UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
BRUNO LEONARDO SILVA
SÍNTESE DE GALACTOSÍDEOS DE ARILA INIBIDORES
POTENCIAIS DE TRANS-SIALIDASE DE TRYPANOSOMA
CRUZI
Belo Horizonte – MG
2012
BRUNO LEONARDO SILVA
SÍNTESE DE GALACTOSÍDEOS DE ARILA INIBIDORES
POTENCIAIS DE TRANS-SIALIDASE DE TRYPANOSOMA
CRUZI
Dissertação, como requisito parcial, para obter o
grau de mestre em Ciências Farmacêuticas,
submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia
da Universidade Federal de Minas Gerais.
Orientador Prof. Dr. Ricardo José Alves
Belo Horizonte – MG
2012
S586s
Silva, Bruno Leonardo.
Síntese de galactosídeos de arila inibidores potenciais de transsialidase de Trypanosoma cruzi / Bruno Leonardo Silva. – 2012.
162 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo José Alves.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais,
Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas.
1. Trypanosoma cruzi – Teses. 2. Galactosídeos de arila –
Teses. 3. Inibidores enzimáticos – Teses. 4. Síntese orgânica –
Teses. 5. Modelagem molecular – Teses. 6. Chagas, Doença de –
Teses. I. Alves, Ricardo José. II. Universidade Federal de Minas
Gerais. Faculdade de Farmácia. III. Título.
CDD: 615.19
Dedico este trabalho aos meus pais, Márcio e Marli, que me agraciaram com
essa existência e me educaram com bases de amor incondicional e carinho.
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Professor Ricardo José Alves pelas lições acadêmicas e de vida que
nortearam o meu caminhar como profissional e ser humano durante essa
convivência. Obrigado por acreditar nas minhas potencialidades e investir nos meus
talentos.
À minha irmã Aline pela alegria e otimismo dispensados que tornam mais prazerosa
e suave a minha caminhada.
Aos meus padrinhos Marisa e Henrique pelos exemplos de afeto, dedicação e
perseverança que deixam incessantemente para mim e para toda família.
À minha avozinha Francisca Natália que sempre lutou pelos valores da família e,
durante décadas, batalha pela formação de pessoas de bem.
Aos demais familiares, tios e primos e avó materna, que me apoiaram nesta minha
trajetória e me assistiram nos momentos de dificuldade.
Aos amigos Stefânia, Saulo Andrade, Saulo Braga, Marcela, Thiago, Lucas e Carol
que viram no colega de bancada um amigo, abraçaram as dificuldades do grupo
como suas e fizeram do ambiente de trabalho um local de respeito, alegria e
amizade.
Aos demais amigos e colegas do Laboratório de Química Farmacêutica, o meu
obrigado pelo companheirismo e apoio.
À Lavina pela alegria matinal com que sempre me recebeu no laboratório e por seus
exemplos de vida e respeito ao próximo.
Aos amigos do Departamento de Saúde da Fraternidade Espírita Irmão Glacus, que
fortaleceram com seus verdadeiros exemplos de altruísmo o lado humano da minha
formação.
Aos amigos da Campanha do Quilo Irmão Palminha pela amizade querida de anos.
Aos novos amigos Fernanda, Rafael e Lidyane pelo trabalho social inspirador que
realizam e por me abrirem carinhosamente as portas do Centro Juvenil Salesiano.
Aos amigos de graduação Renan, Rogério e Lucas pela amizade sincera e divertida
dos últimos anos.
Aos professores Thais, Renata e Basílio, que nos deram inúmeras lições de
profissionalismo e zelaram pela construção de um grupo mais forte e melhor.
Ao professor Armando e ao Eduardo do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas que trabalham com afinco na melhoria do programa.
Ao professor Ronaldo Nagem por me oferecer sua amizade e por me aceitar um ano
em seu laboratório, apresentando-me uma fantástica área do conhecimento: a
cristalografia de proteínas.
Ao professor José Dias de Souza Filho pela ajuda inestimável na realização dos
experimentos de RMN.
À professora Ivone Carvalho pela disposição em colaborar com o grupo e pela
realização dos ensaios enzimáticos.
“Não há ciência alguma que tenha surgido completa do cérebro do homem;
todas, sem exceção, são o produto de observações sucessivas, apoiadas
nas observações precedentes, como em um ponto conhecido para chegar
ao desconhecido.”
Alan Kardec
RESUMO
A trans-sialidase de Trypanosoma cruzi (TcTS) é uma enzima de superfície que
catalisa a transferência de resíduos do monossacarídeo ácido siálico de
sialogliconjugados do hospedeiro para proteínas mucinas amplamente distribuídas
na superfície do parasita. Fisiologicamente a TcTS medeia ativamente mecanismos
de escape da resposta imune contra T. cruzi, invasão celular e apoptose de células
do tecido sanguíneo. Essa enzima, portanto, é essencial para o desenvolvimento da
doença de Chagas, sendo reconhecidamente um alvo molecular bastante promissor
para o desenvolvimento de fármacos. Nesse contexto, realizou-se neste trabalho o
planejamento e a síntese de derivados de D-galactose inibidores potenciais de TcTS,
utilizando estratégias de modificação molecular, especialmente simplificação
molecular. Dez galactosídeos de arila modificados em C-3 foram sintetizados e
caracterizados para serem ensaiados contra TcTS por espectrofluorimetria.
Utilizando-se reações clássicas da química de carboidratos, foram sintetizados
inicialmente
o
β-D-galactopiranosídeo
de
4-metoxicarbonilfenila
e
o
β-D-
galactopiranosídeo de 4-metoxicarbonil-2-nitrofenila, a partir dos quais foram
realizadas reações regiosseletivas de O-alquilação em C-3. Foram utilizados como
eletrófilos iodeto de metila, bromoacetato de terc-butila e bromoacetonitrila. A
seletividade foi obtida pelo emprego da técnica do óxido de dibutilestanho, que
forma complexos cíclicos estanilados com os galactosídeos e conduz, na presença
de agentes alquilantes, aos produtos substituídos em C-3, geralmente com elevado
rendimento e seletividade. Posteriormente, os derivados com os substituintes tercbutoxicarbonilmetila e cianometila foram modificados, obtendo-se derivados com os
grupos carboximetila e 5-tetrazolilmetila em C-3.
Palavras-chave: trans-sialidase de Trypanosoma cruzi, ácido siálico, planejamento
de
inibidores,
dibutilestanho.
galactosídeos
de
arila,
alquilação
regiosseletiva,
óxido
de
ABSTRACT
Trypanosoma cruzi trans-sialidase (TcTS) is a surface enzyme that catalyses the
transfer of residues of the monosaccharide sialic acid from host sialoglycoconjugates
to the mucins, abundant proteins expressed on the parasite surface. Physiologically
TcTs actively participates of the mechanisms of evasion from the immune system,
cell invasion and blood cell apoptosis. This enzyme is, therefore, essential for the
development of Chagas Disease, and is considered a promising molecular target for
drug design. Thus, the aim of the present work was the design and synthesis of Dgalactose-derived potential inhibitors of TcTS using strategies of molecular
modification, in special molecular simplification. Ten aryl galactosides modified at
carbon-3 were synthesized and characterized for evaluation against TcTS by
spectrofluorimetry.
By
using
classical
carbohydrate
chemistry
4-
methoxycarbonylphenyl β-D-galactopyranoside and 4-methoxycarbonyl-2-nitrophenyl
β-D-galactopyranoside were prepared. The regioselective 3-O-alkylation of both
compounds was then carried out using methyl iodide, tert-butyl bromoacetate and
bromoacetonitrile as electrophylic reagents. The regioselectivity was achieved by
employing the dibutyltin oxide method, in which cyclic tin complexes are formed and,
upon reaction with an alkyl halide, furnish 3-O-alkylated products, in general high
yields and selectivity. The alkylated products bearing tert-butoxycarbonylmethyl or
cyanomethyl groups were modified in order to obtain derivatives bearing at C-3 a
carboxymethyl or a 5-tetrazolylmethyl group.
Key words: Trypanosoma cruzi trans-sialidase, sialic acid, drug design, aryl
galactosides, regiosselective alkylation, dibutyltin oxide.
LISTA DE FIGURAS
1 Fármacos utilizados para o tratamento da doença de Chagas. ................................................. 20
2 Estruturas do ácido neuramínico e seus derivados C-5-substituídos mais comuns. ............. 22
3 Rota biossintética simplificada de Neu5Ac. ................................................................................. 23
4 Atividade enzimática de sialidase, sialiltransferase e trans-sialidade. ..................................... 25
5 Principais eventos bioquímicos mediados pela TcTS decorrentes da infecção pelo
Trypanosoma cruzi no hospedeiro vertebrado. ........................................................................... 27
6 Mecanismo catalítico da trans-sialidase de T. cruzi.................................................................... 30
7 Estruturas do ácido siálico (1) e seus derivados miméticos DANA (2), zanamivir (4) e
oseltamivir (5). Em (3), o cátion sialosil oxacarbênio, análogo do estado de transição
da reação de hidrólise de sialosídeos. ......................................................................................... 31
8 Moléculas com maior atividade avaliadas por Neres e colaboradores e as respectivas
CI50 para TcTS. ................................................................................................................................. 33
9 Inibidor covalente avaliado por Carvalho e colaboradores. ....................................................... 34
10 Estruturas do lactitol, ácido lactobiônico e lactotetrazol. ........................................................ 35
11 Galactosídeos fosfonatos avaliados por Busse e colaboradores e as respectivas
constantes de inibição (Ki) para TcTS. ....................................................................................... 35
12 C-sialosídeos com maior atividade avaliados por Meinke e colaboradores e as
respectivas constantes de dissociação (KD) para TcTS. .......................................................... 36
13 Galactosídeos com maior atividade avaliados por Harrison e colaboradores e as
respectivas porcentagens de inibição de TcTS a 1mM. ........................................................... 36
14 Glicosídeos triazólicos com maior atividade avaliados por Campo e colaboradores e
as respectivas porcentagens de inibição de TcTS a 1mM. ...................................................... 37
15 Estrutura do gangliosídeo GM3. .................................................................................................. 37
16 Substâncias aromáticas hidroxiladas inibidores de TcTS e as respectivas CI50. .................. 38
17 Derivados de lactose e
D-galactose sintetizados no laboratório de Química
Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da UFMG e testados contra TcTS. ........................ 39
18 Estratégias de modificação molecular utilizadas neste trabalho. ........................................... 40
19 Galactosídeos de arila modificados em C-3 propostos para síntese. ..................................... 42
20 Esquema de síntese de 53 e 54 a partir de D-galactose. ........................................................... 43
21 Proposta mecanística de desacetilação de 68 e 69 pelo método de Zemplén. ...................... 44
22 Espectro de RMN de 1H de 53 (200 MHz, DMSO-d6)................................................................... 45
LISTA DE FIGURAS (conclusão)
23 Reação de complexação entre grupos hidroxilas de um poliol e o óxido de
dibutilestanho. ............................................................................................................................... 46
24 Exemplos de modificação regiosseletiva da hidroxila de C-3 de galactosídeos
parcialmente protegidos. ............................................................................................................. 47
25 Estrutura dimérica proposta para o organoestanho 77. ........................................................... 48
26 Configuração dos organoestanhos formados pela complexação de glicosídeos
desprotegidos com óxido de dibutilestanho. ............................................................................ 49
27 Exemplos de modificação regiosseletiva da hidroxila de C-3 de derivados
galactosídicos totalmente desprotegidos. ................................................................................. 50
28 Mecanismo simplificado proposto por Kaji e colaboradores para 3-O-glicosilação do
galactosídeo de metila catalisada por Bu4NF. ........................................................................... 51
29 Etapa de 3-O-modificação dos galactosídeos 53 e 54. ............................................................. 51
30 Espectro de RMN de 1H dos anômeros α e β de 59. .................................................................. 52
31 Sinais de hidrogênios metilênicos α-tetrazólicos no espectro de RMN de 1H de 64. ............ 54
32 Etapa de desproteção do éster terc-butílico dos galactosídeos 56 e 61. ............................... 57
33 Proposta mecanística de desproteção do éster terc-butílico dos galactosídeos 56 e
61. ................................................................................................................................................... 59
34 Reação de obtenção dos galactosídeos 59 e 64........................................................................ 60
35 Estrutura do substrato MuNANA. ................................................................................................ 62
LISTA DE TABELAS
1 Sialomiméticos testados contra TcTS. ......................................................................................... 32
2 Proporção molar dos reagentes utilizados nas 3-O-alquilações dos galactosídeos 53 e
54....................................................................................................................................................... 69
3 Condições empregadas nas 3-O-alquilações dos galactosídeos 53 e 54. ................................ 70
4 Quantidades de reagentes e solventes utilizados na síntese de 59 e 64. ................................. 83
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
Ac
Acetila
ADP
Adenosina difosfato
All
Alila
Arg
Arginina
Asp
Ácido aspártico
ATP
Adenosina trifosfato
ATR
Attenuated Total Reflectance
Bn
Benzila
Bz
Benzoíla
CCD
Cromatografia em Camada Delgada
CCS
Cromatografia em Coluna de Sílica-Gel
CI50
Concentração inibitória de 50% da atividade enzimática
CMP
Citidina 5-monofosfato
COSY
Correlated Spectroscopy
d
Dupleto
DANA
Ácido 2-desoxi-2,3-didesidro-D-N-acetilneuramínico
dd
Dupleto duplo
ddd
Duplo dupleto duplo
DEPT
Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO
Dimetilsulfóxido
EC
Enzyme Commission
F.F.
Faixa de Fusão
FEP
Fosfoenolpiruvato
F.M.
Fórmula Molecular
GH
Glycoside Hydrolase
GlcNAc
N-acetil-D-glicosamina
Glu
Ácido Glutâmico
GPI
Glicosilfosfatidilinositol
His
Histidina
HMBC
Heteronuclear Multiple-Bond Correlation
HMQC
Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence
IV
Infravermelho
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS (continuação)
J
Constante de acoplamento escalar
KD
Constante de dissociação
KDN
Ácido 2-ceto-3-desoxinonônico
LAREMAR
Laboratório de Ressonância Magnética de Alta Resolução
Leu
Leucina
M.M.
Massa Molar
ManNAc
N-acetil-D-manosamina
ManNAc-6-P
N-acetil-D-manosamina-6-fosfato
m
Multipleto
MuNANA
Ácido 4-metillumbeliferil-α-D-N-acetilneuramínico
NANA
Ácido N-acetilneuramínico
Neu2en5Ac
Ácido 2-desoxi-2,3-didesidro-D-N-acetilneuramínico
Neu5Ac
Ácido N-acetilneuramínico
OMS
Organização Mundial de Saúde
P
Coeficiente de partição óleo-água
P.A.
Para análise
P.E.
Ponto de ebulição
Pi
Fosfato inorgânico
PLC
Fosfolipase C
RMN
Ressonância Magnética Nuclear
s
Simpleto
SAPA
Shed Acute Phase Antigen
Ser
Serina
SN1
Substituição nucleofílica unimolecular
SN2
Substituição nucleofílica bimolecular
SVS/MS
Secretaria de Vigilância em Saúde/Ministério da Saúde
t
Tripleto
TcTS
Trans-sialidase de Trypanosoma cruzi
THF
Tetra-hidrofurano
Thr
Treonina
TBAI
Iodeto de tetrabutilamônio
TMS
Tetrametilsilano
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS (conclusão)
Trp
Triptofano
TS
Trans-sialidase
Tyr
Tirosina
UDP
Uridina difosfato
Val
Valina
WHO
World Health Organization
∆ν
Variação de deslocamento químico
δ
Deslocamento químico
[α]D
Poder rotatório específico
®
Marca registrada
Número de onda
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19
1.1 Doença de Chagas ............................................................................................ 19
1.2 Farmacoterapia convencional e novas perspectivas ..................................... 20
1.3 Ácidos siálicos .................................................................................................. 21
1.4 Sialidases, sialiltransferases e trans-sialidases............................................. 24
1.5 Trans-sialidase de Trypanosoma cruzi: alvo potencial para o
desenvolvimento de fármacos ......................................................................... 26
1.6 Estrutura, função e mecanismo de ação da TcTS .......................................... 28
1.7 Inibidores da TcTS ............................................................................................ 30
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 40
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 43
3.1 Síntese dos galactosídeos 53 e 54 .................................................................. 43
3.2 Alquilação 3-O-seletiva dos galactosídeos 53 e 54 ........................................ 45
3.3 Análise espectral dos produtos modificados em C-3 .................................... 53
3.3.1 Caracterização dos galactosídeos 55 e 60 ................................................... 55
3.3.2 Caracterização dos galactosídeos 56 e 61 ................................................... 55
3.3.3 Caracterização dos galactosídeos 58 e 63 ................................................... 56
3.4 Síntese e caracterização dos galactosídeos 57 e 62 ...................................... 57
3.4.1 Caracterização dos galactosídeos 57 e 62 ................................................... 59
3.5 Síntese e caracterização dos galactosídeos 59 e 64 ...................................... 60
3.5.1 Caracterização dos galactosídeos 59 e 64 ................................................... 61
3.6 Ensaios enzimáticos ......................................................................................... 62
4 PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................................... 65
4.1 Métodos gerais .................................................................................................. 65
4.2 Métodos de síntese ........................................................................................... 66
4.2.1 Procedimento de síntese de 53 e 54 ............................................................. 66
4.2.2 Procedimento geral de 3-O-alquilação dos galactosídeos 53 e 54 ............ 69
4.2.3 Procedimento de síntese de 55 ..................................................................... 70
4.2.4 Procedimento de síntese de 60 ..................................................................... 72
4.2.5 Procedimento de síntese de 56 ..................................................................... 74
4.2.6 Procedimento de síntese de 61 ..................................................................... 75
4.2.7 Procedimento de síntese de 58 ..................................................................... 77
SUMÁRIO (continuação)
4.2.8 Procedimento de síntese de 63 ..................................................................... 78
4.2.9 Procedimento de síntese de 57 e 62 ............................................................. 80
4.2.10 Procedimento de síntese de 59 e 64 ........................................................... 83
4.3 Ensaios enzimáticos ......................................................................................... 86
5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 88
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 89
APÊNDICE A – Espectro no infravermelho de 53 .......................................................... 97
APÊNDICE B – Espectro de RMN de 1H de 53 (DMSO-d6; 200 MHz) ................................. 98
APÊNDICE C – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 53 (DMSO-d6; 50
MHz) ................................................................................................. 99
.................................
APÊNDICE D – Espectro no infravermelho de 54 ......................................................... 100
APÊNDICE E – Espectro de RMN de 1H de 54 (DMSO-d6; 200 MHz)................................. 101
APÊNDICE F – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 54 (DMSO-d6; 50
MHz)................................................................................................. 102
............................
APÊNDICE G – Espectro no infravermelho de 55 ......................................................... 103
APÊNDICE H – Espectro de RMN de 1H de 55 (piridina-d5; 400 MHz)............................... 104
APÊNDICE I – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 55 (piridina-d5; 100
MHz) .................................................................................................. 105
..............
APÊNDICE J – Mapa de contornos COSY de 55 (piridina-d5; 400 MHz) ............................ 106
APÊNDICE K – Mapa de contornos HMQC de 55 (piridina-d5; 400 MHz) .......................... 107
APÊNDICE L – Mapa de contornos HMBC de 55 (piridina-d5; 400 MHz) ........................... 108
APÊNDICE M – Espectro no infravermelho de 56 ......................................................... 109
APÊNDICE N – Espectro de RMN de 1H de 56 (CDCl3; 400 MHz) ..................................... 110
APÊNDICE O – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 56 (CDCl3; 100
MHz) ................................................................................................ 111
....................................
APÊNDICE P – Mapa de contornos COSY de 56 (CDCl3; 400 MHz).................................. 112
APÊNDICE Q – Mapa de contornos HMQC de 56 (CDCl3; 400 MHz) ................................ 113
APÊNDICE R – Mapa de contornos HMBC de 56 (CDCl3; 400 MHz) ................................. 114
APÊNDICE S – Espectro no infravermelho de 57 ......................................................... 115
APÊNDICE T – Espectro de RMN de 1H de 57 (DMSO-d6; 400 MHz) ................................. 116
APÊNDICE U – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 57 (DMSO-d6; 100
MHz) ................................................................................................ 117
.................................
SUMÁRIO (continuação)
APÊNDICE V – Mapa de contornos COSY de 57 (DMSO-d6; 400 MHz) ............................. 118
APÊNDICE X – Mapa de contornos HMQC de 57 (DMSO-d6; 400 MHz) ............................ 119
APÊNDICE Y – Mapa de contornos HMBC de 57 (DMSO-d6; 400 MHz)............................. 120
APÊNDICE W – Espectro no infravermelho de 58 ........................................................ 121
APÊNDICE Z – Espectro de RMN de 1H de 58 (DMSO-d6; 400 MHz) ................................. 122
APÊNDICE AA – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 58 (DMSO-d6;
................................................................
100 MHz) ........................................................................................ 123
APÊNDICE BB – Mapa de contornos COSY de 58 (DMSO-d6; 400 MHz) .......................... 124
APÊNDICE CC – Mapa de contornos HMQC de 58 (DMSO-d6; 400 MHz).......................... 125
APÊNDICE DD – Mapa de contornos HMBC de 58 (DMSO-d6; 400 MHz) .......................... 126
APÊNDICE EE – Espectro no infravermelho de 59 ....................................................... 127
APÊNDICE FF – Espectro de RMN de 1H de 59 (DMSO-d6; 400 MHz)............................... 128
APÊNDICE GG – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 59 (DMSO-d6;
100 MHz) ....................................................................................... 129
.....................................................................
APÊNDICE HH – Mapa de contornos COSY de 59 (DMSO-d6; 400 MHz) .......................... 130
APÊNDICE II – Mapa de contornos HMQC de 59 (DMSO-d6; 400 MHz) ............................. 131
APÊNDICE JJ – Mapa de contornos HMBC de 59 (DMSO-d6; 400 MHz) ........................... 132
APÊNDICE KK – Espectro no infravermelho de 60 ...................................................... 133
APÊNDICE LL – Espectro de RMN de 1H de 60 (piridina-d5; 400 MHz) ............................. 134
APÊNDICE MM – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 60 (piridina-d5;
100 MHz) ....................................................................................... 135
.........................................................................
APÊNDICE NN – Mapa de contornos COSY de 60 (piridina-d5; 400 MHz) ........................ 136
APÊNDICE OO – Mapa de contornos HMQC de 60 (piridina-d5; 400 MHz) ....................... 137
APÊNDICE PP – Mapa de contornos HMBC de 60 (piridina-d5; 400 MHz) ........................ 138
APÊNDICE QQ – Espectro no infravermelho de 61 ...................................................... 139
APÊNDICE RR – Espectro de RMN de 1H de 61 (CDCl3; 400 MHz) .................................. 140
APÊNDICE SS – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 61 (CDCl3; 100
MHz) .............................................................................................. 141
............................................................
APÊNDICE TT – Mapa de contornos COSY de 61 (CDCl3; 400 MHz)................................ 142
APÊNDICE UU – Mapa de contornos HMQC de 61 (CDCl3; 400 MHz) .............................. 143
APÊNDICE VV – Mapa de contornos HMBC de 61 (CDCl3; 400 MHz) ............................... 144
APÊNDICE XX – Espectro no infravermelho de 62 ....................................................... 145
SUMÁRIO (conclusão)
APÊNDICE YY – Espectro de RMN de 1H de 62 (DMSO-d6; 400 MHz) .............................. 146
APÊNDICE WW – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 62 (DMSO-d6;
...................................................................................
100 MHz) ...................................................................................... 147
APÊNDICE ZZ – Mapa de contornos COSY de 62 (DMSO-d6; 400 MHz) ........................... 148
APÊNDICE AAA – Mapa de contornos HMQC de 62 (DMSO-d6; 400 MHz) ....................... 149
APÊNDICE BBB – Mapa de contornos HMBC de 62 (DMSO-d6; 400 MHz) ....................... 150
APÊNDICE CCC – Espectro no infravermelho de 63 .................................................... 151
APÊNDICE DDD – Espectro de RMN de 1H de 63 (DMSO-d6; 400 MHz) ........................... 152
APÊNDICE EEE – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 63 (DMSO-d6;
100 MHz) ...................................................................................... 153
........................................................................................
