Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul
Unidade Universit€ria de Dourados
Programa de P•s-Gradua‚ƒo em Recursos Naturais
AVALIA„…O DE METODOLOGIAS PARA ESTUDOS DA
ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA
COM
LIGANTES
ORG†NICOS E SEUS RESPECTIVOS COMPLEXOS
MET‡LICOS
Dourados – MS
Mar•o – 2013
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul
Unidade Universit€ria de Dourados
Programa de P•s-Gradua‚ƒo em Recursos Naturais
AVALIA„…O DE METODOLOGIAS PARA ESTUDOS DA
ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA
COM
LIGANTES
ORG†NICOS E SEUS RESPECTIVOS COMPLEXOS
MET‡LICOS
Acad‚mico: Antonio Fernandes dos Santos
Orientador: Prof. Dr. Ademir dos Anjos
Disserta•ƒo apresentada ao Programa de
P„s-gradua•ƒo em Recursos Naturais, …rea
de concentra•ƒo em Recursos Naturais, da
Universidade Estadual de Mato Grosso do
Sul, como parte das exig‚ncias para a
obten•ƒo do t†tulo de Mestre em Recursos
Naturais.
Dourados – MS
Mar•o – 2013
S233a Santos, Antonio Fernandes dos
Avalia•ƒo de metodologias para estudos da atividade
antimicrobiana com ligantes org‡nicos e seus respectivos
complexos met…licos / Antonio Fernandes dos Santos.
Dourados, MS: UEMS, 2013.
80p. ; 30cm.
Disserta•ƒo (Mestrado) – Recursos Naturais – Universidade
Estadual de Mato Grosso do Sul, 2013.
Orientador: Prof. Dr Ademir dos Anjos
1.Complexos met…licos 2. Atividade antimicrobiana
3. Avalia•ƒo de metodologias I. T†tulo.
CDD 20.ed. 660.62
EPˆGRAFE
Bem-aventurado o homem que acha sabedoria,
e o homem que adquire conhecimento
(Provˆrbios 3:13)
iii
Dedico este trabalho a minha amada esposa Andr€ia Aparecida e minha querida filha
Julia Gabrielly.
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, a Deus por me dar sa•de e confian‚a para a realiza‚ƒo deste
trabalho;
Aos meus pais, Severino Antonio dos Santos (In Memoriam) e Celina Machado
Fernandes de Amorim, por todo amor, dedica‚ƒo e paci„ncia comigo por toda minha vida;
A minha esposa Andr€ia Aparecida, pelo apoio e paci„ncia durante toda a
pesquisa;
Ao meu orientador, Prof. Dr. Ademir dos Anjos, pela dedica‚ƒo, confian‚a e
paci„ncia, prestadas a mim durante toda a pesquisa;
Aos Professores Dr. M…rcio Barreto Rodrigues e Dra. Margarath Batistote por
terem aceitado o convite para fazer a avalia‚ƒo desse trabalho;
Ao Programa de P†s-Gradua‚ƒo em Recursos Naturais e a Universidade Estadual
de Mato Grosso do Sul, Unidades Universit…rias de Dourados e Navira‡, pela
oportunidade de estudo;
A todos os colegas, funcion…rios e professores do Programa de Mestrado em
Recursos Naturais/UEMS e UEMS/Unidade Universit…ria de Navira‡, que diretamente ou
indiretamente constribuiram para a realiza‚ƒo deste trabalho.
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Classifica•ƒo dos compostos fen„licos..................................................
26
Tabela 2
Ilustra as cepas bacterianas utilizadas na avalia•ƒo de atividade
antimicrobiana........................................................................................
43
Tabela 3
Ilustra os discos antimicrobianos utilizados na avalia•ƒo de atividade
antimicrobiana........................................................................................
44
Tabela 4
Tabela de solubilidade dos compostos...................................................
56
Tabela 5
Resultados da Concentra•ƒo Inibit„ria M†nima (CIM) e Concentra•ƒo
61
Bactericida M†nima (CBM) em μg/mL dos compostos.........................
Di‡metro do halo de inibi•ƒo, mˆdia e desvio padrƒo (mm), pela a•ƒo
do flavon„ide Quercetina dilu†do em diferentes solventes....................
63
Tabela 7
Di‡metro do halo de inibi•ƒo, mˆdia e desvio padrƒo (mm), pela a•ƒo
da quercetina dilu†da em metanol e complexo met…lico 1.....................
63
Tabela 8
Di‡metro do halo de inibi•ƒo, mˆdia e desvio padrƒo (mm), pela a•ƒo
antimicrobiana do Ligante Sintˆtico e complexo met…lico 2.................
64
Tabela 6
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Morfologia de uma celular procari„tica............................................
05
Figura 2
Diferentes formatos das cˆlulas bacterianas.....................................
06
Figura 3
Fases do crescimento bacteriano.......................................................
08
Figura 4
Estrutura b…sica da parede celular de bactˆrias gram-positivas.......
09
Figura 5
Estrutura b…sica da parede celular de bactˆrias gram-negativas.......
09
Figura 6
Etapas do mˆtodo de colora•ƒo gram................................................ 10
Figura 7
Ilustra fotomicrografias da cepa E. faecalis utilizada neste
11
trabalho..............................................................................................
Figura 8
Ilustra fotomicrografias da cepa S. aureus utilizada neste
12
trabalho..............................................................................................
Figura 9
Ilustra fotomicrografias da cepa E. coli utilizada neste
13
trabalho..............................................................................................
Figura 10
Ilustra fotomicrografias da cepa P. fluorescens utilizada neste
14
trabalho..............................................................................................
Figura 11 Mecanismos de resist‚ncia a antibi„ticos.......................................... 25
Figura 12
Estrutura b…sica dos flavon„ides, dois anˆis fenil (A e B) ligados
29
atravˆs de um anel pirano (C)............................................................
Figura 13 Estruturas b…sicas de algumas classes de flavon„ides....................... 29
Figura 14 Estrutura qu†mica do flavon„ide Quercetina..................................... 37
Figura 15 Estrutura tridimensional da cisplatina...............................................
39
Figura 16 Ilustra a metodologia utilizada para determina•ƒo da CIM..............
48
Figura 17 Ilustra a metodologia utilizada para determina•ƒo da CBM.............
49
Figura 18 Ilustra etapas do teste de sensibilidade a antimicrobiano.................. 52
Figura 19 Ilustra a forma de medi•ƒo dos halos de inibi•ƒo.............................
