste Tukey demonstrou que
esta diferença é estatisticamente significante, Tukey P< 0.05. (Figuras 7, 8 e Tabela 1).
Figura 7: Macrofotografias do reparo das feridas após 30 dias. C = controle. As setas
indicam a localização da ferida.
Figura 8: Macrofotografias do reparo das feridas após 30 dias: E = experimental. As setas
indicam a localização das feridas
25
Tabela 1: Redução do tamanho da ferida 30 dias de tratamento.
CONTROLE
EXPERIMENTAL
4,99mm
4,85mm
4.56mm
4.52mm
4.27mm
4,22mm
2,10mm
0,42mm
0,64mm
3,68mm
MÉDIA = 4.466 +- 0.35
MÉDIA= 2.212 +- 1.72
Comparando a média da área das feridas iniciais (controle) com as feridas 30
dias após, observou-se que no grupo controle houve uma diminuição da área da ferida
em 10,68% e no grupo experimental em 55,76% (Gráfico 1).
55,76%
10,68
Gráfico 1: Comparação da média do reparo das feridas críticas entre os grupos estudados.
4.2 Análise qualitativa
Os cortes histológicos mostraram que o reparo ósseo ocorreu das bordas da
ferida para o centro tanto no grupo controle como no grupo experimental. Entretanto em
algumas feridas, observaram-se indícios de osteogênese na parte central da ferida.
26
No grupo controle a ferida foi preenchida por uma membrana de tecido conjuntivo
localizado entre as bordas do tecido ósseo de reparo e em continuidade com o
periósteo; nas bordas ósseas do reparo não se observou uma continuidade de
osteogênese. (Figuras 9 e 10)
M
Figura 9: Ferida controle, 30 dias. Coloração HE. Aumento 4X. Montagem de 4 fotografias
cobrindo a largura da ferida. Observar: membrana (M) cobrindo a ferida.
Figura 10: Ferida controle, 30 dias. Coloração HE. Aumento 20X. Cotos da ferida com células
achatadas caracterizando células de revestimento (osteoblastos inativos) setas.
No grupo experimental entre as bordas do tecido ósseo de reparo observou-se uma
membrana de tecido conjuntivo em continuidade com o periósteo e com presença de
osteoblastos, junto a borda do tecido ósseo indicando a continuidade do reparo ósseo.
(Figuras 11 e 12)
27
Figura 11: Experimental, 30 dias. Coloração HE. Aumento aproximado no original 4x. As setas
indicam as bordas da ferida em reparo.
A
B
Figura 12: Experimental 30 dias. Coloração HE. Aumento aproximado no original: A 20x e B
40x. Observar: coto ósseo com osteoblastos ativos (setas).
A presença de osso primário no reparo ósseo foi observado tanto no grupo controle
como no grupo experimental, entretanto na maior parte do reparo ósseo do grupo
experimental encontrou-se osso secundário. (Figuras 13 A, B e 14 A, B).
28
P
P
S
S
A
B
Figura 13: Grupo experimental. Coloração H.E. aumento aproximado no original 10x (A) e 20x
(B). Observar: Osso de reparo secundário (S) na sua maioria, contendo poucas regiões de osso
primário (P)
P
S
P
A
S
B
Figura 14: Grupo experimental. Coloração H.E. aumento aproximado no original 10x (A) e 20x
(B). Observar: Osso de reparo primário (P) na sua maioria, contendo poucas regiões de osso
secundário (S).
29
5 DISCUSSÃO
Embora suas dimensões não obedeçam um padrão único, a escolha do modelo
de estudo de ferida crítica em calota craniana de rato, é de aceitação total uma vez que
os estudos que relatam reparo ósseo, o utilizam com muita freqüência (vide capítulo de
revisão da literatura) justificando sua utilização em nosso estudo.
Cabe salientar que em feridas críticas de calota craniana não ocorre o reparo
espontâneo; isto permite a premissa de potencial osteogênico do material utilizado,
quando é observado o fechamento da ferida. Embora, neste estudo, não tenhamos
observado a cascata de eventos vinculados à osteogênese, como relata o estudo de
Ripamonte
e
Reddi
(1992)
em
implantes
heterotópicos
de
matriz
óssea
desmineralizada, podemos afirmar a sua ocorrência induzida pela chalcona.
