ISSN: 2422-3239
Número 1
Marzo de 2015
Primer puesto:
César J. G. Collino Pérez, Fernando Gallego González
Segundo puesto:
Renata Helena Candido Pocente
Contenido
Presentación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Premio Alere
Latinoamericano
a la Investigación en POCT
Primer puesto
Evaluación metodológica del equipamiento PIMA
para la cuantificación de linfocitos T CD4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Convocatoria 2014
© Alere
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Métodos y materiales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Editor: Biosystems S.A.
Autores:
César J. G. Collino Pérez
Resultados y discusiones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Conclusiones y recomendaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
Fernando Gallego González
Renata Helena Candido Pocente
Comité Premio Alere
Latinoamericano
a la Investigación en POCT
Presidenta:
María Eugenia González R.
Móvil: (57) (3) 3104991949
E-mail: [email protected]
http://www.alere.net.co
Segundo puesto
Imunoensaio cromatográfico rápido no diagnóstico
diferencial de tuberculose e micobacteriose não
tuberculosa em um serviço de referência terciária . . . . . . . . . . . . 20
Sumário executivo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
-Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
- Objetivo deste trabalho . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
- Materiais e métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Diseño y diagramación:
El Bando Creativo
Publicación anual
Primera edición, marzo de 2015
Santiago de Cali, Colombia
- Resultados e discussões. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Conclusões e recomendações. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
Bibliografia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Presentación
El Premio Alere, en reconocimiento al esfuerzo de
los profesionales de la salud que están en constante
actualización e innovación, galardona a quienes en
su incansable búsqueda de nuevos horizontes logran
resultados positivos en beneficio de la humanidad.
El Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014 pretende
incentivar la investigación, la capacitación y la actualización enfocadas a
mejorar la calidad de vida de los pacientes.
Con la participación obtenida se superaron las expectativas. Nos sentimos
orgullosos de haber contado con la producción intelectual de tantos
profesionales latinoamericanos que pusieron a consideración del comité
del Premio sus trabajos de investigación. El rigor de la evaluación rindió
sus frutos, se encontraron trabajos de mucha importancia, relevancia y
trascendencia para el área de la salud. Todos somos ganadores en el
Premio Alere. El interés mostrado y la persistente labor por un mejor futuro
hacen descollar a estos investigadores hasta el nivel de la excelencia.
El jurado, por su parte, estuvo a la altura del Premio. Profesionales de talla
mayor como Gustavo Méndez (México), María Belén Bouzas (Argentina)
y Luisane Marie Falci Vieira (Brasil), tuvieron la ardua tarea de evaluar los
proyectos y tomar la decisión de elegir al número uno.
A los participantes, gracias por dar lo mejor de ustedes. Al jurado, gracias
por la entrega y por la responsabilidad que le imprimieron a su meritoria
misión.
En 2015, el Premio Alere continuará incentivando la labor investigativa en
POCT, y espera contar con una amplia y representativa participación de
profesionales de los países de América.
Presidenta Premio Alere Latinoamericano
a la Investigación en POCT
Presentación
3
Primer puesto
Evaluación metodológica
del equipamiento PIMA
para la cuantificación
de linfocitos t cd4
César J. G. Collino Pérez, Fernando Gallego González
Sección Citometría de Flujo, Servicio de Laboratorio, Hospital G.
Rawson, Ministerio de Salud de la Provincia de Córdoba, Argentina.
Tel: 0054-0351-156245311, e-mail: [email protected]
Introducción
La valoración confiable de los niveles de linfocitos CD3+CD4+ (LTCD4)
resulta indispensable para el monitoreo de la progresión de la infección por
el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). Además, esta cuantificación
tiene un impacto definitorio en la conducta terapéutica y evaluación del
tratamiento antirretroviral (TAR) en este tipo de pacientes.
En la actualidad, la metodología considerada como referencia (gold
standard) para el recuento de LTCD4 es la citometría de flujo (CF) de simple
plataforma, principalmente debido a que es una técnica precisa, exacta y
reproducible. Sin embargo, es mandatorio la aplicación de estrategias de
evaluación de métodos (EM) de forma previa a la aplicación en rutina de
un sistema de medición, no siendo la CF una excepción a esta regla. En
este sentido, es necesario establecer también una estrategia de control
de calidad interno que permita realizar un seguimiento de la estabilidad del
sistema de medición a lo largo del tiempo.