53
Figura 20 Ilustra a estrutura qu†mica proposta para o complexo 1.................... 55
Figura 21
A estrutura qu†mica proposta para: a) o ligante sintˆtico H2bbppd
57
e b) o complexo met…lico 2, respectivamente...................................
vii
Figura 22
Ilustra diagramas em caixa dos resultados do teste de sensibilidade
62
a antimicrobiano utilizando diferentes compostos..........................
Figura 23 Ilustra resultados do teste de sensibilidade a antimicrobiano............
65
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
a.C.
Antes de cristo
ANVISA
Ag‚ncia Nacional de Vigil‡ncia Sanit…ria
ATCC
American Type Culture Collection
BaSO4
Sulfato de B…rio
CBM
Concentra•ƒo Bactericida M†nima
CHN
An…lise elementar de Carbono, Hidrog‚nio e Nitrog‚nio
CIM
Concentra•ƒo Initib„ria M†nima
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
Cu(CH3 COO)2 .H2 O Acetato CŠprico ou de Cobre II (aquoso)
DMSO
Dimetilsulf„xido
DNA
‹cido Desoxirribonucleico
H2bbppd
Ligante sintˆtico N,NŒ,N,NŒ-bis[2-hidroxi-3,5-di-terc-butilbenzil)
(2-piridilmetil)]-1-3-diaminopropano
KClO4
Perclorato de Pot…ssio
LB
Caldo Luria-Bertrani
mL
Mililitro
NaCl
Cloreto de S„dio (Sal de Cozinha)
P.A.
ParA an…lise
QEtOH
Quercetina dilu†da em Etanol
ix
QMeOH
Quercetina dilu†da em Metanol
ROS
Espˆces reativas de oxig‚nio
TSA
Teste de sensibilidade a antimicrobiano (TSA)
UFC/mL
Unidades formadoras de col•nia por mililitro
UV-Vis
Ultravioleta-vis†vel (comprimento de onda)
‰g
Micrograma
x
RESUMO
O surgimento de bactˆrias resistentes reduz a efic…cia de terapias antimicrobianas com
antibi„ticos de amplo espectro de a•ƒo, o que implica no uso de antibi„ticos altamente
seletivos, de custo mais elevado e em alguns casos podem ser mais t„xicos ao paciente. O
presente trabalho buscou avaliar metodologias e realizar bioensaios de atividade
antimicrobiana com complexos met…licos e seus ligantes livres (nƒo coordenados) frente a
bactˆrias padronizadas Gram-positivas e Gram-negativas, utilizando normas para teste de
suscetibilidade e estudos de avalia•ƒo de atividade antimicrobiana de extratos vegetais.
Foram avaliadas metodologias para determina•ƒo da Concentra•ƒo Inibit„ria M†nima e
Concentra•ƒo Bactericida M†nima pelo mˆtodo de macrodilui•ƒo em tubo e plaqueamento,
repectivamente, e Teste de Sensibilidade a Antimicrobiano pelo mˆtodo de disco-difusƒo,
utilizando o complexo met…lico 1 - sintetizado a partir de quercetina com †ons Ga(III), e o
complexo met…lico 2 - produzido a partir do ligante sintˆtico H2bbppd com †ons Cu(II) e
respectivos ligantes org‡nicos. Sƒo metodologias de baixo custo capazes de determinar a
CIM e CBM, e realizar o TSA de complexos met…licos, com boa efici‚ncia e
reprodutividade de execu•ƒo. Os dados produzidos nos bioensaios foram quantitativos e/ou
qualitativos, relacionados Ž suscetibilidade das cepas bacterianas aos compostos testados.
Os resultados dos bioensaios revelaram atividade antimicrobiana nos complexos met…licos
1 e 2 superior a de seus ligantes. Os valores de CIM obtidos para estes complexos
demonstram potencial para o uso farmacol„gico, e que os qualificam para estudos
posteriores sobre o mecanismo de inibi•ƒo do crescimento e toxicidade visando avaliar o
potencial de aplica•ƒo terap‚utica destes compostos como futuros f…rmacos.
Palavras-chave:
metodologias.
Atividade
antibacteriana,
Complexo
met…lico,
Avalia•ƒo
de
xi
ABSTRACT
The emergence of resistant bacteria reduces the effectiveness of antimicrobial therapy with
broad-spectrum antibiotic action, which involves the use of antibiotics highly selective,
higher cost and in some cases may be more toxic to the patient. This study aimed to
evaluate methodologies and perform bioassays with antimicrobial metal complexes and
their free ligands (uncoordinated) standardized against bacteria Gram-positive and Gramnegative bacteria, using standards for susceptibility testing and evaluation studies of
antimicrobial activity of plant extracts. Methodologies were evaluated to determine the
minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration by the method
of macrodilution tube and plating, respectively, and Antimicrobial Susceptibility Testing
by the disk diffusion method, using the metal complex 1 - synthesized from quercetin ions
Ga (III) metal complex and 2 - produced from synthetic binder H2bbppd with Cu (II) and
their organic ligands. Methodologies are inexpensive able to determine the MIC and MBC,
and realize the TSA metal complex, with good reproducibility and efficiency of execution.
The data generated in Bioassays were quantitative and / or qualitative, related to
susceptibility of the bacterial strains to the compounds tested. The results of bioassays
showed antimicrobial activity in the metal complexes 1 and 2 above their ligands. The
MIC values obtained for these complexes show potential for pharmacological use, and that
qualify for further studies on the mechanism of growth inhibition and toxicity to evaluate
the potential therapeutic applications of these compounds as future drugs.
Keywords: Antibacterial activity, complex metallic, Evaluation methodologies.
