MYCOFAST® EvolutioN 2
Diagnóstico de Micoplasmas urogenitales
l Numeración
l Identificación
l Detección de la resistencia a antibióticos
12 tests (Ref. 00030)
30 tests (Ref. 00031)
ES-2006-09
1- FINALIDAD
El estuche MYCOFAST EvolutioN 2 permite la numeración y la identificación del
Ureaplasma urealyticum (U.u.) y del Mycoplasma hominis (M.h.) a partir de muestras endocervicales, uretrales, urinarias, gástricas y en esperma. El estuche MYCOFAST EvolutioN
2 permite, además, la detección de las resistencias de U.u. y M.h. a ciertos antibióticos.
Un estuche permite realizar 12 ó 30 tests.
2- INTRODUCCIÓN
Con una talla comprendida entre 0,15 y 0,25 (m, los micoplasmas son los más pequeños y
los más simples procariotas capaces de autoreproducirse. (1). Los micoplasmas, que comprenden 15 especies censadas al día de hoy en el hombre, pertenecen a la clase de los
mollícutes (de cutis mollis:piel blanda). Se diferencian de las otras bacterias en numerosos
aspectos, entre ellos, la ausencia de pared que les confiere una resistencia natural a las
beta-lactaminas, así como una membrana con esteroles proveniente de las membranas de
las células eucariotas sobre las que se fijan. Los micoplasmas son organismos relativamente frágiles, que no se multiplican en medio acelular mas que en presencia de numerosos factores de crecimiento y a una temperatura constante entre 35 y 37 ºC.
La mayoría de los micoplasmas humanos son simples comensales. De las 9 especies aisladas a partir del tracto urogenital, Ureaplasma urealyticum y Mycoplasma hominis son los
encontrados más frecuentemente. U.u.ó M.h. se transmiten por vía sexual y pueden comportarse como verdaderos patógenos.
En el recién nacido, la contaminación se produce en el paso por el cordón genital y puede
llevar consigo daños respiratorios así como daños meníngeos (3).
En el adulto, U.u. y M.h. son directamente responsables de las patologías descritas en el
cuadro siguiente (6) :
Uretritis no gonocócicas
Uretro-prostatitis
Epididimitis
Cálculos urinarios
Pielonefritis
Inflamación pélvica
Fiebre post-partum/aborto
Corioamnionitis
U. urealyticum
M. hominis
++++
++
+++
++
-++++
++
++
+++
++++
-
El diagnóstico convencional se basa en el cultivo en medio con agar (tipo A7) seguido
de la identificación con microscopio de las colonias U.u (en forma de erizo) o de M.h.
(de huevo en plato).
Al ser U.u. y M.h. organismos comensales, el dignóstico de las infecciones por micoplasmas dependerá de la determinación de un umbral patológico y, por tanto, de una
cuantificación precisa.
3 - PRINCIPIO
El estuche MYCOFAST EvolutioN 2 es un método “todo líquido” en 24 horas basado en
la capacidad de U.u y M.h. de metabolizar respectivamente la urea y la arginina. El crecimiento de los micoplasmas en medio líquido se visualiza por el viraje de un indicador
coloreado -el rojo fenol- del amarillo-anaranjado al rojo que traduce la alcalinización del
medio debido a la liberación de amoniaco.
El crecimiento de micoplasmas visualizado de esta forma permite:
- la numeración basada en la velocidad de hidrólisis de los sustratos, que es proporcional a la cantidad de gérmenes que contiene la muestra (cinética enzimática - patentes:
europea n° 0311541, US n° 5.091.307).
- la identificación basada en la sensibilidad o no del germen frente a tres antibióticos
(identibiotique®)
- la detección de la resistencia a tres antibióticos: doxicilina, roxitromicina y ofloxacina.
4 - COMPOSICIÓN DEL ESTUCHE
DESCRIPCIÓN
CANTIDAD
#00030
U.M.M.t.: Frasco de medio de transporte
12
de micoplasmas (2ml).
U.M.M. Lyo: Frasco de medio de
12
crecimiento liofilizado.
Galería MYCOFAST EvolutioN 2: Galería con
6
2x10 pocillos presentada en sobre de aluminio.
S. M.h.: Activador del crecimiento
1
de Mycoplasma hominis (4,5 ml)
Temp.