En la realidad de nuestro país, los laboratorios que disponen de citómetros
de flujo para hacer recuento de LTCD4, poseen desde una mediana hasta
una alta complejidad, y están ubicados en grandes ciudades y requieren
de personal altamente capacitado para la operación correcta de los
mismos. Esto obliga a que pacientes que residen en pequeñas ciudades
o en regiones geográficas periféricas, tengan que trasladarse grandes
distancias para su atención; por otro lado, las muestras tomadas en centros
de menor complejidad deben ser transportadas hacia los centros donde
realicen la determinación considerada de alta complejidad, con todo el
costo que esto conlleva. La primera situación planteada atenta contra
la adherencia del paciente frente al seguimiento y tratamiento de esta
patología, lo cual incrementa la barrera para la expansión y descentralización
de los programas de Tratamiento Anti Retroviral (TAR) y adherencia de los
pacientes a los mismos. En el segundo caso, y teniendo en cuenta factores
Primer puesto
5
importantes como las distancias en nuestro país, el lapso de tiempo que
transcurre desde la toma de la muestra primaria hasta su procesamiento,
podrían afectar la integridad de las mismas, comprometiendo la calidad del
resultado emitido.
Una solución alternativa a la problemática descrita, es la aparición de
las nuevas tecnologías de tipo Point of Care (POC) para efectuar la
cuantificación de LTCD4. Pima CD4 Analyzer (Alere) es uno de estos equipos
de tipo POC. Entre sus ventajas se tienen: a) es portátil, su tamaño y peso
permiten un fácil transporte; b) utiliza un sistema de medición compuesto
por cartuchos donde se realiza la reacción, estos son estables en
condiciones ambientales variables en cuanto al calor y humedad; c) puede
utilizarse con una fuente de energía externa o con una batería recargable,
lo cual permite acceder a lugares sin fuentes de electricidad y medir por un
periodo de tiempo establecido (6 a 8 horas); d) utiliza muestras de sangre
capilar obtenidas por punción digital (pequeñas fracciones de ensayo),
lo que hace posible independizarse de la necesidad de utilizar materiales
para una venopunción convencional; e) la información del resultado de la
cuantificación de LTCD4 se obtiene en un tiempo promedio de 20 minutos
por muestra; f) finalmente, no requiere un operador altamente especializado
para la operación de la metodología de medición establecida.
Por lo mencionado en los párrafos precedentes, el objetivo de este trabajo
fue llevar a cabo una exhaustiva EM del sistema de medición PIMA (Alere),
evaluando el desempeño de este método en términos de precisión,
linealidad y veracidad, para establecer finalmente la aceptabilidad del mismo
en función de los requerimientos de calidad establecidos para los analitos
implicados (LTCD4).
6
Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014
Métodos y materiales
Muestras
Se recolectaron un total de 101 muestras de pacientes que acudieron
al servicio de laboratorio del Hospital Rawson; 60 de pacientes de sexo
masculino y 41 de sexo femenino, con una mediana global de 39 años,
y un rango de edad entre 20 y 72 años. En todas las muestras se realizó
la cuantificación de las subpoblaciones linfocitarias por CF de simple
plataforma utilizando el sistema TruCount (BD Bioscience, USA); además
se efectuó la medición de la totalidad de las muestras con el sistema PIMA
(Alere Pima AnalyserTM, Germany).
El tipo de muestras utilizadas fueron: a) sangre venosa entera anticoagulada
con EDTA K3 (tubos comerciales DVS 2,5 ml volumen final); b) sangre
arterial capilarizada (pulpejo del dedo); c) material control comercial
provistos por la empresa Alere (cartuchos comerciales); y d) muestra
control estabilizada immunotrol (Coulter Corporation, Miami, Florida 33196,
EE.UU.).
Equipamiento utilizado
Se aplicó el Método POC Alere Pima AnalyserTM; este es un sistema de
medición basado en reacciones antígenos-anticuerpos que utiliza la sangre
tomada (de 1 a 2 gotas) directamente por digitopunción, y es introducida
en lo cartuchos diseñados para tal fin, en un volumen de 25ul, de los
cuales solo se utilizan 5ul para el análisis posterior. En este proceso de
medición la sangre se mezcla con anticuerpos monoclonales conjugados
con fluorocromos (anti-CD3 y anti-CD4) contenidos dentro del cartucho de
reacción; esta reacción se transfiere a la cámara de detección donde se
toman imágenes (fotos), se integra la información y se calcula el valor de
LTCD4 por µL de sangre.