O grau de atividade celular comprometida com a osteogênese no reparo pode
ser avaliado pelo grau de diminuição das dimensões da ferida crítica como encontrado
por Gomez et al. (2006), em feridas críticas de calota craniana de ratos, onde relata
pouca, nenhuma ou moderada formação de osso, concluindo que o fator de
crescimento derivados de fibroblastos-1 (FGF-1) não evidenciou benefícios no reparo
ósseo; em nosso estudo, evidenciamos um potencial osteogênico da chalcona , melhor
do que o promovido pelo FGF-1, uma vez que houve uma redução de 55,76% do
tamanho da ferida com presença de osteoblastos ativos.
Entendo que a superfície de contato de implantes com o tecido receptor é
importante para a resposta osteogênica, Kneser et al. (2006) revestiram discos de osso
esponjoso bovino com gel de fibrina contendo osteoblastos e observou que, após 4
meses houve neoformação óssea significativa e que a presença dos osteoblastos não
modificou o potencial de reparo do disco de osso esponjoso; nossos resultados, 30
dias pós aplicação do gel de chalcona mostra a continuidade da osteogênese,
sugerindo que em períodos maiores possam ser atingidos níveis maiores de reparo,
além do que o procedimento cirúrgico é mais simples por não necessitar do preparo de
um disco de osso.
Werkman et al. (2006), estudando reparo ósseo lesões corticais na tíbia de ratos
experimentalmente
osteoporóticos
(castração),
observaram
que
o
uso
de
30
medicamentos homeopáticos como a calcarea phosphorica (3 gotas/dia) podem ser
mais eficientes formando osso lamelar que os medicamentos alopáticos como o
risedronato (1mg/kg/dia), formando osso primário 30 dias pós início do tratamento. Em
nosso estudo, embora executado em animais normais, 30 dias após a aplicação local
do gel chalcona, o mecanismo de reparo ósseo, formando osso primário e sua
substituição por osso secundário, continua ocorrendo. Cabe salientar que o protocolo
experimental que utilizamos é muito mais cômodo do que aquele utilizado por Werkman
et al. (2006). Além disso, nossos resultados sugerem a possibilidade de um reparo total
em períodos maiores de 30 dias. Neste sentido, Kamamura et al. (2007), em feridas
críticas de calota craniana em ratos tratados com implantes de discos de compósitos de
colágeno e fosfato octocálcico, fosfato tricálcico e hidroxiapatita, mostrou que 3 meses
após o compósito de colágeno e fosfato octocálcico promoveu um reparo mais
acentuado que os outros compósitos. Desta forma, fica evidente a necessidade de
continuar nossos estudos em tempos maiores que 30 dias.
Da mesma forma, o estudo realizado por Marzouk et al. (2007) com superfícies
de microesferas de polivinil estireno tratadas com fator de crescimento derivado de
plaquetas e implantadas em feridas críticas de calotas cranianas de ratos, sugerem que
nosso estudo deva se estender por períodos maiores, pois 4 meses após relata um
reparo estatisticamente mais acentuado. Em nosso estudo, algumas feridas do grupo
experimental (tratadas com gel de chalcona) mostraram o quase total fechamento da
ferida indicando uma possibilidade de indução do reparo de maneira mais eficiente que
o fator de crescimento derivado de plaquetas, que foi utilizado por Marzouk et al.
Acreditamos que a presença de um quadro inflamatório em pontos focais e com
poucas células, observadas nas feridas tratadas com chalcona, cujos dados não os
relatamos neste estudo, por não terem sido quantificados, não invalidam os resultados
que obtivemos, pois Nyan et al. (2007) observaram, em feridas críticas de calota
craniana de ratos, que a sinvastatina em combinação com sulfato de cálcio, durante 2,
4 e 8 semanas, promove uma inflamação intensa nos períodos iniciais seguida de
reparo ósseo acentuados nos períodos tardios.