#00031
30
2-8ºC
30
2-8ºC
15
2-8ºC
2
2-8ºC
Medio UMMt - Composición en g/l de agua destilada:
Caldo micoplasmas...................................................................... 20
Antibióticos................................................................................... 10 ml
pH : 6.0 ± 0.2
Medio reconstituido (UMMt+UMMlyo) - Composición en g/l de agua destilada:
Caldo micoplasmas...................................................................... 20
Suero de caballo ..........................................................................200 ml
Extracto de levadura .................................................................... 5,8
Cisteína......................................................................................... 0,3
Arginina.......................................................................................... 9
Urea .............................................................................................. 3,6
Rojo de fenol ................................................................................ 0,04
Antibióticos................................................................................... 10 ml
pH : 6.1 ± 0.1
Galería MYCOFAST EvolutioN 2
Galería de 2 tests de 2 x 10 pocillos que comprende 4 partes de los dos
lados:
Pocillos Objetivo
1 al 3
Cuantificación de U.u para tasas de 103 a >105 UCC/ml
Evaluación de las resistencias de U.u y M.h. a 3
antibióticos :
4 al 6
Doxiciclina 8 (g/ml (D), Roxitromicina 4 (g/ml (ROX) y Ofloxacina 4 (g/ml
(OFX)
7 al 9
Identibiotique : Identificación de U.u y M.h. por su perfil de resistencia o
sensibilidad a: Lincomina (L), trimethoprimsulfametoxazol (SXT) y
Eritromicina (E).
10
Cuantificación de M.h. para tasas >104 UCC/ml
Para obtener una cuantificación específica, los pocillos 1 al 3 reservados para la numeración de U.u. contienen lincomicina que inhibe el crecimiento de M.h. eventualmente
presente; el pocillo 10 reservado para la numeración de M.h. contiene eritromicina que
inhibe, de forma selectiva, el crecimiento de U.u.
5. PRECAUCIONES DE EMPLEO
l Los reactivos de este estuche son únicamente para uso in vitro por personas autorizadas.
l Las muestras y los reactivos sembrados son potencialmente infecciosos; deben ser
manipulados con precauciones de uso y desecharse a continuación respetando las
reglas de higiene y la reglamentación vigente para este tipo de productos en el país de
utilización.
l Los reactivos que contienen materias primas de origen animal deben ser manipulados
con las precauciones de uso correspondientes.
l No utilice los reactivos pasada la fecha de caducidad.
l No utilice los reactivos deteriorados o mal conservados antes de usar.
l Un resultado positivo con el método MYCOFAST traduce una colonización por parte
de los micoplasmas urogenitales, pero no puede servir por sí solo para realizar un diagnóstico clínico. Éste debe realizarlo el médico en función de los resultados biológicos
y la sintomatología clínica.
6. RECOGIDA Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS
6.1 Recogida de las muestras
Toma de muestras endocervicales/vaginales
Utilizar únicamente un hisopo de Dacrón® ó de rayón un “cytobrush “ ó un Bact.
Efectuar la toma de muestra después de una eliminación cuidadosa de las secreciones
del exocervix con ayuda de un primer hisopo.
Los micoplasmas tienen una fuerte afinidad con las células mucosas sobre las que se
adhieren; es esencial raspar bien la mucosa para obtener un buen rendimiento (2).
Toma de muestras uretrales
Limpiar el meato y recoger con el hisopo ó por raspado de las células.
Esperma, orinas
Colocar el esperma o el primer chorro de orina en un frasco estéril.
Líquido gástrico
El líquido gástrico de los recién nacidos se toma por aspiración con la ayuda de un cateter y
colocar en un frasco estéril.
6.2 Transporte en medio UMMt
Muestras en hisopo: Descargar el hisopo en un frasco de medio UMMt.
Muestras líquidas: Sembrar un frasco de medio UMMt con 200µl de líquido homogeneizado.
Una vez inoculado, el medio de transporte UMMt. se puede conservar a temperatura ambiente (18-25ºC) durante 8 horas, o a 2-8ºC durante 16 horas.
7. PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS
l Todos los reactivos están listos para su empleo. Los reactivos conservados a 2-8ºC en
su estado original son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja.
l El medio UMMt puede conservarse temporariamente a temperatura ambiente, pero
tiene una mejor estabilidad a 2-8°C.
l En caso de utilizar una sola mitad de galería, guardar la otra mitad cubriéndola con su
adhesivo en la bolsa de aluminio original cerrada herméticamente. La mitad de la galería conservada de esta forma permanece estable durante 3 semanas a 2-8°C.
l El suplemento Mh permanece estable 3 meses después de abierto
l No congelar los reactivos del estuche.
8. MATERIAL REQUERIDO NO SUMINISTRADO
l Material para la toma de muestra (hisopos de Dacrón ó de rayón, cilobrochas, frascos
estérils para la toma de muestras líquidas).
l Pipetas y conos de 100 µl.
l Recipiente para residuos contaminados.
l Vaselina líquida esteril.
l Estufa calibrada a 37ºC ± 1°C.
9. PROCEDIMIENTO
Poner los reactivos a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos.
9.1 Regeneración del medio UMMlyo
Trasvasar cada medio UMMt sembrado en un nuevo frasco UMMlyo. El medio UMMlyo
regenerado de esta forma debe presentar un color anaranjado. Homogeneizar.
9.2 Siembra de la galería
l Identificar cada serie de pocillos.
l Espegar la película adhesiva de la 1a serie conservando el extremo fijado a la galeria.
l Distribuir sucesivamente en los pocillos de una misma serie:
pocillos 1-10
100 µl de medio UMMlyo regenerado
pocillos 9-10
50 µl de suplemento S.Mh
pocillos 1-10
2 gotas de la vaselina esteril
l Recubrir la primera serie de pocillos con ayuda de película adhesiva.