Primer puesto
7
Por otro lado, todas las muestras medidas por el sistema PIMA se
valoraron mediante CF de simple plataforma con un citómetro de flujo
BD FACSCaliburTM (BD Bioscience), y se utilizaron tubos trucount para el
recuento absoluto y la clasificación relativa de cada población celular. Se
trabajó con el reactivo Multitest para la evaluación del perfil linfocitario T
(CD3/CD8/CD45/CD4). La calibración diaria de este equipamiento y el
control de calidad interno fueron realizados acorde a las recomendaciones
del fabricante. Este equipamiento participa además del Programa de
Evaluación Externa de la Calidad del CEMIC, ProgBA.
Análisis estadístico
En los ensayos de precisión se siguieron los lineamientos y análisis
estadísticos propuestos en las guías EP15-A2 y EP5-A2 del CLSI (Clinical
and Laboratory Standards Institute, USA), utilizando el programa Microsoft Office
Excel ver. 2007. Para evaluar la linealidad de esta metodología se realizó
un análisis de regresión polinomial aplicando el protocolo descrito en la
guía EP6-A del CLSI, usando el programa estadístico InfoStat ver. 2011p.
Con respecto al estudio de la concordancia clínica, se construyeron
3 tablas de 2 x 2, en las cuales se tomaron como valores de corte los
niveles de decisión médica de 200, 350 y 500 LTCD4/µL, y a partir de
ellas se calcularon sensibilidad diagnóstica, especificidad diagnóstica, valor
predictivo positivo y valor predictivo negativo.
Aspectos éticos
No se requirió consentimiento informado, ya que los datos suministrados se
destinaron a fines clínicos y se garantizó el anonimato.
8
Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014
Resultados y discusiones
Evaluación de la precisión (Preliminar e intermedia)
Experiencia con cartuchos control Alere PimaTM Bead Standard,
provistos por el fabricante. Para esta experiencia se valoró cada uno de
los dos cartuchos control (uno con valor asignado bajo, y otro con valor
asignado normal de LTCD4) veinte veces en una misma corrida analítica,
con la finalidad de establecer el límite de outliers. Acto seguido, se realizó
una estimación de la precisión intermedia midiendo el recuento de LTCD4
de los dos cartuchos control durante veinte días, efectuando dos corridas
diarias por duplicado cada una. Los resultados se encuentran expresados
en la Tabla 1, donde también se expresan los requerimientos de calidad
establecidos para este analito en función de variabilidad biológica individual
y grupal (únicos requerimientos de calidad disponibles para recuento de
LTCD4).
Experiencia con muestras de sangre entera venosa (SEV). Esta
experiencia se llevó a cabo de la misma forma que la realizada con los
cartuchos comerciales, utilizando dos muestras de SEV, una de las cuales
poseía un recuento de LTCD4 bajo y la otra, un recuento de LTCD4 normal.
Estas muestras se valoraron en cinco corridas analíticas por triplicado. Los
resultados se pueden observar en Tabla 1.
Experiencia con muestras controles estabilizadas (MCE). En esta
experiencia se determinó el recuento de LTCD4 a la MCE durante veinte
corridas analíticas. Se realizó para obtener información respecto a la
precisión intercorrida de la metodología de medición. Estos resultados se
muestran en la Tabla 1.
Primer puesto
9
Tabla 1. Resultados de la evaluación de la precisión
Precisión preliminar
cartuchos comerciales
Precisión intermedia
cartuchos comerciales
Media
(*)
Imprecisión
(*)
CV (%)
V.B. Min
(%)
V.B. Des
(%)
142,9
1,5 (DS) (**)
1,0
18,8
12,5
947,0
16,9 (DS) (**)
1,8
18,8
12,5
141,3
2,2 (St) (***)
1,6
18,8
12,5
940,2
19,8 (St) (***)
2,1
18,8
12,5
Precisión intermedia
muestras Sangre Entera
Venosa
176,9
18,2 (St) (***)
10,3
18,8
12,5
1040,5
65,9 (St) (***)
6,3
18,8
12,5
Precisión intermedia MCE
489,5
62,3 (DS) (**)
12,7
18,8
12,5
(*) Unidades: Células/µL. (**) Valor de desviación estándar. (***) Valor de precisión intermedia.
