ARS VETERINARIA, Jaboticabal, SP, Vol. 20, nº 2, 228-232, 2004.
ISSN 0102-6380
VARIAÇÃO MORFOLÓGICA DA MICROGLIA NA ENCEFALITE
EXPERIMENTAL PELO VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR
EM CAMUNDONGOS
(MORPHOLOGIC VARIATION OF MICROGLIA IN THE EXPERIMENTAL ENCEPHALITIS FOR
THE VESICULAR STOMATITIS VIRUS IN MICE1)
(VARIACIÓN MORFOLÓGICA DE LA MICROGLÍA EN LA ENCEFALITIS EXPERIMENTAL
POR EL VIRUS DE LA ESTOMATITIS VESICULAR EN RATONES)
R. O. VASCONCELOS1,2*; L. S. JARDIM1; G. F. MACHADO2; A. C. ALESSI3
RESUMO
O modelo murino de encefalite viral, utilizando o vírus da estomatite vesicular (VEV), é amplamente empregado nas
pesquisas sobre os mecanismos de resposta aos agentes virais e das células residentes e inflamatórias no Sistema
Nervoso Central (SNC). A compreensão desses mecanismos possibilita determinar se os efeitos nocivos à neuroglia são
causados por fatores ligados ao agente etiológico ou se podem estar associados com mediadores químicos inflamatórios,
liberados por células imunocompetentes ativadas (microglia, astrócitos, leucócitos). Foram utilizados 20 camundongos
jovens, inoculados com o vírus, por via intranasal. Os encéfalos foram colhidos e submetidos à Técnica de Imunoistoquímica
para marcação da microglia. A reação microglial foi discreta nos animais com 2 e 4 dias pós-inoculação (p.i.), com morfologia
fusiforme (bipolar) predominante. Nos animais que apresentaram sinais clínicos (6 dias p.i.) houve uma proliferação
microglial e uma variação morfológica. A morfologia arredondada da microglia fagocítica foi uma constante nas áreas com
necrose do neurópilo. Na periferia destas áreas observou-se a forma ramificada ativada e nas áreas mais distantes ao foco
de lesão verificaram-se as formas bipolar e ramificada não ativada. Esta variação morfológica é indicativa da versatilidade
da microglia em resposta a um processo infeccioso no tecido nervoso e da importância desta célula na defesa do SNC
contra agentes invasores.
PALAVRAS-CHAVE: Microglia. Vírus da estomatite vesicular. Encefalite viral. Imunoistoquímica.
SUMMARY
The murine model of viral encephalitis using the vesicular stomatitis virus (VEV) is largely used in researches
concering the response mechanisms to the viral agents and resident and inflammatory cells in the Central Nervous System.
The understanding of these mechanisms facilitates to determine if the noxious effects to the neuroglia are caused by
factors linked to the causative agent or if they can be associated with inflammatory chemical mediators, released by
activated immune cells (microglia, astrocytes, leukocytes). Twenty young mice were used, which were inoculated with the
virus by intranasal route. The encephalons were collected and submitted to the Immunohistochemistry for demarcation of
the microglia. The microglial reaction was mild for the animals at 2 and 4 days post-inoculation (p.i.), with predominance of
spindled morphology (bipolar). In the animals that presented clinical signs (6 days p.i.) there were microglial proliferation
and morphologic variation. The rounded morphology of the phagocytic microglia was constant in the areas with necrosis
1
Médica Veterinária - Doutoranda da Unesp Jaboticabal
Médica Veterinária - Prof. Assistente Doutor da Unesp Araçatuba
3
Médico Veterinário - Prof. Titular da Unesp Jaboticabal
* Endereço para Correspondência: Rua Clóvis Pestona, 793. CEP 16050-680 - Araçatuba, SP. End. Eletrôn.:
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R. O. VASCONCELOS, L. S. JARDIM, G. F. MACHADO, A. C. ALESSI. Variação morfológica da microglia na encefalite experimental pelo vírus da estomatite vesicular em
camundongos. / Morphologic variation of microglia in the experimental encephalitis for the vesicular stomatitis virus in mice. / Variación morfológica de la microglia
en la encefalitis experimental por el virus de la estomatitis vesicular en ratones. Ars Veterinaria, Jaboticabal, SP, Vol. 20, nº 2, 228-232, 2004.
of the neuropil. In the periphery of these areas the activated ramified form was observed and in the most distant areas of
the lesion focus the bipolar forms were verified and not ramified activated. This morphologic variation is indicative of the
versatility of the microglia in responding against an infectious process in the nervous tissue and of the importance of this
cell in the defense of CNS against invasive agents.
