ELISA PARA LA DETERMINACIÓN DE IgE CANINA ESPECÍFICA DE ALERGENOS.
CORRELACIÓN CON ENSAYOS DE DIAGNÓSTICO IN VIVO.
1 Dpto.
González-Arribas JL1, Arevalo MA2, Rodríguez V1 and Rollán E1
Patología Animal II, Hospital Clínico Veterinario, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense. Madrid.
2 Dpto. Macromoléculas, Instituto Cajal, Consejo Superior de Investigaciones Científicas.Madrid.
INTRODUCCIÓN
El diagnóstico de la hipersensibilidad mediada por IgE en perros, se basa en la historia clínica del animal, la exploración física y los resultados de los tests
de alergia a una batería de alerge1nos correlacionados con su historia clínica. Los tests intradérmicos (IDST), han sido considerados durante mucho tiempo
como el "gold standard" (estándar de oro) entre todos los tests. Sin embargo hay importantes desventajas para la realización práctica de esta técnica, en
comparación con los ensayos "in vitro".
Recientemente, un nuevo enzimoinmunoensayo (PET-ELISA) para la detección de IgE canina específica de alergenos, ha sido desarrollado por Alergovet S.L.
OBJETIVOS
Estudiar la correlación entre los niveles de IgE específica frente a polen de gramíneas determinados por PET_ELISA, y los resultados obtenidos por los ensayos
de diagnóstico in vivo en un grupo de perros alérgicos al polen de gramíneas.
MATERIAL Y METODOS
• Pacientes:
41 perros con historias clínicas sugerentes de atopia e IDST positivo a
gramíneas fueron seleccionados y clasificados en tres grupos de acuerdo con la
intensidad de las reacciones cutáneas, el número de reacciones positivas a una
batería estándar de alergenos inhalantes (Stallergenes S.A. Y C.B.F. Leti S.A.) y la
historia clínica.
Tabela 1. Descripçión de los tres grupos de pacientes y del grupo
control.
• ELISA para IgE especifíca a polen de gramíneas:
La IgE específica frente a polen de gramíneas en el suero de los pacientes fue
determinada con el PET-ELISA para la mezcla de gramíneas I, Grass mix I (Lolium
perenne, Phleum pratense, Dactylis glomerata, Festuca elatior y Poa pratensis).
Brevemente, los pocillos de las placas de ELISA se tapizan con los extractos de polen
y se incuban sucesivamente con las muestras de suero, una anti IgE policlonal
biotinilada, estreptavidina conjugada con peroxidasa, y un sustrato cromógeno para
la peroxidasa (orto-fenilendiamina). La intensidad del color en la reacción
enzimática es proporcional a la cantidad de IgE específica presente en la muestra de
suero. El nivel de IgE específica se determina por comparación con la intensidad de
color producido por controles previamente calibrados, y se expresa según las clases:
negativo (0), dudoso (1), débilmente positivo (2), positivo (3) y altamente positivo
(4).
Grupo
No.
IDST
Gramíneas
A
17
3+, 4+
B
16
2+, 3+
Síntomas
Patrón atópico de prurito
Picos estaciónales acentuados.
Prurito entre moderado e débil.
Picos estaciónales.
Atopia dudosa.
C
8
1+, 2+
Control
16
0
Prurito débil.
Sin picos estaciónales.
Sin historia de atopia.
RESULTADOS Y DISCUSION
Los resultados obtenidos con el ELISA para IgE específica , se muestran en la
tabla 2 para cada grupo de pacientes.
Sólo 3 de los 24 perros incluidos en los grupos C y control, dieron un resultado
débil positivo (Clase 2) en el ELISA para IgE específica y ninguno de ellos fue Clase
3 ó 4.
En los grupos formados por animales claramente atópicos, A y B, sólo 8 pacientes
de un total de 33 dieron resultados en las clases 0 y 1 ; 5 de estos pacientes fueron
“borderline”.
La tabla 3 muestra los parámetros comúnmente usados para evaluar un test
de laboratorio: sensibilidad, especificidad, los valores predictivos de resultados
positivos y negativos, y la eficacia diagnóstica del test.
Tabla 2. Resultados de ELISA para IgE específica en los cuatro
grupos de perros.
IgE Específica
Grupo
Clase 0
Clase 1
Clase 2
Clase 3
Clase 4
A
0
2
4
8
3
B
3
3
7
1
2
C
4
3
1
0
0
Control
13
1
2
0
0
De los resultados de estas tablas se deduce que el ELISA para la
determinación de IgE específica diferencia claramente animales alérgicos de no
alérgicos. Así, tanto la especificidad (81,3%) como la sensibilidad (82,9%) del
ensayo son muy altas. Además, los intervalos elegidos para definir las diferentes
clases de IgE específica mostraron una correspondencia muy buena con los criterios
usados para clasificar a los pacientes en subgrupos, los cuales incluyeron las
historias clínicas. De esta forma, los perros incluidos en el grupo A se distribuyeron
casi homogéneamente en torno a la Clase 3, y los pacientes del grupo B se
agruparon fundamentalmente en la Clase 2.