Conservar el excedente del frasco UMMlyo a 2-8ºC durante, al menos 48 horas para
permitir una eventual verificación (ver 11).
9.3 Incubación de la galería
Incubar la galería a 37°C ± 1°C durante 24 horas.
Para la numeración de los U.u, leer los resultados en 24 horas. Para la detección de los
M.h, incubar 48 horas de ser necesario.
Importante: la incubación se puede prolongar hasta 72 horas para las muestras de
tipo orina, esperma y líquido gástrico.
10. LECTURA E INTERPRETACIÓN
10.1. Validación
Verificar que todos los pocillos de una misma serie están limpios. Un pocillo turbio indica contaminación bacteriana. En este caso empezar otra vez la prueba.
10.2. Lectura e Interpretación
La lectura de los resultados consiste en identificar las coloraciones obtenidas en los
diferentes pocillos de las galerías.
El crecimiento de los micoplasmas urogenitales en los pocillos, se traduce por una alcalinización del medio que vira al rojo. En ausencia de crecimiento de micoplasmas urogenitales, el medio permanece amarillo.
Importante: Una coloración anaranjada debe ser considerada como un test positivo
(tasa límite).
10.2.1. Identificación (pocillos 7, 8 y 9)
La identificación se realiza en función del viraje específico de los pocillos (ver capítulo
10.2.2.) así como por la lectura de los pocilllos 7, 8, y 9 para la determinación del perfil
Identibiotico:
7(L)
Color de los pocillos #
8(SXT)
9(E)
Ureaplasma
urealyticum
rojo
rojo
amarillo
Mycoplasma
hominis
amarillo
rojo
rojo
10.2.2. Numeración (pocillos 1, 2, 3 y 10)
Marcar los pocillos de numeración que hayan virado al rojo e interpretar según la tabla
siguiente:
viraje al rojo
de los pocillos #
1
1y2
1,2 y 3
10
Interpretación (UCC /ml)
tasa U.u
tasa U.u
tasa U.u
tasa M.h
103
104
>105
>104
Notas
l La numeración de los micoplasmas urogenitales ha sido validada en las muestras
donde pueden estar presentes en estado de comensales (cérvico-vaginales y uretrales).
l La aparición de U. urealyticum y de M. hominis a partir de muestras normalmente estériles,
sea cual fuere su tasa, es significativa (5).
4
l Para los hombres, los criterios de interpretación para U. urealyticum son: > 10
UCC/ml para una muestra uretral y > 103 UCC/ml para el primer chorro de orina (5).
10.2.3.Detección de las resistencias (pocillos 4, 5 y 6)
Perfil resistente: El viraje del medio al rojo en los pocillos conteniendo un antibiótico
traduce la capacidad de la cepa para desarrollarse en presencia del antibiótico analizado.
Perfil sensible: El color amarillo del medio traduce la incapacidad de la cepa para
desarrollarse en presencia del antibiótico analizado.
Notas
l Los pocillos reservados para el test de resistencia no contienen suplemento S.Mh. En
caso de un resultado positivo para el Mycoplasma hominis, la lectura e interpretación
del perfil de resistencia deben efectuarse después de 48 horas de incubación.
l Como el inóculo no está estandarizado, los resultados de la numeración deben tenerse en cuenta para la interpretación del test de resistencia a los antibióticos (§13).
11 - CASOS PARTICULARES
Tasas muy elevadas de U.u y de M.h
Se produce un viraje al rojo de todos los pocillos de la galería. Por ende se recomienda
proceder a una dilución de la muestra para obtener un resultado más preciso. En este
caso, proceder de la siguiente manera:
l Sembrar un nuevo frasco UMMt con 200 µl del medio UMMlyo original conservado a
2-8°C (ver § 9.2). Comprobar la ausencia de viraje al sacarlo del refrigerador.
l Regenerar un nuevo frasco UMMlyo con la totalidad del frasco UMMt sembrado.
l Sembrar una nueva galería utilizando el medio obtenido (§ 9.3)
l Tener en cuenta la dilución (1:10) para la interpretación de la numeración.
l De ser necesario, confirmar en gelosa A7 la presencia de micoplasmas volviendo a aislar a partir del medio UMMlyo original conservado a 2-8°C (ver§ 9.2).
12 - CONTROL DE CALIDAD
El control de calidad puede realizarse a partir de una cepa de colección liofilizada
(Ureaplasma urealyticum ATCC 27618).
Realizar un precultivo después de sembrar 100µl de la cepa regenerada en un frasco de
medio UMM reconstituido (UMMt+UMMlyo).
Incubar a 37°C ± 1°C durante 6 horas.
Sembrar un nuevo caldo UMM reconstituido mediante 200µl del precultivo homogeneizado.