KEY-WORDS: Microglia. Vesicular stomatitis virus. Viral encephalitis. Immunohistochemistry.
RESUMEN
El modelo murino de encefalitis viral, utilizando el vyrus de la estomatitis vesicular (VEV), es ampliamente usado en
las investigaciones sobre los mecanismos de respuesta a los genes virales y de las células residentes e inflamatorias en el
sistema nervoso central (SNC). La comprensión de estos mecanismos posibilita determinar si los efectos nocivos a la
neuroglia son causados por factores ligados al agente etiológico o si pueden estar asociados con mediadores químicos
inflamatorios, liberados por células inmunocompetentes activadas (microglia, astrocitos, leucocitos). Fueron utilizados 20
ratones jóvenes, inoculados con el virus, por vía intranasal. Los encéfalos fueron colectados y sometidos a la técnica de
inmunohistoquímica para marcación de la microglia. La reacción microglial fue discreta en los animales con 2 y 4 días pos
inoculación (p.i.), con morfología fusiforme (bipolar) predominante. En los animales que presentaron signos clínicos (6
días p.i.) hubo proliferación microglial y variación morfológica. La morfología arredondeada de la microglía fagocítica fue
una constante en las áreas con necrosis do neurópilo. En la periferia de estas áreas se observó la forma ramificada activada
y en las áreas más distantes del foco de la lesión se verificaron las formas bipolar y ramificada no activada. Esta variación
morfológica es indicativa de la versatilidad de la microglía en respuesta a un proceso infeccioso en el tejido nervioso y de
la importancia de esta célula en la defensa del SNC contra agentes invasores.
PALABRAS CLAVE: Microglia. Virus de la estomatitis vesicular. Encefalitis viral. Inmunohistoquímica.
INTRODUÇÃO
A microglia corresponde a cerca de 5 a 20% da
população glial do SNC. São células altamente
especializadas, com morfologia variada no cérebro maduro.
A microglia em repouso possui o citoplasma com
processos ramificados. Quando reativa, essas
ramificações ficam mais espessas e evidentes. Nos
processos degenerativos, principalmente de morte
neuronal, aparece a forma fagocítica ou amebóide (“gitter
cells”), caracterizada por um aspecto arredondado
(KETTENMANN & RANSON, 1995).
Essas transformações na forma da célula são
acompanhadas por mudanças no fenótipo celular, na
produção e secreção de citocinas e quimiocinas e na
expressão de moléculas de MHC (Complexo de
Histocompatibilidade Maior) na membrana celular (XIAO
& LINK, 1998, LOKENSGAR et al., 2000).
Os marcadores celulares, para essas células gliais,
variam e alguns não aparecem na célula em repouso
(vimentina, marcadores de macrófagos, marcadores do
receptor do complemento CR3, MHC classes I e II, CD4).
Esta célula glial faz parte da “glia limitans perivascular”,
pois seus processos citoplasmáticos estão interligados
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aos “pés terminais” de astrócitos. A observação dessa
proximidade vascular resultou no termo “microglia
perivascular” (KETTENMANN & RANSON, 1995).
As principais funções desse fagócito glial são a
apresentação de antígenos, citotoxicidade, fagocitose e
indução da neovascularização. A célula microglial é
quiescente no cérebro maduro, com morfologia ramificada.
Alguns dias após a injúria, ela começa a expressar
receptores “scavanger” (como os macrófagos) e seus
processos citoplasmáticos começam a retrair e a célula
migra para as áreas injuriadas, iniciando a fagocitose
(KETTENMANN & RANSON, 1995, McMANUS et al.,
1998, LOKENSGAR et al., 2000).
A rápida ativação da microglia, mediante mudanças
patológicas mínimas, é um importante mecanismo de
defesa do encéfalo contra doenças infecciosas, traumas,
isquemias e tumores. Quando imunocompetentes, as
células microgliais expressam MHC (classes I e II),
receptores para o complemento, produzem citocinas e óxido
nítrico e expressam moléculas de adesão, tais como, LFA3, ICAM-1 e CD-80 (XIAO & LINK, 1998).
Na fase de desenvolvimento, a microglia aparece
na forma amebóide, progredindo para uma forma
diferenciada com processos citoplasmáticos ramificados.