Linealidad
Para evaluar este aspecto se aplicó un análisis de regresión polinomial
empleando el programa informático InfoStat V. 2011. Se evaluó la
distribución de los distintos niveles de concentración mediante modelos
polinomiales de primer, segundo y tercer orden, de acuerdo con los
lineamientos de la guía EP6-A del CLSI. Para la preparación de los
distintos niveles de concentración se siguieron los lineamientos publicados
previamente (H26-A2 CLSI); se partió de una muestra de SEV con un
valor alto de LTCD4, que se puso en posición vertical, y se dejó en reposo
durante 2 horas, aproximadamente, de manera que sedimentaran los
elementos formes celulares.
10
Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014
Luego, utilizando el plasma sobrenadante de esa misma muestra, se
realizaron las correspondientes diluciones para obtener 6 puntos de
concentración equidistantes entre sí. Cada nivel de concentración se
midió por duplicado. La concentración teórica del nivel más alto se
estableció como el promedio del duplicado medido, y las restantes
concentraciones teóricas se determinaron en función de los volúmenes
de plasma adicionados (Tabla 2). Los resultados obtenidos se encuentran
representados en la Tabla 3 y en la Figura 1.
Tabla 2. Resultados de la evaluación de la linealidad
Dilución
1° Medición (*)
2° Medición (*)
Rec. Teórico (*)
15%
194
262
261
30%
414
565
520
45%
851
864
781
60%
1062
1016
1041
85%
1438
1487
1478
100%
1742
1728
1735
(*) Unidades: Células/µL.
Primer puesto
11
Tabla 3. Resultados del Análisis de Regresión Polinomial
Orden
polinomial
Coeficiente
Primer
Valor coef.
E.E. Coef (2)
t (3)
b0
-9,68
34,88
-0,28
0,7870
8
56,66
Primer
b1
1,01
0,03
31,75
<0,0001
8
56,66
Segundo
b0
-75,86
66,25
-1,15
0,2817
7
55,66
Segundo
b1
1,19
0,16
7,64
<0,0001
7
55,66
Segundo
b2
-8,80E-05
7,50E-05
-1,17
0,2731
7
55,66
Tercero
b0
-164,74
127,99
-1,29
0,2341
6
56,72
Tercero
b1
1,60
0,53
3,03
0,0163
6
56,72
Tercero
b2
-5,80E-04
6,10E-04
-0,95
0,3675
6
56,72
Tercero
b3
1,70E-07
2,10E-07
0,82
0,4374
6
56,72
p-Valor
(4)
G.L. (5)
Des. Est.
(1)
Residual
(6)
Valor coef.: Coeficiente del polinomio; (2) E.E.: Error Estándar; (3) t: Valor obtenido del test-t; (4) p-Valor: valor
p asociado al resultado del test-t; (5) G.L.: Grados de Libertad; (6) Des. Est. Residual: Desviación Estándar
Residual de la regresión.
(1)
12
Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014
Figura 1. Regresión Primer Orden Recuento LTCD4*
1800
Recuento Medido
1375
950
525
100
100
525
950
1375
1800
Recuento Teórico
* Regresión lineal: en el eje Y se graficaron las concentraciones medidas, y en el X las teóricas (calculadas).
Ambas concentraciones se expresan en cel./µL. Rango de linealidad teórico evaluado: 261 - 1735 LTCD4/µL
Concordancia clínica
Se establecieron los parámetros sensibilidad diagnóstica, especificidad
diagnóstica, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo para
distintos niveles de recuento de LTCD4. La metodología de referencia
empleada este ensayo fue la Citometría de Flujo Simple Plataforma
(FACSCalibur, BD); en la cual se consideró la primera determinación de los
duplicados realizados por el sistema PIMA, y se actuó de la misma forma
para las determinaciones elaboradas por FACSCalibur; esto se llevó a cabo
sobre la totalidad de las muestras (101) de SEV que se valoraron. Los
resultados obtenidos están representados en la Tabla 4.
Primer puesto
13
Tabla 4. Resultados del Análisis de Concordancia Clínica
Recuento LTCD4 de corte
(células/µL)
200 (*)
FACSC. ≤ 200(*)
FACSC. >
200(*)
PIMA ≤ 200
PIMA > 200
24
1
2
74
350 (*)
FACSC. ≤ 350(*)
FACSC. >
350(*)
PIMA ≤ 350
PIMA > 350
32
0
1
68
500 (*)
FACSC. ≤ 500(*)
FACSC. >
500(*)
PIMA ≤ 500
PIMA > 500
37
1
7
56
Sensibilidad
(%)
Especificidad
(%)
VPP
(%)
VPN
(%)
96
97,37
92,31 98,67
100
98,55
96,97
97,37
88,89
84,09 98,25
100
(*) Unidades: Células/µL.