(los resultados están expresados según las clases definidas en el
Material y Métodos).
Aunque no debe ser esperada una correlación perfecta entre las clases
definidas para el ensayo ELISA, y los tests intradérmicos, debido a que estas
técnicas miden distintos parámetros (el ELISA mide IgE circulante, mientras que el
IDST detecta IgE unida a mastocitos), se ha observado una concordancia muy
buena entre ambos métodos diagnósticos.
Tabela 3. Valores indicadores del PET-ELISA para IgE
canina específica.
Cómo hemos mencionado anteriormente, la clasificación de los animales en los
diferentes grupos, se ha basado en la historia clínica de atopia y en los resultados
de los tests intradérmicos. Sin embargo, está descrito que los métodos diagnósticos
de alergia pueden detectar hipersensibilidades que en alguno casos no son
clínicamente significativas. En particular, una de las principales características de
los tests intradérmicos es su extrema sensibilidad, de forma que pueden detectarse
reacciones positivas incluso en estados de hipersensibilidad subclínicos. Teniendo
en cuenta todo lo dicho, podríamos considerar negativo el grupo C de nuestro
estudio, con un diagnóstico dudoso de atopia y, de la misma manera, podríamos
considerar negativos los resultados de la Clase 1 (dudoso o “borderline”) del ELISA.
En este caso, la especificidad del ensayo podría ser considerada incluso mayor
(87,5%, ver los valores entre paréntesis de la Tabla 3).
Sensibilidad
Especifidad
82.9
(75.8)
81.3
(87.5)
Valores indicadores de
Resultado + Resultado 91.9
(89.3)
65.0
(72.4)
Eficacia
82.5
(80.7)
Estos valores están expresados en %. Entre paréntesis aparecen
los valores estimados cuando control e C e as clases 0 y 1 son
considerados negativos.
CONCLUSIONES
En este estudio hemos demostrado que el PET-ELISA para IgE canina específica de alergeno presenta una alta sensibilidad
(83%) y especificidad (81%), respecto a los tests intradérmicos (IDST), y además, muestra una muy buena correspondencia
con las historias clínicas de atopia de los pacientes.
ELISA PARA LA DETERMINAÇÃO DE IgE CANINA ESPECÍFICA DE ALERGÉNIOS.
CORRELAÇÃO COM OS ENSAIOS DE DIAGNÓSTICO IN VIVO.
1 Dpto.
González-Arribas JL1, Arevalo MA2, Rodríguez V1 and Rollán E1
Patología Animal II, Hospital Clínico Veterinario, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense. Madrid.
2 Dpto. Macromoléculas, Instituto Cajal, Consejo Superior de Investigaciones Científicas.Madrid.
INTRODUÇÃO
O diagnóstico da hipersensibilidade mediada por IgE em cães baseia-se na história clínica del animal, na exploração física e nos resultados dos testes
alérgicos a uma batería de alergénios correlacionados con sua historia clínica. Os testes intradérmicos (IDST), foram considerados durante muito tempo como
o "gold standard" (estandarte de ouro) entre todos os testes. Contudo, existem desvantagens importantes para a realizacão prática desta técnica, em
comparação com os ensaios "in vitro".
Recentemente, foi desenvolvido pela Alergovet S.L. um novo ensaio imuno- enzimatico (PET-ELISA) para a detecção de IgE de canina específica de alergénios.
OBJECTIVOS
Estudar a correlação entre los níveis de IgE específica frente ao pólen das gramíneas determinados pelo PET_ELISA e os resultados obtidos pelos ensaios de
diagnóstico”in vivo” num grupo de cães alérgicos ao pólen das gramíneas.
MATERIAL E METODOS
• Doentes:
41 çães com histórias clínicas sugestivas de atopia e IDST positivo a gramíneas
foram seleccionados e classificados em três grupos de acordo con a intensidade das
reacções cutâneas, o número de reacções positivas a uma batería padrão de
alergénios inalantes (Stallergenes S.A. Y C.B.F. Leti S.A.) e a história clínica.
• ELISA para IgE especifíca ao pólen das gramíneas:
A IgE específica frente ao pólen das gramíneas no soro dos doentes foi
determinada com o PET-ELISA para a mistura de gramíneas I, Grass mix I (Lolium
perenne, Phleum pratense, Dactylis glomerata, Festuca elatior y Poa pratensis).
