CURSO NACIONAL DE ATUALIZACAO EM
PNEUMOLOGIA
19 A 21 DE ABRIL DE 2007
SÃO PAULO - SP
TUBERCULOSE
NA ERA PÓS
GENÔMICA
AFRANIO LINEU KRITSKI
Programa Acadêmico de Tuberculose
Faculdade de Medicina da UFRJ
Tendência da incidência de TB em nível mundial
1990–2004
100
50
Incidence per 100,000
150
0
1990
Year
1995
2000
2005
WHO Report 2006. Global tuberculosis control. WHO/HTM/TB/2006.362
Prevalência de Infecção pelo HIV entre casos de
TB em nível mundial
HIV prevalence in TB
cases, 15-49 years (%)
0-4
5 - 19
20 - 49
50 or more
No estimate
The boundaries and names shown and the designations used on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the
legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries.
Dotted lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement.
 WHO 2005. All rights reserved
Taxas de TBMR entre os casos novos de TB
< 3%
3–6%
> 6%
No estimate
TB – multirresistente primária
The boundaries and names shown and the designations used on this map do not imply the expression of any opinion
whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or
area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. Dotted lines on maps represent
approximate border lines for which there may not yet be full agreement.  WHO 2006. All rights reserved
Tuberculose multirresistente  TB-MDR
Definição: cepas resistentes a rifampicina e a isoniazida.
Emergiram na década de 80-90 nos EUA e Europa.
No inquérito de 1996 no Brasil  TB-MDR primária 1%
excluiu os soropositivos e
população de risco.
Estudo global entre 1996-1999 (58 regiões)  > 3% dos casos novos.
“hot spots” Estônia (14,1%) China (10,8%)
Letônia (9%) Ivanovo Oblast (9,0%)
Iran(5%) Moçambique(3,5%)
India(3,4%)
Estudo global entre 1999-2002 (77 países)  Europa Oriental e Ásia Central
com 14% dos casos novos.
79% dos casos são resistentes a pelo menos 3 fármacos
OMS,2004
Tuberculose multirresistente  TB-MDR (continuação).
O RISCO PARA TB-MDR
- usuários de drogas intravenosas (OR 4,68)
- desabrigados (OR 2,55)
-viver em clínica de repouso (OR 2,05)
Estudo em 4 países
da União Européia.
- tuberculose anterior (OR2,03)
- prisões (OR 2,02)
Casal et al.,2005
- ser contato de paciente com TBMDR (OR 2,01)
- imunossupressão sem HIV (OR 1,96)
- AIDS (OR 1,96)
- trabalhador na área de saúde (OR 1,77)
OR: odds ratio (razão de chance)
Taxa de notificação de TB em grandes áreas
Metropolitanas América Latina - 2004
Área
Metropolitana
TB/HIV
Taxa de incidência
TB-MDR
/100,000
País Metropi
País
Bnos. Aires
27
Não há vigilância
Sistemática
Río de J.
Cidade
45,2 114,3
8%
11.2%
42,6%
São Paulo
45,2 59,7
8%
19,5%
17,1%
42,5
Lima e Callao 108, 192,3
Montevideo
(1997)
18,8
26,3
Metrop
Não há vigilância
Sistemática
Não vigilância
Sistemática
País
Metrop
??
70%
??
85%
ND
OPAS - 2004
Técnicas moleculares e suas contribuições
no controle da TB
1. Filogenia (SNPs, RDs, etc)
2. Determinar distribuição geográfica de cepas (Spoligotyping, etc).
3. Estudo da dinâmica de transmissão (RFLP, MIRU?)
(Investigação de surtos, desvendar cadeia de transmissão, conhecer a
transmissão populações específicas, identificar fatores e grupos de risco)
4. Diferenciar reinfecção exógena de reativação/infecção policlonal
(RFLP, DR-PCR)
5. Detectar contaminação laboratorial (RFLP, DR-PCR)
6. Detectar precocemente a TB por técnicas Amplificação Ácidos
Nucléicos (i.e.: PCR)
7. Monitorar transmissão de cepas multirresistentes (Innolipa,
GenotypeMTBDR)
Elementos/Eventos genéticos identificados em
M.tuberculosis - bases das ferramentas moleculares.
Seqüências repetitivas DRs - Spoligotyping
 “Single –nucleotide polymorphisms” SNPs
 Regiões de Deleção (RDs)
 Seqüências de inserção - RFLP-IS6110
 Elementos
repetitivos de regiões intergênicas-MIRU-VNTR
A importância de estudos populacionais de genotipagem
e caracterização integral dos genomas.