Veracidad - Comparación de métodos
En esta experiencia se siguieron los lineamientos de la guía EP9-A2 del CLSI; se
hizo una comparación de métodos entre los resultados obtenidos por el sistema
PIMA (contemplado como método en estudio) y por FACSCalibur (contemplado
como método de referencia). Para ello se consideró la media de los duplicados
de los valores cuantificados en cada uno de los sistemas de medición. De las
101 muestras de SEV valoradas en ambos equipos, se descartaron 2 muestras
que poseían recuentos superiores a 2000 LTCD4/µL, esto respeta estrictamente
el estudio precedente de linealidad realizado en este trabajo. No se encontró
ningún valor anómalo dentro de las 99 determinaciones que se tuvieron en
cuenta. Con el fin de establecer la ecuación de la recta que mejor se ajusta a la
14
Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014
distribución de los datos, se aplicó la regresión de Passing-Bablok utilizando
el programa MedCalc V.12.7.0.0. Los resultados alcanzados fueron 11,72
para la ordenada al origen, y 0,876 para la pendiente; sus respectivos
intervalos de confianza (95%) fueron de 4,45 a 16,77 y de 0,857 a 0,892;
y se obtuvo un coeficiente de correlación r = 0,9897 (Figura 2). También se
aplicó el análisis de Bland-Altman (MedCalc V. 12.7.0.0.) para calcular el BIAS
promedio con el cual se cuantifica el sistema PIMA respecto al sistema de
medición FACSCalibur, y se determinó que el mismo tiene una magnitud
de -74,1 LTCD4/ µL, con su respectivo intervalo de confianza (IC 95%) de
-264,0 a 115,8 (Figura 3).
Figura 2. Estudio de Regresión - Passing Bablock
2000
1800
Recuento LTCD4 - PIMA
1600
1400
1200
1000
800
600
PIMA = 0,876 X FACSCalibur + 11,72
400
200
0
0
500
1000
1500
2000
Recuento LTCD4 - FACSCalibur
Primer puesto
15
Figura 3. Estudio de Bland - Atlman. Diferencias absolutas
200
+ 1.96 SD
100
115,8
0
Diferencia (PIMA - FACSCalibur)
Mean
- 100
-74,1
- 200
- 1.96 SD
- 264,0
- 300
- 400
- 500
- 600
- 700
0
500
1000
1500
2000
2500
Media de PIMA y FACSCalibur
Comparación Sangre Capilar
vs. Sangre Entera Venosa (SEV)
También se hizo una comparación de métodos para evaluar posibles
diferencias que puedan establecerse al realizar el recuento de LTCD4 en
sangre capilar obtenida por punción capilar utilizando el equipo PIMA, y
la cuantificación de LTCD4 a partir de SEV. Se compararon 18 muestras
de individuos adultos sanos, de quienes se adquirieron simultáneamente
la muestra de SEV y la de sangre capilar obtenida por punción digital. La
regresión efectuada por Passing-Bablok arrojó una pendiente de 1,026
(I.C. 95% de 0,778 a 1,382), una ordenada al origen de 9,73 (I.C. 95%
de -323,94 a 234,50) y un coeficiente de correlación r = 0,900 (Figura
4). Respecto a los resultados arrojados por la comparación mediante
Bland-Altman, se encontró que el BIAS promedio del sistema PIMA (Sangre
Capilar) en comparación con PIMA (SEV) es de 28,3 LTCD4/ µL, con un I.C.
95% de -151,3 a 207,9 (Figura 5).
16
Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014
Figura 4. Estudio de Regresión - Passing Bablock (Sangre Capilar vs. SEV)
1200
1100
PIMA - Sangre Capilar
1000
900
800
700
600
500
PIMA (S. capilar) = 1,026 x PIMA (S. venosa) + 9,73
400
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
PIMA - Sangre Venosa
Figura 5. Estudio de Bland - Atlman (Sangre Capilar vs. SEV).
Diferencias absolutas
250
+ 1.96 SD
Diferencia (PIMA s.Capilar - PIMA S. Venosa)
200
207,9
150
100
50
Mean
28,3
0
- 50
- 100
- 1.96 SD
- 150
- 151,3
- 200
400
600
800
1000
1200
Media de PIMA con S. Capilar y S. Venosa
Primer puesto
17
Conclusiones y
recomendaciones
Se demostró que para todos los casos en los que se evaluó la precisión,
con sus diferentes componentes, el sistema PIMA cumple con los
requerimientos deseables de calidad basados en la variabilidad biológica.