Brevemente, os pocinhos das placas de ELISA enchem-se com os extractos de pólen
e incubam-se sucessivamente com as amostras de suero, uma anti IgE policlonal
biotinilada, estreptavidina conjugada com peroxidase e um substrato cromogénico
para a peroxidase (orto-fenilendiamina). A intensidade da cor na reacção enzimática
é proporcional á quantidade de IgE específica presente na amostra do soro. O nível
de IgE específica determina-se por comparacão con a intensidade da cor produzido
por controlos previamente calibrados, e expressa-se segundo as classes: negativo
(0), duvidoso (1), debilmente positivo (2), positivo (3) e altamente positivo (4).
Tabla 1. Descripção dos três grupos de doentes e do grupo controlo.
Grupo
No.
IDST
Gramíneas
A
17
3+, 4+
B
16
2+, 3+
Síntomas
Padrão atópico de prurido
Picos estacionais acentuados.
Prurido entre moderado e débil.
Picos estacionais.
Atopia duvidosa.
C
8
1+, 2+
Controlo
16
0
Prurido débil.
Sem picos estacionais.
Sem história de atopia.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos com o ELISA para a IgE específica, apresentam-se na
tabela 2 para cada um dos grupos de doentes.
Somente 3 dos 24 cães incluídos nos grupos C e controlo deram um resultado
débil positivo (Classe 2) no ELISA para a IgE específica e nenhum deles foi Classe 3
ó 4.
Tabla 2. Resultados do ELISA para IgE específica nos quatro
grupos de cães.
IgE Específica
Nos grupos formados pelos animais claramente atópicos, A e B, somente 8
doentes de um total de 33 deram resultados nas classes 0 e 1 ; 5 destes doentes
foram “borderline”.
Grupo
Classe 0
Classe 1
Classe 2
Classe 3
Classe 4
A tabela 3 mostra os parâmetros comumnmente usados para avaliar um teste
de laboratorio: sensibilidade, especificidade, os valores indicadores de resultados
positivos e negativos e a eficácia diagnóstica do teste.
A
0
2
4
8
3
B
3
3
7
1
2
C
4
3
1
0
0
Controlo
13
1
2
0
0
Dos resultados destas tabelas pode-se deduzir que o ELISA para a
determinação de IgE específica diferencia claramente animais alérgicos dos não
alérgicos. Assim, tanto a especificidade (81,3%) como a sensibilidade (82,9%) do
ensaio são muito altas. Para além disso, os intervalos elegidos para definir as
diferentes classes de IgE específica mostraram uma correspondência muito boa
com os critérios usados para classificar os doentes em subgrupos, os quais
incluíram as historias clínicas. Desta forma, os cães incluidos no grupo A
distribuíram-se quase homogeneamente em torno da Classe 3, e os doentes do
grupo B agruparam-se fundamentalmente na Classe 2.
(Os resultados estão expressos segundo as classes definidas no
Material y Métodos).
Embora não deva ser esperada uma correlação perfeita entre as classes
definidas para o ensaio ELISA e os testes intradérmicos, devido a que estas técnicas
meden distintos parâmetros (o ELISA mede IgE circulante, enquanto que o IDST
detecta IgE unida aos mastocitos), observou-se uma concordância muito boa entre
ambos os métodos diagnósticos.
Tabla 3. Valores indicadores del PET-ELISA para IgE canina
específica.
Como mencionámos anteriormente, a classificação dos animais nos diferentes
grupos baseou-se na história clínica de atopia e nos resultados dos testes
intradérmicos. Porém, está descrito que os métodos diagnósticos de alergia podem
detectar hipersensibilidades que em alguns casos não são clínicamente
significativas. Em particular, uma das principais características dos testes
intradérmicos e a sua extrema sensibilidade, de forma que podem detectar-se
reacções positivas incluseve em estados subclínicos de hipersensibilidade. Tendo
em conta tudo o que foi dito, poderíamos considerar negativo o grupo C do nosso
estudio, com un diagnóstico duvidoso de atopia e, da mesma maneira, poderíamos
considerar negativos os resultados de la Classe 1 (duvidoso o “borderline”) do
ELISA. Neste caso, a especificidade do ensaio podia ser considerada inclusive mayor
(87,5%, ver os valores entre parêntesis da Tabela 3).
Sensibilidade Especifidade
82.9
(75.8)
81.3
(87.5)
Valores indicadores de
Resultado + Resultado 91.9
(89.3)
65.0
(72.4)
Eficácia
82.5
(80.7)
Os valores estão expressos em %. Entre parêntesis aparecem os
valores estimados quando os grupos Controlo y C, y las classes 0
y 1 são considerados negativos.
CONCLUSÕES
Neste estudo demonstrámos que o PET-ELISA para IgE canina específica de alergénios apresenta um alta sensibilidade
(83%) e especificidade (81%), em comparação com os testes intradérmicos (IDST), e para além disso, apresenta uma
correspondência muito boa com as histórias clínicas de atopia dos doentes.