R. O. VASCONCELOS, L. S. JARDIM, G. F. MACHADO, A. C. ALESSI. Variação morfológica da microglia na encefalite experimental pelo vírus da estomatite vesicular em
camundongos. / Morphologic variation of microglia in the experimental encephalitis for the vesicular stomatitis virus in mice. / Variación morfológica de la microglia
en la encefalitis experimental por el virus de la estomatitis vesicular en ratones. Ars Veterinaria, Jaboticabal, SP, Vol. 20, nº 2, 228-232, 2004.
Os astrócitos sinalizam parcialmente esta diferenciação
morfológica e a motilidade microglial. Em culturas mistas
de microglia e astrócitos do cérebro fetal humano, a
diferenciação da microglia progrediu de amebóide para
ramificada a bipolar e a tripolar. A velocidade de migração
foi de 20 a 35μm / hora, em um estado ramificado e em
confluência com astrócitos (REZAIE et al., 2002).
A glia fagocítica do SNC pode ser fonte de danos
tóxicos a neurônios. Esta célula libera neurotoxinas (in
vitro), tais como, os radicais livres (intermediários reativos
do O2, proteinases, óxido nítrico), que levam à morte
neuronal. Os astrócitos e a microglia (in vitro) podem
regular a sobrevivência neuronal, pela secreção de
diferentes produtos. A competição entre essas células
gliais e seus produtos sugere que mecanismos secretórios
opostos podem influenciar (in vivo) a viabilidade tecidual.
Os astrócitos tentam atenuar os efeitos tóxicos da
microglia. As células inflamatórias também podem
apresentar efeitos neurotóxicos (KETTENMANN &
RANSON, 1995, LOKENSGAR et al., 2000).
No Complexo Dementia da Aids, a microglia
participa do processo de migração de monócitos, através
da barreira hematoencefálica, para o tecido nervoso. Isso
ocorre, quando estimulada pelo HIV-1 e/ou por sua
interação com astrócitos ativados (PERSIDSKY et al.,
1999).
Nas neuropatias traumáticas, o recrutamento de
macrófagos e da microglia, os quais são hábeis em liberar
fatores críticos para a sobrevivência neuronal, podem
influenciar no processo de morte dos neurônios
(LOKENSGAR et al., 2000, BAJETTO et al., 2001).
O objetivo deste estudo foi apresentar os
diferentes tipos morfológicos da microglia, em resposta a
um estímulo viral, nas diferentes fases deste processo.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 20 camundongos entre 18 a 22
dias de idade, da linhagem Swiss, provenientes do Biotério
Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP
– USP), em Ribeirão Preto, SP. Os animais foram divididos
em 4 grupos. Os três primeiros foram inoculados, por via
intranasal, com VEV na dose de 3ml, com um título de
3x102,8 vírus / animal. Os animais infectados foram
sacrificados aos 2o. e 4o. dias p.i., respectivamente, para
os grupos 1 e 2. O terceiro grupo foi sacrificado no início
dos sintomas neurológicos (6 dias p.i.), segundo protocolo
de MACHADO (1999). O último grupo (controle),
inoculado com salina pela mesma via, foi sacrificado junto
com o terceiro grupo.
Cérebros de todos os grupos foram processados
para congelação, após prévia perfusão com Solução
Tampão PBS (pH 7,2 a 4 o C), via transcardíaca e,
armazenados em “freezer” –80oC, até o corte em micrótomo
de congelação (MACHADO, 1999).
As secções de cérebro foram cortadas a 5μ e fixadas
em Acetona P.A. (-20oC), por 5 minutos. A técnica de
imunoistoquímica utilizada foi Avidina-Biotina Peroxidase
(Vectastain ABC Kit, VECTOR, PK 4000). O anticorpo
primário para a microglia foi o OX-42, de camundongo
anti-rato (SEROTEC, MCA275G). O anticorpo 2o foi o de
cabra anti-camundongo biotinilado (DAKO, E0433). Após
a fixação dos cérebros, foram dados 3 banhos de 5 min.
em PBS (pH 7,2), que se repetiu entre cada passo.
Posteriormente fez-se o bloqueio da peroxidase endógena
(DAKO, S2001). No bloqueio dos sítios inespecíficos
utilizou-se o soro normal de cabra (KPL, XDO24). O
anticorpo primário ficou incubando “overnight” e o
secundário por 30 min, ambos na diluição de 1:100. O
cromógeno foi DAB (Diaminobenzidina - KPL, XB100).
Na contra-coloração utilizou-se a Hematoxilina de Harris
(diluição de 2:1), por 1 minuto.