APÊNDICE FFF – Mapa de contornos COSY de 63 (DMSO-d6; 400 MHz) ......................... 154
APÊNDICE GGG – Mapa de contornos HMQC de 63 (DMSO-d6; 400 MHz) ...................... 155
APÊNDICE HHH – Mapa de contornos HMBC de 63 (DMSO-d6; 400 MHz) ....................... 156
APÊNDICE III – Espectro no infravermelho de 64 ......................................................... 157
APÊNDICE JJJ – Espectro de RMN de 1H de 64 (DMSO-d6; 400 MHz) ............................. 158
APÊNDICE KKK – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 64 (DMSO-d6;
100 MHz) ....................................................................................................... 159
...............................................................................................
APÊNDICE LLL – Mapa de contornos COSY de 64 (DMSO-d6; 400 MHz) ......................... 160
APÊNDICE MMM – Mapa de contornos HMQC de 64 (DMSO-d6; 400 MHz) ...................... 161
APÊNDICE NNN – Mapa de contornos HMBC de 64 (DMSO-d6; 400 MHz) ....................... 162
19
1 INTRODUÇÃO
1.1 Doença de Chagas
A doença de Chagas ou tripanossomíase americana é uma infecção parasitária
crônica causada pelo hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Segundo a Organização
Mundial de Saúde (OMS), essa doença tropical acomete 10 milhões de indivíduos e
representa um risco para uma população de 25 milhões de pessoas da América
Latina, geograficamente distribuídas desde o México até o sul da Argentina, onde a
enfermidade tem caráter endêmico (WHO, 2010).
A existência de diferentes formas evolutivas do parasita bem como de um elevado
número de reservatórios vertebrados e insetos triatomínios que participam do ciclo
de transmissão torna bastante complexa essa zoonose e, portanto, tem
impossibilitado a sua erradicação. As estratégias para eliminação da doença de
Chagas baseiam-se no controle dos vetores, triagem sistemática dos doadores de
sangue em todos os países endêmicos, detecção e tratamento da transmissão
congênita e tratamento de crianças infectadas e de casos agudos.
Nas
duas
últimas
décadas,
intervenções
dessa
natureza
contribuíram
significativamente para a interrupção da transmissão da infecção em importantes
áreas de risco. Brasil, Chile e Uruguai declararam-se livres da transmissão da
doença de Chagas pelo Triatoma infestans, o principal vetor domiciliar nesses
países. Contudo, a prevalência da doença ainda permanece elevada. Em 2007,
estimou-se a existência de 7.694.500 pessoas infectadas (1,448%) nos 21 países
onde a doença de Chagas é endêmica. O número de novos casos anuais devido à
transmissão vetorial e congênita são 41.200 e 14.385, respectivamente (WHO,
2007).
No Brasil, de 2006 a 2010 foram notificados 799 casos de doença de Chagas aguda,
com índice de letalidade de 2,25%. No estágio crônico, onde está a maioria dos
chagásicos, 30 a 40% dos casos evoluem para formas graves de cardiopatia e/ou
megaformações digestivas, o que provoca grande impacto nos sistemas de saúde
pública (SVS/MS, 2011).
20
1.2 Farmacoterapia convencional e novas perspectivas
Desde o final dos anos 1970, há somente dois fármacos disponíveis no mercado
para o tratamento da doença de Chagas: o nifurtimox (Lampit®) e o benznidazol
(Radanil® e Rochagan®) (Figura 1). Ambos os fármacos são tripanocidas contra as
formas tripomastigotas e amastigotas do T. cruzi e reduzem consideravelmente os
níveis de parasitemia, a gravidade e a letalidade na fase aguda da doença, obtendose curas parasitológicas em 80% dos casos. Entretanto, são bem menos eficazes na
fase crônica, não se obtendo, nesse estágio, sucesso terapêutico em mais de 20%
das pessoas tratadas (CANÇADO, 1999).
Figura 1 – Fármacos utilizados para o tratamento da doença de Chagas.
N
O
S
N N
O
O
N
O
Nifurtimox
O
N
H
N
O
N
O
O
Benznidazol
O nifurtimox é um 5-nitrofurano administrado por via oral, seus efeitos adversos são
bastante comuns e cerca de 50% dos pacientes não toleram o tratamento até o fim.
Seu modo de ação não está totalmente elucidado, mas provavelmente envolve a
redução e oxidação cíclica do grupo nitro, produzindo ânion superóxido, peróxido de
hidrogênio e radicais livres, justificando a reduzida seletividade do fármaco (DIAS et
al., 2009). O estresse oxidativo provocado por esse ciclo redox é responsável por
danos em macromoléculas celulares como DNA, lipídeos de membrana e proteínas
(FAIRLAMB, 2003). O nifurtimox apresenta sérios problemas de toxicidade e não se
encontra mais disponível comercialmente, mas permanece na lista de medicamentos
essenciais da OMS (WHO, 2010).
O benznidazol, um análogo nitroimidazólico, por outro lado, não atua através do ciclo
redox e não está envolvido diretamente na formação de espécies reativas de
oxigênio. Há evidências de que o efeito tripanocida do benznidazol deve-se
principalmente à ação direta de nitro-radicais e metabólitos eletrofílicos do fármaco,
21
que se ligam covalentemente às macromoléculas do T. cruzi (DIAS et al., 2009).
Embora o tratamento com esse fármaco seja recomendado devido à falta de opção
terapêutica, o benznidazol também causa efeitos adversos frequentemente graves
tais como: reações de hipersensibilidade, dermatite com erupções cutâneas,
depressão
da
medula
óssea,
trombocitopenia
e
polineuropatia
periférica
(RODRIGUES-COURA e DE CASTRO, 2002).
Diante desse panorama típico de uma doença negligenciada, uma intensa busca por
novas opções quimioterápicas mais efetivas e seguras para combater a doenças de
Chagas tem sido feita nos últimos anos. As principais estratégias exploradas para o
planejamento racional de novos fármacos envolvem a inibição das seguintes vias
bioquímicas do Trypanosoma cruzi: biossíntese de novo do ergosterol, proteólise
mediada por cruzipaína, metabolismo do pirofosfato, síntese e metabolismo redox da
tripanotiona e recaptação de purinas. Atividade seletiva contra T. cruzi dos inibidores
dessas vias já foi demonstrada in vitro e in vivo (URBINA, 2010 e 2003; WHO, 2007).
1.3 Ácidos siálicos
Os derivados do ácido neuramínico (Figura 2), conhecidos como ácidos siálicos,
constituem uma família de monossacarídeos de nove carbonos derivados de
hexose, amplamente distribuídos entre as glicoproteínas e os glicolipídeos de
membrana. Eles são encontrados principalmente em posições terminais de cadeias
oligossacarídicas da superfície celular e, ocasionalmente, de cadeias laterais de
âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Esses açúcares também podem ocupar
posições internas dentro de glicanas, sendo mais comum quando um resíduo do
monossacarídeo é anexado a outro, muitas vezes em posição C-8. Além disso,
resíduos
internos
podem
ocorrer
nas
unidades
de
repetição
de
alguns
polissacarídeos bacterianos e oligossacarídeos equinodermais (VARKI, 2009).
22
Figura 2 - Estruturas do ácido neuramínico e seus derivados C-5-substituídos mais comuns.
HO
OH
9
8
7
R
1
OH
6
5
HO
O
4
COOH
2
OH
R=
NHCOCH3
NHCOCH2OH
OH
NH2
(Neu5Ac; NANA)
(Neu5Gc)
(KDN)
(Neu)
3
Grande variedade estrutural surge das modificações naturais do esqueleto carbônico
desses carboidratos (Figura 2). C-5 pode ter um grupo N-acetil (Neu5Ac; NANA) ou
uma hidroxila (como em KDN). O grupo 5-N-acetil também pode ser hidroxilado,
originando o ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc). Menos comumente, o grupo 5-Namino não é acilado, dando o ácido neuramínico (Neu). Cada uma destas quatro
moléculas, Neu5Ac, Neu5Gc, KDN e Neu, pode conter um ou mais substituintes
adicionais nas hidroxilas em C-4, C-7, C-8 e C-9 (O-acetil, O-metil-, O-sulfato, Olactil ou grupos fosfato). Formas insaturada e anidra de ácido siálico livre também
existem, 2-desoxi-2,3-didesidro-Neu5Ac (Neu2en5Ac) é a mais comum (VARKI,
2009). O ácido siálico mais abundante em eucariotos é o Neu5Ac, frequentemente
chamado somente de “ácido siálico” (LEHNINGER, 2005).
Neu5Ac e Kdn são os principais precursores metabólicos dos ácidos siálicos de
origem animal. Em organismos vertebrados, o ácido N-acetilneuramínico é obtido no
citosol das células pela condensação de N-acetil-D-manosamina-6-fosfato (ManNAc6-P) com fosfoenolpiruvato e subsequente desfosforilação. O precursor fosfatado
ManNAc-6-P é produzido a partir de UDP-N-acetilglicosamina ou N-acetilglicosamina
em duas etapas: uma epimerização em C-2 e uma fosforilação na hidroxila de C-6
(Figura 3; DE FÁTIMA et al., 2005).
23
Figura 3 – Rota biossintética simplificada de Neu5Ac.
O grupo ácido carboxílico
rboxílico dos ácidos siálicos está ionizado em pH fisiológico, mas
pode também,, em uma cadeia oligossacarídica, estar condensado na forma
lactônica com uma hidroxila de carboidratos adjacentes ou na forma lactâmica com
um grupo amino livre de C-5.
C
Além dessa
a diversidade estrutural, diferentes
d
conectividades podem ser obtidas pela formação da ligação α-glicosídica
glicosídica entre C-2
do ácido siálico e um açúcar adjacente, promovida por sialiltransferases específicas.
As posições aceptoras mais comuns são os carbonos C-3
3 e C-6
C de resíduos de
galactose e C-6
6 de galactosamina (VARKI, 2009).
A diversidade química dos derivados do ácido neuramínico contribui para a enorme
variedade de estruturas sacarídicas que compõem o glicocálice amplamente
distribuído na superfície das
da células. Com efeito, esses monossacarídeos estão
envolvidos em diversos processos biológicos, atuam como mediadores em
interações específicas célula-célula
célula célula e interações entre célula e componentes da
matriz
z extracelular, uma vez que podem ser reconhecidos por anticorpos e lectinas
específicas de origem endógena
endógen e exógena (SCHAUER, 2004).
A alta expressão de ácidos siálicos na superfície externa de
d membranas celulares e
em glicoproteínas secretadas, como proteínas sanguíneas e mucinas,
mucinas sugere que
eles têm funções na estabilização das
d
membranas. Eles protegem as células e
24
macromoléculas do ataque de proteases e glicosidades, estendendo seu tempo de
vida e função (VARKI, 2009). Devido à carga dos grupos carboxilato, os ácidos
siálicos estão envolvidos na ligação e no transporte de fármacos e íons, como
cátions Ca2+. A repulsão eletrostática das cargas negativas estabiliza as
conformações de proteínas, incluindo enzimas, aumenta a viscosidade das mucinas
e evita agregação de eritrócitos (IZUMIDA et al., 1991).
1.4 Sialidases, sialiltransferases e trans-sialidases
Sialidases ou neuraminidases são enzimas hidrolíticas (EC 3.2.1.18) que catalisam a
remoção de resíduos terminais de ácido siálico da cadeia oligossacarídica de
glicoconjugados (Figura 4). Fisiologicamente esse fenômeno leva à captura e
degradação de glicoproteínas plasmáticas pelo fígado, que contém receptores de
proteínas asialiladas (sem ácido siálico). Mecanismo semelhante é responsável pela
depuração hepática dos eritrócitos, indicando que a desialilação de gliconjugados de
membrana constitui um método de marcação de células velhas e que, portanto,
precisam ser renovadas (LEHNINGER, 2005).
O ácido siálico participa de muitos processos patológicos principalmente como sítio
de reconhecimento de macromoléculas virais e bacterianas. As neuraminidases do
vírus Influenza tipo A e B atuam no processamento de novos vírions sintetizados
quando estes brotam de uma célula infectada e evitam a auto-aglutinação de vírus.
Outro exemplo é a sialidase do Vibrio cholerae, que possui um papel muito bem
definido no desenvolvimento da cólera. A sialidase remove unidades de ácido siálico
de glangliosídeos das células da mucosa intestinal para criar GM1, o sítio de ligação
da toxina colérica (TAYLOR, 1996).
Outra importante família de enzimas envolvidas no metabolismo dos sialosídeos,
oligossacarídeos contendo ácido siálico, é formada pelas sialiltransferases (EC
2.4.99.X; Figura 4). Estas são glicosiltransferases que catalisam a transferência de
ácido siálico de citidina 5-monofosfafo de ácido siálico (CMP-ácido siálico; CMPNeu5Ac) para glicoconjugados, usualmente em resíduos terminais de galactose, Nacetilgalactosamina ou outro resíduo de ácido siálico (CHEN e VARKI, 2010).
Podem ser formadas ligações glicosídicas α2,3, α2,6, ou α2,8, dependendo da
25
especificidade da sialiltransferase envolvida na catálise (HARDUIN
HARDUIN-LEPERS et al.,
2001).
Figura 4 – Atividade enzimática de sialidase, sialiltransferase e trans-sialidade.
trans
cariotos inferiores que também expressam sialidases, um restrito grupo
Entre os eucariotos
do reino Protozoa, incapaz de sintetizar o ácido siálico de novo, desenvolveu uma
notável capacidade de adquiri-lo
adquiri lo de sialoglicoconjugados do hospedeiro. O
protozoário causador da doença
doenç de Chagas, Trypanosoma cruzi,
cruzi incorpora resíduos
de ácido siálico do hospedeiro em suas próprias moléculas de superfície por meio da
trans-sialidase (TS; Figura 4) (SCHENKMAN et al., 1994). Essa
Es
enzima é uma
sialidase modificada que, ao invés de remover o ácido siálico, transfere-o
transfere
de
sialoglicoconjugados
do
hospedeiro
para
proteínas
mucinas
extensamente
distribuídas
uídas na superfície do parasito (PREVIATO et al., 1985; FRASCH, 2000).
A trans-sialidase
sialidase também foi encontrada em tripanosomatídeos africanos como
Trypanosoma brucei brucei, Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma brucei
rhodosiense e Trypanosoma congolense (ENGSTLER et al., 1993a;
199
1993b; 1995).
Curiosamente, as espécies Trypanosoma evansi, Trypanosoma equiperdum não
expressam trans-sialidase
sialidase ou sialidase, enquanto que Trypanosoma rangeli possui
somente sialidase (ENGSTLER
ENGSTLER et al., 1995; PONTES-DE-CARVALHO
CARVALHO et al., 1993;
PEREIRA e MOSS,, 1985).
26
1.5
Trans-sialidase
de
Trypanosoma
cruzi:
alvo
potencial
para
o
desenvolvimento de fármacos
A atividade de neuraminidase exibida pelo Trypanosoma cruzi, encontrada nas
formas tripomastigotas
sanguíneas, mas
ausente
nas formas
amastigotas
intracelulares, foi pioneiramente descrita em 1983 (PEREIRA, 1983). Verificou-se,
posteriormente, que o parasito também possui a atividade de trans-sialidase
mediada por enzimas de membrana com âncora de GPI (PREVIATO et al., 1985) e
que ambas as atividades catalíticas são exercidas pela mesma enzima, a transsialidase do Trypanosoma cruzi (TcTS) (SCHENKMAN et al., 1992).
A TcTS possui muitas características específicas que a tornam um bom alvo para o
desenvolvimento de fármacos para o tratamento da doença de Chagas (NERES et
al., 2008). Trata-se de uma enzima de membrana essencial para o parasito, pois,
como dito anteriormente, os tripanosomatídeos são incapazes de biossintetizar o
ácido siálico e de adquiri-lo por vias alternativas. A expressão de trans-sialidases é
significativamente maior em tripomastigotas, principalmente na forma sanguínea
invasiva (ATWOOD III et al., 2005), o que facilitaria o direcionamento de
quimioterápicos para esse alvo.
A participação da trans-sialidase na patogênese da doença de Chagas é
corroborada por um número cada vez maior de estudos (Figura 5). A TcTS está
envolvida na evasão do protozoário da resposta imune mediada pelo complemento,
permitindo imediata sobrevida das formas tripomastigotas liberadas na corrente
sanguínea (TOMLINSON e RAPER, 1998). Outro mecanismo de defesa é a
sialilação de glicoproteínas mucinas da superfície do parasito, produzindo uma
cobertura de moléculas negativamente carregadas sobre o patógeno e protegendo-o
da lise por anticorpos humanos anti-α-galactosídicos (PEREIRA-CHIOCCOLA et al.,
2000).
A expressão da TcTS é consideravelmente aumentada em cepas do protozoário
mais letais quando comparada com os níveis da enzima presentes em cepas menos
letais (RISSO, 2004). Os fenótipos invasivos do protozoário são restritos a
populações que expressam a trans-sialidase, o que torna a enzima um importante
fator de virulência do T. cruzi. (PEREIRA et al, 1996).
27
Figura 5 – Principais eventos bioquímicos mediados pela TcTS decorrentes
da infecção pelo Trypanosoma cruzi no hospedeiro vertebrado.
_________________________
Adaptado de Buscaglia,
Buscaglia 2006
O modo pelo qual a TcTS medeia a adesão e invasão celular não está totalmente
esclarecido. A importância do ácido siálico na superfície
perfície das células hospedeiras
para a invasão foi demonstrada em trabalhos independentes, através de
experimentos com células de ovário de hamster deficientes
deficientes de ácido siálico. Estas
Est
células são fracamente invadidas pelo patógeno quando comparadas com as células
selvagens (CIAVAGLIA et al., 1993; MING et al., 1993; SCHENKMAN
CHENKMAN; EICHINGER,
1993a).
Por outro lado, há evidências de que unidades de ácido siálico na superfície do
parasito também participa
articipam do
o processo de invasão celular.
celular A incubação de
tripomastigotas em meio contendo sialoglicoproteínas, aumenta
aument a penetração do
T. cruzi em cultura de fibroblastos (PIRAS et al, 1987). Foi observado que uma
significativa redução da adesão e invasão celular ocorre quando epítopos sialilados
(Ssp-3) formados em tripomastigotas
pomastigotas pela ação da trans-sialidase
trans sialidase são neutralizados
28
por anticorpos monoclonais (SCHENKMAN et al., 1991). Entretanto, vários estudos
contrariam tais resultados, segundo os quais a remoção do ácido siálico na
superfície do parasito ou sua neutralização por anticorpos é capaz de aumentar a
infecção celular pelo T. cruzi (YOSHIDA et al., 1997; PRIOLI et al., 1990;
CAVALLESCO et al., 1988; VILLALTA et al., 1984).
Uma vez que a TcTS possui uma âncora de GPI, esta pode ser clivada pela enzima
fosfolipase C, ocorrendo a liberação da enzima exógena para a corrente sanguínea.
A TcTS livre é capaz de remover resíduos de ácido siálico da superfície plaquetária,
causando trombocitopenia na fase aguda da doença de Chagas (TRIBULATTI et al.,
2005), e de induzir apoptose em células do timo, baço e gânglios periféricos (MUCCI
et al., 2002; LEGUIZAMON et al., 1999). Constatou-se ainda que a apoptose
induzida pela TcTS no sistema imune é desencadeada pela sialilação das células
alvo (MUCCI et al., 2006).
1.6 Estrutura, função e mecanismo de ação da TcTS
A TcTS é codificada por genes de uma superfamília constituída de 1430 membros, a
maior família do genoma diplóide do Trypanosoma cruzi, evidenciando a importância
da modificação do perfil de sialilação do patógeno para a sua sobrevivência no
hospedeiro. Deste total somente 12 membros codificam TS enzimaticamente ativas,
725 codificam proteínas do tipo TS enzimaticamente inativas e outros 693 membros
são pseudogenes (EL SAYED et al., 2005). Verificou-se por experimentos de
sequenciamento que a perda de atividade enzimática da trans-sialidase deve-se a
mutação pontual Tyr342His (CREMONA et al., 1995). Contudo, membros do grupo
enzimaticamente inativo conservam a afinidade pela β-galactose com idêntica
especificidade àquela apresentada pela TcTS enzimaticamente ativa (CREMONA et
al., 1999).
A
TcTS
é
um
membro
da
família
das
glicosídeo-hidrolases
GH33
(http://www.cazy.org) e foi classificada como uma exo-α-sialidase (EC 3.2.1.18). No
entanto, TcTS comporta-se como uma trans-sialidase in vivo e in vitro na presença
de substratos adequados, açúcares doadores e aceptores de ácido siálico. TcTS
catalisa a transferência de ácido siálico de α-2,3-sialoglicoconjugados β-galactose
29
terminal do hospedeiro para outras unidades β-galactosil de mucinas da superfície
do parasita (Figura 5; AGUSTÍ et al., 2004).
Estruturalmente a TcTS possui duas regiões principais: um domínio catalítico
globular N-terminal com arranjo propulsor β de seis lâminas, conectado por uma
longa α-hélice a um domínio antigênico C-terminal do tipo lectina, com sequências
repetidas de 12 resíduos de aminoácidos que constituem o antígeno de fase aguda
da trans-sialidase (Shed acute phase antigen - SAPA) (BUSCHIAZZO et al., 2002).
A variabilidade da quantidade de repetições SAPA, assim como o tamanho do
domínio N-terminal (entre 640 e 1000 aminoácidos), resultam em proteínas que
variam de 85 a mais de 200 kDa de peso molecular (FRASCH, 2000).
A arquitetura molecular do sítio ativo da enzima conserva diversas características
das sialidases microbianas: uma tríade de argininas (Arg 35, Arg245 e Arg314), que
forma ligação iônica com o grupo carboxilato do ácido siálico, um ácido glutâmico
(Glu357) que estabiliza a Arg35, um ácido aspártico essencial para a catálise (Asp
59), e dois resíduos (Tyr342 e Glu230) adequadamente posicionados no fundo sítio
ativo para estabilizar as espécies reativas do estado de transição. Há um bolso
hidrofóbico, conservado em todas as sialidases, que acomoda o grupo N-acetil do
ácido siálico, definido pela cadeia lateral dos resíduos Val95, Leu176 e Trp120
(BUSCHIAZZO et al., 2002).
A TcTS possui dois (sub)sítios no centro ativo: o sítio de ligação ao ácido siálico e o
sítio de ligação à galactose. O primeiro está presente em todas as sialiadases,
porém, ligeiramente modificado na TcTS; enquanto que o segundo está ausente em
todas as sialidases e se forma somente com a ligação do substrato doador de ácido
siálico. Induzindo o substrato tal modificação, o mecanismo catalítico inicia-se pelo
ataque nucleofílico da Tyr342 reativa ao carbono anomérico do ácido siálico via
reação SN2. Em seguida, via catálise geral ácido-base, o Glu230 ativador da Tyr342
capta o próton da hidroxila desse aminoácido e o Asp59 protona o resíduo de
galactose abandonador (AMAYA et al., 2004; BUSCHIAZZO et al., 2000, 2002).
Forma-se então um intermediário covalente sialil-enzima (WATTS et al., 2003).
Ocorre novamente uma etapa SN2 para regeneração da enzima e formação do
produto sialilado com retenção de configuração do carbono anomérico do resíduo de
ácido siálico (TODESCHINI et al., 2000). O nucleófilo, desta vez, é o grupo hidroxila
30
do carbono 3 do resíduo de galactose aceptor e os resíduos Glu230 e Asp59
novamente realizam a catálise geral ácido-base (Figura 6).
Figura 6 – Mecanismo catalítico da trans-sialidase de T. cruzi.
_________________________
Adaptado de Neres, 2008
A reação bissubstrato catalisada pela TcTS acontece por um mecanismo de dupla
troca ou Ping-Pong (DAMAGER et al., 2008; AMAYA et al., 2004), uma vez que o
substrato aceptor, lactose por exemplo, somente se liga à enzima quando o ácido
siálico já efetivamente ocupou o sítio ativo (BUSCHIAZZO et al., 2002).
1.7 Inibidores da TcTS
Acredita-se que a seletividade seja uma característica dos inibidores de TcTS,
devido a ausência do alvo no organismo humano, capaz de sintetizar o ácido siálico.