En el caso de la MCE, cumplió con los requerimientos mínimos estipulados
según variabilidad biológica. Es importante destacar que las magnitudes de
los valores de imprecisión obtenidos con muestras de SEV y con MCE son
similares entre ellos, pero los mismos difieren ampliamente de los obtenidos
con cartuchos control Alere PimaTM Bead Standard. Esto puede ser explicado
por el hecho de que en el caso de los cartuchos control, en realidad no se
procesa una muestra de SEV, sino que se hace una determinación sobre
un cartucho control que viene cerrado con un contenido fijo, y lo esperable
es que la dispersión que se obtenga en este sea mucho menor en
comparación con la dispersión obtenida a partir de varias determinaciones
de una misma muestra utilizando varios cartuchos Alere PimaTM CD4, con la
manipulación previa que esto conlleva (variables preanalíticas a considerar).
Lo anterior deja de manifiesto que los cartuchos control Alere PimaTM Bead
Standard son de gran utilidad para evaluar el funcionamiento del equipo
Alere Pima AnalyserTM, pero no son aptos para evaluar en términos analíticos
(precisión, veracidad, linelidad) el funcionamiento del sistema en su
totalidad, que también incluye los cartuchos Alere PimaTM CD4.
Una forma de controlar el sistema en su totalidad sería con muestras
de sangre entera estabilizadas (como es el caso de MCE). Utilizando
estrategias de control de calidad interno se puede evaluar el funcionamiento
del sistema de medición en su totalidad (inclusive los cartuchos Alere PimaTM
CD4) en términos de precisión y veracidad, y de esta forma se puede
demostrar el correcto funcionamiento del equipo a lo largo del tiempo.
18
Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014
En términos de linealidad, se demostró que el recuento de LTCD4 del
equipo PIMA tiene un comportamiento lineal, y el modelo de medición
es explicado por un polinomio de primer orden, en el rango reportable
evaluado.
En cuanto a la concordancia clínica, los resultados obtenidos permiten
afirmar que la determinación de LTCD4 mediante la utilización del
equipo Alere Pima AnalyserTM, al tener una alta sensibilidad y especificidad
diagnóstica para los niveles descritos previamente, es una herramienta útil
para tomar decisiones médicas en pacientes de reciente diagnóstico de
poseer el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), y que los cuales por
diferentes situaciones no pueden acceder a metodologías convencionales
para determinar sus niveles de LTCD4.
Respecto al desempeño obtenido en términos de veracidad, observando
los resultados de la regresión realizada, podemos asumir que el equipo
Alere Pima AnalyserTM, en comparación con FACSCalibur, tiene un error
sistemático constante positivo (ordenada al origen positiva de 11,72), y
un error sistemático proporcional negativo (pendiente menor a uno, de
0,876), lo cual coincide con trabajos previos. Esto da aún más respaldo
a los resultados de nuestro trabajo, y dejan en evidencia que dichos
errores sistemáticos no son producto de la aleatoriedad. Al analizar y
utilizar la ecuación de la recta obtenida en la regresión, encontramos que
el punto en el cual el recuento entre un equipo y otro serían “equivalentes”
es a 94 LTCD4/µL. Esto implicaría que por debajo de esa concentración
el equipo PIMA sobreestima (error por exceso), y que por encima de
esa concentración subestima (error por defecto), respecto al equipo
FACSCalibur; así se demuestra el bajo impacto clínico de estos errores en
estos niveles de concentración en este analito (LTCD4).
Primer puesto
19
Segundo puesto
Imunoensaio cromatográfico
rápido no diagnóstico
diferencial de tuberculose
e micobacteriose não
tuberculosa em um serviço
de referência terciária
Renata Helena Candido Pocente*, Margarida Maria Passeri do Nascimento,
Sandra Mara Nunes Moroti , Livia Maria Pala Anselmo, Cinara Feliciano,
Roberto Martinez, Rodrigo C. Santana, Valdes Roberto Bollela.
*Autor principal: Renata Helena Candido Pocente. Endereço: Laboratório de
Micobactérias do Hospital sas Clínicas da Faculdade se Medicina se Ribeirão Preto.
Campus Universitário S/N 14048-900 Ribeirão Preto-São Paulo. Tel: (16)3602-2747.