Sembrar la galería MYCOFAST EvolutioN 2 y continuar el test según las presentes
instrucciones (§9.2, 9.3 y 10).
Resultado esperado :
103 104
>105
D
ROX
OFX
L
SXT
E
>104
+
+
-
-
-
-
+
+
-
-
Importante : En el caso de una cepa liofilizada debilitada en actividad ureásica, la incubación puede se prolongada hasta 18-24 horas. El caldo será sembrado con 20 µl.
13 - LÍMITES DEL MÉTODO
6-7 UFC/ml y que poseen una ureasa,
l Algunas bacterias, presentes en cantidad >10
pueden hacer virar todos los pocillos de la galería. Se puede verificar su presencia volviendo a aislar sobre gelosa chocolate a partir del medio UMMlyo original conservado
a 2-8°C (ver § 9.2).
l Un pH de muestra básica (pH > 8) puede hacer virar el medio UMM.En ese caso, diluir
la muestra (1:10) en otro medio UMM y realizar la interpretación teniendo en cuenta la
disolución.
l Como sucede con cualquier método de búsqueda de gérmenes, la calidad de la muestra condiciona el resultado del test. Un test negativo no significa necesariamente una
ausencia de infección.
l El test de resistencia se realiza a partir de la muestra, y sólo brinda una estimación de
la resistencia a 3 clases de antibióticos. El resultado debe ser apreciado en función de
la numeración de la especie detectada (tasa recomendada: 104-5 UCC/ml).
3 UCC/ml) puede causar un
l Una muestra débilmente cargada de micoplasmas (<10
viraje aleatorio en los distintos pocillos de la galería.
14 - PERFORMANCES
Las performances del método MYCOFAST han sido evaluadas en relación con el cultivo en gelosa A7 a partir de muestras clínicas. Los resultados de identificación se resumen en la siguiente tabla:
MUESTRAS
n=
Prevalencia
Sensibilidad
Especificidad
Uretrales
Vaginales
Esperma
Orina
100
52%
98,2%
100%
150
13,3%
88%
98,4%
150
16%
86,4%
98,4%
El método MYCOFAST también ha sido validado para la detección e identificación en
muestras de secreciones gástricas de recién nacidos (n=208, prevalencia 19,2%) y, en
forma paralela, sobre las muestras cervicales-vaginales de la madre (n=208, prevalencia
48,1%). Todas las cepas de micoplasmas presentes en la gelosa A7 han sido detectadas con el método MYCOFAST (4).
15 - ELIMINACIÓN DE LOS DESECHOS
Los desechos deben ser eliminados respetando las reglas de higiene y la reglamentación en vigor para este tipo de productos en el país de utilización.
16 - BIBLIOGRAFIA
1. BEBEAR C., B. DE BARBEYRAC. 1994. Les mycoplasmes, p. 1443-1463. Dans FRENEY J., F. RENAUD, W. HANSEN, C. BOLLET (éd.). “ Manuel de bactériologie clinique “,
0 éd., vol. 3, Elsevier, Paris.
2. BOUCAUD-MAITRE Y. et S. THOINET. 1993. Analyse des prélèvements en bactériologie médicale - 2ème
partie : prélèvements génitaux. Feuil. Biol., 34 : 21-24.
3. GENIAUX M. 1994. Microbiologie des MST chez les mineurs de moins de 15 ans.
Méd Mal Infect. 24 : 409 - 424.
4. GRATTARD F., B. SOLEIHAC, B. DE BARBEYRAC, C. BEBEAR, P. SEFFERT and
B. POZZETTO. 1995. Epidemiologic and molecular investigations of genital mycoplasmas from women and neonates at delivery. Pediatr. Infect. Dis. J., 14 : 853 - 858.
5. TAYLOR-ROBINSON D. 1995. Ureaplasma urealyticum (T-strain Mycoplasma) and
Mycoplasma hominis, p. 1713 - 1718. Dans MANDELL G.L., J.E. BENNET and R. DOLIN
(ed.). Principles and practices of Infectious Diseases, 4th ed., vol. 2, Churchill
Livingstone, New York.
MYCOFAST® es una marca registrada de ELITech France SAS
Sitio de fabricación :
ELITech France
Parc d’activités
Allée d’Athènes
83870 SIGNES
(FRANCE)
ELITECH France SAS
305, allée de Craponne
13300 SALON DE PROVENCE
(FRANCE)
Tél. : 33 (0)4 90 17 54 50
Fax : 33 (0)4 90 17 54 51
M e io UM M t - Co m p o s içã o e m g /l d e á g u a d e sti la d a :
Caldo Micoplasmas ..............................................20
Antibióticos ..........................................................10 ml
pH : 6.0 ± 0.2
M Y C O FA S T ® E v o l u t i o N 2
Di ag nó st ic o de Mi co pl asm as Ur og en ita is
l
l
l
Contagem
Identificação
Detecção da resistência aos antibióticos
1 2 teste s (Réf. 00030)
3 0 teste s (Réf. 00031)
PT-2006-09
1 - UTILIZAÇÃO PREVISTA
A embalagem MYCOFAST EvolutioN 2 permite efectuar a cultura, contagem e
identificação de Ureaplasma urealyticum (U.u.) e de Mycoplasma hominis (M.h.) em
amostras endocervicais, uretrais, urinárias, gástricas e de esperma. O dispositivo
MYCOFAST EvolutioN 2 permite ainda a detecção das resistências a certos antibióticos.