Tal suposição é corroborada pelo fato de que neuraminidases virais, homólogos
relativamente distantes da TcTS, são seletivamente inibidas por fármacos miméticos
do ácido siálico ou análogos do seu estado de transição, como o ácido 2-desoxi-2,3-
31
didesidro-D-N-acetilneuramínico
acetilneuramínico 1 (DANA) (VON ITZTEIN et al., 1993). Dentre
esses, destacam-se o zanamivir 4 e o oseltamivir 5 (Figura 7), fármacos bastante
seguros e potentes contra o vírus Influenza
Influenza A e B, devido a sua seletividade pela
sialidase viral (BRUNTON, 2006).
Figura 7 – Estruturas do ácido siálico (1) e seus derivados miméticos DANA
(2), zanamivir (4) e oseltamivir (5). Em (3), o cátion sialosil oxacarbênio,
ox
análogo do estado de transição da reação de hidrólise de sialosídeos.
sialosídeos
Apesar de todas as evidências anteriormente citadas, a TcTS não foi totalmente
validada como alvo terapêutico, uma vez que a descoberta de pequenas moléculas,
moléculas
potentes inibidores da sua atividade enzimática,
enzimática aconteceu somente a partir de 2009
20
e, portanto, a efetividade desses compostos no tratamento da doença de Chagas
ainda não foi demonstrada.
demonstrada. Os inibidores de sialidases virais DANA (Ki = 12,3 mM) e
seus derivados, incluindo o zanamivir,
zanamivir, falharam em inibir a TcTS (NERES et al.,
2007). Curiosamente, a sialidase de Trypanosoma rangeli é fortemente inibida por
DANA (Ki = 0,15 nM), a despeito de haver 70% de identidade na sequência do
domínio catalítico dessa sialidase em relação a trans-sialidase
tran sialidase homóloga do
Trypanosoma cruzi (PARIS et al., 2005).
Outros sialomiméticos,, que conservam um grupo ácido para reproduzir a ligação
iônica entre o ácido siálico e a tríade de argininas, foram ensaiados contra TcTS
32
(Tabela 1). Avaliou-se uma substituição bioisostérica do ácido carboxílico do ácido
siálico por um grupo ácido fosfônico, obtendo-se excelentes inibidores de sialidases,
mas não houve inibição de TcTS na concentração de 1mM (ENGSTLER et al.,
1994).
Tabela 1 – Sialomiméticos testados contra TcTS.
Sialomiméticos e inibição de TcTS
OH
HO
R1
OH
O
AcHN
OH
HO
O
AcHN
HO
6 R1 = PO32-; R2 = H
7 R1 = H; R2 = PO32(ambos, sem inibição a 1 mM)a
ENGSTLER, M. et al,
1994
F
F
WATTS, A. G. et al,
2003
8 (completa inibição a 20 mM)
inibidor covalente
O
RO
HO
-
AcHN
COOH
OH
R2
HO
Referência
PO3 Et NH4
H
STREICHER, H.;
+
BUSSE, H., 2006
H3 C
OPO32-
N
HO
9 R1 = CH2CH2 OH (CI50 4,7 mM)a
10 R1 = H (CI50 5,7 mM)a
NH2
O
NH
HO
N
NH
HO
O
12 (Ki ~ 0,3 mM - CI50 0,54 mM)b
não competitivo ou misto
M. A., 1993
11 (Ki 7,3 mM)a
não-competitivo
OH
O
FERRERO-GARCIA,
NERES, J. et al, 2007
X
13 X = O (CI50 0,44 mM)b
14 X = S (CI50 0,54 mM)b
_________________________
a = Ensaios de transferência de ácido siálico; b = Ensaios de hidrólise de MuNANA.
33
Derivados monoésteres de ciclo-hexenofosfonato (derivados de DANA) também
foram avaliados, mas não se observou atividade inibitória (STREICHER e BUSSE,
2006). O piridoxal fosfato 11 apresentou fraca inibição não-competitiva contra TcTS
(Ki = 7,3 mM), entretanto, seus análogos piridoxina, piridoxal e fosfato de
piridoxamina são inativos (FERRERO-GARCIA et al., 1993).
Neres
e
colaboradores,
utilizando
estratégias
de
simplificação
molecular,
sintetizaram sialomiméticos ácidos derivados de piridina e de ácido benzóico, porém
os resultados foram demasiadamente modestos (Tabela 1; NERES et al., 2007).
Posteriormente, outras moléculas foram descobertas pelo grupo por meio de triagem
in silico, com valores experimentais de CI50 ligeiramente menores, porém da mesma
ordem de grandeza (submilimolar) (Figura 8; NERES et al., 2009)
Figura 8 – Moléculas com maior atividade avaliadas por Neres e
colaboradores e as respectivas CI50 para TcTS.
O
O
HO
S
O
H
N
S
S
O O
N
H
S
O
N
N N
16 CI50 0,15 mM
15 CI50 0,28 mM
HO
O
O
O
O
S
N
H
O
O O
HN
OH
S
O
17 CI50 0,27 mM
18 CI50 0,21 mM
Inibição covalente foi descrita para diferentes compostos fluorados. O ácido 2,3difluorosiálico 8 apresenta perfil de inibição da TcTS tempo-dependente, resultante
da formação de uma ligação covalente de C-2 com a hidroxila fenólica de Tyr342.
Porém, completa inibição somente ocorre em elevadas concentrações do
carboidrato (20 mM) e a enzima recobre atividade quando o excesso do ligante é
eliminado (WATTS et al., 2003). Mesmo perfil de inibição apresentou derivados de 8
acrescidos de grupos hidrofóbicos em C-9 (BUCHINI et al., 2008). Por um
mecanismo distinto, Carvalho e colaboradores relataram a inibição tempo-
34
dependente e irreversível por 19 (Figura 9), molécula capaz de inibir 50% da
atividade enzimática a 0,6 mM após incubação e de reduzir em 34% a infecção de
células LLC-MK2 a 1mM. Foi proposto que a aglicona do sialosídeo liga-se
covalentemente aos resíduos Arg245 ou Asp247 (CARVALHO et al., 2010a).
Figura 9 – Inibidor covalente avaliado por
Carvalho e colaboradores.
OH
O
OH
O
AcHN
HO
OH
HO
NO2
O
CF 2H
19
Uma vez que a trans-sialidase de T. cruzi possui um sítio de ligação à galactose,
esse monossacarídeo constitui interessante modelo para proposição de derivados.
O lactitol 20, derivado de lactose constituído por uma galactose substituída em C-1
pelo poliol glucitol (Figura 10), é um mimético do substrato aceptor de ácido siálico.
Ocorre ávida competição do lactitol pela TcTS (Ki 0,57 mM), prevenindo a sialilação
de lactose, N-acetil-lactosamina e β-D-galactopiranosídeo de 4-metilumbeliferila, um
substrato fluorescente da TcTS (AGUSTÍ et al., 2004). A sialiação de mucinas do T.
cruzi é prevenida em concentrações milimolares pelo composto e a infecção de
células mamíferas é reduzida em 20-27%. O lactitol, contudo, não é um inibidor
efetivo, mas somente um substrato preferencial aos substratos convencionais
(AGUSTÍ et al., 2004).
Derivados ácidos do lactitol, ácido lactobiônico 21 e lactotetrazol 22 (Figura 10) são
inativos em ensaios de transferência de ácido siálico. Além disso, o ácido
lactobiônico foi um bom substrato aceptor de ácido siálico nas condições
experimentais utilizadas e, uma vez sialilado, também um bom substrato doador
(AGUSTÍ et al., 2004).
35
Figura 10 – Estruturas do lactitol, ácido lactobiônico e lactotetrazol.
OH
OH HO
O
OH
N
NH
N
OH HO
OH
O
HO
OH
CH2OH
OH
N
COOH
OH
O
HO
CH 2OH
OH
CH 2OH
OH
20
OH
O
OH HO
OH
O
HO
O
OH
CH 2OH
OH
21
22
Uma série de derivados fosfonatos de D-galactose 23-31 foram avaliados, mas não
apresentaram boa atividade (Figura 11; BUSSE et al., 2007).
Figura 11 – Galactosídeos fosfonatos avaliados por Busse e colaboradores e
as respectivas constantes de inibição (Ki) para TcTS.
O O
R P
O
HO
HO
O
O
P
O
R
O
OH
23 R = CH3
OH
OH
HO
O
O
OH
O
OMe
R
P
O
O
OH
O
OMe
OH
27 R = H 28 R = OH
25 R = CH3
HO
24 R = AcHN
HO
HO
26 R = AcHN
HO
HO
29 R = AcHN
OH
30 R = AcHN
31 R =
_________________________
Valores de Ki: 23: >8 mM; 24: sem inibição; 25: ~3 mM; 26: ~1,5 mM; 27: >8 mM; 28: >8
mM; 29: ~8 mM; 30: >8 mM; 31: ~6 mM
Inibição pouco maior, com valores de KD submilimolares, foi observada para Csialosídeos com resíduos aromáticos, sintetizados por metátase de olefinas e
testados por ressonância plasmônica de superfície (Figura 12; MEINKE et al.,
2011).
36
Figura 12 – C-sialosídeos com maior atividade avaliados por Meinke e colaboradores
e as respectivas constantes de dissociação (KD) para TcTS.
OH
O
OH
HO
COOH
OH
O
AcHN
HO
33 R1 = H
KD 0,16 mM
34 R2 = NH2 KD 0,35 mM
32 KD 0,37 mM
biblioteca
de
galactosídeos,
O
AcHN
HO
Uma
R
COOH
OH
N-acetillactosaminas
e
tiogalactosídeos
sistematicamente substituídos por diversos grupos químicos, foi avaliada quanto à
atividade como inibidor e substrato de TcTS, por meio de ensaio radioquímico.
Observou-se que o bloqueio ou substituição da hidroxila de C-3 é a modificação que
mais reduz a capacidade aceptora de ácido siálico dessas moléculas, corroborando
estudos anteriores. Quanto à atividade inibitória, os galactosídeos de octila não
substituído 35 e o O-metilado em C-6 36 (Figura 13) foram os melhores,
apresentando 75 e 84% de inibição enzimática a 1 mM, respectivamente
(HARRISON et al., 2011).
Figura 13 - Galactosídeos com maior atividade avaliados por Harrison e
colaboradores e as respectivas porcentagens de inibição de TcTS a 1mM.
HO
HO
OH
O
HO
O
HO
OH
OCH3
O
O
OH
35 75%
36 84%
A avaliação de uma biblioteca de galactosídeos modificados em C-1 e C-6 e
glicosídeos e gulosídeos modificados em C-3, contendo o núcleo 1,2,3-triazol 1,4dissubstituído, levou à descoberta de moléculas bastante promissoras (Figura 14).
Esses compostos apresentaram altos índices de inibição na concentração 1 mM. A
0,5 mM o derivado 38 foi o mais ativo, inibindo 30% da atividade enzimática
(CAMPO et al., 2012; CARVALHO et al., 2010b).
37
Figura 14 – Glicosídeos triazólicos com maior atividade avaliados por
Campo e colaboradores e as respectivas porcentagens de inibição de
TcTS a 1mM.
OH
OH
HO
COOH
O
AcHN
N
O
HO
N
R
R=
HO
OH
OH
HO
O
HO
O
HO
OH
HO
O
HO
HO
OH
37 88%
N
O
HO
OH
38 91%
OH
OH
OH
39 67%
40 69%
O gangliosídeo GM3 41 (Figura 15) é um bom substrato de TcTS e,
interessantemente, análogos dessa molécula se mostraram bons inibidores de
TcTS. O derivado desóxi em C-4 ou C-8 e o metóxi em C4 no resíduo de ácido
siálico inibiram a trans-sialidase com valores de CI50 que variam de 10-100 µM
(VANDEKERCKHOVE et al., 1992).
Figura 15 – Estrutura do gangliosídeo GM3.
HO
OH
OH
COO-
OH
AcHN
O
OH
O
O
OH
HO
41
OH
HO
O
O
O
CERAMIDA
OH
Em trabalhos independentes, substâncias poliaromáticas poliidroxiladas apareceram
como potentes inibidores de TcTS, os mais promissores descobertos até o momento
(Figura 16). Kim e colaboradores sintetizaram e ensaiaram chalconas hidroxiladas e
quinolinas contendo sulfonamidas, obtendo-se CI50 submicromolar (KIM et al., 2009).
Por meio de refinada triagem de um vasto banco de substâncias naturais, foi
descoberto um grupo de flavonóides e antraquinonas, também com excelente
38
atividade inibitória sobre TcTS, sendo o composto 45 e a miricetina 46 os mais
ativos de cada classe (ARIOKA et al., 2010).
Figura 16 – Substâncias aromáticas hidroxiladas inibidores de
TcTS e as respectivas CI50.
O
O
R1
R2
OH
OH
OH
OH
O
42 R1 = H; R2 =
O
S
O
S
OH
OH
O
O
43 R1 =
; R2 = H
S
44
O
OH
OH
O
O
HO
OH
HO
O
Cl
OH
OH
OH
O
OH
45
OH
O
46
_________________________
Valores de CI50 – 42: 2,5 µM; 43: 0,9 µM; 44: 0.6 µM; 45: 0,58 µM; 46:
17 µM
A despeito de muitos resultados negativos, importantes avanços foram feitos na
busca de um inibidor, o que culminou na obtenção novos protótipos. Pode-se
observar que a descoberta de potentes inibidores de TcTS está bastante
desafiadora, pois nenhum planejamento racional foi totalmente inequívoco, apesar
da elucidação de muitos aspectos estruturais da enzima. Isso é explicado, pelo
menos em parte, pela complexidade e flexibilidade da macromolécula (DEMIR e
ROITBERG 2009; NERES et al., 2008), pois o encaixe induzido decorrente da
interação ligante-enzima foi verificado desde a resolução da estrutura 3D da transsialidase (AMAYA et al., 2004; BUSCHIAZZO et al., 2002) e tem sido
paulatinamente melhor compreendido por meios de estudos cristalográficos e de
modelagem molecular.
Os resíduos Tyr119 e Trp312 são apontados nos estudos como as principais
subestruturas responsáveis pela plasticidade enzimática, pois estão em regiões de
39
loop, na entrada do sítio ativo e, devido a sua flexibilidade, modulam a afinidade dos
ligantes pela macromolécula e vice-versa (BUSCHIAZZO et al., 2012; MITCHELL et
al., 2010; DEMIR e ROITBERG, 2009). O primeiro aminoácido foi bloqueado pelo
mais potente inibidor descrito de TcTS, um anticorpo monoclonal (KD ~ 0,72 nM e
CI50 0,056 nM) (BUSCHIAZZO et al., 2012).
No contexto do presente trabalho, derivados de lactose e D-galactose 47-54
sintetizados no laboratório de Química Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da
UFMG (Figura 17) foram ensaiados com TcTS por espectrofluorimetria contínua,
em colaboração com a Dra. Ivone Carvalho da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da USP-Ribeirão Preto. Não houve inibição significativa, os
derivados mais ativos foram os compostos 49 e 54, com 13 e 14% de inibição,
respectivamente, na concentração de 1mM.
Figura 17 – Derivados de lactose e D-galactose sintetizados no laboratório de Química
Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da UFMG e testados contra TcTS.
O
HO
OH
O
HO
OCH3
OH
HO
O
O
OH
O
HO
O
OH
O
HO
OCH3
OH
HO
O
O
O
OH
OH
I
47
48
O
HO
OH
O
HO
HO
O
O
OH
HO
OH
OH
O
HO
O
HO
OH
HO
50
OH
HO
HO
O
H
N
OH
OH
OH
O
49
O
O
O
OH
HO
O
HO
H
N
OH
OH
51
OH
HO
O
O
HO
OH
OCH3
OH
O
NO2
O
OH
OCH3
O
52
53
O
54
40
2 OBJETIVOS
Objetivou-se
neste
trabalho
sintetizar
e
caracterizar
espectrometricamente
galactosídeos de arila 3-O-substituídos inibidores potenciais de TcTS. Almejou-se
ainda avaliar a atividade inibitória dessas substâncias por meio de ensaio enzimático
de hidrólise de MuNANA por espectrofluorimetria contínua (DOUGLAS et al., 2006).
A estratégia utilizada para proposição de inibidores potenciais de TcTS com fácil
acesso sintético consistiu em modificações moleculares do substrato doador de
ácido siálico 3’-sialil-lactose (Figura 18). O núcleo de D-galactose, como discutido
anteriormente, é um interessante arcabouço (scaffold) para proposição de inibidores
e, portanto, foi mantido.
Figura 18 – Estratégias de modificação molecular utilizadas neste trabalho.
OH
HO
HO
O
OH
O
AcHN
OH
OH
OH
O
O
HO
O
OH
HO
O
OH
OH
3'-sialil-lactose
Simplificação molecular
HO
O
OH
OH
O
O
X
O
O
OH
OCH3
I
Bioisosterismo
N
N
Simplificação molecular
NH
N
OH
O
OH
O
X
O
O
OH
X = H, NO2
OH
H3CO
OCH3
II
OH
O
X
O
O
OH
OCH3
III
41
Por outro lado, o resíduo de glicose parece não ser essencial para uma boa
interação do substrato com o sítio catalítico. Por análise do modo como a lactose
interage com TcTS, por meio de cristalografia de raios-X do complexo enzimaligante, pode-se observar que a glicose do dissacarídeo interage minimamente com
a macromolécula, pois o resíduo está pouco penetrado na fenda catalítica. Somente
uma ligação de hidrogênio mediada por água da hidroxila de C-3 da glicose com
Arg311 foi encontrada (BUSCHIAZZO et al., 2002). Com efeito, esse pressuposto é
corroborado por estudo de análogos de lactose que falharam em inibir a TcTS
(AGUSTÍ et al., 2004). Logo, foi proposta a substituição da porção correspondente à
lactose por galactosídeos de arila, ou seja, planejou-se a troca do resíduo de glicose
por um grupo aromático hidrofóbico.
Foi proposta uma simplificação molecular da porção sialil do substrato, eliminandose todos os centros quirais do resíduo de ácido siálico e originando estruturas do
tipo I (Figura 18). A subestrutura foi substituída por um grupo carboximetila, o mais
simples fragmento capaz de mimetizar a ligação iônica entre o grupo ácido
carboxílico do substrato e a tríade de argininas (Arg 35, Arg245 e Arg314) do sítio
catalítico enzimático. Planejou-se também a substituição bioisostérica do grupo
carboxilato do fragmento carboximetila por um grupo 5-tetrazolil, originando
estruturas do tipo II, com o intuito de se investigar a relevância de tal modificação
para a atividade.
A adição de um grupo metila ao oxigênio de C-3, conforme estruturas do tipo III
(Figura 18), foi proposta para se avaliar a importância do bloqueio dessa posição.
Sem um grupo ácido, será possível avaliar a importância da ligação iônica acima
citada para a ancoragem dos ligantes. Justificando ainda a seleção dessas
estruturas, é importante ressaltar que, uma vez substituído, o oxigênio de C-3 perde
seu caráter nucleofílico, logo nenhuma das estruturas propostas pode ser substrato
aceptor de ácido siálico (Figura 6).
Assim colocado, foram propostos para síntese 10 galactosídeos de arila modificados
em C-3 (Figura 19). A aglicona selecionada é o 4-hidroxibenzoato de metila
(nipagin), que é facilmente disponível e contribui para o caráter hidrofóbico das
substâncias. O grupo nitro foi adicionado porque o derivado galactosídico nitrado 50
previamente testado foi o que apresentou melhor inibição (Figura 16). Essas
42
agliconas aumentam a lipossolubilidade e o log P dos galactosídeos e contribuem
para o balanço das propriedades hidrofílicas e lipofílicas das moléculas. Assim,
pode-se explorar mais consistentemente o efeito hidrofóbico decorrente da interação
ligante-enzima.
Figura 19 – Galactosídeos de arila modificados em C-3 propostos para síntese.
X=H
HO
R
O
OH
O
X
O
OH
H
COOC(CH3)3
COOH
CN
OCH3
H
N N
59 R =
O
N
N
55
56
57
58
R=
R=
R=
R=
X = NO2
R=H
R = COOC(CH 3)3
R = COOH
R = CN
H
N N
64
N
N
60
61
62
63
As substâncias 56, 61, 58 e 63, que não se aplicam às estruturas tipo I, II ou III do
planejamento anteriormente exposto, são intermediários de síntese, porém é
objetivo neste trabalho realizar seus ensaios enzimáticos em conjunto com os outros
galactosídeos sintetizados.
43
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Síntese dos galactosídeos 53 e 54
A síntese de 53 e 54 foi feita a partir de D-galactose, conforme mostrado na rota de
síntese a seguir.
Figura 20 – Esquema de síntese de 53 e 54 a partir de D-galactose.
HO
OH
HO
i
O
OH
OH
AcO
OAc
AcO
AcO
OAc
ii
AcO
66
OAc
O
iv
O
OAc
68 X = H
69 X = NO2
OCH3
O
iii
O
67
HO
X
OAc
AcO Br
OAc
65
AcO
O
AcO
HO
OH
O
X
O
OH
53 X = H
54 X = NO2
OCH3
O
_________________________
i) Ac2O, AcONa, 100 ºC; ii) HBr, Ac2O, CH2Cl2, temperatura ambiente; iii) fenol
correspondente, LiOH, acetona/H2O, temperatura ambiente; iv) MeONa/MeOH, 0 ºC
Utilizaram-se as condições experimentais estabelecidas no laboratório por Carvalho
e colaboradores, que relataram a síntese de 53 e 54 (CARVALHO, 2008).
Inicialmente, foi feita a peracetilação de D-galactose com anidrido acético e acetato
de sódio anidro, condições que produzem majoritamente a forma anomérica β do
produto, obtendo-se 66 com rendimento de 45%, após recristalização. Em seguida,
produziu-se o brometo de galactopiranosila peracetilado 67 por meio da reação de
66 com solução acética de brometo de hidrogênio. O intermediário 67 foi obtido com
98% de rendimento.
Os haletos de O-acilglicosila são intermediários bastante úteis na síntese de
glicosídeos de alquila/arila, sendo os brometos de acetilglicosila os mais comumente
44
utilizados, uma vez que eles são mais reativos do que os cloretos e mais estáveis do
que os iodetos correspondentes (COLLINS e FERRIER, 1995). O haleto 67 foi
utilizado imediatamente na etapa posterior, a síntese dos galactopiranosídeos de
arila peracetilados por meio da reação de glicosilação de fenóis em meio alcalino
(CONCHIE et al., 1957). Os produtos 68 e 69 foram obtidos com rendimentos de 69
e 53%, respectivamente, após recristalização.
A síntese dos galactosídeos desacetilados 53 e 54 foi feita empregando-se o método
de Zemplén (CONCHIE et al., 1957), que consiste em uma transesterificação dos
grupos ésteres do carboidrato com metóxido de sódio em metanol (Figura 21).
Figura 21 – Proposta mecanística de desacetilação de 68 e 69 pelo método de Zemplén.
CH3O- Na+ + 1/2 H2
CH3 OH + Na
..
:O:
O
AcO
O
O
AcO
OAr
..
CH3 O
.. :
OAc
AcO
AcO
O
O
OCH3
O
OCH3
AcO
..
:O:
O
AcO
OAr
AcO
OH
O
OAc
..
OAr + CH 3O
.. :
CH3 O H
OAc
OAc
68 X = H; 69 X = NO2
AcO
OAr
Ar =
HO
HO
OH
O
X
..
OAr + CH3 O
.. :
OH
53 X = H; 54 X = NO2
O
OCH3
Por esse método, as reações são realizadas em condições brandas e fornecem os
produtos com rendimento e pureza elevados. Os materiais de partida acetilados 68 e
69 são consumidos em apenas 15 minutos, quando ocorre precipitação parcial do
produto correspondente, facilitando a percepção do término da reação. Os produtos
53 e 54 foram obtidos com rendimentos de 91 e 86%, respectivamente.
Os galactosídeos desprotegidos foram caracterizados por ponto de fusão, [α]D,
espectrometria no infravermelho, de RMN de 1H,
13
C e subespectro DEPT-135. No
espectro no infravermelho (páginas 97 e 100, para os derivados 53 e 54,
respectivamente), observam-se bandas de estiramento de ligação C=C e C=O (1674
45
cm-1 para 53; 1725 cm-1 para 54), compatíveis com a estrutura da aglicona. No
espectro do galactosídeo nitrado também são observadas bandas de estiramento do
grupo nitro em 1532 e 1361 cm-1.