Os meios utilizados na produção do material a ser implantado em feridas críticas
para estudo do reparo ósseo é importante; assim, Pripatnanont et al. (2007) relatam
31
que a hidroxiapatita sinterizada a 1200°C promove uma maior formação óssea do que
as sinterizadas a 800°C e 135°C.
Da mesma forma, o implante da substância
osteógena com veículo ou puro, como no estudo realizado por Ascherman et al. (2008),
com cimento de hidroxiapatita puro ou sobre uma membrana reabsorvível, pode
modificar a resposta do reparo uma vez que o cimento de hidroxiapatita puro promoveu
maior osteogênese. Nós utilizamos um composto de chalcona a 10% em vaselina
(fornecido pela equipe de Farmácia da UNIVALI) que nos abre a perspectiva de que
com modificação da formulação do composto se possa chegar a respostas mais
efetivas.
Também, nas feridas críticas circunferenciais, independentemente de sua
localização, ocorre o reparo da periferia para o centro quando estimulados por agentes
indutores ou quando ocorre a tentativa de reparo em feridas não estimuladas como
mostra o trabalho de Hong et al. (2008), em mandíbula de coelhos. Isto valida o método
de mensurar o diâmetro da ferida durante o mecanismo de reparo para obter dados
quantitativos do tecido neoformado como os que obtivemos em nosso estudo.
Honma et al. (2008), relataram que tanto as feridas críticas como as não críticas,
em calota craniana de ratos, a neoformação óssea durante o reparo cessa dentro de 24
semanas. Estes resultados não são concordantes com os nossos uma vez que, 30 dias
após não encontramos mais neoformação óssea, pois as bordas das feridas críticas
estiveram cobertas por células de revestimento ósseo caracterizados pela morfologia
achatada, além disto, nas feridas que tratamos com chalcona os osteoblastos ativos,
caracterizados pela sua morfologia cúbica, ainda estão presentes sugerindo que o
mecanismo de reparo ainda continua e que provavelmente em 24 semanas esteja
totalmente reparado.
Por outro lado, os resultados mostram que as feridas tratadas com chalcona
tiveram uma redução de tamanho de 55,76% após 30 dias (ou 4 semanas) do seu
implante, indicando uma possibilidade de formulação medicamentosa com uma
eficiência semelhante aos obtidos com proteína morfogenética de osso humano
recombinante-2 (rhBMP-2), reconhecido como o mais eficiente indutor do reparo ósseo,
como consta no estudo de Issa et al. (2008a), a ponto de ser utilizado como controle
positivo em trabalhos de investigação como os de Intini et al. (2008), que relataram
32
reparo total em 8 semanas e melhor do que o osso descalcificado e liofilizado ou
proteínas derivadas do esmalte relatadas no mesmo trabalho. Nossa afirmação se
baseia no fato de que Issa et al. (2008a) demonstraram que o reparo ósseo é
dependente do tempo pós-implante. Cabe salientar que o uso de osso liofilizado é uma
das preferências para obter ganho de volume ósseo ou melhorar o reparo nas
intervenções odontológicas.
Da mesma forma, a qualidade do novo osso formado, promovido pela chalcona,
é semelhante ao obtido com proteína morfogenética de osso humano recombinante-2
(rhBMP-2), cuja eficiência já foi provada por Issa et al. (2008b) que relatam uma
melhoria substancial em qualidade e quantidade do reparo em extrações dentárias
quando comparadas com o reparo espontâneo.
O uso de células tronco mesenquimais Khojasteh et al. (2008), isoladas ou em
combinação com biomateriais como o Bio-Oss (osso liofilizado), tem também mostrado
um sucesso maior na indução de reparo ósseo, entretanto devemos salientar que,
assim como os fatores de crescimento, sua obtenção para posterior utilização numa
formulação medicamentosa, é muito dispendiosa inviabilizando seu uso em programas
de saúde coletiva quando comparadas a moléculas bioativas de plantas medicinais
como é caso da chalcona usado neste estudo.