xii
SUM‡RIO
1 INTRODU••O..........................................................................................................................1
2 OBJETIVOS...............................................................................................................................3
2.1 Objetivo Geral......................................................................................................................3
2.2 Objetivos Espec†ficos ...........................................................................................................3
3 REVIS•O DA LITERATURA ...................................................................................................4
3.1 MICRO-ORGANISMOS .....................................................................................................4
a) Conceito.............................................................................................................................4
b) Bactˆrias ............................................................................................................................4
c) Crescimento bacteriano ......................................................................................................7
3.2 BACT‘RIAS SELECIONADAS .........................................................................................8
a) Mˆtodo de colora•ƒo Gram.................................................................................................8
b) BACT‘RIAS GRAM-POSITIVAS ..................................................................................10
b.1) Enterococcus faecalis....................................................................................................10
b.2 Staphylococcus aureus....................................................................................................11
c) BACT‘RIAS GRAM-NEGATIVAS................................................................................13
c.1) Escherichia coli.............................................................................................................13
c.2) Pseudomonas fluorescens ..............................................................................................14
3.4 M‘TODOS PARA AVALIA••O DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ......................16
a) Bioensaios de difusƒo .......................................................................................................17
b) Bioensaios de dilui•ƒo......................................................................................................17
b) Bioensaios em meio de cultura .........................................................................................18
3.5 ANTIBI’TICOS................................................................................................................18
3.5.1 Mecanismos de a•ƒo dos antibi„ticos ...........................................................................20
3.5.2 Antibi„ticos de uso cl†nico...........................................................................................21
3.5.3 Resist‚ncia a antibi„ticos .............................................................................................24
3.6 POLIFEN’IS.....................................................................................................................26
3.6.1 Flavon„ides .................................................................................................................27
3.6.2 Efeitos Biol„gicos dos Flavon„ides..............................................................................29
a) Atividade antioxidante......................................................................................................30
b) A•ƒo antitumoral..............................................................................................................31
c) Atividade antiinflamat„ria ................................................................................................32
d) Atividade hormonal..........................................................................................................33
e) Atividade antiviral............................................................................................................34
f) Atividade antimicrobiana ..................................................................................................34
g) Toxicidade dos flavon„ides ..............................................................................................36
3.6.3 Quercetina ...................................................................................................................37
3.7 COMPLEXOS MET‹LICOS DE INTERESSE BIOL’GICO ...........................................38
3.7.1 G…lio ...........................................................................................................................40
3.7.2 Cobre ..........................................................................................................................41
4 MATERIAIS E M‘TODOS......................................................................................................43
4.1 MATERIAIS......................................................................................................................43
4.1.1 Reagentes e solventes ..................................................................................................43
4.1.2 Materiais utilizados......................................................................................................43
4.1.3 Equipamentos utilizados ..............................................................................................44
4.2 M‘TODOS ........................................................................................................................45
4.2.1 Metodologias utilizadas nos bioensaios ........................................................................45
4.2.2 Determina•ƒo da Concentra•ƒo Inibit„ria M†nima (CIM).............................................45
4.2.3 Determina•ƒo da Concentra•ƒo Bactericida M†nima (CBM) ........................................48
4.2.4 Teste de sensibilidade a antimicrobiano (TSA).............................................................49
4.2.5 An…lise Estat†stica .......................................................................................................52
4.2.6 Padrƒo de turbidez do in„culo ......................................................................................53
4.3 S“NTESES DOS COMPOSTOS QU“MICOS.....................................................................54
4.3.1 Complexo Met…lico 1: Quercetina e †ons de Ga(III) .....................................................54
4.3.2 Ligante Sintˆtico H2bbppd ..........................................................................................55
4.3.3 Complexo Met…lico 2: H2bbppd e †ons Cu(II)..............................................................55
5. RESULTADOS E DISCUSS”ES ............................................................................................57
5.1 CARACTERIZA••O........................................................................................................57
a) Complexo 1: Quercetina e †ons Ga(III) .............................................................................57
b) Ligante H2bbppd e Complexo 2 [H2bbppd e †ons Cu(II)].................................................57
5.2 BIOENSAIOS....................................................................................................................57
5.2.1 Concentra•ƒo Inibit„ria M†nima e Concentra•ƒo Bactericida M†nima...........................57
5.2.2 Teste de Sensibilidade a Antimicrobiano......................................................................60
6 CONCLUS•O..........................................................................................................................66
7 PERSPECTIVAS FUTURAS ...................................................................................................67
8 REFER•NCIAS........................................................................................................................68
1 INTRODU„…O
Os antibi„ticos sƒo subst‡ncias que possuem a capacidade de inibir o crescimento
microbiano, pois interferem na biologia dos micro-organismos, causando a destrui•ƒo do
seu corpo celular, alterando seu metabolismo ou inibindo a reprodu•ƒo, o que auxilia o
sistema imunol„gico a combater as infec•–es.
Anualmente, milh–es de pessoas morrem em decorr‚ncia de infec•–es causadas por
micro-organismos patog‚nicos resistentes aos antibi„ticos atuais. Ao mesmo tempo,
grupos de pesquisas buscam produzir novos compostos capazes de combater estes microorganismos.
O aparecimento de bactˆrias resistentes reduz a efic…cia de terapias antimicrobianas
e causam o aumento de custos de tratamento de infec•–es, com o uso de antibi„ticos com
alta seletividida, que ainda podem ser mais t„xicos ao paciente. As bactˆrias que causam
mortes por infec•ƒo hospitalar sƒo exemplos de micro-organismos que se tornaram
resistentes a antibi„ticos.
Estudos cient†ficos t‚m revelado melhoria nas atividades biol„gicas de ligantes
org‡nicos ap„s a coordena•ƒo com †ons met…licos, inclusive aumento da a•ƒo
antimicrobiana frente a diversos microrganismos.
Na busca de novos antimicrobianos que sejam eficazes no tratamento de infec•–es
causadas por bactˆrias resistentes, deve-se considerar basicamente a descoberta de novos
alvos e a potencializa•ƒo da atividade de compostos com atividade antimicrobiana
conhecida.
Desse modo, a coordena•ƒo de †ons met…licos a ligantes org‡nicos, que j…
apresentam atividade antimicrobiana quando puros, pode favorecer a produ•ƒo de novos
f…rmacos com mecanismo de a•ƒo desconhecidos por bactˆrias patog‚nicas e apresentando
potencial para infec•–es causadas por estes micro-organismos.
A atividade antimicrobiana pode ser avaliada por bioensaios utilizando microorganismos de interesse cl†nico, sƒo estudos iniciais para a investiga•ƒo de novos agentes
antimicrobianos.
Este trabalho de pesquisa buscou avaliar metodologias e realizar bioensaios de
atividade antimicrobiana com complexos met…licos e seus ligantes livres (nƒo
coordenados) frente a bactˆrias padronizadas Gram-positivas e Gram-negativas, utilizando
normas para teste de suscetibilidade e estudos de avalia•ƒo de atividade antimicrobiana de
extratos vegetais.
Os resultados dos bioensaios demonstraram efici‚ncia das metodologias
desenvolvidas para avalia•ƒo antimicrobiana, com reprodutividade do mˆtodo. Sendo
produzidos dados quantitativos e/ou qualitativos relacionados Ž suscetibilidade das cepas
bacterianas padronizadas aos compostos avaliados.
Ap„s a avalia•ƒo das metodologias foram realizados bioensaios com os complexos
met…licos e seus ligantes livres (nƒo coordenados). Os resultados dos bioensaios
demonstraram aumento significativo da atividade antimicrobiana dos ligantes org‡nicos
ap„s a coordena•ƒo com †ons met…licos.