No espectro de RMN de 1H (páginas 98 e 101, para os derivados 53 e 54,
respectivamente) podem ser identificados os sinais da metoxila e dos hidrogênios
aromáticos, compatíveis com o padrão de substituição do anel benzênico. Há um
dupleto correspondente ao hidrogênio anomérico com deslocamento químico em
torno de 5 ppm e constante de acoplamento J1,2 de 7,6 Hz, o que confirma a
obtenção dos produtos 53 e 54 na forma anomérica β, como pode ser observado na
Figura 22.
5.260
5.235
4.971
4.933
4.896
4.722
4.694
4.669
4.566
4.543
3.811
3.730
3.713
3.695
3.653
3.628
3.603
3.581
3.567
3.554
3.529
3.502
3.468
3.419
3.179
3.153
7.140
7.096
7.926
7.882
Figura 22 – Espectro de RMN de 1H de 53 (200 MHz, DMSO-d6).
OH
HO
6
O1
5
HO
3
2
O
OH
7
8
9
10
12
OCH3
13 14
11
H-14
O
H-9; H-11 H-8; H-12
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
1.01
1.01
8.0
1.99
8.5
1.00
9.0
2.00
9.5
2.00
10.0
H-1
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
ppm
2.99
1.00
2.03
2.00
14.81
4
3.2 Alquilação 3-O-seletiva dos galactosídeos 53 e 54
A alquilação regiosseletiva da hidroxila de C-3 dos galactosídeos 53 e 54 foi
realizada via compostos organoestanhos como intermediários. Sabe-se que a
complexação de grupos hidroxila com óxido de dibutilestanho aumenta a nucleofilia
dos átomos de oxigênio envolvidos e os tornam mais reativos do que hidroxilas livres
46
na presença de reagentes eletrofílicos. Logo, a complexação seletiva de hidroxilas
específicas de poliois pode, consequentemente, modificar as reatividades relativas
desses grupos, permitindo a realização de alquilações, acilações e oxidações
regiosseletivas em substâncias poliidroxiladas como os carboidratos. Assim, evita-se
ou minimiza-se o uso das técnicas de bloqueio/desbloqueio de grupos que não estão
envolvidos diretamente na reação de interesse (COLLINS e FERRIER, 1995).
Hidroxilas de carboidratos são queladas pelo óxido de dibutilestanho produzindo
derivados cíclicos estanilados. O complexo é obtido quantitativamente preparandose em metanol sob refluxo uma mistura do material de partida hidroxilado com o
óxido de dibutilestanho, em quantidades estequiométricas, conforme a reação a
seguir (DAVID e HANESSIAN, 1985).
Figura 23 – Reação de complexação entre grupos hidroxilas de um poliol
e o óxido de dibutilestanho.
O óxido de dibutilestanho, empregado inicialmente em acilações seletivas de
ribonucleosídeos, tem importante aplicabilidade em modificações seletivas de
monossacarídeos
hexapiranosídicos,
incluindo
β-galactosídeos
de
alquila.
Descobriu-se que galactosídeos parcialmente protegidos com somente as hidroxilas
de C-3 e C-4 livres complexam com o óxido de dibutilestanho e o complexo obtido
reage com eletrófilos, originando majoritariamente produtos modificados em C-3 com
elevado rendimento (Figura 24; DAVID et al., 1981; NASHED e ANDERSON, 1976).
47
Figura 24 – Exemplos de modificação regiosseletiva da hidroxila de C-3 de galactosídeos
parcialmente protegidos.
OBn
HO
O
HO
Bu
Bu2SnO
Bu
Sn
O
71
OBn
O
Bu
OBn
Bu2SnO
Bu
Sn
O
OBn
76
72
73
74
75
O
eletrófilo
OBn
OBn
77
O
BnO OAll
OBn
O
OBn
R1O
BnO OAll
70
HO
HO
eletrófilo
O
O
BnO OAll
HO
OBn
R1 = Bz (81%)
R1 = Bn (72%)
R1 = All (79%)
R1 = Me (77%)
HO
R2O
OBn
O
OBn
OBn
78 R2 = Bn (87%)
79 R2 = CH2 OMe (92%)
_________________________
Bz = benzoíla; Bn = benzila; All = alila; Me = metila
A regiosseletividade observada nessas reações é explicada conjuntamente por uma
série de fatores estruturais característicos do intermediário organometálico (DAVID e
HANESSIAN, 1985). Verificou-se que o óxido de dibutilestanho complexa
preferencialmente com hidroxilas vicinais dos monossacarídeos formando um anel
de cinco membros, como pode ser observados nas estruturas 71 e 77. Em solventes
apolares, contudo, propõe-se que o derivado estanilado exista em equilíbrio com
uma forma dimérica, na qual o átomo de estanho é pentacoordenado e possui um
arranjo de bipirâmide trigonal (Figura 25).
48
Figura 25 – Estrutura dimérica proposta para o organoestanho 77.
OBn
OBn
O
OBn
Bu
O Sn
O
BnO
Bu
OBn O
OBn
O
Sn O
Bu Bu
Nesse dímero os átomos de oxigênio de C-3 são bicoordenados e estão em
posições apicais, ao passo que os átomos de oxigênio de C-4 são tricoordenados e
estão em posições equatoriais com relação ao átomo de estanho. Os primeiros são
estericamente menos impedidos e aceptores de maior densidade eletrônica
proveniente da ligação Sn-O do que os segundos, logo o caráter nucleofílico dos
oxigênios de C-3 é maior do que os de C-4 (DAVID e HANESSIAN, 1985). A
estrutura dimérica foi confirmada para diferentes complexos estanilados de
monossacarídeos por experimentos de cristalografia de raios-X e de RMN de 1H, 13C
e
119
Sn em solução (CAMERON et al., 1992; GRINDLEY e THANGARASA, 1990;
SMITH et al., 1972).
O método do óxido de dibutilestanho também foi utilizado em modificações seletivas
de glicosídeos totalmente desprotegidos, destacando-se o estudo abrangente de
Haque e colaboradores (HAQUE et al., 1985; TSUDA et al., 1983; MUNAVU e
SZMANT, 1976; GONÇALVES et al., 2005; DAVID et al. 1991). Devido à presença
de vários grupos hidroxilas nesses carboidratos, complexos com diferentes arranjos
podem ser obtidos. Constatou-se, entretanto, que aqueles que possuem as
hidroxilas queladas com configuração cis (axial-equatorial) são mais estáveis e,
portanto, formam-se preferencialmente (Figura 26).
49
Figura 26 – Configuração dos organoestanhos formados pela
complexação de glicosídeos desprotegidos com óxido de dibutilestanho.
_________________________
A estrutura sacarídica foi simplificada para facilitar a visualização
Observou-se também que todos os complexos do tipo IV, ativam seletivamente o
oxigênio equatorial (localizado na posição apical do dímero) em reações de
substituição
anteriormente.
nucleofílica,
Logo,
corroborando
galactosídeos
a
proposta
totalmente
dimérica
desprotegidos
apresentada
também
são
modificados seletivamente em C-3 pelo método do óxido de dibutilestanho. Este foi
bastante eficiente em reações de alquilação 3-O-seletivas em β-galactopiranosídeos
de metila e benzila (Figura 27).
50
Figura 27 – Exemplos de modificação regiosseletiva da hidroxila de C-3 de derivados
galactosídicos totalmente desprotegidos.
HO
HO
OH
O
1) Bu 2SnO
OBn
2) eletrófilo
OH
HO
OH
O
R1O
81 R1 = CH2 CH=CH2 (85%)
82 R1 = Bn (67%)
OBn
OH
Referência: DAVID et al., 1981
80
HO
HO
OH
O
OMe
1) Bu 2SnO
2) eletrófilo
OH
HO
OH
O
R2O
84 R2 = Bn (95%)
85 R2 = CH2 OCH3 (93%)
OMe
OH
Referência: HAQUE et al., 1985
83
HO
HO
OH
O
1) Bu 2SnO
OMe
2) eletrófilo
OH
HO
R3 = (CH2)nCH3
OH
O
R3O
86 n = 13 (43%)
87 n = 11 (54%)
88 n = 9 (52%)
OMe
OH
83
HO
HO
Referência: GONÇALVES et al., 2005
OH
O
OH
89
SMe
O
1) Bu 2SnO
2) eletrófilo
O
HO
OH
O
O
SMe
OH
90 (70%)
Referência: PRODGER et al., 1996
Alais e Veyrières relataram um aumento da velocidade da reação de alquilação
seletiva de derivados manopiranosídicos pelo uso de 0,1-0,3 equivalente de haletos
de tetrabutilamônio (ALAIS e VEYRIÈRES, 1981). O uso de sais de flúor como
catalisador em reações em que se utilizam óxido de dibutilestanho também foi
relatado (NAGASHIMA e OHNO, 1991). Foi proposto, então, que os ânions haleto
coordenam com o estanho no complexo estanilado formando um par iônico e,
posteriormente, um ânion alcóxido nucleofílico (Figura 28; ALAIS e VEYRIÈRES,
1981; NAGASHIMA e OHNO, 1991; DAVID et al., 1981; KAJI et al., 2003).
51
Figura 28 – Mecanismo simplificado proposto por Kaji e colaboradores para 3-O-glicosilação
do galactosídeo de metila catalisada por Bu4NF.
Neste trabalho, os produtos de 3-O-alquilação dos galactosídeos 53 e 54 foram
obtidos pelo método do óxido de dibutilestanho nas condições experimentais
relatadas por Prodger e colaboradores (Figura 29; PRODGER et al., 1996). A
complexação de 53 e 54 com Bu2SnO foi realizada em metanol e ocorreu com
variação da turbidez da reação, conforme descrito na literatura (HAQUE et al.,
1985). Os meios de reação, inicialmente turvos, ficaram totalmente límpidos após
uma hora aproximadamente. Ao término da reação, o metanol foi removido, uma vez
que a etapa posterior de alquilação é feita em THF, um solvente aprótico. Foi obtido
um sólido branco (complexo de 53) ou amarelo (complexo de 54), utilizado em
seguida sem purificação e caracterização. Para a alquilação propriamente dita foram
adicionados ao complexo estanilado THF anidro, o eletrófilo correspondente e, como
catalisador, iodeto de tetrabutilamônio (TBAI).
Figura 29 – Etapa de 3-O-modificação dos galactosídeos 53 e 54.
HO
HO
HO
OH
O
X
1) Bu2SnO, MeOH, 60 ºC
O
OH
OCH 3
O
53 X = H
54 X = NO2
R
O
OH
O
X
O
OH
OCH3
O
2) TBAI, eletrófilo,THF
X= H
X = NO2
55 R = H
60 R = H
56 R = COOC(CH3)3 61 R = COOC(CH3)3
63 R = CN
58 R = CN
Foram obtidos rendimentos modestos a elevados: 55 (54%), 60 (32%), 56 (82%), 61
(73%), 58 (61%), 63 (64%). Os produtos foram obtidos com elevada pureza por CCS
52
do material bruto de reação, porém as nitrilas 58 e 63 e os derivados metilados 55 e
60 precisaram ser recromatografados para eliminação de contaminação residual.
Esta foi atribuída, com base nos sinais observados nos espectros de RMN de 1H e
13
C dos materiais contaminados, ao iodeto de tetrabutilamônio. O contaminante,
de
que em CCD revela positivamente em vapores de iodo, foi removido por CCS
adicional (eluente: acetato de etila).
Apesar de a etapa de alquilação ser realizada em solução diluída em THF a 60 ºC,
condições bastante suaves, ocorreu anomerização nas reações dos derivados
nitrados, como pode ser observado no espectro de RMN de
1
H de 61 após
purificação por CCS. (Figura 30).
O
3.475
3.467
3.451
3.443
3.5
ppm
0.69
3.6
2.66
0.95
4.45
0.73
4.391
4.375
4.348
4.332
4.311
4.302
4.286
4.278
4.203
4.193
4.179
4.158
4.136
4.115
4.074
4.039
4.023
4.009
3.993
3.933
3.903
3.881
3.870
3.842
3.826
3.809
3.795
3.788
3.771
3.763
3.756
3.742
3.728
3.7
14
7.0
6.5
6.0
0.42
7.5
0.47
0.60
8.0
1.09
1.00
3.8
OCH3
H-α1
8.5
3.9
9
13
9.0
4.0
10
11
9.5
4.1
8
12
10.0
0.74
NO2
7
4.2
1.41
O
OH
4.3
0.54
O1
4.4
ppm
H-β1
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
ppm
11.11
2
5.1
0.50
3
ppm
0.60
O
15
6.0
0.55
16
6
5
0.61
0.55
0.60
0.54
1.41
0.74
0.73
0.95
4.45
2.66
0.69
O
OH
0.61
17
4
0.42
HO
O
18
5.023
5.004
5.910
5.901
8.536
8.532
8.468
8.463
8.221
8.216
8.195
8.174
8.169
7.488
7.466
7.393
7.371
7.276
5.910
5.901
5.023
5.004
4.391
4.375
4.348
4.332
4.311
4.302
4.286
4.278
4.203
4.193
4.179
4.158
4.136
4.115
4.074
4.039
4.023
4.009
3.993
3.933
3.903
3.881
3.870
3.842
3.826
3.809
3.795
3.788
3.771
3.763
3.756
3.742
3.728
3.475
3.467
3.451
3.443
2.169
1.505
1.480
Figura 30 – Espectro de RMN de 1H dos anômeros α e β de 59.
Esse resultado foi contornado com o abaixamento da temperatura de reação para
temperatura ambiente, o que resultou em um aumento de cerca de 100% do tempo
de reação. No entanto, ambas as reações de metilação, tanto a síntese do derivado
53
nitrado 60, quanto do não-nitrado 55, foram conduzidas por tempos iguais. Assim,
atribui-se à diferença de temperatura, a grande diferença de rendimento observada
na síntese desses compostos.
As reações de metilação foram bastante lentas e não houve consumo completo do
material de partida. Após 4 dias de reação, quando não mais se observou por CCD
progresso significativo da reação, decidiu-se elaborá-las. Esses resultados são
concordantes com os de Haque e colaboradores, que realizaram metilações pelo
mesmo método, porém em condições mais drásticas de reação do que outras
alquilações, como temperatura elevada (100 ºC) e grande excesso do agente
alquilante (até 30 equivalentes de iodeto de metila) (HAQUE et al., 1985).
Em termos mecanísticos, os eletrófilos utilizados, iodeto de metila, bromoacetato de
terc-butila e bromoacetonitrila, reagem via SN2. Porém, na reação do eletrófilo αbromocarbonílico, o estado de transição é estabilizado pela carbonila, devido à
sobreposição do orbital molecular antiligante π* da ligação C=O com o orbital p
ocupado do oxigênio nucleofílico (CLAYDEN et al., 2001). Esse efeito ativador do
caráter eletrofílico do carbono ligado ao halogênio ocorre similarmente no
bromoacetonitrila, mas não ocorre no iodeto de metila. Justifica-se, assim, a menor
reatividade deste eletrófilo, a despeito do seu menor impedimento estérico.
3.3 Análise espectral dos produtos modificados em C-3
Os produtos modificados em C-3 foram caracterizados por faixa de fusão, [α]D,
espectrometria no infravermelho, de RMN de
1
H,
13
C, subespectro DEPT-135,
mapas de contornos COSY, HMQC e HMBC. Todos tiveram sua identidade química
confirmada pelos métodos espectrométricos. Para facilitar a análise espectral dos
compostos, atribuiu-se, em todas as moléculas, o número 15 ao grupo (metila ou
metileno) diretamente ligado ao oxigênio de C-3.
Algumas características espectrais importantes na identificação dos compostos são
comuns nos espectros dessas substâncias. Nos mapas de contornos HMBC são
observadas as correlações H-3xC-15 e H-15xC-3. Conclui-se, assim, que as
alquilações ocorreram seletivamente na posição 3, conforme descrito na literatura.
54
Os espectros de RMN de H1 dos produtos que possuem um metileno na posição 15
contêm sinais espectrais de segunda ordem. Os sinais desses hidrogênios
metilênicos (H-15a e H-15b) são dupletos com constantes de acoplamento geminal
elevadas de 14-17 Hz. Eles formam um sistema de acoplamento de spin do tipo AB
e o valor da razão ∆ν/J é bem reduzido, logo o “efeito telhado” é bastante
pronunciado nesses sinais (Figura 31).
Figura 31 – Sinais de hidrogênios metilênicos α-tetrazólicos no espectro
de RMN de 1H de 64.
O deslocamento químico dos sinais de H-15 variou bastante conforme a vizinhança.
O sinal de H-15a (hidrogênio metilênico mais desprotegido) do derivado tetrazólico
64 está a δ 5,05 ppm, ao passo que o sinal correspondente do derivado ácido 55
está a δ 3,79 ppm. Os hidrogênios H-15 de 64 estão no cone de desproteção do
anel tetrazólico, que possui um efeito de anisotropia diamagnética bastante intenso,
enquanto que o efeito anisotrópico da carbonila sobre os hidrogênios H-15 de 55 é
mais fraco.
Observou-se também que não houve acoplamento eficiente entre os hidrogênios H-4
e H-5. Em todos os espectros de RMN de 1H, somente a constante de acoplamento
J4,3 foi encontrada no sinal de H-4, com exceção dos espectros de 58 e 63 nos quais
também se observou acoplamento entre H-4 e OH-4. Além disso, corroborando
esses achados, não se observa correlação entre H-4 e H-5 no mapa de contornos
COSY dos produtos modificados em C-3. De acordo com esse resultado, o valor da
55
constante de acoplamento J4,5 do galactopiranosídeo de metila encontrado na
literatura é bastante reduzido, de apenas 0,8 Hz (BOCK e THØGERSEN, 1982).
3.3.1 Caracterização dos galactosídeos 55 e 60
OH
HO
6
5
4
H3 CO
15
3
O1
2
X
O
OH
7
8
9
10
12
OCH3
13
11
14
O
55 X = H; 60 X = NO2
No espectro de RMN de 1H do produto 55 (página 104) são observados dois
simpletos a δ 3,77 e 3,60 ppm, que correspondem às metoxilas da molécula. No
espectro de RMN de 1H do produto nitrado 60 (página 134) os sinais dos grupos
metoxila estão a δ 3,79 e 3,60 ppm. O sinal de maior deslocamento químico
corresponde à metoxila do éster aromático, devido ao efeito anisotrópico da
carbonila.
Diferentemente, no espectro de RMN de
13
C o sinal de maior deslocamento químico
corresponde à metoxila do carboidrato. No espectro de RMN de
13
C de 55 (página
105) os sinais dos referidos grupos estão a δ 57,3 e 51,7 ppm, enquanto que, no
espectro de RMN de 13C de 60 (página 135), esses sinais estão a δ 57,3 e 52,3 ppm.
3.3.2 Caracterização dos galactosídeos 56 e 61
HO
O
18
17
O
16
4
O
15
3
OH
6
5
2
O1
OH
X
O
8
7
9
10
12
11
O
56 X = H; 61 X = NO2
OCH3
13 14
56
No espectro no infravermelho de 56 e 61 (páginas 108 e 138, respectivamente) há
duas bandas de estiramento C=O, uma da carbonila alifática e outra da aromática,
sendo que a primeira é observada em maior frequência (1721 e 1697 cm1, para o
derivado 56; 1730 e 1718 cm-1, para o derivado 61).
No espectro de RMN de 1H de ambas as moléculas (página 109, para o derivado 56;
página 139, para o derivado 61) observa-se o simpleto relativo aos hidrogênios tercbutílicos com integral correspondendo a nove átomos a δ 1,49 ppm. São observados
também dois dupletos parcialmente sobrepostos ao sinal de H-2, que correspondem
aos hidrogênios metilênicos H-15a e H-15b do substituinte em C-3. Eles estão a δ
4,26 e 4,15 ppm no espectro do composto 56 e a δ 4,36 e 4,16 ppm no espectro do
composto nitrado 61. Nesses sinais, há uma constante de acoplamento elevada
J15a,15b de 17,2 Hz, característica de acoplamento de hidrogênios geminais.
No subespectro DEPT-135 de 56 e 61 (páginas 111 e 141, respectivamente), os
sinais de C-15 estão a δ 68,1 e 68,7 ppm, respectivamente. Devido ao efeito
anisotrópico da carbonila adjacente ao metileno, tanto os hidrogênios quanto o
carbono desse grupo são mais desprotegidos do que os respectivos átomos do
metileno 6 do núcleo de D-galactose.
No espectro de RMN de
13
C de 56 e 61 (páginas 111 e 141, respectivamente), os
sinais de C-16 e C-18 foram observados a δ 171,5 e 28,3 ppm, para ambos os
compostos. O sinal de C-17 de 56 e 61 está a δ 83,5 e 83,3 ppm, respectivamente.
Assim, pela análise conjunta dos sinais e bandas mencionados, confirma-se a
identidade desses produtos.
3.3.3 Caracterização dos galactosídeos 58 e 63
OH
HO
N
4
16
5
O
15
X
6
3
2
O1
OH
O
7
8
9
10
12
11
O
58 X = H; 63 X = NO2
OCH3
13 14
57
Não é observada banda de estiramento de nitrila no espectro no infravermelho de 58
e 63 (páginas 121 e 151, respectivamente). No espectro de RMN de 1H desses
compostos (página 122, para o derivado 58; página 152, para o derivado 63) os
dupletos de H-15a e H-15b são observados a δ 4,62 e 4,58 ppm para o produto 58 e
a δ 4,62 e 4,57 para o produto 63. Há nesses sinais uma constante de acoplamento
geminal J15a,15b de 16,4 e 16,2 Hz, para os compostos 58 e 63, respectivamente.
No subespectro DEPT-135 de 58 e 63 (páginas 123 e 153, respectivamente) o sinal
de C-15 está a δ 54,7 ppm. Contrariamente ao que é observado para os compostos
56 e 61, esse carbono está localizado em uma região de proteção do grupo nitrila,
logo seu sinal pode ser observado mais próximo ao sinal do TMS do que o sinal de
C-6 do núcleo de D-galactosse e com um deslocamento químico 14 ppm menor do
que o deslocamento químico de C-15 de 56 e 61.
Para ambos os galactosídeos, o sinal do carbono da nitrila no espectro de RMN de
13
C (página 123, para o derivado 58; página 153, para o derivado 63) aparece a δ
117,7 ppm, um valor que está em um intervalo de deslocamento químico
característico desse grupo funcional.
3.4 Síntese e caracterização dos galactosídeos 57 e 62
Esses derivados foram obtidos conforme a reação a seguir.
Figura 32 – Etapa de desproteção do éster terc-butílico dos galactosídeos 56 e 61.
O
O
HO
O
OH
O
CF 3COOH,
CH2 Cl 2, 0 ºC
X
O
OH
O
HO
HO
O
OH
O
X
O
OH
OCH3
OCH3
O
O
56 X = H
61 X = NO2
57 X = H
62 X = NO2
A reação de desproteção dos ésteres terc-butílicos foi realizada com ácido
trifluoracético/diclorometano
1:1
em
banho
de
gelo,
que
são
condições
58
experimentais otimizadas a partir de relato de Gong e colaboradores (GONG et al.,
2009). O material de partida é consumido totalmente em duas horas.
Ao final da reação, o excesso de ácido trifluoroacético foi removido por meio de
coevaporações, de forma rápida e eficiente. Utilizou-se convenientemente
diclorometano nesse processo, pois o solvente já faz parte do meio reacional e pode
ser eliminado facilmente a baixa temperatura. Além disso, por ser um solvente de
baixa polaridade, ocorre cristalização do produto polar à medida que o ácido
trifluoracético é removido.
Os produtos 57 e 62 foram purificados por CCS e obtidos com 75 e 76% de
rendimento, respectivamente. Foi observado que ambos os compostos são
deliquescentes e, portanto, após a obtenção na forma cristalina, a exposição dessas
substâncias ao ar foi evitada ao máximo.
É proposto que a síntese dos galactosídeos ácidos se processa por um mecanismo
SN1 no qual se produz o cátion terc-butílico, de forma semelhante à desproteção de
aminas protegidas por pelo grupo terc-butoxicarbonila (Figura 33). Pelo uso
sistemático dessa técnica em síntese de peptídeos, descobriu-se que a principal
forma de neutralização do cátion terc-butílico é o ataque nucleofílico do ânion
trifluoroacetato formando
o
trifluoracetato
de
terc-butila
(SURESHBABU
e
NARENDRA, 2011; LUNDT, et al., 1978). Esse mecanismo é coerente com a
observação experimental de que a reação não ocorre com quantidades catalíticas de
ácido trifluoracético.