O aspecto morfológico que observamos no osso neoformado, em resposta ao
estímulo da chalcona, sugere que o volume e a espessura são semelhantes ao osso
original; para afirmar isto será necessário realizar mais estudos e caso seja confirmada
esta observação, a chalcona poderá ser considerada como um material superior ao
osso de reparo promovido pelo enxerto autógeno ou pelo osso esponjoso bovino
desproteinizado. (KRAMER et al., 2008) O plasma enriquecido com plaquetas, 30
meses após implante, não estimula a regeneração óssea completa além de que o osso
neoformado é mais delgado que o normal. (MESSORA et al., 2008)
Durante o reparo de feridas críticas, promovidas pelo implante de osso autógeno
e osso bovino desmineralizado, Oliveira et al. (2008) mostraram que o osso bovino
desmineralizado, 21 dias após, é substituído por tecido fibrótico e que em períodos
posteriores (90 dias) o reparo é incompleto, cabe salientar que em nosso estudo não
33
encontramos tecido fibrótico e o mecanismo de reparo ainda está ativo indicando uma
probabilidade de reparo total da ferida.
Os dados que encontramos na literatura consultada, mostram a preocupação de
descobrir um material que melhore o mecanismo de reparo de feridas críticas. Neste
contexto, Park et al. (2008) observaram que a mistura de partículas de dentina e
chitosan, sessenta dias pós, apresenta um excelente efeito na regeneração óssea,
embora não relate um reparo completo da ferida. Acreditamos que a chalcona possa
ser relacionada com esta mesma eficiência e em período inferior, pois nossos
resultados mostram apenas uma atividade reparadora de trinta dias.
Da mesma forma, Por et al. (2008) estudaram implantes de cromo cobalto
cobertas com misturas complexas de matriz óssea desmineralizada, proteínas
morfogenética de osso humano recombinante-2 (rhBMP-2) e plasma enriquecido com
plaquetas (PRP); seus resultados mostraram que os complexos contendo rhBMP-2
promoveram reparo mais acentuado e que os complexos contendo PQP não tem efeito
significativo no reparo. Estes dados permitem sugerir estudos futuros utilizando
complexos de metais com a chalcona, cujos resultados eventualmente poderiam ser
aproveitados na implantodontia com um custo inferior aos complexos contendo
metal/rhBMP-2 que a literatura já consagrou como o melhor agente osteogênico.
Produtos como o Surgibone® (mistura de hidroxiapatita com colágeno bovino),
disponibilizados no comércio especializado como agente indutor do reparo ósseo já
estão sendo utilizados. Em estudo do reparo ósseo em feridas críticas de calota
craniana, Develioglu et al. (2009) relatam que as partículas de Surgibone®, 30 dias
após seu implante, são revestidas por uma camada de tecido fibroso, concluindo que
este material é biocompatível com potencial para preencher defeitos ósseos. Em nosso
estudo, observamos neoformação óssea 30 dias após o implante, por este motivo,
discordamos do fato de que partículas rodeadas por fibras colágenas sejam indicadores
de potencial osteogênico e no mínimo podemos afirmar que a chalcona apresenta uma
capacidade osteogênica melhor do que o Surgibone® comercialmente obtido.
A etnobotânica tem uma contribuição importante na descoberta de drogas e no
desenvolvimento socioeconômico assim, Uprety et al. (2010), em estudo realizado no
Nepal, relataram que as plantas medicinais são encontradas nas próprias residências e
34
utilizadas principalmente para resolver problemas de saúde relacionadas com distúrbios
gastrointestinais, menstruais, febre, dor de cabeça, dor de dente, problemas
oftalmológicos e renais. Apesar dos vários estudos já realizados, são poucos os que
comparam o uso de plantas indígenas com as propriedades fitoquímicas e
farmacológicas. Neste aspecto, as chalconas estão sendo estudadas pelo grupo de
investigadores do curso de Farmacologia da UNIVALI e no presente momento se
encontra na fase de sua manipulação molecular para descobrir novas aplicações
medicamentosas, sendo que nosso estudo salienta a possibilidade de utilização
medicamentosa para reparo de feridas ósseas.