Cada embalagem permite realizar 12 ou 30 testes.
2 - INTRODUÇÃO
De tamanho compreendido entre 0,15 e 0,25 µm, os micoplasmas constituem os
procariotas mais pequenos e mais simples com capacidade para se auto-replicarem (1).
Os micoplasmas, dos quais se conhecem, até ao momento, 15 espécies referenciadas,
pertencem à classe das mollicutae (de cutis mollis : pele mole). Diferenciam-se das
outras bactérias em inúmeros pontos, entre os quais a ausência de parede, que lhe
confere uma resistência natural às ß-lactamases, bem como uma membrana rica em
esteróis provenientes das membranas das células eucariotas, nas quais se fixam. Como
os micoplasmas são organismos relativamente frágeis, apenas se multiplicam em meio
acelular na presença de várioa factores de crescimento e a uma temperatura constante,
compreendida entre 35 e 37°C.
A maior parte dos micoplasmas humanos são comensais. Das 9 espécies isoladas a partir do tracto urogenital, Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma hominis são as mais frequentemente encontradas. U.u. ou M.h. transmitem-se por via sexual e podem ser verdadeiros agentes patogénicos. No recém-nascido, a contaminação verifica-se na passagem pelo aparelho genital e pode provocar diversas afecções respiratórias, bem como
meningites (3). No adulto, U.u. e M.h. são directamente responsáveis pelas patologias
descritas no quadro seguinte (6):
Uretrites não gonocócicas
Uretroprostatite
Epididimite
Cálculos urinários
Pielonefrite
Inflamação pélvica
Febre pós-parto/aborto
Corioamnionite
U . u r e a l yt i c um
++++
++
+++
++
++
++
M . h o mi n i s
++++
+++
++++
-
O diagnóstico convencional assenta na cultura em placas de agar A7, seguida de
reconhecimento ao microscópio das colónias de U.u. (em forma de ouriço-do-mar) ou
M.h. (em forma de ovo estrelado).
Dado que U.u. e M.h. são organismos comensais, o diagnóstico das infecções por
micoplasmas deverá depender da determinação de um limiar patológico e seguido de
uma contagem precisa.
3 - PRINCÍPIO
A técnica MYCOFAST EvolutioN 2 identifica o crescimento de U.u. e de M.h. após 24
horas de incubação num meio líquido. Durante o crescimento metabolizam ureia e
arginina, visualizado por passagem de um indicador colorido - o vermelho de fenol - de
amarelo alaranjado a vermelho, o que traduz a alcalinização do meio devido à libertação
de amónia.
O crescimento dos micoplasmas assim visualizado permite obter:
- a contagem, com base na velocidade de hidrólise dos substratos, que é proporcional à
quantidade de germes contidos na amostra (patentes: europeia nº 0311541, US n°
5.091.307).
- a identificação com base na sensibilidade, ou não, do germe, perante três antibióticos
(identibiotique®)
- a detecção das resistências a três antibióticos: doxiciclina, roxitromicina e ofloxacina.
4 - REAGENTES
D es c r i ç ão
U.M.M.t : Frasco de meio de transporte de
micoplasmas (2 ml)
U.M.M.lyo : Frasco de meio de crescimento
liofilizado
Galeria MYCOFAST E v o l u t i o N 2: Galeria de 2x10
poços, acondicionada em saqueta de alumínio
S. M.h.: Activador de crescimento de
Mycoplasma hominis (4,5 ml)
Q ua nt i da de
#00030
#00031
12
30
Temp.
2 - 8°C
12
30
2 - 8°C
6
15
2 - 8°C
1
2
2 - 8°C
M e i o r e c o n s ti tu í d o ( U M M t+ U M M ly o )
Co m p o si çã o e m g /l d e á g u a d e st il a d a :
Caldo Micoplasmas ..............................................20
Soro de potro ....................................................200 ml
Extracto de leveduras ............................................5,8
Cisteína ..................................................................0,3
Arginina ..................................................................9
Ureia ......................................................................3,6
Vermelho de fenol ..................................................0,04
Antibióticos ..........................................................10 ml
pH : 6.1 ± 0.1
9 - MÉTODO
E st a b i li za r o s r e a g e n te s à te m p e r a t u r a a m b ie n te d u r a n te 2 0 a 3 0 m in u to s .
9.1 Re genera ção do mei o UMMl yo
Transferir cada meio UMMt inoculado para um novo frasco UMMlyo. O meio UMMlyo
assim regenerado deve apresentar uma cor alaranjada. Misturar bem.