59
Figura 33 – Proposta mecanística de desproteção do éster terc-butílico dos galactosídeos
56 e 61.
..
O:
O
OH
HO
O
O
OAr + H
OH
O
H ..
O
- (CF3COO-)
O
CF3
HO
O
O
OH
O
OH
56 X=H, 61 X = NO2
O
OH HO
O
Ar =
O
OH
O
OAr
..
:O
..
OAr +
O
- (Produto)
OH
X
O
CF3
CF3
O
57 X=H, 62 X = NO2
OCH3
3.4.1 Caracterização dos galactosídeos 57 e 62
Os produtos carboxilados foram caracterizados por faixa de fusão, [α]D,
espectrometria no infravermelho, de RMN de
1
13
H,
C, subespectro DEPT-135,
mapas de contornos COSY, HMQC e HMBC.
HO
O
HO
16
4
O
15
3
OH
6
5
2
O1
OH
X
O
8
7
9
10
12
11
OCH3
13
14
O
57 X = H; 62 X = NO2
No espectro no infravermelho dos produtos ácidos (página 115, para o produto 57;
página 145, para o produto 62) as bandas são mais alargadas do que as dos
compostos anteriores e somente uma banda de carbonila foi observada (1706 cm-1
para 57; 1720 cm-1 para 62).
No espectro de RMN de 1H de 57 (página 116) os dupletos de H-15a e H-15b são
observados a δ 3,79 e 3,70 ppm. Há nesses sinais uma constante de acoplamento
60
geminal J15a,15b de 16,0 Hz. No subespectro DEPT-135 de 57 e 62 (páginas 117 e
147, respectivamente) o sinal de C-15 está a δ 69,2 e 68,7 ppm, respectivamente.
No espectro de RMN de
13
C de 57 e 62 (páginas 117 e 147, respectivamente), o
sinal de C-16 de 57 e 62 é observado a δ 174,4 e 174,6 ppm, respectivamente.
Esses valores estão num intervalo de deslocamento químico característico de
carbono carbonílico de ácido carboxílico e são ligeiramente maiores do que os
valores
de
deslocamento
químico
do
sinal
do
carbono
das
carbonilas
correspondentes dos ésteres de 56 e 61. Não são observados os sinais de C-17 e
C-18 do grupo terc-butílico citados na caracterização dos respectivos precursores,
os galactosídeos 56 e 61. Com todas essas observações espectrométricas confirmase que a reação de desproteção dos ésteres terc-butílicos foi realizada com êxito.
3.5 Síntese e caracterização dos galactosídeos 59 e 64
Esses derivados foram obtidos conforme a reação a seguir.
Figura 34 – Reação de obtenção dos galactosídeos 59 e 64.
HO
N
O
OH
O
X
NaN3, NH4Cl
O
OH
OCH3 THF, H2O,
O
58 X = H
63 X = NO2
N N
HN
N
HO
O
OH
O
X
O
OH
65 ºC
OCH3
O
59 X = H
64 X = NO2
A síntese dos derivados tetrazólicos foi realizada sob condições experimentais
adaptadas do relato de Viana e colaboradores (VIANA, 2007). Realizou-se a reação
sob aquecimento, com largo excesso de azida de sódio e cloreto de amônio e um
volume bastante reduzido de uma mistura de THF/H2O 1:1, o solvente da reação.
Nessas condições o consumo do material partida se completa em aproximadamente
60 horas.
Ao final da reação o meio é acidificado até pH 1 e o solvente orgânico é eliminado. O
procedimento extrativo com acetato de etila descrito na referência utilizada não foi
61
adequado, pois 59 e 64 são bastante polares. Dessa forma, os produtos não se
transferem eficientemente para a fase orgânica e o rendimento diminui
consideravelmente. Logo, procurou-se otimizar as condições de elaboração da
reação para favorecer a precipitação do produto isento de sal.
Na síntese do produto 59, o volume de água adicionado por meio do HCl utilizado
para acidificação do meio foi suficiente para solubilizar o material inorgânico e
permitir, após evaporação do THF, a precipitação do produto. Foi necessária uma
recristalização para se obter 59 espectrometricamente puro, obtendo-se, então, o
produto com 51% de rendimento.
A síntese do derivado nitrado foi mais difícil, pois, utilizando o mesmo procedimento
adotado na obtenção de 59, houve cocristalização de azida da sódio, detectada no
infravermelho pela presença de uma banda em 2118 cm-1. Assim, decidiu-se fazer
uma extração exaustiva com acetato de etila em pequena escala. A contaminação
foi eliminada e o produto 64 foi obtido com 32% de rendimento.
3.5.1 Caracterização dos galactosídeos 59 e 64
Os
produtos
tetrazólicos
foram
caracterizados
espectrometria no infravermelho, de RMN de
por
1
H,
faixa
de
fusão,
[α]D,
13
C, subespectro DEPT-135,
mapas de contornos COSY, HMQC e HMBC.
HN
N
16
OH
HO
N N
5
O
15
X
6
4
3
2
O1
OH
O
7
8
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
59 X = H; 64 X = NO 2
No espectro de RMN de 1H de 59 e 64 (páginas 128 e 158, respectivamente)
observam-se os dupletos de H-15a e H-15b a δ 5,06 e 5,01 ppm para o produto 59 e
a δ 5,05 e 4,99 para o produto 64. Esses sinais estão, em média, 0,4 ppm mais
distantes do sinal do TMS do que os respectivos sinais dos seus precursores, os
62
galactosídeos 58 e 63. Percebe-se, portanto, que a vizinhança do grupo metileno em
questão foi modificada, como se propõe na reação acima. Há nesses sinais há uma
constante de acoplamento geminal J15a,15b de 13,6 Hz, para ambos os produtos.
No subespectro DEPT-135 de 59 e 64 (páginas 129 e 159, respectivamente) o sinal
do metileno C-15 está a δ 69,2 e 68,7 ppm, respectivamente. Esses sinais estão, em
média, 14,3 ppm mais distantes do sinal do TMS do que os respectivos sinais dos
galactosídeos de partida.
No espectro de RMN de
13
C de 59 e 64 (páginas 129 e 159, respectivamente) é
observado o sinal do carbono do anel tetrazólico a δ 154,3 e 154,5 ppm,
respectivamente. Além disso, não se observa o sinal do carbono da nitrila de 56 e
61, confirmando-se, juntamente com os outros sinais analisados, o consumo do
material de partida e a formação efetiva dos produtos 59 e 64.
3.6 Ensaios enzimáticos
Os galactosídeos 53-64 sintetizados neste trabalho foram testados contra a TcTS
em colaboração com a Dr. Ivone Carvalho da Faculdade de Ciências Farmacêuticas
da USP-Ribeirão Preto. Utilizou-se a técnica espectrofluorimétrica contínua
desenvolvida por Douglas e colaboradores (DOUGLAS et al., 2006) que consiste em
um ensaio de hidrólise do substrato ácido 4-metillumbeliferil-α-D-N-acetilneuramínico
91 (MuNANA; Figura 35) pela TcTS. Quando não há inibição da enzima, ocorre
hidrólise
da
ligação
sialosídica,
liberação
da
aglicona
fluorescente
e,
consequentemente, detecção de maiores unidades de fluorescência. Em caso de
inibição enzimática, menores unidades de fluorescência são observadas.
Figura 35 - Estrutura do substrato MuNANA.
CH3
HO
OH
COOH
OH
O
AcHN
O
HO
91
O
O
63
Os derivados de D-galactose planejados e sintetizados apresentaram baixa atividade
inibitória de TcTS na concentração de 1mM, com porcentagens de inibição inferior
àquela apresentada pelo controle positivo piridoxal fosfato 11. O composto mais
ativo foi o galactosídeo 64, que inibiu com 41% da atividade enzimática (Gráfico 1).
Os derivados ácidos 62 e 64 também foram ensaiados na concentração de 500 µM e
apresentaram 16 e 23% de inibição de TcTS, respectivamente, ao passo que o
controle positivo exibiu 56% de inibição.
Apesar da impossibilidade dos galactosídeos obtidos atuarem como substratos de
TcTS, observa-se que a introdução de um grupo metila ou cianometila no oxigênio
de C-3 dos galactosídeos diminui a atividade inibitória de TcTS. Esses resultados
são concordantes com os de Harrison e colaboradores que verificaram que o
derivado 3-O-metilado do galactosídeo de octila apresenta apenas 13% de inibição
de TcTS a 1 mM, ao passo que o respectivo galactosídeo não modificado exibiu
75% de inibição na mesma concentração (HARRISON et al., 2011).
Gráfico 1 – Porcentagem de inibição de TcTS pelos galactosídeos 53-64 a 1mM.
100
79
% de inibição de TcTS
90
80
70
60
31
50
41
40
24
30
21
18
19
11
20
10
10
7
5
5
6
0
Galactosídeos ensaiados contra TcTS
64
Os derivados ácidos 57 e 62 também apresentaram atividades inibitórias inferiores a
dos galactosídeos não modificados 53 e 54, sugerindo-se, assim, que a contribuição
da ligação iônica com a tríade de argininas para a ancoragem dos ligantes foi
superestimada e/ou que o gasto energético com a dessolvatação do grupo ácido
carboxílico foi muito elevado. Corroborando tais resultados, muitas substâncias
ácidas testadas contra a TcTS foram inativas, como mostrado na introdução deste
trabalho, ou seja, a essencialidade da referida ligação iônica para a ancoragem dos
ligantes não foi demonstrada.
Observa-se, contudo, que a substituição bioisostérica do grupo ácido carboxílico
pelo grupo tetrazol e a introdução do grupo nitro na aglicona foram substituições
moleculares que aumentaram a atividade dos galactosídeos. As bases moleculares
que elevaram a esse incremento de atividade devem ser investigadas mais
acuradamente.
65
4 PARTE EXPERIMENTAL
4.1 Métodos gerais
Utilizaram-se solventes P.A. sem tratamento prévio ou a fração média dos
respectivos destilados simples, conforme está descrito em cada experimento. A
obtenção de tetra-hidrofurano (THF) anidro foi feita por meio de desidratação
química: 100 mL de uma suspensão 5% m/V de sódio metálico finamente dividido
em THF foi deixada em repouso por 24 horas. Em seguida, adicionou-se uma ponta
de espátula do indicador benzofenona e a mistura foi refluxada até viragem de cor
amarela para azul escuro persistente. Frações do solvente destilado, coletado em
funil de adição, foram adicionadas diretamente no(s) meio(s) de reação.
Faixas de fusão (F.F.) foram determinadas em aparelho Microquímica MQAPF 301 e
não foram corrigidas.
Valores de poder rotatório específico, [α]D, foram determinados em polarímetro
ADP220 Bellinghan + Stanley Ltd., a 20º C.
Os espectros no infravermelho (IV) foram obtidos pela técnica de Reflectância Total
Atenuada (ATR) em aparelho de Spectrum One, Perkin-Elmer.
Os espectros de RMN de 1H e 13C foram obtidos em espectrômetros DPX 200 e DPX
400, ambos da Brucker. Utilizou-se tetrametilsilano (TMS) ou o próprio solvente
deuterado como padrão interno. Os valores de deslocamento químico (δ) foram
expressos em ppm e as constantes de acoplamento (J), em hertz.
A evolução das reações foi acompanhada por meio de cromatografia em camada
delgada (CCD) em placas confeccionadas no próprio laboratório com sílica gel 60 G
Merck. Os sistemas de eluentes empregados estão especificados em cada
experimento. Os reveladores utilizados foram vapores de iodo e solução etanólica de
ácido sulfúrico 15% V/V, com aquecimento a 150 ºC logo após aplicação.
Em cromatografia em coluna de sílica (CCS), foi utilizada sílica gel 60 Merck com
intervalo granulométrico de 0,040-0,063 mm. Os sistemas de eluentes empregados
estão especificados em cada experimento.
66
Os experimentos de RMN foram conduzidos no Laboratório de Ressonância
Magnética de Alta Resolução (LAREMAR) do Departamento de Química da UFMG.
Todos os demais, excetuando os ensaios biológicos, foram realizados no
Laboratório de Química Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da UFMG.
4.2 Métodos de síntese
4.2.1 Procedimento de síntese de 53 e 54
AcO
AcO
OAc
O
HO
X
MeONa/MeOH
O
OAc
OCH3
HO
OH
O
X
O
OH
O
68 X = H
69 X = NO2
OCH3
O
53 X = H
54 X = NO2
Em um balão de 125 mL foi preparada uma solução de metóxido de sódio pela
adição de cerca de 30 mg de sódio metálico a 80 mL de metanol destilado, com
resfriamento em banho de gelo e água. A esta solução adicionou-se o galactosídeo
tetra-O-acetilado correspondente (2,00 g (4,14 mmol) de 68 ou 1,95 g (3,70 mmol)
de 69) e ao balão foi acoplado um tubo com cloreto de cálcio. O resfriamento foi
mantido durante a reação, realizada sob agitação magnética e acompanhada por
CCD (eluente: acetato de etila/metanol 9:1). Ao fim da reação, a mistura foi
neutralizada até pH 7 com resina ácida Amberlite® IRA 120 previamente lavada com
metanol, ligeiramente aquecida em banho-maria até completa solubilização do
produto parcialmente insolúvel e filtrada para remoção da resina. O solvente foi
removido em evaporador rotatório. Os galactosídeos 53 e 54 foram obtidos com
rendimentos de 91 e 86%, respectivamente.
67
4.2.1.1
Dados
de
caracterização
de
β-D-galactopiranosídeo
de
4-
metoxicarbonilfenila (53)
Sólido branco [1,19 g (3,79 mmol; 91%) a partir de 2,00 g (4,14 mmol) de 68]
F.M.: C14H18O8
M.M.: 314,29 g.mol-1
F.F.: 183,6 - 184,9 ºC [literatura: 153,5 - 155 ºC (CARVALHO, 2008)]
[α] –44 (c 0,5 MeOH)
OH
HO
6
4
O1
5
HO
3
2
OH
O
7
8
IV (
11
/cm-1): 3580, 3378, 3205 (ν O-H);
1674 (ν C=O); 1606, 1514, 1439 (ν C=C);
9
10
12
máx
OCH3
13 14
O
1250 (ν C-O da aglicona); 1085, 1057,
1031, 1023 (ν C-O do carboidrato)
RMN de 1H (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 200
MHz): 7,90 (d; 2H; J9,8; 11,12 8,8 Hz; H-9, H-11); 7,12 (d; 2H; J8,9; 12,11 8,8 Hz; H-8, H12); 5,25 (d; 1H; J 5,0 Hz; OH); 4,95 (d; 1H; J1,2 7,6 Hz; H-1); 4,92 (d; 1H; OH); 4,69
(t; 1H; JOH-6,6a 5,4 Hz, JOH-6,6b 5,4 Hz; OH-6); 4,56 (d; 1H; J 4,6 Hz; OH); 3,81 (s; 3H;
H-14); 3,71 (m; 1H; H-4); 3,65-3,42 (m; H-2, H-3, H-5, H-6a, H-6b)
RMN de
13
C (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 50 MHz): 165,94 (C-13); 161,29 (C-7); 131,14
(C-9, C-11); 122,92 (C-10); 116,09 (C-8, C-12); 100,45 (C-1); 75,67 (C-5); 73,27 (C3); 70,24 (C-2); 68,15 (C-4); 60,37 (C-6); 51,98 (C-14)
Os espectros no IV, de RMN de 1H, de
nas páginas 97-99, respectivamente.
13
C e subespectro DEPT-135 de 53 estão
68
4.2.1.2
Dados
de
caracterização
de
β-D-galactopiranosídeo
de
4-
metoxicarbonil-2-nitrofenila (54)
Sólido branco [1,14 g (3,17 mmol; 86%) a
OH
HO
O1
5
HO
3
2
OH
partir de 1,95 g (3,70 mmol) de 69]
NO2
6
4
O
7
8
F.M.: C14H17NO10
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
M.M.: 359,29 g.mol-1
F.F.: 180,7 - 182,5 ºC decompõe
[literatura: 198 ºC decompõe
(CARVALHO, 2008)]
[α] –90 (c 0,4 MeOH) [literatura: [α] –88 (c 0,4 MeOH) (CARVALHO, 2008); [α] –
90 (c 0,4 MeOH) (KRÖGER e THIEM, 2007)]
IV (
máx
/cm-1): 3547, 3374 (ν O-H); 1725 (ν C=O); 1617, 1498, 1436 (ν C=C); 1532,
1361 (ν NO2); 1275 (ν C-O da aglicona); 1063, 1019 (ν C-O do carboidrato)
RMN de 1H (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 200 MHz): 8,33 (d; 1H; J9,11 2,0 Hz; H-9); 8,14
(dd; 1H; J11,9 2,0 Hz, J11,12 8,8 Hz; H-11); 7,54 (d; 1H; J12,11 8,8 Hz; H-12); 5,31 (d;
1H; J 2,8 Hz; OH); 5,17 (d; 1H; J1,2 7,4 Hz; H-1); 4,99 (d; 1H; J 4,8 Hz; OH); 4,79 (m;
1H; OH-6); 4,69 (d; 1H; J 3,4 Hz; OH); 3,85 (s; H-14); 3,73-3,55 (m; H-2, H-3, H-4, H5, H-6a, H-6b)
RMN de
13
C (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 50 MHz): 164,59 (C-13); 153,29 (C-7); 139,74
(C-8); 134,79 (C-11); 126,05 (C-9); 123,01 (C-10); 117,28 (C-12); 101,01 (C-1);
76,10 (C-5); 73,43 (C-3); 70,18 (C-2); 68,18 (C-4); 60,48 (C-6); 52,75 (C-14)
Os espectros no IV, de RMN de 1H, de
nas páginas 100-102, respectivamente.
13
C e subespectro DEPT-135 de 54 estão
69
4.2.2 Procedimento geral de 3-O-alquilação dos galactosídeos 53 e 54
HO
HO
HO
OH
O
X
R
1) Bu2SnO, MeOH
O
OH
OCH3
O
O
X
O
OH
OCH3
O
2) TBAI, eletrófilo,
THF
53 X = H
54 X = NO2
O
OH
X=H
X = NO2
55 R = H
60 R = H
56 R = COOC(CH3)3 61 R = COOC(CH3)3
63 R = CN
58 R = CN
A um balão de 125 mL foram adicionados 30 mL de metanol destilado, 0,300 g do
galactosídeo correspondente (0,95 mmol de 53; 0,83 mmol de 54) e óxido de
dibutilestanho. Ao balão acoplou-se um tubo com cloreto de cálcio e essa mistura foi
submetida à agitação magnética e aquecimento a 60 ºC em banho de óleo por uma
hora e meia. Em seguida, o solvente foi removido em evaporador rotatório.
Ao mesmo balão onde foi feita a síntese do complexo de estanho, adicionaram-se
28 mL de THF anidro para síntese dos derivados não-nitrados ou 16 mL para
síntese dos nitrados, o catalisador iodeto de tetrabutilamônio e o agente alquilante
(Tabela 2), manipulado somente em capela. Acoplou-se um tubo com cloreto de
cálcio ao balão e a mistura reagente foi submetida à agitação magnética.
Tabela 2 – Proporção molar dos reagentes utilizados nas 3-O-alquilações dos galactosídeos
53 e 54.
Material de
partida (MP)
Eletrófilo
Proporção molar –
MP/Bu2SnO/TBAI/eletrófilo
Produto
(Rendimento)
53
MeI
1/1,1/0,5/11,6
55 (54%)
54
MeI
1/1,1/0,5/11,6
60 (32%)
53
BrCH2COOC(CH3)3
1/1,5/0,5/5,8
56 (82%)
54
BrCH2COOC(CH3)3
1/1,5/0,5/5,8
61 (73%)
53
BrCH2CN
1/1,5/0,5/5,8
58 (61%)
54
BrCH2CN
1/1,5/0,5/5,8
63 (53%)
70
As alquilações de 53 foram feitas sob aquecimento a 60 ºC em banho de óleo e as
alquilações de 54 foram feitas à temperatura ambiente. Uma vez detectado por CCD
o término ou, exclusivamente na síntese de 55 e 60, a não-evolução da reação, o
solvente foi removido em evaporador rotatório, formando-se um óleo castanho. Esse
material foi diretamente purificado por CCS.
Tabela 3 – Condições empregadas nas 3-O-alquilações dos galactosídeos 53 e 54.
Produto
Eluente da CCD
(3 eluições)
Tempo de
reação (horas)
Temperatura
55
diclorometano/MeOH 93:7
24
60 ºC
60
diclorometano /MeOH 93:7
48
ambiente
56
diclorometano /MeOH 96,5:3,5
24
60 ºC
61
diclorometano /MeOH 96,5:3,5
48
ambiente
58
diclorometano /MeOH 95:5
96
60 ºC
63
diclorometano /MeOH 95:5
96
ambiente
Ambas as etapas de formação do intermediário organometálico e alquilação
propriamente dita, foram feitas mais de uma vez, exceto a síntese de 55. Na maioria
delas, realizou-se escalonamento para maiores quantidades, como será citado em
cada procedimento de síntese, porém a proporção molar dos reagentes, temperatura
e tempo de reação acima citados foram mantidos.
4.2.3 Procedimento de síntese de 55
HO
HO
OH
HO
O
1) Bu2SnO, MeOH
O
OH
OCH3
2) TBAI, MeI, THF
H3CO
OH
O
O
OH
O
53
OCH3
O
55
71
O derivado 55 foi sintetizado utilizando-se o procedimento geral de 3-O-alquilação
dos galactosídeos 53 e 54 e as condições anteriormente citadas, com três
modificações. Primeiramente, optou-se por modificar o sistema de reação,
colocando um condensador entre o balão e o tubo com cloreto de cálcio, para
minimizar a perda do iodeto de metila por volatilização. A segunda alteração foi o
modo de adição do agente alquilante, acrescentado de duas vezes. Iniciou-se a
reação com 5,8 equivalentes de iodeto de metila e, após 24 horas, devido ao
andamento modesto da reação e à volatilidade do eletrófilo (p.e. 42,5 ºC), foram
adicionados mais 5,8 equivalentes. A última modificação foi o momento de adição do
catalisador, adicionado somente após 32 horas de reação. As quantidades de
reagentes e solventes foram estas: 0,300 g (0,95 mmol) de 53, 0,257 g (1,05 mmol)
de Bu2SnO, 30 mL de metanol, 0,176 g de Bu4NI (0,48 mmol), 2 x 0,35 mL (11,08
mmol) de iodeto de metila e 28 mL de THF anidro.
Após 96 horas, mesmo sem completo consumo do material de partida, elaborou-se a
reação. Foi feita CCS (eluente: diclorometano/ metanol 94,5:5,5) do material bruto
de reação. Obtiveram-se duas frações de interesse, uma contendo 0,143 g de
produto contaminado com TBAI e outra contendo 0,125 g de produto contaminado
com quantidade residual de TBAI e um subproduto com polaridade muito próxima ao
produto, possivelmente, resultado de anomerização. A primeira foi recromatografada
por CCS (eluente: acetato de etila), obtendo-se 0,118 g do derivado metilado
desejado. A segunda foi recristalizada em MeOH/éter etílico, produzindo 0,057 g de
produto puro. Ao final de toda elaboração, foi obtido 0,169 g (54%) do produto 55.