Sumário executivo
Introdução
O Brasil está entre os 22 países que concentram aproximadamente
80% do total de casos de tuberculose (TB), ocupando a 16ª posição
em número absoluto de casos. À semelhança de outros países, o
Brasil tem conseguido avançar no controle da doença nas últimas duas
últimas décadas. Entretanto as elevadas taxas de co-infecção entre o
vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o bacilo da tuberculose (TB)
e a emergência de bacilos resistentes tem sido um limitante para o o
controle de ambas as doenças1. Os pilares para o controle da TB incluem
o diagnóstico precoce e o tratamento efetivo. O aumento da prevalência
global do HIV tem promovido dificuldades adicionais no diagnóstico e,
consequentemente, no controle da TB, especialmente no paciente com
imunodeficiência em fase avançada. Nestes casos observa-se um aumento
na ocorrência de micobactérias não tuberculosas (MNT), cujo diagnóstico
inicial pode ser facilmente confundido com o da TB. Este fato se torna ainda
mais desafiador se considerarmos que existem MNTs colonizando a árvore
respiratória, a região gênitourinária, trato gastrintestinal e região perineal
de pessoas saudáveis. Assim, a presença de baciloscopia e até a cultura
positiva para micobactérias em alguns espécimes clínicos não é suficiente
para garantir o diagnóstico de tuberculose. Além do cultivo é preciso
identificar com acurácia a espécie de micobactéria para que o tratamento
apropriado seja instituído.
O Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
(HCRP) é um hospital terciário com cerca de 700 leitos, referência para
uma macrorregião com cerca de 4 milhões de habitantes. Nele estão
localizados os serviços de referência para TB resistente, co-infecçãoTB/
aids e para pacientes com micobacteriose não-tuberculosa do Nordeste
do estado de São Paulo. Pelo porte, o hospital também é o centro onde se
faz a maioria dos transplantes desta região do estado, o que provoca um
elevada concentração de pacientes imunocomprometidos. Neste contexto,
é fundamental diferenciar as espécies de micobactérias isoladas em cultivo.
Segundo puesto
21
Até 2013 a rotina do laboratório para isolamento e identificação de
micobactérias incluia o exame direto (Ziehl-Neelsen) e incubação no sistema
automatizado MGIT 960TM para qualquer amostra, exceto sangue e medula
óssea. Estes dois espécimes são cultivados no sistema BD Bactec 9120TM.
Após sinalizar o crescimento no sistema automatizado, uma alíquota do
meio de cultivo era separada para extração de DNA e amplificação por
meio de técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) “in house”
que amplifica um fragmento de 123 pares de bases da região IS6110 do
Mycobacterium tuberculosis2. Na presença da amplificação confirmava-se
M. tuberculosis, e na sua ausência concluia-se pela presença de MNT. O
tempo de execução da identificação das micobactérias pela PCR (extração
do DNA, amplificação, revelação no gel de agarose e fotografia do gel)
variava entre 8 e 10 horas para 6 a 8 isolados/semana, ou um dia de
trabalho da biologista responsável pelo laboratório.
Objetivo deste trabalho
O objetivo deste estudo é avaliar a implantação de um imunoensaio
cromatográfico rápido (IECR), na rotina de identificação de micobactérias do
laboratório de um hospital de referência no Estado de São Paulo.
Materiais e métodos
Desenho do estudo: Estudo transversal, que avaliou os resultados da
incorporação de teste TBAgMPT64TM (Standard Diagnostic Inc-Republic of
Korea; distribuido pela Alere S/A no Brasil) na rotina de identificação das
micobactérias isoladas em cultura no hospital.
Obtenção de amostras: as amostras coletadas por ocasião da
investigação diagnóstica rotineira de TB e MNT em pacientes internados no
HCRP.
22
Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014
Amostras estudadas: Foram analisadas amostras de 237 isolados de
micobactérias em cultura, entre os meses de outubro de 2013 e julho de
2014. A confirmação de M. tuberculosis foi feita através de dois métodos
moleculares: PCR “in house” e resultado do teste molecular rápido
Genotype MTBDRplus (Hain Lifescience, GmbH, Germany), o qual é feito
de rotina no laboratório e que, além de detectar mutações de resistência do
bacilo, também identifica a espécie. As amostras caracterizadas como MNT
pela PCR foram encaminhadas ao Laboratório de referência do Estado de
São Paulo para identificação da espécie (Instituto Adolfo Lutz-IAL).
Aspectos éticos: O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do HCRP,
com número 9586/2011.