9.2 In oc ul aç ão da g al eri a
Identificar cada série de poços.
Retirar a fita adesiva e distribuir sucessivamente nos poços de cada série
poços 1-10 100 µl de meio UMMlyo inoculado
poços 9-10 50 µl de suplemento S.Mh
poços 1-10 2 gotas de óleo de parafina
l Cobrir a galeria com película adesiva.
C onservar o ex cedente do fra sco UMMlyo a 2-8° C durante, pelo menos, 48 horas, a
fim de permitir uma eventual verificação (ver § 11).
l
l
Galeria MYCOFA S T Ev olut ioN 2
Galeria de 2 testes de 2 x 10 poços compreendendo 4 partes:
Po ço
Objec tivo
1a3
Contagem de U.u. entre 103 e >105 UCC/ ml
4a6
Avaliação das resistências de Uu e Mh a 3 antibióticos
Doxiciclina 8 µg/ml (D), Roxitromicina 4 µg/ml (ROX) e
Ofloxacina 4 µg/ml (OFX)
7a9
Identibiotique®: Identificação de U.u. e M.h. pelo seu perfil
de resistência ou de sensibilidade à: Lincomicina (L),
Trimetoprim-sulfametoxazole (SXT) e Eritromicina (E)
10
Contagem de Mh >104 UCC/ ml
9.3 In cu baç ão d a gal eri a
Incubar a galeria a 37°C ± 1°C durante 24 horas.
Para a contagem de U.u proceder à leitura dos resultados em 24 horas. Para a detecção de M.h incubar durante 48 horas, se necessário.
Nota: A incubação pode ser prolongada até 72 horas, para as amostras de urina,
esperma e suco gástrico.
A fim de se obter uma contagem específica, os poços 1 a 3, reservados à contagem de
U.u. contêm lincomicina, que inibe o crescimento de M.h. eventualmente presente; o
poço 10, reservado à contagem de M.h., contém eritromicina, que inibe o crescimento de
U.u.
10.2 Le i tu ra e i nt er pre t aç ão
A leitura dos resultados é a identificação das colorações obtidas nos diferentes poços da
galeria.
O crescimento de micoplasmas urogenitais nos poços traduz-se numa alcalinização do
meio, que passa a vermelho. Na ausência de crescimento de micoplasmas urogenitais,
o meio mantém-se amarelo.
Nota: Uma coloração alaranjada deve ser considerada como teste positivo (taxa limite).
5 - PRECAUÇÕES
l Os reagentes desta embalagem foram concebidos apenas para utilização in vitro, só
devendo ser manipulados por técnicos especializados.
l As amostras e os reagentes inoculados são potencialmente infecciosos; logo, devem
ser manipulados de acordo com as precauções de utilização implementadas, respeitando as normas em termos de higiene bem como a legislação em vigor no país de utilização para este tipo de produto.
l Os reagentes que contêm matérias-primas de origem animal devem ser manipulados
de acordo com as precauções de utilização.
l Não utilize os reagentes que estejam fora do prazo de validade.
l Não utilize os reagentes danificados ou indevidamente conservados antes do respectivo uso.
l Um resultado positivo com o método MYCOFAST indica colonização por micoplasmas
urogenitais, mas não serve, só por si, para efectuar um diagnóstico clínico. Este deverá
ser realizado pelo médico em função dos resultados biológicos e dos sinais clínicos.
6 - RECOLHA E TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
6.1 Re c ol ha da s a mo st ra s
A m o s t r a s e n d o c e rv i c ai s / v a g i n a i s
Para recolher amostras, utilizar unicamente um escovilhão Dacron® ou rayon, ou uma
escova de citologia. Efectuar a colheita com um novo escovilhão, após cuidadosa
eliminação das secreções do colo do útero.
Como os micoplasmasaderem fortemente às células das mucosas às quais aderem, é
e s se n ci a l r a s p a r b e m a m u co sa a fi m d e o b te r m a t e r i a l s u f ic i e n t e ( 2 ) .
Am o s t r a s u r e t ra i s
Limpar o meato e proceder à recolha por esfregaço ou raspagem das células.
E sp er m a, u r i na
Recolher o esperma ou o primeiro jacto de urina num frasco esterilizado.
Su c o g á str ic o
Recolher o suco gástrico do recém-nascido por aspiração, através de um cateter, e colocar num frasco esterilizado.
6.2 Tr ans por te em m eio UMM t
A m o s t ra s p o r e s c o v i l h ã o: Depositar o escovilhão num frasco de meio UMMt.
A m o s t r a s l í q u i d a s: Inocular um frasco de meio UMMt com 200µl de líquido
homogeneizado.
Um a ve z in o c u la d o , o m e i o UM M t p o d e se r co n se r va d o à te m p e r a tu r a a m b ie n te
( 1 8 - 2 5° C ) d u r an t e 8 h o r a s ou a 2- 8 ° C d u r a n t e 1 6 h or a s .