4.2.3.1 Dados de caracterização de 3-O-metil-β-D-galactopiranosídeo de 4metoxicarbonilfenila (55)
HO
54%) a partir de 0,300 g (0,95 mmol)
6
4
5
H3CO
15
Sólido branco [0,169 g (0,51 mmol;
OH
3
2
O1 O
OH
7
8
de 53]
9
10
12
11
OCH3
13
O
14
F.M.: C15H20O8
M.M.: 328,31 g.mol-1
F.F.: 161,6 - 164,0 ºC
[α] –36 (c 0,5 MeOH)
72
IV (
máx /cm
-1
): 3416 (ν O-H); 1713 (ν C=O); 1604, 1586, 1432 (ν C=C); 1238 (ν C-O
da aglicona); 1050 (ν C-O do carboidrato)
RMN de 1H (δ/ppm; J/Hz; piridina-d5; 400 MHz): 8,07 (d; 2H; J9,8; 11,12 8,8 Hz; H-9, H11); 7,36 (d; 2H; J8,9; 12,11 8,8 Hz; H-8, H-12); 5,65 (d; 1H; J1,2 7,7 Hz; H-1); 4,79 (dd;
1H; J2,1 7,7 Hz, J2,3 9,3 Hz; H-2); 4,68 (d; 1H; J4,3 3,0 Hz; H-4); 4,48 (m; 2H; H-6a, H6b); 4,25 (m; 1H; H-5); 3,77 (s; 3H; H-14); 3,72 (dd; 1H; J3,2 9,3 Hz, J3,4 3,0 Hz; H-3);
3,60 (s; 3H; H-15)
RMN de
13
C (δ/ppm; J/Hz; piridina-d5; 100 MHz): 166,58 (C-13); 162,20 (C-7);
131,83 (C-9, C-11); 124,10 (C-10); 116,57 (C-8, C-12); 102,13 (C-1); 84,81 (C-3);
77,49 (C-5); 70,66 (C-2); 65,83 (C-4); 62,27 (C-6); 57,28 (C-15); 51,74 (C-14)
HMBC (piridina-d5; 400 MHz): H-3xC-15; H-15xC-3
Os espectros no IV, de RMN de 1H, de
contornos
COSY,
HMQC e
13
HMBC de
C, subespectro DEPT-135, mapa de
55
estão
nas
páginas
103-108,
respectivamente.
4.2.4 Procedimento de síntese de 60
HO
HO
OH
HO
NO2
O
1) Bu2SnO, MeOH
O
OH
OCH3
2) TBAI, MeI, THF
H3CO
OH
NO2
O
O
OH
O
54
OCH3
O
60
O derivado 60 foi sintetizado utilizando-se o procedimento geral de 3-O-alquilação
dos galactosídeos 53 e 54 e as condições anteriormente citadas, com as
modificações citadas no procedimento de síntese de 53, exceto pelo uso de
condensador. As quantidades de reagentes e solventes foram estas: 0,350 g (0,97
mmol) de 54, 0,272 g (1,09 mmol) de Bu2SnO, 35 mL de metanol, 0,182 g (0,49
mmol) de Bu4NI, 2 x 0,36 mL (11,45 mmol) de iodeto de metila e 19 mL de THF
anidro.
73
Após 96 horas, mesmo sem completo consumo do material de partida, elaborou-se a
reação. Foi feita CCS (eluente: diclorometano/ metanol 94,5:5,5) do material bruto
de reação, obtendo-se 0,130 g de produto contaminado com TBAI. Esse material foi
recromatografado por CCS (eluente: acetato de etila), obtendo-se 0,115 g (32%) de
produto 60.
4.2.4.1 Dados de caracterização de 3-O-metil-β-D-galactopiranosídeo de 4metoxicarbonil-2-nitrofenila (60)
OH
HO
6
5
4
H3 CO
15
Sólido amarelo pálido [0,115 g (0,31
2
3
O1
OH
mmol; 32%) a partir de 0,350 g (0,97
NO2
O
7
8
mmol) de 54]
9
F.M.: C15H19NO10
10
12
11
OCH3
13 14
O
M.M.: 373,31 g.mol-1
F.F.: 150,7 – 151,9 ºC
[α] –76 (c 0,5 MeOH)
IV (
máx
/cm-1): 3525, 3347 (ν O-H); 1700 (ν C=O); 1619, 1440 (ν C=C); 1537, 1352
(ν NO2); 1264 (ν C-O da aglicona); 1075, 1053 (ν C-O do carboidrato)
RMN de 1H (δ/ppm; J/Hz; piridina-d5; 400 MHz): 8,53 (d; 1H; J9,11 2,0 Hz; H-9); 8,07
(dd; 1H; J11,9 2,0 Hz, J11,12 8,8 Hz; H-11); 7,89 (m; 1H; OH); 7,79 (d; 1H; J12,11 8,8 Hz;
H-12); 6,87 (m; 1H; OH); 6,60 (m; 1H; OH); 5,80 (d; 1H; J1,2 8,0 Hz; H-1); 4,82 (m;
1H; H-2); 4,64 (d; 1H; J4,3 2,9 Hz; H-4); 4,53 (dd; 1H; J6a,5 6,8 Hz, J6a,6b 11,2 Hz; H6a); 4,43 (dd; 1H; J6b,5 4,8 Hz, J6b,6a 11,2 Hz; H-6b); 4,30 (m; 1H; H-5); 3,79 (s; 3H;
H-14); 3,72 (dd; 1H; J3,2 9,4 Hz, J3,4 2,9 Hz; H-3); 3,60 (s; 3H; H-15)
RMN de
13
C (δ/ppm; J/Hz; piridina-d5; 100 MHz): 164,83 (C-13); 154,26 (C-7);
140,57 (C-8); 134,92 (C-11); 126,72 (C-9); 122,99 (C-10); 117,67 (C-12); 102,80 (C1); 84,83 (C-3); 78,10 (C-5); 70,16 (C-2); 65,74 (C-4); 62,26 (C-6); 57,30 (C-15);
52,30 (C-14)
HMBC (piridina-d5; 400 MHz): H-3xC-15; H-15xC-3
74
Os espectros no IV, de RMN de 1H, de
contornos
COSY,
HMQC e
13
C, subespectro DEPT-135, mapa de
HMBC de
60
estão
nas
páginas
133-138,
respectivamente.
4.2.5 Procedimento de síntese de 56
HO
OH
O
HO
O
1) Bu2SnO, MeOH
O
O
OH
OCH3
O
HO
OH
O
O
O
OH
2) BrCH2COOC(CH3)3
TBAI, THF
OCH3
O
53
56
O derivado 56 foi sintetizado utilizando-se o procedimento geral de 3-O-alquilação
dos galactosídeos 53 e 54 e as condições anteriormente citadas. As quantidades de
reagentes e solventes foram estas: 0,400 g (1,27 mmol) de 53, 0,475 g (1,91 mmol)
de Bu2SnO, 40 mL de metanol, 0,235 g (0,64 mmol) de Bu4NI, 1,09 mL (7,38 mmol)
de bromoacetato de terc-butila e 37 mL de THF anidro. O material bruto de reação
foi elaborado por CCS (eluente: acetato de etila), obtendo-se 0,448 g (82%) do
produto 56.
4.2.5.1
Dados
de
caracterização
de
3-O-(terc-butoxicarbonilmetil)-β-D-
galactopiranosídeo de 4-metoxicarbonilfenila (56)
HO
O
18
17
O
16
4
O
15
3
Sólido branco [0,448 g (1,04
OH
6
5
2
O1
OH
mmol; 82%) a partir de 0,400
O
7
8
g (1,27 mmol) de 53]
9
F.M.: C20H28O10
10
12
11
OCH3
13 14
O
M.M.: 428,43 g.mol-1
F.F.: 83,2 - 84,8 ºC
[α] –44 (c 0,5 CHCl3)
IV (
máx
/cm-1): 3531, 3405 (ν O-H); 1721 (ν C=O éster alifático); 1697 (ν C=O éster
aromático); 1605, 1508, 1437 (ν C=C); 1245 (ν C-O da aglicona); 1062 (ν C-O do
carboidrato)
75
RMN de 1H (δ/ppm; J/Hz; CDCl3; 400 MHz): 7,98 (d; 2H; J9,8; 11,12 8,8 Hz; H-9, H-11);
7,07 (d; 2H; J8,9; 12,11 8,8 Hz; H-8, H-12); 5,01 (d; 1H; J1,2 8,0 Hz; H-1); 4,26 (d; 1H;
J15a,15b 17,2 Hz; H-15a); 4,15 (d; 1H; J15b,15a 17,2 Hz; H-15b); 4,13 (m; 1H; H-2); 4,06
(d; 1H; J4,3 2,8 Hz; H-4); 4,00 (dd; 1H; J6a,5 6,6 Hz, J6a,6b 11,8 Hz; H-6a); 3,88 (s; 3H;
H-14); 3,86 (dd; 1H; J6b,5 4,8 Hz, J6b,6a 11,8 Hz; H-6b); 3,68 (m; 1H; H-5); 3,41 (dd;
1H; J3,2 9,6 Hz, J3,4 2,8 Hz; H-3); 1,49 (s; 9H; H-18)
RMN de
13
C (δ/ppm; J/Hz; CDCl3; 100 MHz): 171,54 (C-16); 166,89 (C-13); 160,85
(C-7); 131,74 (C-9, C-11); 124,61 (C-10); 116,30 (C-8, C-12); 100,55 (C-1); 84,06 (C3); 83,53 (C-17); 74,92 (C-5); 70,00 (C-2); 68,14 (C-15); 66,80 (C-4); 62,52 (C-6);
52,18 (C-14); 28,27 (C-18)
HMBC (CDCl3; 400 MHz): H-3xC-15; H-15axC-3; H-15bxC-3
Os espectros no IV, de RMN de 1H, de
contornos
COSY,
HMQC e
13
HMBC de
C, subespectro DEPT-135, mapa de
56
estão
nas
páginas
109-114,
respectivamente.
4.2.6 Procedimento de síntese de 61
HO
HO
OH
NO2
O
1) Bu2SnO, MeOH
O
O
OH
OCH3
O
54
O
HO
O
OH
O
NO2
O
OH
2) BrCH2COOC(CH3)3
TBAI, THF
OCH3
O
61
O derivado 61 foi sintetizado utilizando-se o procedimento geral de 3-O-alquilação
dos galactosídeos 53 e 54 e as condições anteriormente citadas. Devido ao
escalonamento, os volumes de metanol e THF foram proporcionalmente reduzidos
em 30%. As quantidades de reagentes e solventes foram estas: 0,710 g (1,98 mmol)
de 54, 0,735 g (2,96 mmol) de Bu2SnO, 50 mL de metanol, 0,364 g (0,99 mmol) de
Bu4NI, 1,69 mL (11,5 mmol) de bromoacetato de terc-butila e 26 mL de THF anidro.
O material bruto de reação foi elaborado por CCS (eluente: clorofórmio/metanol
98:2), obtendo-se 0,686 g (73%) do produto 61. Formou-se um material resinoso,
porém conseguiu-se a cristalização do galactosídeo após solubilização do produto
76
em volume mínimo de acetona, adição de éter etílico e atrito nas paredes do balão
com uma espátula. Os solventes foram removidos em evaporador rotatório e o
produto se conservou no estado cristalino.
4.2.6.1
Dados
de
caracterização
de
3-O-(terc-butoxicarbonilmetil)-β-D-
galactopiranosídeo de 4-metoxicarbonil-2-nitrofenila (61)
HO
O
18
17
O
16
4
15
3
2
O1 O
OH
mmol; 73%) a partir de 0,710
NO2
6
5
O
Sólido branco [0,686 g (1,45
OH
7
8
g (1,98 mmol) de 54]
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
F.M.: C20H27NO12
M.M.: 473,43 g.mol-1
F.F.: 136,5 - 137,4 ºC
[α] +36 (c 0,5 CHCl3)
IV (
máx
/cm-1): 3523, 3391 (ν O-H); 1730 (ν C=O éster alifático); 1718 (ν C=O éster
aromático); 1618, 1436 (ν C=C); 1529, 1349 (ν NO2); 1259 (ν C-O da aglicona);
1244, 1059 (ν C-O do carboidrato)
RMN de 1H (δ/ppm; J/Hz; CDCl3; 400 MHz): 8,49 (d; 1H; J9,11 2,0 Hz; H-9); 8,19 (dd;
1H; J11,9 2,0 Hz, J11,12 8,8 Hz; H-11); 7,39 (d; 1H; J12,11 8,8 Hz; H-12); 5,01 (d; 1H; J1,2
7,8 Hz; H-1); 4,36 (d; 1H; J15a,15b 17,2 Hz; H-15a); 4,19 (dd; 1H; J2,1 7,8 Hz, J2,3 9,3
Hz; H-2); 4,16 (d; 1H; J15b,15a 17,2 Hz; H-15b); 4,11 (d; 1H; J4,3 2,9 Hz; H-4); 4,04 (dd;
1H; J6a,5 6,4 Hz, J6a,6b 12,0 Hz; H-6a); 3,94 (s; 3H; H-14); 3,91 (dd; 1H; J6b,5 4,4 Hz,
J6b,6a 12,0 Hz; H-6b); 3,75 (m; 1H; H-5); 3,47 (dd; 1H; J3,2 9,3 Hz, J3,4 2,9 Hz; H-3);
1,49 (s; 9H; H-18)
RMN de
13
C (δ/ppm; J/Hz; CDCl3; 100 MHz): 171,47 (C-16); 164,90 (C-13); 153,74
(C-7); 140,27 (C-8); 135,52 (C-11); 127,30 (C-9); 125,00 (C-10); 117,98 (C-12);
102,69 (C-1); 83,25 (C-17); 83,06 (C-3); 75,44 (C-5); 70,26 (C-2); 68,66 (C-15);
67,16 (C-4); 62,56 (C-6); 52,83 (C-14); 28,27 (C-18)
HMBC (CDCl3; 400 MHz): H-3xC-15; H-15axC-3; H-15bxC-3
77
Os espectros no IV, de RMN de 1H, de
contornos
COSY,
HMQC e
13
C, subespectro DEPT-135, mapa de
HMBC de
61
estão
nas
páginas
139-144,
respectivamente.
4.2.7 Procedimento de síntese de 58
HO
OH
O
HO
1) Bu2SnO, MeOH
O
OH
N
HO
OH
O
O
O
OH
OCH3
2) TBAI, BrCH2 CN, THF
O
53
OCH3
O
58
O derivado 58 foi sintetizado utilizando-se o procedimento geral de 3-O-alquilação
dos galactosídeos 53 e 54 e as condições anteriormente citadas. As quantidades de
reagentes e solventes foram estas: 0,300 g (0,95 mmol) de 53, 0,356 g (1,43 mmol)
de Bu2SnO, 30 mL de metanol, 0,176 g (0,48 mmol) de Bu4NI, 0,40 mL (5,54 mmol)
de bromoacetonitrila e 28 mL de THF anidro.
O material bruto de reação foi elaborado por CCS (eluente: diclorometano/metanol
97:3), obtendo-se 0,260 g de produto contaminado com TBAI. Esse material foi
recromatografado por CCS (eluente: acetato de etila), obtendo-se 0,206 g (61%) do
produto 58.
4.2.7.1 Dados de caracterização de 3-O-(cianometil)-β-D-galactopiranosídeo de
4-metoxicarbonilfenila (58)
OH
HO
N
5
O
15
61%) a partir de 0,300 g (0,95
6
4
16
Sólido branco [0,206 g (0,58 mmol;
3
2
O1 O
OH
7
8
mmol) de 53]
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
F.M.: C16H19NO8
M.M.: 353,32 g.mol-1
F.F.: 171,4 – 171,8 ºC
[α] –36 (c 0,5 MeOH)
78
IV (
máx
/cm-1): 3525, 3182 (ν O-H); 1709 (ν C=O); 1607, 1584, 1514, 1442 (ν C=C);
1244 (ν C-O da aglicona); 1069, 1052 (ν C-O do carboidrato)
RMN de 1H (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 400 MHz): 7,91 (d; 2H; J9,8; 11,12 8,8 Hz; H-9, H11); 7,13 (d; 2H; J8,9; 12,11 8,8 Hz; H-8, H-12); 5,58 (d; 1H; JOH-2,2 5,6 Hz; OH-2); 5,05
(d; 1H; J1,2 7,6 Hz; H-1); 4,84 (d; 1H; JOH-4,4 5,4 Hz; OH-4); 4,73 (t; 1H; JOH-6,6a 5,6 Hz,
JOH-6,6b 5,6 Hz; OH-6); 4,62 (d; 1H; J15a,15b 16,4 Hz; H-15a); 4,58 (d; 1H; J15b,15a 16,4
Hz; H-15b); 3,99 (dd; 1H; J4,OH-4 5,4 Hz, J4,3 3,2 Hz; H-4); 3,82 (s; 3H; H-14); 3,75
(ddd; 1H; J2,OH-2 5,6 Hz, J2,1 7,6 Hz, J2,3 9,6 Hz; H-2); 3,66 (m; 1H; H-5); 3,56 (qn; 1H;
J6a,OH-6 5,6 Hz, J6a,5 5,6 Hz, J6a,6b 11,2 Hz; H-6a); 3,49 (qn; 1H; J6b,OH-6 5,6 Hz, J6b,5
5,7 Hz, J6b,6a 11,2 Hz; H-6b); 3,47 (dd; 1H; J3,2 9,6 Hz, J3,4 3,2 Hz; H-3)
RMN de 13C (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 100 MHz): 165,79 (C-13); 161,03 (C-7); 131,06
(C-9, C-11); 123,02 (C-10); 117,72 (C-16); 116,03 (C-8, C-12); 100,00 (C-1); 81,82
(C-3); 75,17 (C-5); 68,94 (C-2); 64,20 (C-4); 59,94 (C-6); 54,75 (C-15); 51,88 (C-14)
HMBC (DMSO-d6; 400 MHz): H-3xC-15; H-15axC-3; H-15bxC-3
Os espectros no IV, de RMN de 1H, de
contornos
COSY,
HMQC e
13
C, subespectro DEPT-135, mapa de
HMBC de
58
estão
nas
páginas
121-126,
respectivamente.
4.2.8 Procedimento de síntese de 63
HO
HO
OH
NO2
O
1) Bu2SnO, MeOH
O
OH
OCH3
O
HO
N
O
OH
O
NO2
O
OH
2) TBAI, BrCH2 CN, THF
53
OCH3
O
63
O derivado 63 foi sintetizado utilizando-se o procedimento geral de 3-O-alquilação
dos galactosídeos 53 e 54 e as condições anteriormente citadas. As quantidades de
reagentes e solventes foram estas: 0,400 g (1,11 mmol) de 54, 0,416 g (1,67 mmol)
de Bu2SnO, 40 mL de metanol, 0,205 g (0,56 mmol) de Bu4NI, 0,46 mL (6,46 mmol)
de bromoacetonitrila e 21 mL de THF anidro.
79
O material bruto de reação foi elaborado por CCS (eluente: clorofórmio/metanol
96,5:3,5), obtendo-se 0,303 g de produto contaminado com TBAI. Esse material foi
recromatografado por CCS (eluente: acetato de etila), obtendo-se 0,286 g (64%) do
produto 63.
4.2.8.1 Dados de caracterização de 3-O-(cianometil)-β-D-galactopiranosídeo de
4-metoxicarbonil-2-nitrofenila (63)
Sólido branco [0,286 g (0,72 mmol;
OH
HO
N
6
5
4
16
O
15
3
2
O1
OH
64%) a partir de 0,400 g (1,11
NO2
O
7
8
mmol) de 54]
9
F.M.: C16H18N2O10
10
12
11
OCH3
13 14
O
M.M.: 398,32 g.mol-1
F.F.: 160,5 – 161,4 ºC
[α] –76 (c 0,5 MeOH)
IV (
máx
/cm-1): 3527, 3482, 3236 (ν O-H); 1696 (ν C=O); 1650, 1618, 1443 (ν C=C);
1535, 1330, (ν NO2); 1273 (ν C-O da aglicona), 1053 (ν C-O do carboidrato)
RMN de 1H (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 400 MHz): 8,37 (d; 1H; J9,11 2,0 Hz; H-9); 8,17
(dd; 1H; J11,12 8,8 Hz, J11,9 2,0 Hz; H-11); 7,57 (d; 1H; J 12,11 8,8 Hz; H-12); 5,64 (d;
1H; JOH-2,2 5,6 Hz; OH-2); 5,28 (d; 1H; J1,2 7,6 Hz; H-1); 4,94 (d; 1H; JOH-4,4 5,0 Hz;
OH-4); 4,76 (t; 1H; JOH-6,6a 5,6 Hz, JOH-6,6b 5,6 Hz; OH-6); 4,62 (d; 1H; J15a,15b 16,2 Hz;
H-15a); 4,57 (d; 1H; J15b,15a 16,2 Hz; H-15b); 4,00 (dd; 1H; J4,OH-4 5,0 Hz, J4,3 3,2 Hz;
H-4); 3,87 (s; 3H; H-14); 3,76 (ddd; 1H; J2,OH-2 5,6 Hz, J2,1 7,6 Hz, J2,3 9,4 Hz; H-2);
3,73 (m; 1H; H-5); 3,57 (qn; 1H; J6a,OH-6 5,6 Hz, J6a,5 5,7 Hz, J6a,6b 11,2 Hz; H-6a);
3,51 (qn; 1H; J6b,OH-6 5,6 Hz, J6b,5 5,6 Hz, J6b,6a 11,2 Hz; H-6b); 3,48 (dd; 1H; J3,2 9,4
Hz, J3,4 3,2 Hz; H-3)
RMN de 13C (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 100 MHz): 164,31 (C-13); 152,91 (C-7); 139,64
(C-8); 134,51 (C-11); 125,87 (C-9); 122,98 (C-10); 117,67 (C-16); 117,07 (C-12);
100,41 (C-1); 81,79 (C-3); 75,51 (C-5); 68,68 (C-2); 64,00 (C-4); 59,85 (C-6); 54,73
(C-15); 52,51 (C-14)
HMBC (DMSO-d6; 400 MHz): H-3xC-15; H-15axC-3; H-15bxC-3
80
Os espectros no IV, de RMN de 1H, de
contornos
COSY,
HMQC e
13
C, subespectro DEPT-135, mapa de
HMBC de
63
estão
nas
páginas
151-156,
respectivamente.
4.2.9 Procedimento de síntese de 57 e 62
O
O
HO
O
OH
O
CF3COOH,
CH2Cl2
X
O
OH
OCH3
O
HO
HO
O
OH
O
X
O
OH
O
56 X = H
61 X = NO2
OCH3
O
57 X = H
62 X = NO2
A um balão de 100 mL foram adicionados 1,5 mL de diclorometano destilado e o
éster terc-butílico correspondente nestas quantidades: 0,152 g de 56 (0,35 mmol) ou
0,158 g de 61 (0,33 mmol). A mistura foi submetida à agitação magnética e
resfriamento a 0 ºC em banho de gelo e água, condições mantidas até o final do
experimento. Após completa solubilização do material de partida, adicionou-se 1,5
mL (20 mmol) de ácido trifluroacético gota a gota e acoplou-se um tubo com cloreto
de cálcio ao balão. A reação foi acompanhada por CCD (eluente: acetato de etila, 3
eluições) e tem duração de duas horas.
Ao término da reação verteram-se 75 mL de diclorometano no balão e evaporou-se
o solvente em evaporador rotatório a 35 ºC até aproximadamente um quarto do
volume. Repetiu-se o procedimento duas vezes, porém na última evaporação o
solvente foi eliminado completamente. O material sólido obtido foi purificado por
CCS (eluente: acetato de etila), obtendo-se 0,098 g (0,26 mmol) de 57 ou 0,106 g
(0,25 mmol) de 62, com 75 e 76% de rendimento, respectivamente.
81
4.2.9.1 Dados de caracterização de 3-O-(carboximetil)-β-D-galactopiranosídeo
de 4-metoxicarbonilfenila (57)
HO
O
HO
16
mmol; 75%) a partir de 0,152 g
6
4
5
O
3
15
Sólido branco [0,098 g (0,26
OH
2
O1 O
OH
7
8
(0,35 mmol) de 56]
9
10
12
11
OCH3
13
14
Substância deliquescente
F.M.: C16H20O10
M.M.: 372,32 g.mol-1
O
F.F.: 142,4 – 145,7 ºC
[α] –36 (c 0,5 MeOH)
IV (
máx /cm
-1
): 3361 (ν O-H); 1706 (ν C=O); 1605, 1509, 1435 (ν C=C); 1241 (ν C-O
da aglicona); 1065 (ν C-O do carboidrato)
RMN de 1H (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 400 MHz): 7,90 (d; 2H; J9,8; 11,12 8,8 Hz; H-9, H11); 7,20 (d; 2H; J8,9; 12,11 8,8 Hz; H-8, H-12); 4,95 (d; 1H; J1,2 7,6 Hz; H-1); 3,82 (s;
4H; H-14, H-4); 3,79 (d; 1H; J15a,15b 16,0 Hz; H-15a); 3,70 (d; 1H; J15b,15a 16,0 Hz; H15a); 3,68 (m; 1H; H-2); 3,61 (m; 1H; H-5); 3,57-3,47 (m; 2H; H-6a, H-6b); 3,25 (dd;
1H; J3,2 9,6 Hz, J3,4 2,8 Hz; H-3)
RMN de
13
C (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 100 MHz): 174,41 (C-16); 165,83 (C-13);
161,17 (C-7); 131,03 (C-9, C-11); 122,78 (C-10); 115,98 (C-8, C-12); 100,71 (C-1);
83,12 (C-3); 75,34 (C-5); 69,17 (C-15); 68,52 (C-2); 64,62 (C-4); 60,42 (C-6); 51,85
(C-14)
HMBC (DMSO-d6; 400 MHz): H-3xC-15; H-15axC-3; H-15bxC-3
Os espectros no IV, de RMN de 1H, de
contornos
COSY,
respectivamente.