“Single –nucleotide polymorphisms” SNPs
polimorfismo de base única no gene katG códon 463
(Leu463Arg) e no códon 95 (Thr95Ser) do gene gyrA

três grupos genéticos principais (PGG)
Grupo 1 katG códon 463 CTG (Leu) e gyrA códon 95 ACC (Thr)
 Ancestrais
Grupo 2 katG códon 463 CGG (Arg) e gyrA códon 95 ACC (Thr) )
 LAM
Sreevatsan et al,1997
 Grupo 3 katG códon 463 CGG (Arg) e gyrA
códon 95 AGC (Thr)
Visão evolucionária proposta por Sreevatsan, 1997.
A contribuição da conhecimento das deleções no
genoma de M.tuberculosis
Seqüênciamento de M.tuberculosis e M.bovis comparação genômica
Identificação de regiões de deleção/inserção
Ex: 10 regiões deletadas (RD1-RD10) em M.bovisPasteur estão presentes na cepa H37Rv
 dentre 7 regiões de deleções (RD4-RD3) em
M.bovis verificou-se que RD1-RD3 são
específicas
 as regiões RD9 são exclusivas de M.africanum
Esquema evolucionário proposto por Brosh et al, 2002
 Estirpes
modernas
M.tb evoluiu em paralelo ao M.bovis
Grupo 1
Grupo 2
Grupo3
ESTUDOS DA DINÃMICA DA TRANSMISSÃO DE TB
Método padrão ouro de genotipagem RFLP – IS6110 (cepas cluster)
“Mycobacterial Interspead Repetitive Units”
MIRU-VNTR:
Amplificação por PCR de elementos repetitivos dispersos
em regiões intergênicas .
Repetições possuem 40 a 100pb e variam em número de
repetições e comprimento(VNTRs).
12 loci e 15 loci.
Manualmente seguida por gel de eletroforese ou automatizado.
Técnica mais fácil de realizar que o RFLP.
Mas ainda não é considerada padrão ouro para análise de cluster no
contexto clínico-epidemiológico
O método de genotipagem pelo MIRU-VNTR:
Posição dos 41 MIRU-VNTR no cromossomo do M. tuberculosis H37Rv. O primeiro número
indica a posição de cada lócus ocupado por um MIRU-VNTR. A letra c indica orientação
contraria a estabelecida por Cole et al, em 1998. Algarismos romanos indicam o tipo de
MIRU (I, II ou III). Os números seguintes indicam a localização de cada loci. A esfera em
preto indica os 12 loci com número variável de MIRU-VNTR.
Uso de técnicas moleculares para confirmar reinfecção com
nova cepa Mtb, mesmo em países em desenvolvimento
Reinfecção exógena de
pacientes HIV. Tipagem por
DRE-PCR e RFLP
Lourenço et al. 2000 no Brasil e Warren R, 2005 na Africa do Sul
Países desenvolvidos – Década de
1990
Fatores de risco para agrupamento
genotípico (“cluster”) – INFECÇÃO RECENTE
•
•
•
•
•
Atendimento anterior em Hospital sem biossegurança
Institucionalização prévia (prisão)
HIV e estágio
Idade
Drogadição
• Resistência
• Doença cavitária
Small et al, 1994; Tabet et al., 1994; Shafer et al., 1995; Ferrazoli et al., 2000
Diaz et al., 2001; Mc Conkey et al., 2002; Tudó et al., 2001; Barnes et al., 1997;
French et al., 1998; Lockman et al., 2000
Estudos de epidemiologia molecular - Novo Milênio
“Spoligotyping”
RFLP
Alguns genótipos de Mtb:
• se disseminam com maior rapidez
• são mais virulentas
• mais associadas com falências e recidivas
Daley CL. Clin Chest Med 26 (2005) 217 – 231
Bjune G, Clin Exp Immunol. 2006 Sep;145(3):389-97
Estudos que avaliaram distribuição de cepas
W/Beijing
Na América Latina, não há dados
a respeito dos resultados do
tratamento anti-TB; associaçao
com fatores genotipicos das
Foi descrito associação
cepas M. tb; frequência de
de surtos MDR em
mutações dos genes de
hospitais e prisões
resistência
Relevância:
• Identificar marcadores geneticos associados a
resistencia a drogas, doença, falência
tratamento= desenvolvimento novos testes de
identificação simples e rápidos
“Spoligotyping”
A. Estrutura das DR no

genoma das micobactérias
B. Amplificação das DR
por PCR

C. Padrões de hibridização
spoligo-tipos

Kamerbeek et al, 1997
“Spacer oligonucleotide typing” Spoligotyping
Baseado
no locus “direct-repear” DRcópia única com 10 a 50
repetições de DR com 36pb separadas por seqüências
espaçadoras 37 a 41 pb (PCR + Hibridização reversa)
 Principais famílias/sub-famílias do Complexo M. tuberculosis:
• East African and Indian”-5 sub-famílias
• Haarlem – 3 sub-famílias
• Middle Eastern Asian -2 sub-famílias
• ”T”, “S”, “X”
• Latin America and Mediterranean” (LAM) - 10 sub-famílias
• Beijing (sub-tipo antigo e moderno)
Distribuiçao de genótipo Beijing de
tuberculose - 2005 Mutator gene
mut, ogt
>29,000
pacientes
de 35
países
Blue: stable, no drug resistance; Red: increasing, associated with drug
resistance; Green: increasing, drug sensitive; Yellow: absent; Striped: trend
and/or drug resistance not known
Relação entre TB resistente e Wgenótipo Beijing em ArchangelRussia - 2005
80%
60%
40%
20%
0%
W-Beijing
non-Beijing
W-Beijing
community
E
non-Beijing
prison
H
R
S
Drobniewski F, JAMA 2005; 293 (22): 2726-2731
.