2
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar metodologias e realizar bioensaios de avalia•ƒo da atividade antimicrobiana
de complexos met…licos contendo †ons Ga(III) e Cu(II) e seus ligantes, frente Ž cepas
bacterianas padronizadas.
2.2 Objetivos EspecŠficos
Avaliar metodologia para determinar a Concentra•ƒo Inibit„ria M†nima (CIM) por
macrodilui•ƒo em tubos de complexos met…licos contendo †ons Ga(III) e Cu(II) e seus
ligantes, frente a cepas de bactˆrias padronizadas.
Estudar a aplica•ƒo da metolodologia para estimar a Concentra•ƒo Bactericida
M†nima (CBM) de complexos met…licos contendo †ons Ga(III) e Cu(II) e seus ligantes,
frente a cepas de bactˆrias padronizadas.
Adaptar metodologia para a realiza•ƒo de Teste de Sensibilidade a Antimicrobiano
(TSA) com complexos met…licos contendo †ons Ga(III) e Cu(II) e seus ligantes, frente a
cepas de bactˆrias padronizadas.
Realizar bioensaios para avaliar a suscetibilidade de cepas bacterianas padronizadas
a complexos met…licos contendo †ons Ga(III) e Cu(II) e seus ligantes, utilizando as
metodologias citadas anteriormente.
3
3 REVIS…O DA LITERATURA
3.1 MICRO-ORGANISMOS
a) Conceito
O termo “micro-organismos” engloba seres vivos filogeneticamente distintos,
incluindo organismos procariontes, arqueobactˆrias (Archaea) e as bactˆrias, bem como
eucariontes, as algas microsc„picas (cianof†ceas), fungos filamentosos, leveduras e os
protozo…rios (TORTORA et al., 2010).
Os micro-organismos sƒo encontrados em abund‡ncia na natureza, formando
grandes popula•–es compostas de diversas espˆcies, apresentam tamanho microsc„pico e
podem ser encontrado isoladamente ou formando agrupamentos conhecidos como col•nias
(KAR, 2008).
A microbiologia ˆ uma …rea especializada da biologia que lida com as formas de
vida pequenas que nƒo podem ser observados sem ferramentas de amplia•ƒo (TALARO &
CHESS, 2012).
b) Bact‹rias
As
bactˆrias (do grego bakterion,
"bastƒo")
sƒo
organismos
unicelulares
procariontes. Os procariontes (do Grego pro, "antes", e karyon, "am‚ndoa" ou "nŠcleo")
sƒo micro-organismos que apresentam um nŠcleo primitivo com morfologia muito mais
simples do que as cˆlulas eucari„ticas, e que nƒo possuem uma verdadeira membrana
separando as organelas celulares do nŠcleo, o envolt„rio nŠclear (TRIVEDI et al., 2010).
As bactˆrias em forma de bastonete (bacilo) possuem dimens–es aproximdas de 1
μm de largura por 3 μm de comprimento, embora existam bacilos mais curtos e bactˆrias
em forma de filamentos (espirilos) mais longas. Esses micro-organismos se reproduzem de
forma assexuada por fissƒo bin…ria (cissiparidade). Muitos organismos procariotas sƒo
similares na morfologia, porˆm, apresentam uma grande quantidade de varia•–es
fisiol„gicas relacionadas a diferen•as genˆticas e ecol„gicas (ENGELKIRK & DUBENENGELKIRK, 2011).
4
Figura 1. Morfologia de uma celular procari•tica. Fonte: adaptado de Engelkirk & DubenEngelkirk (2011) p. 29.
As bactˆrias sƒo comumente encontradas em duas formas b…sicas: a) Cocos
(coccus) sƒo cˆlulas de aproximadamente esfˆricas, como cˆlulas individuais, ou
associadas a arranjos caracter†sticos frequentemente Šteis para a identifica•ƒo de bactˆrias;
b) Diplococos (diplococcus) surgem da divisƒo dos cocos e uniƒo aos pares atˆ formar
longas cadeias de cocos, este padrƒo ˆ visto no g‚nero Streptococcus, Enterococcus, e
Lactococcus. Nos indiv†duos do g‚nero Micrococcus ocorre divisƒo em dois planos
simˆtricos se formam grupos quadrados de quatro cˆlulas chamados tˆtrades. A divisƒo em
tr‚s planos simˆtricos produz pacotes cŠbicos de oito cˆlulas, como observado no G‚nero
Sarcina (WYLLEY et al., 2008)
As bactˆrias tambˆm podem ser encontradas em formato de haste conhecida como
bacilo (lactobacilos). Os bacilos diferem consideravelmente na sua rela•ƒo comprimentolargura dos cocos, com exce•ƒo dos cocobacilos que podem ser tƒo curtos e largos que se
assemelham cocos. Outros formatos bacterianos comuns sƒo o vibriƒo que se assemelha a
uma v†rgula, e o espirilo que se parece com um espiral, a qual geralmente possui tufos de
flagelos em uma ou ambas as extremidades da cˆlula, ou espiroquetas, que sƒomais
flex†veis e tem um Šnico arranjo flagelar interno (BENSON & BROWN, 2001).
5
Figura 2. Diferentes formatos das c‹lulas bacterianas. Fonte: adaptado de Talaro & Talaro
(2003) p. 105.
A ampla gama de produtos que utilizam bactˆrias no seu ciclo produtivo afeta a
sociedade humana de v…rias maneiras, alˆm do que as atividades ecol„gicas desenvolvidas
por estes micro-organismos sƒo de enorme import‡ncia a regula•ƒo do ecossistema
(ENGELKIRK & DUBEN-ENGELKIRK, 2011).
As bactˆrias t‚m import‡ncia ecol„gica na manuten•ƒo equil†brio do meio ambiente
atravˆs da reciclagem de elementos qu†micos, tais como o carbono e nitrog‚nio entre o
solo, os organismos, e a atmosfera, utilizadas em aplica•–es comerciais e industriais para
produzir alimentos, produtos qu†micos e drogas (tais como antibi„ticos) e tratamento de
esgoto, controle de pragas, e limpar poluentes (TORTORA et al., 2010).
6
c) Crescimento bacteriano
Os fatores necess…rios para o crescimento microbiano podem ser divididos em duas
categorias principais: f†sicos e qu†micos. Os fatores f†sicos incluem temperatura, pH,
pressƒo osm„tica, pressƒo baromˆtrica, a pressƒo atmosfˆrica e sua composi•ƒo. Os fatores
qu†micos necess…rios incluem fontes de carbono, nitrog‚nio, enxofre, f„storo,
oligoementos, oxig‚nio e fatos org‡nicos de crescimento (TORTORA et al., 2010). Se os
cientistas desejam promover ou inibir o crescimento de micro-organismos, deve primeiro
compreender essas necessidades fundamentais (ENGELKIRK & DUBEN-ENGELKIRK,
2011).