HMQC e
13
HMBC de
C, subespectro DEPT-135, mapa de
57
estão
nas
páginas
115-120,
82
4.2.9.2 Dados de caracterização de 3-O-(carboximetil)-β-D-galactopiranosídeo
de 4-metoxicarbonil-2-nitrofenila (62)
HO
O
HO
16
6
5
4
O
3
15
Sólido branco [0,106 g (0,25
OH
2
O1 O
OH
mmol; 76%) a partir de 0,158 g
NO2
7
8
(0,33 mmol) de 61]
9
10
12
11
OCH3
13
14
Substância deliquescente
F.M.: C16H19NO12
M.M.: 417,32 g.mol-1
O
F.F.: 137,2 – 138,6 ºC decompõe
[α] –56 (c 0,5 MeOH)
IV (
máx
/cm-1): 3359 (ν O-H); 1720 (ν C=O); 1617, 1436 (ν C=C); 1534, 1356 (ν
NO2); 1269 (ν C-O da aglicona); 1055 (ν C-O do carboidrato)
RMN de 1H (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 400 MHz): 8,34 (d; 1H; J9,11 2,1 Hz; H-9); 8,14
(dd; 1H; J11,9 2,1 Hz, J11,12 9,1 Hz; H-11); 7,56 (d; 1H; J12,11 9,1 Hz; H-12); 5,19 (d;
1H; J1,2 7,6 Hz; H-1); 3,90-3,80 (m; 6H; J15b,15a 16 Hz; H-4, H-14, H-15a, H-15b);
3,72-3,67 (m; 2H; H-2, H-5); 3,56 (dd; 1H; J6a,5 5,6 Hz, J6a,6b 10,8 Hz; H-6a); 3,50 (dd;
1H; J6b,5 6,4 Hz, J6b,6a 10,8 Hz; H-6b); 3,30 (dd; 1H; J3,2 9,4 Hz, J3,4 2,6 Hz; H-3)
RMN de
13
C (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 100 MHz): 174,60 (C-16); 164,33 (C-13);
152,99 (C-7); 139,63 (C-8); 134,47 (C-11); 125,76 (C-9); 122,82 (C-10); 117,16 (C12); 101,19 (C-1); 82,87 (C-3); 75,70 (C-5); 68,72 (C-15); 68,45 (C-2); 64,46 (C-4);
60,20 (C-6); 52,49 (C-14)
HMBC (DMSO-d6; 400 MHz): H-3xC-15; H-15axC-3; H-15bxC-3
Os espectros no IV, de RMN de 1H, de
contornos
COSY,
respectivamente.
HMQC e
13
HMBC de
C, subespectro DEPT-135, mapa de
62
estão
nas
páginas
145-150,
83
4.2.10 Procedimento de síntese de 59 e 64
HO
N
O
OH
O
X
NaN3, NH4Cl
O
OH
N N
HN
N
HO
OH
O
O
O
OH
OCH3 THF, H O
2
O
OCH3
O
58 X = H
63 X = NO2
59 X = H
64 X = NO2
A um balão de 50 mL foram adicionados a nitrila correspondente, o cloreto de
amônio e a azida de sódio na proporção molar de 1:14:14. Adicionou-se um volume
inicial de 1 mL de uma mistura de THF/H2O 1:1, acoplou-se ao balão um
condensador de refluxo e submeteu-se a mistura à agitação magnética e
aquecimento a 65 ºC em banho de óleo. Uma vez estabelecido equilíbrio térmico
entre o meio reacional e a fonte de aquecimento, adicionaram-se ao balão
quantidades adicionais de THF/H2O 1:1 em incrementos de 0,5 mL até solubilização
completa dos reagentes. O aquecimento, a agitação magnética e o fluxo de água no
condensador foram mantidos durante toda a reação, que foi acompanhada por CCD
(eluente: acetato de etila/metanol 9:1).
Tabela 4 – Quantidades de reagentes e solventes utilizados na síntese de 59 e 64.
Nitrila
NH4Cl
NaN3
THF/H2O
1:1
0,100 g (0,28 mmol) de 58
0,210 g (3,93 mmol)
0,256 g (3,93 mmol)
2 mL
0,150 g (0,38 mmol) de 63
0,280 g (5,23 mmol)
0,340 g (5,23 mmol)
3 mL
Ao longo da reação ocorreu redução do volume de solvente e, naturalmente,
deposição de material insolúvel nas paredes do balão. Nesses momentos, volumes
adicionais de 0,5 mL do mesmo solvente foram adicionados até que houvesse
agitação homogênea de todo conteúdo reacional. Ambas as reações tem duração de
aproximadamente 60 horas.
84
Após consumo do material de partida, foi feita acidificação do meio com HCl 3 mol/L
até pH 1. Em seguida, o balão foi exposto a fluxo de ar comprimido para evaporação
de THF. Ocorreu precipitação de produto que foi filtrado e lavado com
diclorometano.
Na síntese do derivado tetrazólico não nitrado 59, obteve-se um resíduo de 80 mg.
Esse sólido foi recristalizado em DMSO/diclorometano, obtendo-se 57 mg (0,10
mmol) de 59. O rendimento da recristalização e da reação foram 71 e 51%
respectivamente.
Na síntese do derivado tetrazólico nitrado 64, obteve-se um resíduo de 135 mg,
porém contaminado com azida de sódio. Foi feita, então, uma extração exaustiva em
pequena escala. Adicionaram-se a um frasco de penicilina o resíduo obtido, 3 mL de
água e 3 mL de acetato de etila. Tampou-se o frasco com uma tampa de borracha,
agitou-se a mistura vigorosamente e, após separação das fases, retirou-se com uma
pipeta pasteur o maior volume possível de fase orgânica. Adicionou-se volume de
acetato de etila suficiente para completar o volume inicial de 6 mL e repetiu-se o
procedimento extrativo. Ao todo foram feitas 20 extrações e as frações orgânicas
foram reunidas em um balão de 100 mL. O solvente foi removido em evaporador
rotatório, obtendo-se 46 mg (0,10 mmol) de 64. O rendimento da extração e da
reação foram 34 e 28%, respectivamente.
4.2.10.1
Dados
de
caracterização
de
3-O-(5-tetrazolimetil)-β-D-
galactopiranosídeo de 4-metoxicarbonilfenila (59)
Sólido branco [0,057 g (0,10
HN
HO
N N
N
16
OH
6
5
4
O
15
3
2
O1 O
mmol; 51%) a partir de 0,100 g
7
8
OH
(0,28 mmol) de 58]
9
F.M.: C16H20N4O8
10
12
11
OCH3
13 14
O
M.M.: 396,35 g.mol-1
F.F.: 198,1 – 199,8 ºC
[α] –13 (c 0,3 MeOH)
IV (
máx
/cm-1): 3524, 3274 (ν O-H); 1701, 1689 (ν C=O); 1605, 1509, 1438 (ν C=C);
1250 (ν C-O da aglicona); 1115, 1065 (ν C-O do carboidrato)
85
RMN de 1H (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 400 MHz): 7,91 (d; 2H; J9,8; 11,12 8,8 Hz; H-9, H11); 7,13 (d; 2H; J8,9; 12,11 8,8 Hz; H-8, H-12); 5,06 (d; 1H; J15a,15b 13,6 Hz; H-15a);
5,04 (1H; H-1); 5,01 (d; 1H; J15b,15a 13,6 Hz; H-15b); 4,03 (d; 1H; J4,3 3,0 Hz; H-4);
3,82 (s; 3H; H-14); 3,82-3,79 (1H; H-2); 3,65 (m; 1H; H-5); 3,58 (m; 1H; J6a,5 5,6 Hz;
H-6a); 3,53-3,49 (1H; H-6b); 3,51 (dd; 1H; J3,2 9,6 Hz, J3,4 3,0 Hz; H-3)
RMN de 13C (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 100 MHz): 165,80 (C-13); 161,03 (C-7); 154,31
(C-16); 131,07 (C-9, C-11); 123,02 (C-10); 116,06 (C-8, C-12); 100,01 (C-1); 81,96
(C-3); 75,25 (C-5); 69,26 (C-2); 64,64 (C-4); 60,52 (C-15); 60,02 (C-6); 51,89 (C-14)
HMBC (DMSO-d6; 400 MHz): H-3xC-15; H-15axC-3; H-15bxC-3
Os espectros no IV, de RMN de 1H, de
contornos
COSY,
HMQC e
13
C, subespectro DEPT-135, mapa de
HMBC de
59
estão
nas
páginas
127-132,
respectivamente.
4.2.10.2
Dados
de
caracterização
de
3-O-(5-tetrazolilmetil)-β-D-
galactopiranosídeo de 4-metoxicarbonil-2-nitrofenila (64)
Sólido amarelo [0,046 g (0,10
N N
HN
N 16
OH
HO
6
5
4
O
15
3
2
O1
OH
mmol; 28%) a partir de 0,150 g
NO2
O
7
8
(0,38 mmol) de 63]
9
F.M.: C16H19N5O10
10
12
11
OCH3
13 14
O
M.M.: 441,35 g.mol-1
F.F.: 163,9 – 164,9 ºC
[α] –47 (c 0,3 MeOH)
IV (
máx
/cm-1): 3363 (ν O-H); 1727 (ν C=O); 1619, 1439 (ν C=C); 1535, 1348 (ν
NO2); 1269 (ν C-O da aglicona); 1052 (ν C-O do carboidrato)
RMN de 1H (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 400 MHz): 8,36 (d; 1H; J9,11 2,1 Hz; H-9); 8,16
(dd; 1H; J11,9 2,1 Hz, J11,12 8,9 Hz; H-11); 7,58 (d; 1H; J12,11 8,9 Hz; H-12); 7,27 (m;
2H; OH); 5,26 (d; 1H; J1,2 7,6 Hz; H-1); 5,05 (d; 1H; J15a,15b 13,6 Hz; H-15a); 4,99 (d;
1H; J15b,15a 13,6 Hz; H-15b); 4,79 (s; 1H; OH); 4,05 (d; 1H; J4,3 2,8 Hz; H-4); 3,87 (s;
3H; H-14); 3,81 (m; 1H; H-2); 3,72 (m; 1H; H-5); 3,58 (dd; 1H; J6a,5 5,8 Hz, J6a,6b 10,6
Hz; H-6a); 3,54-3,51 (m; 2H; H-6b, H-3)
86
RMN de
13
C (δ/ppm; J/Hz; DMSO-d6; 100 MHz): 164,32 (C-13); 154,46 (C-16);
152,93 (C-7); 139,65 (C-8); 134,52 (C-11); 125,85 (C-9); 122,95 (C-10); 117,17 (C12); 100,51 (C-1); 82,00 (C-3); 75,59 (C-5); 69,03 (C-2); 64,35 (C-4); 60,67 (C-15);
59,91 (C-6); 52,51 (C-14)
HMBC (DMSO-d6; 400 MHz): H-3xC-15; H-15axC-3; H-15bxC-3
Os espectros no IV, de RMN de 1H, de
contornos
COSY,
HMQC e
13
HMBC de
C, subespectro DEPT-135, mapa de
64
estão
nas
páginas
157-162,
respectivamente.
4.3 Ensaios enzimáticos
Utilizou-se
o
método
espectrofluorimétrico
desenvolvido
por
Douglas
e
colaboradores (DOUGLAS et al., 2006) e condições experimentais adaptadas por
Carvalho e colaboradores (CARVALHO et al., 2010b).
Inicialmente foram preparadas soluções dos galactosídeos a 4 mM contendo 5% de
DMSO em volume. O ensaio foi realizado em placas de 96 poços, sendo que em
cada poço foram adicionados 25 µL de tampão fosfato pH 7,4, 25 µL de solução
diluída da enzima recombinante trans-sialidase de Trypanosoma cruzi e 25 µL de
solução 4,0 mM de inibidor. O meio reacional foi incubado por 10 minutos a 25 ºC e,
em seguida, adicionou-se 25 µL de solução de substrato MuNANA a 0,4 mM. Uma
vez que o volume final em cada poço foi 100 µL, a concentração final de amostra e
de substrato foi 1 e 0,1 mM, respectivamente. Os derivados nitrados 62 e 64
também foram ensaiados na concentração de 500 µM, sob as mesmas condições
citadas.
A liberação do fluoróforo ocorreu normalmente no meio reacional sem inibidor (50 µL
de tampão + 25 µL de enzima + 25 µL de MuNANA), o controle negativo. Por outro
lado, no meio reacional contendo o piridoxal fosfato (25 µL de tampão + 25 µL de
enzima + 25 µL de piridoxal fosfato a 4mM + 25 µL de MuNANA), o controle positivo,
a liberação do fluoróforo foi inibida. A fluorescência foi monitorada durante 10
minutos a 25 ºC, com comprimentos de onda de excitação e emissão de 360 e 460
87
nm, respectivamente. Foram realizados 3 três experimentos em dias distintos e
todas as reações foram feitas em triplicata.
Os dados foram analisados no programa Prisma 4.0 e o valor da porcentagem de
inibição enzimática foi calculado empregando-se a equação % I = 100 x [1 – (Vi / V0],
em que Vi é a velocidade da reação na presença de inibidor e V0 é a velocidade da
reação na ausência de inibidor (controle negativo).
88
5 CONCLUSÕES
Neste trabalho foram sintetizados 10 galactosídeos de arila modificados em C-3,
sendo todos inéditos. Uma vez otimizadas as condições experimentais, as reações
de alquilação utilizando óxido de dibutilestanho foram eficientes e seletivas. Esses
achados são compatíveis com os resultados igualmente positivos da literatura.
Conclui-se, assim, que o método de óxido de dibutilestanho também tem
aplicabilidade em reações de alquilação 3-O-seletivas de galactosídeos de arila,
relatadas pioneiramente neste trabalho.
Os rendimentos dessas reações foram de modestos a elevados; somente a síntese
do derivado 55 foi inferior a 50%. A eficiência das reações variou conforme o
eletrófilo utilizado, sendo observada a seguinte ordem de reatividade: bromoacetato
de terc-butila > bromoacetonitrila > iodeto de metila.
O planejamento de galactosídeos de arila inibidores pontenciais de trans-sialidase
de Trypanosoma cruzi logrou pouco êxito, uma vez que os produtos obtidos não
inibiram sensivelmente a enzima. O simples bloqueio da posição 3 dos
galactosídeos 53 e 54 ou mesmo a introdução do grupo ácido carboximetil não
incrementaram a atividade biológica dessas moléculas.
Observou-se, entretanto, que a introdução de um grupo nitro na aglicona hidrofóbica
e a substituição bioisostérica do grupo ácido carboxílico por um grupo tetrazol nos
compostos 57 e 62 são modificações moleculares que aumentam significativamente
a atividade inibitória de TcTS dos galactosídeos de arila e que podem ser exploradas
mais consistentemente.
Têm-se como perspectivas sintetizar e ensaiar novos galactosídeos de arila,
derivados tetrazólicos modificados em diferentes posições do núcleo de D-galactose
e com outras agliconas contendo o grupo nitro. Assim, será possível planejar outro
grupo de moléculas com maior potencial inibitório de TcTS e estabecer relações
estrutura-atividade mais confiáveis.
89
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97
APÊNDICE A – Espectro no infravermelho de 53
96,3
1922
90
85
2915
2960
2882
3580
1373
810
80
3205
1630
830
75
1398
1422
1197
1514
70
3378
728
65
1439
1674
1218
1324
1131
882
951
%T 60
1606
1179
852
6
4
5
HO
50
902
OH
HO
55
1300
3
45
2
O1
OH
O
7
8
9
10
12
1250
OCH3
13 14
11
O
40
697
1057
1085
1031
1023
35
772
28,3
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
9.5
9.0
O1
O
OH
8.5
7
8
12
11
10
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
2.99
1.00
2.03
2.00
14.81
3
2
1.01
1.01
10.0
5
1.99
4
1.00
HO
2.00
HO
2.00
5.260
5.235
4.971
4.933
4.896
4.722
4.694
4.669
4.566
4.543
3.811
3.730
3.713
3.695
3.653
3.628
3.603
3.581
3.567
3.554
3.529
3.502
3.468
3.419
3.179
3.153
7.140
7.096
7.926
7.882
98
APÊNDICE B – Espectro de RMN de 1H de 53 (DMSO-d6; 200 MHz)
6
OH
9
13 14
OCH3
O
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
ppm
99
51.979
60.373
75.669
73.269
70.241
68.148
100.452
116.087
122.922
131.144
161.291
165.937
APÊNDICE C – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 53 (DMSO-d6; 50 MHz)
OH
HO
6
4
O1
5
HO
3
2
O
OH
7
8
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ppm
100
APÊNDICE D – Espectro no infravermelho de 54
98,1
95
90
85
2888
2958
1649
1579
1169
3547
1690
1498
1388
861
851
883 809
912
897
80
3374
75
1332
1361
1436
70
1219
65
60
OH
HO
%T
4
5
3
2
O1
OH
680
NO2
6
HO
55
828
O
7
8
1617
982
1129
1101
935
707
9
1725
10
12
11
50
OCH3
13 14
1532
760
O
45
1275
1063
40
35
1019
30,0
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
101
3.847
3.732
3.707
3.672
3.553
5.313
5.299
5.191
5.154
5.002
4.978
4.790
4.700
4.683
7.565
7.521
8.338
8.328
8.166
8.156
8.122
8.112
APÊNDICE E – Espectro de RMN de 1H de 54 (DMSO-d6; 200 MHz)
OH
HO
NO2
6
4
O1
5
HO
3
2
O
OH
8
7
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
24.03
7.5
2.13
8.0
1.06
1.09
1.02
8.5
1.01
9.0
1.01
9.5
1.00
10.0
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
ppm
102
52.747
60.484
76.101
73.425
70.184
68.183
101.008
117.275
126.054
123.007
134.792
139.744
153.292
164.585
APÊNDICE F – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 54 (DMSO-d6; 50 MHz)
OH
HO
NO2
6
4
O1
5
HO
3
2
OH
O
7
8
9
10
12
OCH3
13 14
11
O
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ppm
103
APÊNDICE G – Espectro no infravermelho de 55
97,5
95
2068
90
2989
2918
2843
2951
2890
85
80
1467
803
1422
1394
75
1586
70
831
1432
3416
1118
1513
699
1604
65
1135
957
928
666
%T
60
OH
HO
55
6
5
4
H3CO
50
15
3
2
1271
1187
O1
O
7
8
OH
11
1238
769
984
754
10
12
45
1713
9
857
OCH3
1020
1099
1072
13 14
O
40
35
1050
30
23,4
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
4.7
4.6
6.5
6.0
4.5
5.5
4.4
4.3
5.0
ppm
4.5
3.80
4.0
3.5
3.0
2.5
3.75
2.0
3.00
4.8
1.01
11
2.99
10
2.99
1.01
3.00
12
1.03
OH
1.03
9.5
8
2.00
2
7
1.00
1.01
2.00
10.0
3
O1 O
1.13
H3CO
6
5
5.66
15
3.604
3.737
3.729
3.714
3.706
3.766
4.266
4.252
4.237
4.519
4.502
4.491
4.474
4.458
4.443
4.430
4.683
4.676
4.810
4.791
4.787
4.767
OH
1.01
1.00
4
2.04
HO
2.00
5.654
5.635
4.810
4.791
4.787
4.767
4.683
4.676
4.519
4.502
4.491
4.474
4.458
4.443
4.430
4.266
4.252
4.237
3.766
3.737
3.729
3.714
3.706
3.604
7.581
7.367
7.345
7.213
8.085
8.063
8.728
104
APÊNDICE H – Espectro de RMN de 1H de 55 (piridina-d5; 400 MHz)
9
13 14
OCH3
O
3.70
3.65
1.5
ppm
1.0
0.5
ppm
105
51.742
57.279
65.825
62.265
70.664
77.485
84.808
102.132
116.574
124.096
131.826
OH
HO
6
5
4
H3CO
15
162.198
166.582
APÊNDICE I – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 55 (piridina-d5; 100 MHz)
3
2
O1 O
7
8
OH
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ppm
106
APÊNDICE J – Mapa de contornos COSY de 55 (piridina-d5; 400 MHz)
ppm
9.0
8.5
8.0
7.5
3.0
3.5
4.0
OH
HO
6
5
4
4.5
H3CO
15
3
2
O1 O
7
8
OH
10
12
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9
11
OCH3
13 14
O
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
ppm
107
APÊNDICE K – Mapa de contornos HMQC de 55 (piridina-d5; 400 MHz)
ppm9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
50
60
70
80
OH
HO
6
5
4
H3CO
15
3
2
O1 O
7
8
OH
10
12
11
90
100
110
120
130
140
150
9
OCH3
13 14
O
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
ppm
108
APÊNDICE L – Mapa de contornos HMBC de 55 (piridina-d5; 400 MHz)
ppm
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
50
6
5
4
H3CO
15
3
2
O1 O
7
8
OH
100
110
120
130
140
150
160
170
5.0
4.5
4.0
3.5
9
10
12
90
5.5
OH
HO
80
6.0
H-3xC-15
60
70
6.5
11
OCH3
13 14
O
H-15xC-3
ppm
109
APÊNDICE M – Espectro no infravermelho de 56
100,3
95
2091
2995
2957
2933
3531
90
3405
85
1583
1461
1421
80
1316
806
75
919
70
%T
HO
O
18
65
17
O
60
16
6
5
4
O
15
1508
OH
3
2
O1
886
1371
O
7
8
9
1605
983
1179
OH
10
12
11
55
1396
1437
672
853
1721
OCH3
656
13 14
1283
O
751
697
50
1143
1012
1116
45
1697
768
40
1245
1062
35
29,7
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
15
9.5
3
9.0
2
8.5
7
8
OH
12
10
11
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
3.9
3.8
4.5
4.0
3.5
1.01
1.03
4.00
1.05
1.01
1.08
0.91
1.00
O1 O
4.0
3.7 ppm
3.45
3.0
2.5
2.0
9.09
O
6
5
4.1
5.16
10.0
O
16
4
4.2
1.00
0.91
1.08
1.01
1.05
4.00
1.03
1.01
17
HO
4.3
0.99
O
OH
2.02
18
2.00
3.4275
3.4197
3.4040
3.3962
3.697
3.683
3.669
3.883
3.867
3.849
3.837
4.065
4.059
4.022
4.005
3.992
3.976
4.165
4.152
4.128
4.122
4.109
4.245
4.288
1.489
5.015
4.995
4.288
4.245
4.165
4.152
4.128
4.122
4.109
4.065
4.059
4.022
4.005
3.992
3.976
3.883
3.867
3.849
3.837
3.697
3.683
3.669
3.428
3.420
3.404
3.396
2.627
7.077
7.055
7.989
7.967
110
APÊNDICE N – Espectro de RMN de 1H de 56 (CDCl3; 400 MHz)
ppm
9
13 14
OCH3
O
1.5
1.0
0.5
ppm
111
18
17
O
16
6
5
4
O
15
28.268
52.175
74.918
69.996
68.139
66.796
62.521
84.058
83.531
100.550
116.295
124.606
131.737
160.854
OH
HO
O
166.887
171.543
APÊNDICE O – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 56 (CDCl3; 100 MHz)
3
2
O1 O
7
8
OH
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ppm
112
APÊNDICE P – Mapa de contornos COSY de 56 (CDCl3; 400 MHz)
ppm
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
1.0
1.5
2.0
2.5
17
3.0
O
16
OH
HO
O
18
6
5
4
O
15
3
2
O1 O
7
8
OH
10
12
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9
11
OCH3
13 14
O
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
ppm
113
APÊNDICE Q – Mapa de contornos HMQC de 56 (CDCl3; 400 MHz)
ppm8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
30
40
50
17
60
O
16
OH
HO
O
18
6
5
4
O
15
3
2
O1 O
7
8
OH
10
12
11
70
80
90
100
110
120
130
9
OCH3
13 14
O
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
ppm
114
APÊNDICE R – Mapa de contornos HMBC de 56 (CDCl3; 400 MHz)
ppm8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
17
O
16
OH
HO
O
18
6
5
4
O
15
3
2
O1 O
7
8
OH
9
H-3xC-15
10
12
11
OCH3
13 14
O
H-15xC-3
2.5
2.0
1.5
ppm