Virulência de M. tuberculosis em
camundongo BALB/c
8 genotype strains (2001)
17 genotype strains (2002)
Em camundongo infectado com
cepa Beijing:
• maior mortalidade
• maior n. de bacilos no pulmão
• menor produção de TNF + IFN
• menor proteção de vacinação
com BCG
Rad M.E. EID 2003; 9:838-845
Lopez B. Clin Exp Immunol 2003; 133:30-7.
Cepas resistentes a Isoniazida mais virulentas
Análise molecular - Holanda
Transmissibilidade de cepa de
M. tuberculosis resistente
Estudo populacional
• Holanda, 1993 - 2002
• 8334 pacientes, 59% estrangeiros
• todos os isolados: TSA, IS6110 RFLP
• determinação de katG315 de cepas INH resist
592 (7,1%) INH resistente
323 (54,6%) katG315 mutante
269 (45,4%) katG315 tipo selvagem
Van Doorn HR, Clin Microbiol Infect 2006. 12 (8): 769-75
Relação entre perfil katG315 com a
ocorrência de agrupamento (cluster)
entre cepas Mtb resistentes a INH
Cluster
INHs
Sim
Não
3922
3818
Odds ratio Ref
(95% CI)
INHr
INHr
315wild 315mutant
112
157
163
160
0.69
0.99
(0.54-0.89)
(0.79-1.25)
Van Doorn HR, Clin Microbiol Infect 2006. 12 (8): 769-75
The population structure of Mycobacterium
tuberculosis in different geographic areas
Beijing
genotype
LAM;
Haarlem
LAM;
Beijing
Haarlem
Projects using spoligotyping
Phylogeny
Spol DB3 (Institut Pasteur, Guadeloupe; Filliol et al. JCM 2003)
(SpolDB4; Brudney et al. 2006)
– 12.000 strains (+/- 150 Brazilian) (39.000)
– > 90 countries (140)
– population genetics, biogeographic distribution and
phylogeny of Mtb Complex
– Rio: 400 patients
•
•
•
•
•
>50% LAM
7% Haarlem
10% new LAM
Only 2 Beijing
Finetuning with MIRU-VNTR
MDR TB epidemic in Argentina:
rise, decline, aftermaths
MDR TB outbreaks arose in
the early ´90s
in two overpolutated cities
Rosario
 AIDS association
Buenos
Aires
 Hospital setting
 Explosive transmission
 Rapid progression to disease
Population
Country:
36,000,000
Buenos Aires: 11,000,000
Rosario:
1,100,000
 Fatal outcome
MDR TB outbreak
Hospital Muñiz, Buenos Aires, 1991-2000
No. of cases
No. of cases
Initial M D R
M D R T B - A ID S
neg
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
91
92
93
TB MR-SIDA
94
95
96
97
98
99
2000
TB MR inicial-HIV neg
T B - HIV
Profile of outbreak MDR TB strains
Strain
City
M
Number of cases in
SubLineage
katG
315
1995
2005
Buenos Aires
150
51
Haarlem 2
mut
Ra
Rosario
15
12
LAM3
mut
Rb
Rosario
8
6
T1 (Tuscany)
wild
C
Buenos Aires
15
1
T5
wild
Análise molecular demonstra a epidemia por TB-MDR de
cepas Mtb tipo Haarlem 2 na Argentina
Papel de outros genótipos de
M.tuberculosis em países em
desenvolvimento ?