O dom†nio destes fatores promove o controle do crescimento de microorganismos
em laborat„rios, indŠstrias, hospitais e demais ambientes urbanos.
A maioria das bactˆrias se reproduz por fissƒo bin…ria transversal, o termo bin…rio
significa que uma celula d… origem a duas, e transversal se refere Ž divisƒo em planos na
largura da cˆlula bacteriana. Durante a fissƒo bin…ria, a cˆlula-mƒe aumenta, duplica seu
cromossomo e forma um septo centro-transversal que divide a cˆlula em duas. Este
processo ˆ repetido em intervalos por cada cˆlula-filha, e com estas sucessivas divis–es h…
o aumento de popula•ƒo bacteriana (TALARO & CHESS, 2012).
O crescimento bacteriano pode ser medido atravˆs de uma curva de crescimento
(Figura 3). Essa curva apresenta quatro fases distintas: a) Fase Lag: ou fase de lat‚ncia,
ocorre logo ap„s o micro-organismo ser distribu†do em meio de cultura, e normalmente
nƒo existe aumento imediato no nŠmero de cˆlulas; b) Fase Log: ou fase fase exponencial,
os cˆlulas bacterianas alcan•am a taxa de divisƒo m…xima na fase de crescimento
exponencial (logar†tmico). Esta fase continuar… de acordo com o potencial genˆtico do
organismo, e contanto que cˆlulas disponham de nutrientes adequados e que o ambiente
seja favor…vel. Neste per†odo a curva de crescimento aumenta geometricamente; c) Fase
Estacion…ria: num sistema fechado, eventualmente, o crescimento da popula•ƒo cessa e a
curva de crescimento se torna horizontal; d) Fase de Decl†nio ou morte: nessa etapa as
mudan•as ambientais se tornam prejudiciais a cˆlulas bacterianas, que por priva•ƒo de
nutrientes e acŠmulo de res†duos t„xicos sofrem danos irrepar…veis resultando em perda de
viabilidade e morte celular (KAR, 2008; TALARO & CHESS, 2012).
7
Figura 3 - Fases do crescimento bacteriano. Fonte: Pr„prio autor.
3.2 BACTŒRIAS SELECIONADAS
a) M‹todo de colora‚ƒo Gram
Em 1884, os estudos de colora•ƒo desenvolvidos pelo mˆdico dinamarqu‚s Hans
Christian Joachim Gram possibilitaram a divisƒo das bactˆrias em dois grandes grupos,
com base nos resultados da colora•ƒo (FREITAS & PICOLI, 2007).
Pela colora•ƒo Gram as bactˆrias gram-positivas sƒo coradas em pŠrpura,
enquanto bactˆrias gram-negativas foram coloridas de rosa ou vermelha. Essa diferen•a se
deve ao fato que a parede celular de bactˆrias gram-positivas serem constitu†das por uma
Šnica camada de peptidoglicano com aproximadamente 20-80 nm de espessura (Figura 3),
enquanto nas bactˆrias gram-negativa a parede celular ˆ bastante complexa, possui uma
fina camada de peptidoglicano 2-7 nm (Figura 5), que ˆ recoberta por uma camada de 7-8
nm de espessura de membrana externa (FREITAS & PICOLI, 2007).
Devido a esta diferen•a estrutural durante a metodologia de colora•ƒo de Gram as
bactˆrias gram-negativas eliminam o primeiro corante e sƒo coradas pelo segundo,
enquanto as bactˆrias gram-positivas se comportam de forma distinta, ret‚m o primeiro
corante e nƒo absorvem o segundo.
8
Essa diferen•a estrutural tambˆm interfere fisiologicamente no corpo celular,
podendo existir diferentes respostas biol„gicas das cepas bacterianas quanto sƒo expostas a
uma mesma subst‡ncia. Assim sendo, um mesmo antibi„tico com amplo espectro de
atividade, pode apresentar a•ƒo bactericida frente a uma cepa bacteriana gram-negativa e
bacteriost…tica contra uma cepa gram-positiva.
Estudo cl†nico de pacientes em tratamento de listeriose humana comprovou que a
Penicilina e Ampicilina, dois anti„ticos beta-lact‡micos reconhecidos por a•ƒo bactericida
contra cepas gram-positivas e gram-negativas, apresentou a•ƒo bacteriost…tica frente a
isolados cl†nicos de Listeria spp, uma bactˆria gram-positiva (NOJIMOTO et al., 1994).
Figura 4. Estrutura b€sica da parede celular de bact‹rias gram-positivas. Fonte: adaptado
de Willey et al. (2008) p.57.
Figura 5. Estrutura b€sica da parede celular de bact‹rias gram-negativas. Fonte: adaptado
de Willey et al. (2008) p.59.
9
Figura 6. Etapas do m‹todo de colora‚ƒo gram. Fonte: Pr„prio autor.
b) BACTŒRIAS GRAM-POSITIVAS
b.1) Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis sƒo bactˆrias gram-positivas que apresentam o corpo celular
em formato estˆrico (cocos), podem ser encontradas isoladamente, em pares ou o mais
cadeias mais. Essa anaer„bia facultativa, possuindo a capacidade de crescer na presen•a ou
na aus‚ncia de oxig‚nio, apresenta um metabolismo fermentativo e motilidade, e sƒo
hospedeiros comuns do intestino grosso dos seres humanos (DALE & PARK, 2004).
Os Enterococcus podem metabolizar uma variedade de fontes de energia, incluindo
hidratos de carbono, glicerol, lactato, malato, citrato, arginina, agmatina, e muitos ceto…cidos, sobrevivem em ambientes muito severos, incluindo pH alcalino extrema e as
concentra•–es de sal, sƒo resistentes a sais biliares, a detergentes, metais pesados, etanol,
azidas, desseca•ƒo, a temperaturas no intervalo de 10 a 45™C, e a 60™ C durante 30 minutos
(PARADELLA, 2007).
10
A
B
Figura 7. Ilustra fotomicrografias da cepa E. faecalis utilizada neste trabalho.
Fonte: Pr„prio autor.