115
APÊNDICE S – Espectro no infravermelho de 57
100,1
95
2893
90
3361
85
922
892
80
1509
1174
75
HO
O
70
%T
65
806
HO
16
4
O
15
3
1706
OH
6
5
2
O1
OH
60
1435
848
1149
O
7
8
9
1605
10
12
11
1285
695
OCH3
13 14
O
1241
1104
769
55
50
45
1065
39,6
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
11
3.8
8.5
8.0
7.5
7.0
3.7
3.6
6.5
6.0
42.22
10
3.5
5.5
3.4
3.3
5.0
4.5
4.09
0.95
1.01
1.16
1.09
2.28
42.22
9.0
12
2.28
OH
1.09
2
8
0.92
9.5
3
7
1.16
15
3.265
3.258
3.241
3.234
3.332
3.716
3.699
3.676
3.656
3.618
3.604
3.588
3.570
3.542
3.513
3.495
3.471
3.771
3.816
O1 O
1.01
O
6
5
0.98
10.0
16
4
OH
0.95
4.09
HO
HO
2.06
O
2.00
4.960
4.941
3.816
3.771
3.716
3.699
3.676
3.656
3.618
3.604
3.588
3.570
3.542
3.513
3.495
3.471
3.332
3.265
3.258
3.241
3.234
7.130
7.108
7.906
7.884
116
APÊNDICE T – Espectro de RMN de 1H de 57 (DMSO-d6; 400 MHz)
9
13 14
OCH3
O
ppm
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
ppm
117
HO
O
HO
16
4
O
15
51.847
69.174
68.516
64.616
60.422
75.341
83.118
100.712
115.978
122.783
131.028
161.167
165.825
174.405
APÊNDICE U – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 57 (DMSO-d6; 100 MHz)
OH
6
5
3
2
O1 O
OH
7
8
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ppm
118
APÊNDICE V – Mapa de contornos COSY de 57 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
3.0
3.5
4.0
HO
4.5
HO
O
16
4
O
15
3
OH
6
5
2
O1 O
OH
7
8
10
12
11
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
9
OCH3
13 14
O
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
ppm
119
APÊNDICE X – Mapa de contornos HMQC de 57 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
50
60
HO
O
70
80
90
100
110
120
130
HO
16
4
O
15
3
OH
6
5
2
O1 O
OH
7
8
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
ppm
120
APÊNDICE Y – Mapa de contornos HMBC de 57 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
50
60
70
HO
80
HO
O
16
4
O
15
3
OH
6
5
2
O1 O
OH
7
8
10
12
11
90
100
110
120
130
140
150
160
170
H-3xC-15
9
OCH3
13 14
O
H-15xC-3
3.0
ppm
121
APÊNDICE W – Espectro no infravermelho de 58
98,7
95
2930
2905
90
3182
1584
3525
1423
85
1514
811
1397
1374
1336
1197
957
833
847
80
N
%T
OH
HO
75
5
O
15
1607
1182
1142
1152
6
4
16
70
703
712
1442
3
2
O1
OH
O
7
8
893
862
9
655
1287
10
12
11
65
989
1015
1108 1028
OCH3
1709
13 14
O
1244
774
60
1069
55
1052
50
47,5
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
9.0
8.5
4.8
8.0
7.5
7.0
6.5
4.7
6.0
4.6
5.5
ppm
5.0
4.00
4.5
ppm
4.0
3.8
3.5
3.0
2.5
3.7
2.0
3.6
1.5
1.0
2.024
10
1.031
11
1.043
12
1.076
8
2.942
7
1.033
OH
O
1.001
O1
1.03
2.94
1.08
1.04
1.03
2.02
6.58
9.5
3
2
1.00
1.02
1.01
1.01
1.00
10.0
15
5
1.009
16
O
1.00
4
1.013
1.023
N
2.01
HO
2.00
3.820
3.782
3.768
3.763
3.758
3.749
3.744
3.739
3.725
3.674
3.658
3.643
3.590
3.575
3.563
3.548
3.534
3.520
3.506
3.490
3.481
3.465
3.458
3.998
3.990
3.985
3.977
4.547
4.609
4.588
4.650
4.745
4.731
4.718
4.847
4.833
5.590
5.576
5.060
5.041
4.847
4.833
4.745
4.731
4.718
4.650
4.609
4.588
4.547
3.998
3.990
3.985
3.977
3.820
3.782
3.768
3.763
3.758
3.749
3.744
3.739
3.725
3.674
3.658
3.643
3.590
3.575
3.563
3.548
3.534
3.520
3.506
3.490
3.481
3.465
3.458
3.330
7.142
7.120
7.924
7.902
122
APÊNDICE Z – Espectro de RMN de 1H de 58 (DMSO-d6; 400 MHz)
OH
6
9
13 14
OCH3
O
3.5
0.5
ppm
ppm
123
5
O
15
54.749
51.877
59.939
64.197
68.937
75.174
81.821
99.995
117.715
116.033
123.021
6
4
16
131.058
OH
HO
N
161.028
165.788
APÊNDICE AA – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 58 (DMSO-d6; 100 MHz)
3
2
O1
O
OH
7
8
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ppm
124
APÊNDICE BB – Mapa de contornos COSY de 58 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
3.0
3.5
HO
4.0
N
4
16
4.5
6
5
O
15
OH
3
2
O1
OH
O
7
8
9
10
12
11
O
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
OCH3
13 14
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
ppm
125
APÊNDICE CC – Mapa de contornos HMQC de 58 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm
8.0
7.5
7.0
6.5
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
HO
N
4
16
6
5
O
15
OH
3
2
O1
OH
O
7
8
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
ppm
126
APÊNDICE DD – Mapa de contornos HMBC de 58 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
50
H-3xC-15
60
HO
70
N
4
16
80
6
5
O
15
OH
3
2
O1
OH
O
7
8
10
12
11
90
100
110
120
130
140
150
160
9
OCH3
13 14
O
H-15xC-3
3.5
ppm
127
APÊNDICE EE – Espectro no infravermelho de 59
98,9
98
96
94
2876
1331
3524
1585
92
946
1561
1391
1193
1181
3274
90
808
1509
964
991
88
1143
1701
86
%T
84
82
N N
HN
N 16
OH
HO
6
5
4
O
15
80
1605
3
2
O1 O
675
882
859
847
902
1438
730
1014
657
1300
1689
7
8
701
9
1250
OH
10
12
11
772
OCH3
1115
13 14
O
78
76
1047
74
72
71,1
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
9.0
8.5
OH
11
10
5.10
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.05
5.5
5.00
5.0
13 14
OCH3
O
4.5
4.0
3.5
4.987
5.030
5.021
5.046
5.080
3.8
3.7
3.0
2.5
3.6
2.0
3.5
1.5
3.343
3.668
3.653
3.637
3.600
3.573
3.559
3.528
3.520
3.512
3.504
3.496
3.486
9
3.819
3.787
ppm
2.32
12
8
1.33
7
1.21
O1 O
4.10
3
2
1.06
4.10
1.21
1.33
2.32
O
6
5
1.06
2.01
4
1.22
9.5
15
OH
2.01
1.06
10.0
HO
2.02
N N
HN
N 16
2.00
5.080
5.046
5.030
5.021
4.987
4.730
4.034
4.027
3.819
3.787
3.668
3.653
3.637
3.600
3.573
3.559
3.528
3.520
3.512
3.504
3.496
3.486
3.343
7.145
7.123
7.923
7.901
128
APÊNDICE FF – Espectro de RMN de 1H de 59 (DMSO-d6; 400 MHz)
3.4
1.0
ppm
0.5
ppm
129
N N
HN
N 16
51.886
64.639
60.516
60.015
69.257
75.245
81.961
100.011
116.055
123.017
131.066
154.313
OH
HO
6
5
4
O
15
161.030
165.801
APÊNDICE GG – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 59 (DMSO-d6; 100 MHz)
3
2
O1 O
7
8
OH
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ppm
130
APÊNDICE HH – Mapa de contornos COSY de 59 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
3.0
3.5
4.0
N N
HN
N 16
OH
HO
6
5
4
O
15
3
2
O1 O
7
OH
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
9
10
12
4.5
8
11
OCH3
13 14
O
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
ppm
131
APÊNDICE II – Mapa de contornos HMQC de 59 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
N N
HN
N 16
OH
HO
6
5
4
O
15
3
2
O1 O
7
8
OH
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
ppm
132
APÊNDICE JJ – Mapa de contornos HMBC de 59 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
50
80
90
100
110
120
130
140
150
160
4.0
3.5
3.0
H-3xC-15
60
70
4.5
N N
HN
N 16
OH
HO
6
5
4
O
15
3
2
O1 O
7
8
OH
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
H-15xC-3
ppm
133
APÊNDICE KK – Espectro no infravermelho de 60
97,1
95
90
2833
2879
2931
85
80
1577
3347
1494
1458
1404
1385
3525
1154
852
811
1191
75
1352
1440
70
OH
HO
%T
65
6
5
4
H3 CO
15
60
837
824
3
2
698
NO2
O1 O
7
8
1619
1135
666
967
9
1700
1537
1296
OH
10
12
OCH3
769
1250
989
13 14
11
1264
O
55
977 912
1106
758
1020
50
1053
45
1075
39,0
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
4.7
4.6
6.0
4.5
5.5
4.4
4.3
5.0
9
13 14
OCH3
O
4.5
4.0
3.5
3.0
4.311
4.297
4.282
4.550
4.533
4.522
4.505
4.446
4.434
4.418
4.405
4.647
4.640
4.837
4.814
4.794
4.928
3.8
3.7
2.5
2.0
3.595
3.736
3.728
3.712
3.704
NO2
3.786
ppm
3.00
4.8
1.02
4.9
2.95
11
1.03
10
1.06
OH
1.01
12
8
2.95
1.02
3.00
9.5
7
1.31
1.03
1.01
1.06
1.03
10.0
3
2
O1 O
1.00
H3 CO
6
5
1.03
1.31
15
OH
1.76
4
0.99
0.71
1.08
HO
0.91
5.806
5.787
4.928
4.837
4.814
4.794
4.647
4.640
4.550
4.533
4.522
4.505
4.446
4.434
4.418
4.405
4.311
4.297
4.282
3.786
3.736
3.728
3.712
3.704
3.595
6.600
6.871
8.729
8.538
8.533
8.086
8.081
8.064
8.059
7.889
7.795
7.773
7.580
7.212
134
APÊNDICE LL – Espectro de RMN de 1H de 60 (piridina-d5; 400 MHz)
3.6 ppm
1.5
1.0
0.5
ppm
135
52.297
57.297
65.738
62.255
70.157
78.096
84.832
102.802
117.670
126.722
122.987
134.920
140.572
OH
HO
6
5
4
H3 CO
15
154.260
164.833
APÊNDICE MM – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 60 (piridina-d5; 100 MHz)
3
2
O1 O
NO2
7
8
9
OH
10
12
11
OCH3
13 14
O
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ppm
136
APÊNDICE NN – Mapa de contornos COSY de 60 (piridina-d5; 400 MHz)
ppm
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
3.5
4.0
OH
HO
4.5
H3 CO
15
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
6
5
4
3
2
O1 O
NO2
7
8
OH
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
ppm
137
APÊNDICE OO – Mapa de contornos HMQC de 60 (piridina-d5; 400 MHz)
ppm
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
50
60
OH
HO
70
H3 CO
15
80
90
100
110
120
130
140
150
6
5
4
3
2
O1 O
NO2
7
8
OH
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
ppm
138
APÊNDICE PP – Mapa de contornos HMBC de 60 (piridina-d5; 400 MHz)
ppm
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
50
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
H-3xC-15
60
70
80
100
110
120
130
140
150
160
6
5
4
H3 CO
15
90
OH
HO
3
2
O1 O
NO2
7
8
OH
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
H-15xC-3
ppm
139
APÊNDICE QQ – Espectro no infravermelho de 61
99,0
95
2989
2958
2883
90
3523
85
1578
1470
1412
80
3391
1197
1394
75
731
899
891
70
1370
1436 1349
65
60
%T 55
50
O
18
17
O
16
OH
HO
6
5
4
O
15
3
2
O1
OH
45
662
1173
691
917
1618
NO2
O
7
8
1296
9
1529
12
11
705
OCH3
13 14
757
1110
O
40
1017
980
1147
1134
1730
10
769
840
824
1718
1259
1243
35
30
25
1059
20
15,8
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
O
15
9.5
6
5
3
9.0
2
O1
NO2
O
OH
7
8.5
12
11
8.0
10
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
3.9
4.5
3.8
4.0
1.15
4.0
1.11
4.1
4.26
1.10
4.2
1.07
2.14
1.07
8
4.3
3.7
3.5
3.6
3.0
2.5
2.0
9.58
4
4.4
1.07
2.14
1.07
1.10
4.26
1.11
1.15
10.0
O
16
OH
1.05
17
HO
1.05
O
1.05
18
1.00
3.480
3.473
3.457
3.449
3.759
3.745
3.732
3.938
3.925
3.914
3.895
3.884
4.215
4.195
4.192
4.175
4.132
4.111
4.104
4.064
4.048
4.034
4.018
4.340
4.383
1.488
5.021
5.002
4.383
4.340
4.215
4.195
4.192
4.175
4.132
4.111
4.104
4.064
4.048
4.034
4.018
3.938
3.925
3.914
3.895
3.884
3.759
3.745
3.732
3.480
3.473
3.457
3.449
7.396
7.374
8.487
8.482
8.207
8.202
8.185
8.180
140
APÊNDICE RR – Espectro de RMN de 1H de 61 (CDCl3; 400 MHz)
ppm
9
13 14
OCH3
O
1.5
1.0
0.5
ppm
141
17
O
16
6
5
4
O
15
28.274
52.829
70.258
68.664
67.158
62.561
75.438
83.254
83.063
102.692
117.982
127.295
125.004
135.521
140.273
153.738
OH
HO
O
18
164.897
171.465
APÊNDICE SS – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 61 (CDCl3; 100 MHz)
3
2
O1
OH
NO2
O
7
8
9
10
12
OCH3
13 14
11
O
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ppm
142
APÊNDICE TT – Mapa de contornos COSY de 61 (CDCl3; 400 MHz)
ppm
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
17
O
16
OH
HO
O
18
6
5
4
O
15
3
2
O1
OH
NO2
O
7
8
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
ppm
143
APÊNDICE UU – Mapa de contornos HMQC de 61 (CDCl3; 400 MHz)
ppm9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
17
O
16
OH
HO
O
18
6
5
4
O
15
3
2
O1
OH
NO2
O
7
8
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
ppm
144
APÊNDICE VV – Mapa de contornos HMBC de 61 (CDCl3; 400 MHz)
ppm
9.0
8.5
8.0
18
O
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
20
30
40
50
60
70
17
O
16
OH
HO
6
5
4
O
15
3
2
O1
OH
NO2
O
7
8
9
10
12
11
OCH3
H-3xC-15
13 14
O
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
H-15xC-3
2.5
2.0
1.5
ppm
145
APÊNDICE XX – Espectro no infravermelho de 62
99,7
95
2900
90
3359
1498
85
1203
911
80
%T
1356
O
75
70
HO
HO
16
4
15
OH
3
2
982
826
NO2
6
5
O
1436
1720
O1 O
7
8
9
1617
697
OH
10
12
11
1534
OCH3
1021
13 14
1118
O
65
60
757
1269
55
1055
51,2
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
10
8.5
11
3.9
8.0
7.5
7.0
3.8
6.5
3.7
3.6
6.0
3.5
3.4
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
0.52
OH
1.14
12
8
3.314
3.308
3.291
3.284
3.724
3.700
3.680
3.665
3.581
3.567
3.554
3.540
3.521
3.505
3.494
3.478
3.802
3.900
3.867
3.842
NO2
0.51
9.0
7
1.22
3
2
O1 O
1.53
7.06
2.91
1.22
1.22
1.14
9.5
5
1.22
15
6
2.91
7.06
O
OH
1.33
10.0
16
4
1.03
HO
HO
1.02
O
1.00
1.187
1.169
1.151
5.197
5.178
4.051
4.033
4.015
3.998
3.900
3.867
3.842
3.802
3.724
3.700
3.680
3.665
3.581
3.567
3.554
3.540
3.521
3.505
3.494
3.478
3.314
3.308
3.291
3.284
2.500
1.982
7.567
7.544
8.346
8.341
8.154
8.149
8.132
8.126
146
APÊNDICE YY – Espectro de RMN de 1H de 62 (DMSO-d6; 400 MHz)
9
13 14
OCH3
O
ppm
1.5
1.0
0.5
ppm
147
HO
O
HO
16
4
15
3
52.492
68.716
68.453
64.463
60.200
59.748
75.701
82.871
101.185
117.161
125.761
122.818
134.470
139.626
152.985
OH
NO2
6
5
O
164.333
174.604
APÊNDICE WW – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 62 (DMSO-d6; 100 MHz)
2
O1 O
7
8
OH
9
10
12
OCH3
13 14
11
O
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ppm
148
APÊNDICE ZZ – Mapa de contornos COSY de 62 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
3.0
3.5
4.0
HO
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
HO
O
16
4
3
NO2
6
5
O
15
OH
2
O1 O
7
8
OH
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
ppm
149
APÊNDICE AAA – Mapa de contornos HMQC de 62 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
50
55
60
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
HO
O
65
HO
16
4
3
NO2
6
5
O
15
OH
2
O1 O
7
8
OH
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
ppm
150
APÊNDICE BBB – Mapa de contornos HMBC de 62 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
ppm
50
60
80
HO
O
70
HO
16
4
3
NO2
6
5
O
15
OH
2
O1 O
7
OH
100
110
120
130
140
150
160
170
180
9
10
12
90
8
11
H-3xC-15
OCH3
13 14
O
H-15xC-3
151
APÊNDICE CCC – Espectro no infravermelho de 63
98,5
95
1577
1497
3096 2934
2876
90
3527
3482
1199
1397
3236
1164
1650
881
933
910
901
991
858
828
967
85
80
1300
N
%T
70
OH
HO
75
6
5
4
16
O
15
1443
3
2
1618
NO2
O1 O
7
8
1137
10
12
773
762
1330
1025
OCH3
13
11
1535
14
712
O
65
691
1344
9
1696
OH
1253
1114
1083
1273
60
55
1053
50,8
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
3
9.5
2
9.0
NO2
7
12
8
OH
11
10
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
2.05
3.7
1.01
4.00 ppm
1.01
ppm
1.06
1.01
1.12
1.01
1.02
4.6
1.01
3.00
1.06
1.01
1.01
2.05
10.96
15
O1 O
4.7
1.03
1.02
1.01
1.12
10.0
O
6
5
4.8
1.00
16
OH
1.03
4.9
1.01
4
1.00
N
1.00
HO
0.93
3.786
3.772
3.767
3.763
3.753
3.749
3.743
3.725
3.709
3.580
3.567
3.553
3.538
3.534
3.519
3.505
3.493
3.485
3.478
3.469
3.462
4.012
4.004
4.000
3.992
4.545
4.609
4.586
4.649
4.774
4.760
4.746
4.945
4.932
5.643
5.629
5.290
5.271
4.945
4.932
4.774
4.760
4.746
4.649
4.609
4.586
4.545
4.012
4.004
4.000
3.992
3.874
3.786
3.772
3.767
3.763
3.753
3.749
3.743
3.725
3.709
3.595
3.580
3.567
3.553
3.538
3.534
3.519
3.505
3.493
3.485
3.478
3.469
3.462
3.329
7.580
7.558
8.367
8.362
8.182
8.177
8.160
8.155
152
APÊNDICE DDD – Espectro de RMN de 1H de 63 (DMSO-d6; 400 MHz)
3.6
3.5 ppm
9
13 14
OCH3
O
1.0
0.5
ppm
153
6
5
4
16
O
15
54.729
52.509
63.995
59.851
68.676
75.509
81.788
100.413
125.872
122.979
117.671
117.068
134.508
139.635
OH
HO
N
152.905
164.306
APÊNDICE EEE – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 63 (DMSO-d6; 100 MHz)
3
2
O1 O
NO2
7
8
OH
9
10
12
OCH3
13 14
11
O
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ppm
154
APÊNDICE FFF – Mapa de contornos COSY de 63 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
3.0
3.5
4.0
OH
HO
N
6
5
4
16
O
15
3
2
O1 O
NO2
7
OH
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9
10
12
4.5
8
11
OCH3
13 14
O
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
ppm
155
APÊNDICE GGG – Mapa de contornos HMQC de 63 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
OH
HO
N
6
5
4
16
O
15
3
2
O1 O
NO2
7
8
OH
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
ppm
156
APÊNDICE HHH – Mapa de contornos HMBC de 63 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
50
H-3xC-15
60
70
N
90
100
110
120
130
140
150
160
170
6
5
4
16
80
OH
HO
O
15
3
2
O1 O
NO2
7
8
OH
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
H-15xC-3
3.5
ppm
157
APÊNDICE III – Espectro no infravermelho de 64
98,3
95
3363
2945
1578 1497
1197
90
854
85
1439
975
1619
80
%T
75
883
907 826
896
777
1348
N N
HN
N 16
OH
HO
6
5
4
O
15
70
3
2
O1
OH
705
766
NO2
O
7
8
1727
9
758
10
12
11
1316
1294
1535
OCH3
1118
13 14
O
1269
65
1093
1068
60
1052
55
52,2
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
cm-1
1600
1400
1200
1000
800
650,0
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
5.05
6.0
5.00
5.5
ppm
5.0
4.5
4.0
4.0
3.5
3.0
3.9
2.5
3.8
2.0
3.7
1.5
1.0
2.56
5.10
1.46
11
1.30
10
1.40
12
2.90
NO2
8
1.08
OH
7
1.08
2.90
1.40
1.30
1.46
2.56
9.5
3
O
1.07
15
2
O1
1.00
1.00
1.07
0.96
1.00
O
6
5
1.87
4
0.96
10.0
HO
0.92
N N
HN
N 16
0.92
3.603
3.588
3.576
3.562
3.535
3.529
3.519
3.512
3.492
3.735
3.719
3.704
3.872
3.836
3.825
3.801
3.782
4.053
4.046
4.969
5.003
5.038
5.072
5.274
5.255
5.072
5.038
5.003
4.969
4.790
4.053
4.046
3.872
3.836
3.825
3.801
3.782
3.735
3.719
3.704
3.603
3.588
3.576
3.562
3.535
3.529
3.519
3.512
3.492
7.266
7.592
7.570
8.367
8.362
8.178
8.172
8.155
8.150
158
APÊNDICE JJJ – Espectro de RMN de 1H de 64 (DMSO-d6; 400 MHz)
OH
9
13 14
OCH3
O
3.6
ppm
0.5
ppm
159
N N
HN
N 16
52.507
69.026
64.346
60.668
59.910
75.586
82.003
100.505
117.172
125.850
122.953
134.521
139.646
OH
HO
6
5
4
O
15
154.460
152.934
164.318
APÊNDICE KKK – Espectro de RMN de 13C e Subespectro DEPT-135 de 64 (DMSO-d6; 100 MHz)
3
2
O1
NO2
O
OH
8
7
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
ppm
160
APÊNDICE LLL – Mapa de contornos COSY de 64 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
N N
HN
N 16
OH
HO
6
5
4
O
15
3
2
O1
OH
NO2
O
8
7
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
ppm
161
APÊNDICE MMM – Mapa de contornos HMQC de 64 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
N N
HN
N 16
OH
HO
6
5
4
O
15
3
2
O1
OH
NO2
O
8
7
9
10
12
11
OCH3
13 14
O
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
ppm
162
APÊNDICE NNN – Mapa de contornos HMBC de 64 (DMSO-d6; 400 MHz)
ppm9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
50
60
70
80
N N
HN
N 16
OH
HO
6
5
4
O
15
3
2
O1
OH
NO2
O
8
7
10
12
11
90
100
110
120
130
140
150
160
H-3xC-15
9
OCH3
13 14
O
H-15xC-3
ppm