7 - PREPARAÇÃO E CONSERVAÇÃO DOS REAGENTES
Todos os reagentes são fornecidos prontos a utilizar. Quando conservados à temperatura de 2 - 8ºC, na embalagem original, os reagentes mantêm-se estáveis até ao termo
do prazo de validade indicado na embalagem.
l O meio UMMt pode ser temporariamente conservado à temperatura ambiente, mas
apresenta melhor estabilidade a 2 - 8°C.
l Em caso de utilização de apenas metade da galeria, guardar a outra metade, coberta
com a respectiva fita adesiva, na saqueta de alumínio de origem e hermeticamente
fechada. A meia galeria, assim conservada, mantém-se estável durante 3 semanas, à
temperatura de 2-8°C.
l O suplemento Mh mantém-se estável durante 3 meses após abertura
l Não congelar os reagentes da embalagem.
l
8 - MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
Material para colheitas (escovilhões, escovas de citologia, frascos esterilizados para
recolha das amostras líquidas)
l Pipetas e pontas
l Recipiente para resíduos contaminados
l Óleo de parafina
l Estufa a 37°C ± 1°C
l
10 - LEITURA E INTERPRETA ÇÃ O
10.1 Va l i da ç ão
Verificar se todos os poços da galeria se apresentam límpidos. Um poço turvo indica uma
contaminação bacteriana. Neste caso é necessário repetir a análise.
1 0 . 2 . 1 I d e nt i f i c a ç ã o ( po ç o s 7, 8 e 9 )
A identificação efectua-se em função da cor específica dos poços de contagem (ver o
capítulo 10.2.2), bem como da leitura dos poços 7, 8 e 9 para a determinação do perfil
Identibiotique® :
Ureaplasma
urealyticum
Mycoplasma
hominis
7 ( L)
C o r d os p oç o s #
8 (SXT)
vermelho
vermelho
amarelo
amarelo
vermelho
vermelho
9 (E)
10.2.2 Contagem (poços 1,2,3 e 10)
Identificar os poços que passaram a vermelho e interpretar:
p a ss a g e m a ve r m e lh o
dos poços #
1
1e2
1, 2 e 3
10
In te r p r e ta ç ã o ( UC C/m l)
taxa
taxa
taxa
taxa
U.u. de 103
U.u. de 104
U.u. > 105
M.h. > 104
N ot a s
l A contagem de micoplasmas urogenitais foi validada nas amostras onde eles possam
estar presentes em estado comensal (cervico-vaginais e uretrais).
l A existência de U. urealyticum e de M. hominis em colheitas normalmente estéreis,
qualquer que seja o nível, é significativa (5).
l Em seres humanos, os critérios de interpretação para U. urealyticum são: > 104
UCC/ml para uma amostra uretral e > 103 UCC/ml para o primeiro jacto de urina (5).
10.2.3 Teste d e resi stência (poços 4, 5 e 6)
P e rf i l de re si s t ên ci a : Se há passagem do meio a vermelho, a estirpe é resistente ao
antibiótico, na concentração presente no poço.
P e rf i l d e s e ns i b i l i da de: Se o meio apresenta cor amarela a estirpe é inibida pelo
antibiótico, na concentração presente no poço.
N ot a s
l Os poços reservados ao teste de resistência não contêm suplemento S.Mh. Em resultados positivos para Mycoplasma hominis, a leitura e a interpretação do perfil de resistência devem ser efectuadas após 48 horas de incubação.
l Como o inoculado não está padronizado, os resultados da contagem têm de ser tidos
em conta para a interpretação do teste de resistência aos antibióticos (§13).
11 - CASOS PARTICULARES
N í v e i s m u i t o el e v a d o s d e U . u e d e M . h
Regista-se uma passagem a vermelho de todos os poços da galeria. Recomenda-se
proceder a uma diluição da amostra, a fim de obter resultados mais específicos. Neste
caso, proceda da seguinte forma:
l Inocular um novo frasco de UMMt com 200 µl do meio UMMlyo original, conservado a
2-8°C (ver § 9.2). Verificar a ausência de mudança de cor do meio, ao retirar do frigorífico.
l Regenerar um novo frasco UMMlyo com a totalidade do frasco UMMt inoculado.
l Inocular uma nova galeria com o meio obtido (§ 9.3)
l Ter em conta a diluição (1:10) para a interpretação da contagem.
l Se necessário, proceder à confirmação da presença de micoplasmas numa placa de
agar A7, isolando de novo a partir do meio UMMlyo original, conservado a 2-8°C (ver §
9.2).
12 - CONTROLO DE QUALIDADE
O controlo de qualidade pode ser realizado a partir de uma estirpe de referência
liofilizada (Ureaplasma urealyticum ATCC 27618).
Efectuar uma pré-cultura após inoculação de 100µl da estirpe regenerada, num frasco
de meio UMM reconstituído (UMMt+UMMlyo).