A espˆcie Enterococcus faecalis ˆ listada como a primeira das tr‚s principais causas
de infec•–es hospitalares. A maioria destas infec•–es ocorre ap„s uma cirurgia abdominal
ou perfura•–es com trauma, mas pode tambˆm estar ligado ao reuso cateteres intravenosos,
os quais deveriam ser considerados potenciais contaminantes. A E. faecalis tambˆm
respons…vel ˆ por infec•–es do trato urin…rio, bacteriemia, endocardite, meningite, e podem
ser encontrados em infec•–es de feridas, juntamente com muitas outras bactˆrias
(WILLEY, 2008).
E. faecalis est… entre as bactˆrias mais resistentes aos antibi„ticos conhecidos. Ele
contˆm muitas resist‚ncias a antibi„ticos naturais, juntamente com v…rias imunidades
adquiridas transferidos em R-plasm†deos entre bactˆrias prom†scuas. Mais de 25% do
genoma de E. faecalis ˆ exogenamente adquiridos, conduzindo a sua resist‚ncia aos
antibi„ticos e o mais forte em certos casos todos os antibi„ticos. O E. faecalis tambˆm ˆ
considerado portador da resist‚ncia Ž vancomicina de outros g‚neros de bactˆrias,
ocorrendo frequentemente em infec•–es hospitalares secund…rias, o torna essas cepas um
problema de saŠde pŠblica. (STUART, 2006).
b.2 Staphylococcus aureus
O Staphylococcus aureus ˆ um coco gram-positivo que ocorre isoladamente ou em
agregados irregulares, sƒo encontrados em cerca de 40% de pessoas saud…veis, nas narinas,
sobre a pele, axilas e per†neo alimentar (SCHELIN, 2011).
O S. aureus sobrevive a ambientes severos com grande varia•ƒo de pH,
temperatura, e concentra•ƒo de cloreto de s„dio (NaCl) em …gua. Essa robustez permite
11
que o micro-organismo se desenvolva em v…rios tipos de alimentos, produzindo
enterotoxinas que podem causar intoxica•ƒo alimentar (SCHELIN, 2011).
A
B
Figura 8. Ilustra fotomicrografias da cepa S. aureus utilizada neste trabalho.
Fonte: Pr„prio autor.
A hist„ria da suscetibilidade de S. aureus ˆ uma li•ƒo na hist„ria de quimioterapia
antimicrobiana. Inicialmente, os S. aureus eram sens†veis Ž penicilina, mas cepas que
produziram β-lactamase logo predominaram, assim a meticilina e agentes relacionados
(e.g. flucloxacilina) foram introduzidos e substituiram a penicilina (GILLESPIE &
BAMFORD, 2012).
Posteriormente, surgiram Staphylococcus aureus resistentes a metilina (MRSA),
sendo necess…rio o uso de antibi„ticos do grupo dos glicopept†deos, tais como vancomicina
ou teicoplanina, Finalmente, surgiram cepas de S. aureus com resist‚ncia intermedi…ria
(heteroresist‚ncia) ou total resist‚ncia a glicopept†deos (GRSA), que atualmente sƒo o
grande problema no tratamento cl†nicos de doen•as causadas por esta bacteria
(SOTOZONO, 2013).
Isolados cl†nicos de S. aureus sƒo comumente encontrados em trabalhos de
avalia•ƒo de atividade antimicrobiana por sua import‡ncia como causadora de infec•–es
hospitalares e por possuir grande resist‚ncia aos antibi„ticos de uso cl†nico.
Na busca de novos antimicrobianos que sejam eficazes no tratamento de infec•–es
causadas por bactˆrias multi-resistentes, deve-se considerar basicamente a descoberta de
novos alvos e a potencializa•ƒo da atividade de compostos com atividade antimicrobiana
conhecida (MASUNARI & TAVARES, 2006; SCHAECHTER et al., 2002)
12
c) BACTŒRIAS GRAM-NEGATIVAS
c.1) Escherichia coli
A bactˆria Escherichia coli est… presente no trato intestinal de seres humanos e
animais, ˆ libertado para o ambiente atravˆs de material fecal e por isso ˆ usado como um
indicador de contamina•ƒo fecal (SAHOO et al., 2012).
A E. coli possui um reservat„rio de genes de resist‚ncia a antibi„ticos, que permite
a evolu•ƒo de isolados cl†nicos em formas resistentes aos medicamentos convencionais
(TORTORA et al., 2010). O uso indiscriminado de antibi„ticos tambˆm ˆ um dos fatores
que contribui para esta resist‚ncia.
A
B
Figura 9. Ilustra fotomicrografias da cepa Escherichia coli utilizada neste trabalho.
Fonte: Pr„prio autor.
No ambiente natural, as bactˆrias resistentes ou que possuam genes de resist‚ncia,
de origem animal ou ambiental, podem ser transferidas para o ser humano (TRAMUTA et
al., 2010, CANAL, 2010).
A E. coli ˆ uma bactˆria nƒo-patog‚nica comensal que comp–em a flora normal de
humanos e diversos animais. No entanto, v…rios trabalhos citam a espˆcie como causadora
de infec•–es do sistema gastrointestinal (PITOUT, 2012; BERT•O & SARIDAKI, 2007;
TRAMUTA et al., 2010).
As bactˆrias da espˆcie E. coli podem causar infec•–es do trato urin…rio (ITU),
infec•–es entˆricas e infec•–es sist‚micas em humanos. As infec•–es sist‚micas incluem
bacteremia, pneumonia nosocomial, colecistite, colangite, peritonite, celulite, osteomielite,
13
artrite infecciosa, sendo a principal causadora da meningite neonatal (PITOUT, 2012;
SAHOO et al., 2012).
c.2) Pseudomonas fluorescens
As Pseudomonas fluorescens sƒo bactˆrias aer„bias obrigat„rias, Gram-negativas,
de oxidase positiva, com corpo celular em formato de haste com locomo•ƒo por flagelos,
que habitam o solo, as plantas, e as superf†cies de …gua, e crescimento „timo a
temperaturas entre 25-30 graus Celsius (SILBY et al., 2009).
A bactˆria Pseudomonas fluorescens ˆ a espˆcie fisiologicamente diversa das
bactˆrias oportunistas (gama-proteobactˆrias), ˆ abundante nas superf†cies das ra†zes das
plantas e das folhas, contribuindo grandemente para o acŠmulo de matˆria org‡nica, e
afetando positivamente a nutri•ƒo e saŠde das plantas (YODER & KISAALITA, 2011).
A
B
Figura 10. Ilustra fotomicrografias da cepa P. fluorescens utilizada neste trabalho.
Fonte: Pr„prio autor.