RESULTADOS
Dos animais inoculados com VEV, os sacrificados
ao 2o e 4o dias p.i. não apresentaram sintomatologia clínica.
Os animais sacrificados com sintomas apresentaram pêlos
arrepiados, prostração, andar em círculos, ataxia de
membros posteriores, convulsões e morte. As lesões
microscópicas mais importantes foram: necrose, que se
estendeu do bulbo olfatório até o tronco cerebral, variando
de focal a localmente extensa. Os neurônios foram as
células mais lesadas pelo vírus (necrose). Processo
inflamatório discreto a moderado, foi observado nas
meninges, ao redor de vasos sangüíneos do neurópilo e
na região subventricular. O tipo de infiltrado inflamatório
foi misto, composto por neutrófilos, linfócitos e alguns
macrófagos.
Nos cérebros submetidos à técnica de
imunoistoquímica, observou-se uma variação morfológica
grande das células microgerais positivas. A morfologia
variou desde fusiforme (bipolar, não-reativa) a ramificada
(com prolongamentos mais finos, (não-reativa) a células
com prolongamentos espessados (reativa) e formas
arredondadas sempre associadas à necrose (fagocítica).
O número de células positivas foi bastante diferente entre
os grupos experimentais. No grupo com 2 dias p.i.,
verificaram-se pouquíssimas células positivas, com
predominância da forma bipolar. Estas células apareciam
mais no córtex cerebral.
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R. O. VASCONCELOS, L. S. JARDIM, G. F. MACHADO, A. C. ALESSI. Variação morfológica da microglia na encefalite experimental pelo vírus da estomatite vesicular em
camundongos. / Morphologic variation of microglia in the experimental encephalitis for the vesicular stomatitis virus in mice. / Variación morfológica de la microglia
en la encefalitis experimental por el virus de la estomatitis vesicular en ratones. Ars Veterinaria, Jaboticabal, SP, Vol. 20, nº 2, 228-232, 2004.
No grupo controle o padrão microglial
predominante foi fusiforme, desde o bulbo olfatório até o
tronco cerebral.
DISCUSSÃO
FIGURA 1 – Fotomicrografias da morfologia microglial na
encefalite por VEV em camundongos. (A)
Aspecto fusiforme ou bipolar no Tronco
Cerebral (seta); (B) Forma ramificada ativada
no Córtex (seta); (C) Morfologia fagocítica
arredondada em área necrótica do Tálamo
(setas). Técnica de Imunoistoquímica
Avidina-Biotina Peroxidase para microglia
(Barra = 25μm).
No grupo com 4 dias p.i., notaram-se células
fusiformes a ramificadas (substância branca) no tronco
cerebral (Figura 1A), corpo caloso e tecido adjacente ao
ventrículo lateral. No bulbo olfatório necrótico e tálamo
foram evidentes as células arredondadas fagocíticas
(Figura 1C). No tecido circunvizinho do bulbo olfatório
foram vistas células microgliais ativadas com processos
citoplasmáticos ramificados (Figura 1B). As células
inflamatórias (da fissura rinal e ventrículo lateral) foram
discretamente positivas para a microglia.
No grupo com sinais neurológicos, o número de
células fusiformes triplicou em todo o cérebro (substância
branca do cerebelo, hipocampo, hipotálamo e tronco
cerebral). Nos bulbos e no tronco cerebral, com lesão,
observaram-se células arredondadas na periferia da área
de necrose. Células microgliais com prolongamentos
citoplasmáticos espessados e com núcleo alongado
hipertrófico (reativa) foram vistas na vizinhança das áreas
necróticas do tronco cerebral.
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A microglia ativada é a principal célula efetora
imune do SNC. Seus produtos inflamatórios estão
implicados em uma variedade de doenças
neurodegenerativas, devido a seus efeitos tóxicos para
neurônios (LOKENSGAR et al., 2000).
Neste estudo, constatou-se que nos animais
controle, a morfologia microglial predominante foi a bipolar
e a ramificada não ativada, em várias regiões do cérebro.
A microglia em repouso, no cérebro normal, ainda
não tem função completamente definida (LOKENSGAR et
al., 2000). Entretanto, a transformação reativa relacionase com a ativação da resposta imune (KETENMANN &
RANSON, 1995, LOKENSGAR et al., 2000). A modulação
da resposta ocorre por super-regulação da expressão de
receptores de membrana (MHC) e pela geração de uma
ampla variedade de produtos secretórios, tais como
citocinas e quimiocinas (McMANUS et al., 1998, XIAO &
LINK, 1998, LOKENSGAR et al., 2000).