As chalconas são flavonóides de cadeia aberta, importantes na pigmentação de
flores agindo como atraentes para a polinização. Estes flavonóides despertaram
interesse na fitoterapia devido a suas propriedades biológicas como antioxidante,
citotóxica, antitumoral, antimicrobiano, analgésica, antiulcera, anti-histamínico e antiinflamatório (Kim et al.,2007; Campos-Buzzi et al., 2007; Tran et al., 2009; Bandgar et
al., 2010). Por outro lado, na sua síntese, mantendo o esqueleto de chalcona e
mudando apenas alguns radicais, tem sido observada a manutenção e melhoria de
algumas das propriedades medicamentosas já evidenciadas clinicamente. E a sua
potencialidade farmacológica ainda não está esgotada (Batovska et al. 2010). Neste
aspecto a molécula de chalcona sintetizada que nós utilizamos sugere um potencial
reparador de feridas ósseas que poderá ser utilizada pela indústria na formulação de
um medicamento osteogênico eficiente.
Õztürt et al. (2008) observou, em fratura de tíbia de coelhos, que fitoestrogênios
contidos em extratos de Vitex agnus - castus L (Verbenaceae), administrados por via
intramuscular, melhoram o reparo somente nas fases iniciais (7 e 14 dias); Da mesma
forma, Sakakura et al. (2008), utilizando comfrey na água dos bebedouros dos animais
que sofreram implantes de parafusos de titânio, observaram também melhoria do
reparo somente nos períodos iniciais (7 e 14 dias). Em nosso estudo, o gel contendo
chalcona surge como uma alternativa medicamentosa mais eficiente que os
fitoestrogênios e o comfrey, uma vez que 30 dias após aplicação única e tópica, ainda
mostra sinais de osteogênese nas feridas.
35
Historicamente entender a regeneração tem sido uma preocupação dos
pesquisadores
permitindo
avanços
importantes
nas
intervenções
cirúrgicas,
transplantes entre outros. Recentemente, analisando genes de apêndices que se
formam durante a regeneração tecidual, utilizando tecnologias modernas, tem
respondido algumas questões vinculadas à transcrição de genes e translação de
proteínas durante vários estágios da regeneração como os estudados no blastema
envolvendo células tronco pluripotenciais e células tronco obtidas a partir de células
diferenciadas (Whited e Tain, 2010). Recentemente foi descoberto que um complexo de
genes Bunched e Madm tem função semelhante ao Fator Transformador do
Crescimento (TGF-ß) controlando o crescimento tecidual por uma via ainda não
totalmente conhecida (Harvey, 2010). Neste contexto, podemos considerar que a
chalcona (molécula sintetizada a partir de plantas medicinais) é uma molécula bioativa
com potencial indutor do reparo ósseo, como é sugerido em nosso estudo, e que
poderá ser utilizada como uma opção entre outras moléculas cujo potencial indutor de
osteogênese já está comprovado, com a vantagem de ser economicamente viável
devido ao baixo custo de sua obtenção quando comparado as extrações de moléculas
bioativas de tecidos animais.
36
6 CONCLUSÃO
A metodologia utilizada neste experimento permitiu concluir que:
A pasta de chalcona promoveu um reparo ósseo significantemente maior no
grupo experimental do que no grupo controle.
O tratamento das feridas com chalcona continua promovendo osteogênese no
período experimental estudado, caracterizado pela presença de osteoblastos ativos na
borda das feridas. Indicando a possibilidade de fechamento da ferida em tempos
maiores de 30 dias.
O tipo de osso formado durante o reparo induzido pela chalcona é principalmente
secundário, sugerindo uma melhor qualidade que o osso formado nas feridas sem
indução que apresentaram um maior volume de osso primário.
O uso da chalcona, portanto, sugere um estímulo no mecanismo de reparo
ósseo. Porém, por ter sido este o primeiro trabalho será necessário realizar mais
estudos para confirmar e aprofundar o conhecimento sobre o mecanismo de indução.
37
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