Os mecanismos envolvidos na rela•ƒo simbi„tica da P. fluorescens com as plantas
ainda nƒo foram amplamente estudado, porˆm se conhece a produ•ƒo de horm•nios de
crescimento, fixa•ƒo de Nitrog‚nio, a supressƒo de agentes patog‚nicos (principalmente
fungos e oomicetos) prejudiciais a saŠde das plantas, via competi•ƒo e/ou efeitos
alelop…tico (SPERANDIO et al., 2012). De contrapartida as plantas fornecem nutrientes e
abrigo a estes micro-organismos.
Devido Ž import‡ncia significativa da Pseudomonas fluorescens na agricultura, o
sequenciamento do genoma de duas linhagens j… foi conclu†do. E, estirpes puras de P.
fluorescens estƒo dispon†veis em institutos de investiga•ƒo, os quais sƒo mantidos sob
condi•–es controladas para o interesse de estudos cient†ficos. A aplica•ƒo futura de P.
14
fluorescens ˆ empreg…-la para uso de controle biol„gico, com o objetivo de reduzir a
pulveriza•ƒo de produtos qu†micos de controle baseados em pragas (GERSHMAN et al.,
2008).
Um dos subprodutos das cˆlulas vegetais ˆ o oxig‚nio ativo, tais como super„xidos
que sƒo t„xicos para os micr„bios. A bactˆria P. fluorescens possui a enzima super„xido
dismutase que converte super„xido em per„xido de hidrog‚nio e oxig‚ncio, o que
contribue para a toler‡ncia Pseudomonas fluorescens ao estresse oxidativo (SPERANDIO
et al., 2012).
Apesar de sua natureza comensal a Pseudomonas fluorescens pode apresentar
fatores de virul‚ncia, e em alguns casos ser pat„gena de vegetais. Em Pseudomonas
fluroescens Pf-5, nƒo patog‚nicas, enzimas que degradam as paredes celulares de plantas e
seus componentes, tais como a celulase e pectinase nƒo estƒo presentes. No entanto, sƒo
capazes de quebrar alguns hidratos de carbono de origem vegetal, …cidos graxos, e „leos e
podem hidrolisar as prote†nas que causam a deteriora•ƒo de leite, carne e peixe (SILBY et
al., 2009).
A Pseudomonas fluorescens possui em sua nomenclatura a "fluorescens" devido Ž
capacidade de secretar o pyoverdin, um pigmento solŠvel em …gua de cor verde
fluorescente, que reage na presen•a de †on de Ferro (Fe2+ e Fe3+). Esse mecanismo resposta
pode ser utilizado como um biosensor de †ons de Ferro em analitos e para a identifica•ƒo
bacteriana de indiv†duos do g‚nero Pseudomonas (ONGENA et al., 2001; FERN‹NDEZ
et al., 2003; YODER & KISAALITA, 2011).
A Pseudomonas fluorescens est… envolvida na altera•ƒo de alimentos refrigerados,
pois consegue crescer a 4šC e hidrolisar lip†dios e prote†nas (lipase e protease) que causam
acidifica•ƒo do leite, e contamina•ƒo de produtos l…cteos. Como exemplos de altera•–es
ocorridas em alimentos referem-se as altera•–es de cor, sabor e aroma do leite e derivados.
As P. fluorescens podem contaminar o sangue e derivados sob refrigera•ƒo, porˆm, como
se multiplica com dificuldade a 37šC, raramente ˆ patog‚nica (SILLANKORVA, 2004).
Embora normalmente apresentem baixo n†vel de virul‚ncia, em 1997 quatro
pacientes do Hospital da Universidade Nacional de Taiwan desenvolveram bacteriemia a
Pseudomonas fluorescens. Os pacientes foram tratados na sala de quimioterapia e
come•aram a apresentar sintomas como febre e calafrios. Oito culturas foram isoladas a
15
partir de cateteres e do sangue dos pacientes. Todos os isolados foram identificados como
Pseudomonas fluorescens (HSUEH et al., 1998).
O tratamento cl†nico de doen•as causadas pela P. fluorescens tem sido relatado
como um problema de saŠde, a razƒo principal ˆ sua resist‚ncia a anti-sˆpticos comuns e
antibi„ticos utilizados em centros mˆdicos. A invasƒo do corpo de um ser corpo humano
por P. fluorescens costuma ser assintom…tica, enquanto que em adultos com sistema
imunol„gico enfraquecido e crian•as causa infec•ƒo (GERSHMAN et al., 2008).
A P. fluorescens ˆ uma bactˆria representante do g‚nero Pseudomonas no qual se
inclui a Pseudomonas aeruginosa, uma cepa multirresistente a antibi„ticos, considerada
como principal causadora de infec•–es em pacientes queimados (ROCHA et al., 2011).
3.4
MŒTODOS
PARA
ANTIMICROBIANA
AVALIA„…O
DA
ATIVIDADE
Uma grande variedade de mˆtodos laboratoriais pode ser empregada para medir a
suscetibilidade in vitro de bactˆrias a agentes antimicrobianos. Esses testes sƒo tambˆm de
grande import‡ncia em estudos sobre epidemiologia de resist‚ncia, e em investiga•–es
sobre novos agentes antimicrobianos (CLSI, 2006).
A concentra•ƒo inibit„ria m†nima (CIM) tem sido calculada por mˆtodos in vitro e
usada como par‡metro para avaliar a atividade antimicrobiana por v…rios autores. A CIM ˆ
a menor concentra•ƒo do agente antimicrobiano capaz de inibir completamente o
crescimento do micro-organismo em tubos de ensaio, placas de microt†tulo em um tempo
espec†fico (CLSI, 2006),
Em alguns trabalhos, tanto o teste que estima a concentra•ƒo bactericida m†nima
(CBM) quanto o teste de disco-difusƒo (halos de inibi•ƒo) sƒo denominados erroneamente
como Concentra•ƒo Inibit„ria M†nima (CIM). Entretanto, o que o bioensaio da CBM
estabelece ˆ a menor concentra•ƒo na qual a bactˆria deixa de crescer em caldo (na
avalia•ƒo da CIM), mas ao ser repicado em meio de cultura contido em placa de petri, e
incubado durante certo tempo, nƒo desenvolve col•nias microbianas.
16
a) Bioensaios de difusƒo
Os biensaios de difusƒo sƒo mˆtodos quantitativos nos quais o efeito pode ser
graduado. Fundamentam-se na difusƒo da subst‡ncia a ser ensaiada em um meio de cultura
s„lido, e inoculado com um micro-organismo. A partir da difusƒo, ocorre o aparecimento
de um halo, onde nƒo h… crescimento do micro-organismo, denominado halo de inibi•ƒo
(OSTROSKY, 2008; FERRONATTO et al., 2007).