Incubar a 37°C ± 1°C durante 6 horas.
Inocular um novo caldo UMM reconstituído com 200µl da pré-cultura homogeneizada.
Inocular a galeria MYCOFAST® Evolution 2 e realizar o teste como indicado neste
folheto informativo (§9.2, 9.3 e 10).
R e s ul t ad o e s pe ra do :
103
+
104
+
>105
-
D
-
ROX
-
OFX
-
L
+
SXT
+
E
-
>104
-
Nota: No caso de uma estirpe liofilizada, com baixa actividade ureásica, a incubação
pode prosseguir até 18-24 horas. O caldo será inoculado por 20 µl.
13 - LIMITAÇÕES
l Algumas bactérias, presentes em quantidade >106-7 UFC/ml que possuem uma urease podem fazer mudar de cor todos os poços da galeria. A sua presença pode ser verificada isolando de novo em agar de chocolate, a partir do meio UMMlyo original, conservado a 2-8°C (ver § 9.2).
l Um pH de amostra básico (pH > 8) pode fazer o meio UMM mudar de cor. Neste caso,
diluir a amostra (1:10) num novo meio UMM e interpretar tendo em conta a diluição.
l Tal como em qualquer método de pesquisa de germes, a qualidade da amostra pode
influenciar o resultado do teste. Um teste negativo poderá assim não traduzir necessariamente uma ausência de infecção.
l O teste de resistência é realizado a partir da amostra, pelo que fornece apenas uma
estimativa da resistência em relação a 3 classes de antibióticos. O resultado deve ser
avaliado em função da contagem das espécies detectadas (nível recomendado: 104-5
UCC/ml).
l Uma amostra com uma carga baixa de micoplasmas (<103 UCC/ml) pode dar origem
a uma mudança de cor aleatória nos diferentes poços da galeria.
14 - DESEMPENHO
Foram utilizadas amostras clínicas para testar o desempenho do método MYCOFAST
por comparação com cultura em placas de agar A7. Os resultados da identificação estão
resumidos no quadro seguinte:
A MO S TR A S
n=
P r e va lê n ci a
S e ns i b i l i d a de
E s p ec i f i c i d ad e
U re t ra i s
Va gi n ai s
100
52%
98,2%
100%
E sp er m a
150
13,3%
88%
98,4%
U ri n a
150
16%
86,4%
98,4%
O método MYCOFAST foi igualmente validado para detecção e identificação de
micoplasmas em amostras de secreções gástricas de recém-nascidos (n=208,
prevalência 19,2%) e em paralelo em amostras cervicais/vaginais da mãe (n=208,
prevalência 48,1%). Todas as estirpes de micoplasmas presentes no agar A7 foram
detectadas pelo método MYCOFAST (4).
15 - ELIMINAÇÃO DOS RESÍDUOS
Os resíduos devem ser eliminados em conformidade com as regras de higiene e a regulamentação em vigor para este tipo de reagentes, nos países onde são utilizados.
16 - B I B L I O G R A F I A
1. BEB EAR C., DE BARBEYRAC B . 1994. Les mycoplasmes, p. 1443-1463. Dans
FRENEY J., RENAUD F. , HANSEN W. , BOLLET C. (éd.).“Manuel de bactériologie clinique”, 2ème éd., vol.3, Elsevier, Paris .
2. BOUCAUD-MAITRE Y. et THOINET S. 1993. Analyse des
prélèvements en bactériologie médicale - 2ème partie : prélèvements génitaux. Feuil. Biol., 34 : 21-24.
3. GENIAUX M. 1994. Microbiologie des MST chez les mineurs de moins de 15 ans. Méd
Mal Infect. 24:409-424.
4. GRATTARD F., SOLEIHAC B., DE BARBEYRAC B., BEBEAR C., SEFFERT P. and
POZZETTO B. 1995. Epidemiologic and molecular investigations of genital mycoplasmas from women and neonates at delivery. Pediatr. Infect. Dis. J. , 14 : 853-858.
5 . Grou pe R émic de la S o cié té Fran çai se d e Mic robi ol ogi e. LE REMIC. 1998. 1re édition. Référentiel en microbiologie médicale (bactériologie et mycologie). 21.
Mycoplasmes.
6. TAYLOR-ROBINSON D. 1995. Ureaplasma urealyticum (T-strain Mycoplasma) and
Mycoplasma hominis, p. 1713-1718. Dans MANDELL G. L. , BENNET J. E. and DOLIN
R. (ed.). Principles and Practices of Infectious Diseases, 4th ed., vol. 2, Churchill
Livingstone, New York.
MYCOFAST® é uma marca registada da ELITech France SAS
Local de fabrico :
ELITech France
Parc d’activités
Allée d’Athènes
83870 SIGNES
(FRANCE)
ELITECH France SAS
305, allée de Craponne
13300 SALON DE PROVENCE
(FRANCE)
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Fax : 33 (0)4 90 17 54 51