• Genótipo Beijing infrequente na America Latina (<5%)
• Escassos dados sobre surtos de TB, resistência as
drogas analisados com ferramentas moleculares
• Genótipo Haarlem também apresenta mutator gene e
pode estar associado com maior virulência e/ou
desenvolvimento de resistência
• Sympatric - allopatric
Interações
diferentes
do bacilo com
hospedeiro
Homem ??
Diagnóstico da Tuberculose
Método
Vantagens
Desvantagens
simples
rápido, custo
sensibilidade baixa
(40% a 70%)
todas as TB
sensível, específico
demorado
trabalhoso
igual a cultura
mais rápido
custo
equipamento
Tuberculina
custo baixo
inespecífico
Radiológico
rápido
inespecífico
Amplificar
ácido
nucléico
Rápido, elevada
sensibilidade e
especificidade
amostra respirat
Custo
equipamento
Baciloscopia
Cultura
BACTEC
n
Nucleic Acid Amplification Trials
Assay
Author
Gen Probe Abe
Miller
Pfyffer
O'Sullivan
Roche
D’Amato
Wobeser
Carpentier
Moore
Bergman
Ichyama
BD
Ichyama
Pfyffer
n
135
594
515
555
985
1480
2073
1009
956
530
530
799
Sens/Spec Smear + Sens Smear - Sens
92/100
91/99
94/98
91/99
67/100
79/99
86/98
83/99
79/100
89/100
95/99.8
98/96.5
100
100
100
100
95
98
95
99
98
77
73
83
75
55
53
74
66
43
100
92
Métodos Diagnósticos
Amplificação de Ácidos Nucleicos (AAN)
Kits commerciais
 E-MTD assay (Gen Probe Inc)
aprovado pelo FDA: baar (-) (+)
 AMPLICOR MTB kit (Roche )*
 LC x Probe System (Abbot)*
 Strand Displacement Amplification*
* aprovados pelo FDA para
escarro baar (+)
LCx® Mycobacterium tuberculosis Assay
Validados APENAS para:
1. amostras respiratórias
2. pacientes adultos,
3. HIV soronegativos,
4. não tratados para TB
Cobas Amplicor™ Mtb Test
Métodos de detecção da resistência
Métodos
Genotípicos
Métodos
Fenotípicos
DNA Heteroduplex
Proporções (Canetti et al1963) 
SSCP(Single Strand Conformation
Polymorphism)
Automatizados Bactec
460-TB, MGIT 960
Line Probe Assay (INNO-Lipa Rif TB)**
LRP - Luciferase Report Phage
Teste Hain p/ INH e RIF **
E-test
Sequenciamento de DNA
MIC (MABA,MTT, etc.)
* Padrão ouro; ** Comercializados na Europa
Molecular MDR screening with line probe
Comparison GenoType® MTBDR and INNO-LiPA Rif.TB
GenoType® MTBDR
INNO-LiPA Rif.TB
Hain Lifescience
Innogenetics
M. tub detection
Yes
yes
Detection of RMP Resistance of M. tub Complex
Yes
yes
Detection Isoniazid Resistance of M. tub Complex
Yes
no
Strip Assay
Yes
yes
DNA-Basis: PCR
Yes
yes
Culture requested
Yes
yes
Direct assay
No
yes (modified version
M. tub-Komplex Detection: 23S-rRNA/16S-rRNA
Yes
yes
RMP-Resistance: rpoB gene
Yes
yes
INH-Resistance: katG gene
Yes
no
Universalcontrol
Yes
no
rpoB unicontrol
Yes
no
kat G unicontrol
yes
no
Company
Prioridades para pesquisa e investimento
em Tuberculose – 2006
OMS, UNICEF, Banco Mundial, Universidades de
Harvard e da Zâmbia
Fonte: Lancet 367:940-42; march 2006
Melhorar o diagnóstico: otimizar os
métodos
existentes e implementar novos sob modelo de
custo-efetividade
 Desenvolvimento de novos fármacos
e regimes
terapêuticos
 Remodelar estratégias de tratamento
 Pesquisa social e agenda global: reduzir o risco e
a vulnerabilidade
 Capacitar unidades para ensaios clínicos
Nosso paciente com TB
nao conta com novas
tecnologias,
como
outras pacientes com
• Hepatite B, C
• HIV
• Doenças Cardíacas
• Doenças Renais
PORQUE??
Cidade do Rio de Janeiro
Obrigado
OBRIGADO PELA ATENÇÃO
[email protected]