Licenciatura em Ciências da Saúde Gené4ca Humana 3º Ano – 1º Semestre 2012-­‐2013 2º Trabalho Laboratorial CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA SENSIBILIDADE AO PTC (fenil4ocarbamida) 1.  Registo da sensibilidade ao PTC 2.  Extracção de DNA genómico a par@r de epitélio bucal e sua caracterização 3.  Detecção do polimorfismo TAS2R38 por PCR-­‐RFLP a.  Amplificação por PCR da região genómica de interesse b.  Hidrólise do produto de PCR com enzima de restrição c.  Avaliação dos resultados por electroforese em gel de agarose 4.  Rastreio de polimorfismos por SSCP 5.  Interpretação e integração dos resultados O paladar é um dos 5 sen@dos dos animais, e que nos permite: §  avaliar o conteúdo nutricional dos alimentos §  prevenir a ingestão de substâncias tóxicas Os mamíferos conseguem dis@nguir apenas 5 sabores básicos: §  Amargo (detectam compostos potencialmente nocivos ou venenosos) §  Ácido §  Salgado (assegura balanço electrolí@co adequado) §  Doce (nutrientes ricos em energia) §  Umami (L-­‐glutamato e 5’-­‐ribonucleó@dos) O reconhecimento do sabor é mediado por células epiteliais especializadas localizadas na língua Amargo Salgado Doce Umami Ácido NATURE|Vol 444|16 November 2006|doi:10.1038/nature05401 O PTC, ou fenil@ocarbamida, é um composto com gosto amargo O gosto amargo é mediado por uma família de ∼30 GPCR (receptores acoplados a proteína G) – os T2Rs O gene que codifica para o receptor de gosto do PTC, TAS2R38, apresenta um modo de transmissão Mendeliano A sequenciação do gene revelou a existência de 3 aminoácidos que variam na população humana, causados por SNPs (single nucleo@de polymorphisms) A combinação específica destes 3 SNPs denomina-­‐se Haplo4po e correlaciona-­‐se fortemente com a capacidade de sen@r o gosto amargo Exemplo ilustra@vo do conceito moderno de Farmacogené4ca, em que a geno@pagem de SNPs é usada para prever a resposta a um fármaco SNPs no gene TAS2R38 Nucleó4do Taster Non-­‐Taster Codão Aminoácido Codão Aminoácido c.145 CCA Pro GCA Ala c.785 GCT Ala GTT Val c.886 GTC Val ATC Ile Haplo4pos no locus PTC Variable nucleo@de posi@ons in PTC haplotypes. Each haplotype is summarized in two rows. The top row summarizes nucleo@de varia@on in the haplotype, and the bohom row summarizes amino acid varia@on in the haplotype. Each column represents a codon containing a variable nucleo@de posi@on, indicated at the top of the column. The number of occurrences of each haplotype is indicated to the right for the African (Af), Asian (As), European (Eu), and North American (NA) samples. Shaded columns indicate the three variable amino acid posi@ons used for haplotype designa@on by Kim et al. (2003). Wooding et al. Am J Hum Genet. 2004 April; 74(4): 637–646. SNPs no gene TAS2R38 O polimorfismo na posição 145 do mensageiro do gene TAS2R38 é detectado pela enzima de restrição HaeIII que reconhece a sequência 5’-­‐GG↓CC-­‐3’ 3’-­‐CC↑GG-­‐5’ Corte pela enzima – T Ausência de corte pela enzima – t Capacidade de sen@r o gosto amargo -­‐ pelo menos um alelo T (TT ou Tt) Incapacidade de sen@r gosto amargo -­‐ dois alelos t (h) Um polimorfismo corresponde à coexistência numa população de 2 ou mais fenó@pos de uma caracterís@ca A maioria das populações são dimórficas em relação à capacidade de sen@r o gosto da fenil@ocarbamida – amargo ou sem sabor. O alelo responsável pela sensação de amargo é dominante, enquanto o outro é recessivo Detecção do polimorfismo rs713598 (n.145c>g ) do gene TAS2R38 U – não digerido com HaeIII D – digerido com HaeIII