As transformações morfológicas da microglia
ativada podem ser induzidas por vírus e por astrócitos
ativados (KETENMANN & RANSON, 1995, REZAIE et
al., 2002).
Neste modelo de encefalite viral, a microglia
fagocítica esteve sempre associada a focos de necrose
do parênquima nervoso.
A microglia é atraída para o foco de injúria por
astrócitos apresentando antígenos. Essa migração ocorre
por mudança na morfologia celular, de ramificada para
arredondada, com o objetivo de fagocitar os restos
celulares necróticos (KETENMANN & RANSON, 1995,
McMANUS et al., 1998, LOKENSGAR et al., 2000).
CONCLUSÃO
Conclui-se que a microglia é uma importante célula
residente no SNC. Quando ativada, tem capacidade de
fagocitar debris celulares e contribuir para o processo de
reparação do tecido nervoso.
É muito importante avaliar a relação da microglia
ativada com neurônios degenerados, devido aos produtos
neurotóxicos liberados por ela. O controle destes efeitos
deletérios contribuiria para a terapia de doenças
inflamatórias e degenerativas do SNC.
R. O. VASCONCELOS, L. S. JARDIM, G. F. MACHADO, A. C. ALESSI. Variação morfológica da microglia na encefalite experimental pelo vírus da estomatite vesicular em
camundongos. / Morphologic variation of microglia in the experimental encephalitis for the vesicular stomatitis virus in mice. / Variación morfológica de la microglia
en la encefalitis experimental por el virus de la estomatitis vesicular en ratones. Ars Veterinaria, Jaboticabal, SP, Vol. 20, nº 2, 228-232, 2004.
ARTIGO RECEBIDO: Outubro/2002
APROVADO: Maio/2003
REFERÊNCIAS
BAJETTO, A., BONAVIA, R., BARBERO, S., FLORIO, T.,
SCHETTINI, G. Chemokines and their receptors in the
central
nervous
system.
Frontiers
in
Neuroendocrinology, v. 22, p. 147-184, 2001.
KETTERMANN, H., RANSON, B.R. Neuroglia. New York
: Oxford, 1079 p., 1995.
LOKENSGAR, J.R., CHEERAN, M.C-J., HU, S., GEKKER,
G., PETERSON, P.K. Microglia: defenders of the brain
against viral infection. In: PETERSON, P.K., REMINGTON,
J.S. New conceptos in the immunopathogenesis of CNS
infections. Blackwell Science : Massachusetts. cap. 3. , p.
39-50, 2000.
MACHADO, G.F. Papel do IFN-gama e do TNF-alfa na
imunopatologia da encefalite experimental induzida pelo
vírus da estomatite vesicular em camundongos C57B16.
Ribeirão Preto, 1999. 129p. Tese (Doutorado) - Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São
Paulo, 1999.
PERRY, V.H., ANDERSSON, P.B., GORDON, S.
Macrophages and inflamation in the central nervous
system. TINS, v. 16, n. 7, 1993.
PERSIDSKY, Y., GHORPADE, A., RASMUSSEN, J.,
LIMOGES, J., LIU, X.J., STINS, M., FIALA, M., WAY, D.,
KIM, K.S., WITTE, M.H., WEINAND, M., CARHART, L.,
GENDELMAN, H.E. Microglial and astrocyte chemokines
regulate monocyte migration through the blood-brain
barrier in human immunodeficiency virus-1 encephalitis.
American Journal of Pathology, v. 155, n. 5, p. 1599-1611,
1999.
REZAIE, P., TRILLO-PAZOS, G., GREENWOOD, J.,
EVERALL, I.P. Motility and ramification of human fetal
microglia in culture: na investigation using time-lapse
video microscopy and image analysis. Experimental Cell
Research, v. 274, n. 1, p. 68-82, 2002. (disponível em:
www.idealibrary.com/links/doi/10.1006/excr.2001.5431 >
Acesso em 23 de setembro de 2002).
XIAO, B.G., LINK, H. Immune regulation within the central
nervous system. Journal Neurological Sciences, v. 157,
n. 1, p. 1-12, 1998.
McMANUS, C.M., BROSNAN, C.F., BERMAN, J.W.
Cytokine induction of MIP-1a and MIP-1b in human fetal
microglia. Journal of Immunology, v. 160, p. 1449-1455,
1998.
232