Resultados e discussões
Das 237 cepas isoladas em cultura nos 10 meses deste estudo, 143
tiveram resultados positivos no imunoensaio cromatrográfico, identificando
M. tuberculosis, e em 94 isolados o resultado indicou a presença de MNT.
Foram isoladas micobactérias de diferentes sítios, conforme demonstrado
na tabela 1:
Tabela 1. Sítio da infecção da micobactéria isolada nos 237 pacientes estudados
Espécime clínica
M. tuberculosis
MNT
Escarro
Líquido cefalorraquidiano
Lavado gástrico
Sangue
Aspirado traqueal/Lav. broncoalveolar
Biópsia (pulmão e linfonodo)
Abscesso
Líquido pleural
Fezes
Osso
107
8
6
6
5
4
3
2
1
1
86
0
2
1
3
0
1
0
1
0
143
94
Total
Segundo puesto
23
A seguir apresentamos em uma tabela 2x2 os resultados do IECR quando
comparado com os resultados obtidos com a PCR in house e o Genotype
MTBDRplus para identificar o complexo M. tuberculosis e os resultados do
laboratório de referência do estado, para as cepas identificadas como MNT.
Definição da espécie: PCR in house; Genotype
MTBDRplus e resultados do laboratório de referência
Imunocromatográfico
POSITIVO
NEGATIVO
POSITIVO
143
0
143
NEGATIVO
1
93
94
144
93
237
A sensibilidade e especificidade do IECR foi de 99,3% e 100%,
respectivamente. O valor preditivo positivo foi de 100% e o negativo de
98,9%.O coeficiente kappa entre o IECR e os testes de referência utilizados
foi de 0,99. O tempo necessário para realizar 10 testes de identificação
com o IECR foi de 20 minutos, cerca de 30 vezes menor do que o tempo
gasto para o teste utilizando o PCR in house. Se considerarmos o tempo de
trabalho do biologista mais os insumos utilizados na PCR, o custo/teste do
IECR também foi menor.
24
Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014
Conclusões e
recomendações
O IECR mostrou elevadas sensibilidade e especificidade quando realizado
no meio líquido do MGIT. Também demonstrou elevada correlação com
os testes de referência (kappa=0,99). Em apenas um, dos 144 isolados
de M. tuberculosis, o IECR não detectou a infecção, o que só foi possível
após resultado do laboratório de referência. Quando utilizamos a PCR
diretamente no líquido de cultura, existe maior risco de contaminação
da reação, consequentemente resultados falsos positivos, além do risco
de contaminação da reação feitas para espécimes clínicos processados
no nosso laboratório, como líquor, líquido pleural ou ascítico. Tal risco
não existe com o uso do IECR. Recentemente, a partir dos trabalhos de
SUTANTANGJAI et al.3, temos considerado utilizar o IECR diretamente
em amostras de escarro com baciloscopia positiva, previamente tratadas
com mucolítico/solvente. Isto poderia encurtar o tempo de detecção e
identificação da espécie presente na amostra clínica.
Desde outubro de 2013, o IECR foi incorporado à rotina de identificação
de micobactérias que creceram no sistema automatizado de cultivo, e esta
prática tem significado maior rapidez e maior confiabilidade, que certamente
impactam na tomada de decisão clínica. É importante destacar que, para
hospitais de referência, continua sendo muito importante contar com a
retaguarda do laboratório de referência, considerando a complexidade dos
casos atendidos neste serviço.†
Agradecemos à equipe do laboratório de Micobactérias do Instituto Adolfo Lutz, parceiros
e referência para identificação das MNT e teste de sensibilidade de M. tuberculosis isolados
no Hospital das Clínicas da de Ribeirão Preto.
†
Segundo puesto
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Bibliografia
World Health Organization (WHO). Global tuberculosis report
2013. Geneva: World Health Organization, 2013.
1
Bollela VR, Sato DN, Fonseca BAL. McFarland nephelometer
as simple method to estimate the sensitivity of polymerase
chain reaction using Mycobacterium tuberculosis as a research
tool. Braz. J. Med. Biol. Res. 1999.32(9),1073-1076.
2
Sutantangjai M, Fasksri K, Chaicumpar K, et al. Evaluation
of an immunochromatographic test kit for detecting
Mycobacterium tuberculosis complex in sputum samples and
on solid and in liquid cultures. Southeast Asian J Trop Med
Public Health. 2014, 45(2):357-64.
3
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Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014
4