Diferentes tipos de reservat„rios podem ser empregados, incluindo discos de papel,
cilindros de porcelana ou de a•o inoxid…vel e orif†cios feitos no meio de cultura. A
subst‡ncia a ser testada ˆ colocada em contato com o meio de cultura inoculado, e a
maneira como se processa esse contato define os diferentes mˆtodos de difusƒo (ANVISA,
2010). Dentre eles, destaca-se o mˆtodo do disco difusƒo ou difusƒo em …gar, que permite
ap„s a incuba•ƒo, que os di‡metros dos halos de inibi•ƒo serem medidos com o aux†lio de
rˆgua milimetrada ou paqu†metro (ALMEIDA, 2007; ADELMANN, 2005).
A atividade antimicrobiana pode ser significativamente influenciada pelo tipo e
tamanho do disco ou orif†cio, pH, pela capacidade do composto em se difundir no meio de
cultura, pelas propriedades do meio e pelo micro-organismo investigado (CLSI, 2006).
Nesse mˆtodo, a presen•a de matˆria particulada na amostra pode interferir na
difusƒo da subst‡ncia antimicrobiana no …gar. Entretanto, o pequeno volume de amostra
necess…rio e a possibilidade de testar cinco a seis compostos por placa, frente a um Šnico
micro-organismo, sƒo vantagens do mˆtodo de difusƒo em …gar (OSTROSKY et al., 2008).
b) Bioensaios de dilui‚ƒo
Os bioensaios de dilui•ƒo sƒo aqueles nos quais os extratos ou subst‡ncias a serem
testados sƒo adicionados aoa meios de cultura l†quidos ou s„lidos adequados, previamente
inoculados com o micro-organismo teste. Ap„s a incuba•ƒo, o crescimento do microorganismo ˆ determinado pela compara•ƒo direta ou turbidimˆtrica da cultura teste com o
controle negativo (meio de cultura inoculado sem adi•ƒo de subst‡ncia inibidora) ou pelo
uso de espectrofot•metro em comprimento de onda apropriado (ALMEIDA, 2007).
17
O mˆtodo de macrodilui•ƒo em tubo apresenta metodologia mais complexa,
entretanto ˆ o mais preciso.
Esse mˆtodo ˆ recomendado principalmente para a
determina•ƒo da Concentra•ƒo Inibit„ria M†nima (CLSI M7-A7, 2006).
b) Bioensaios em meio de cultura
Os bioensaios em meio de cultura para avalia•ƒo de atividade antimicrobiana
empregam al†quotas das solu•–es teste (diferentes concentra•ƒo do composto a ser testado)
em placas de petri contendo meio de cultura, por plaqueamento pela tˆcnica de superf†cie
(spread plate) ou profundidade (pour plate) estimar a Concentra•ƒo Inibit„ria M†nima
(CIM).
Outro bioensaio amplamente utilizado ˆ o que determina a Concentra•ƒo
Bactericida M†nima (CBM), realizada em conjunto com a avalia•ƒo da Concentra•ƒo
Inibit„ria M†nima (CIM).
A metodologia para avalia•ƒo da CBM se baseia na distribui•ƒo de in„culo das
solu•–es teste da avalia•ƒo da CIM distribu†das em placas de petri com meio de cultura
solidificado, e ap„s um per†odo de incuba•ƒo se observa em que concentra•ƒo da solu•ƒo
teste nƒo houve o desenvolvimento de col•nias microbianas (ARAUJO et al., 2009, CLSI
M7-A7, 2006).
3.5 ANTIBI•TICOS
Antibi„tico uma subst‡ncia natural ou sintˆtica que destr„i micro-organismos ou
inibe o seu crescimento. Desse modo, interferem na biologia dos micro-organismos,
destruindo o corpo celular, alterando o metabolismo ou inibindo a reprodu•ƒo destes, o que
auxilia o sistema imunol„gico a combater infec•–es (KAR, 2008).
Um grande grupo de autores divide a hist„ria dos antibi„ticos em eras, marcadas
por tr‚s descobertas: a primeira, conhecida como era dos alcal„ides, iniciada em 1619, diz
respeito ao tratamento da mal…ria com extrato de cinchona e de disenteria amebiana com
raiz de ipecacuanha. Nesta ˆpoca os extratos vegetais e seus derivados (fen„l, alcal„ides,
quinino e a emetina) eram os Šnicos recursos terap‚uticos dispon†veis. A segunda,
conhecida como dos compostos sintˆticos, teve in†cio em 1909, pela descoberta de Paul
18
Ehrlich de que doen•as causadas por protozo…rios como o tripanossomas poderiam ser
tratadas com compostos sintˆticos, sendo aplicada no combate Ž s†filis atˆ 1940, quando
surgiu a penicilina. A terceira, conhecida como era moderna dos antibi„ticos, iniciada em
1936, com o uso cl†nico das sulfonilamidas no controle das infec•–es por estreptococos e
pneumococos (TRIVEDI et al., 2010).
A cria•ƒo do termo “antibi„tico” (contra a vida) ˆ atribu†da ao bioqu†mico
ucraniano, naturalizado norte-americano, Selmam Abraham Waksman, que definiu como
sendo aqueles agentes que matavam as bactˆrias causadoras de doen•as (TINER, 2004).
O primeiro antibi„tico identificado pelo homem foi descoberta por acaso pelo
mˆdico escoc‚s Alexander Fleming em 1928, enquanto trabalhava no hospital St. MaryŒs
em Londres com a bactˆria Staphylococcus aureus. O bacteriologista ap„s retornar de
fˆrias encontrou placas com cultura bacteriana contaminadas por fungos do g‚nero
Penicillium, e que ao redor destes bolores havia sido formado um halo de inibi•ƒo, sem
crescimento bacteriano, estudos posteriores permitiram o isolamento de uma subst‡ncia
com alto poder antibacteriano, a penicilina. Em 1945, Fleming recebeu o Pr‚mio Nobel de
Medicina pela descoberta da penicilina (PEREIRA & PITA, 2005)
A medicina popular j… utilizava bolores de fungos no tratamento de doen•as a
v…rios sˆculos, relatos hist„ricos apontam o uso de coalhada de soja embolorada por
chineses por volta de 500 a.C. no tratamento de furŠnculos e outras infec•–es (DO
CARMO, 2006).
No entanto, somente a partir dos estudos de Alexander Fleming que houve um
avan•o real na …rea de pesquisa de antimicrobianos, sendo produzidos antibi„ticos que
possibilitaram a melhoria da qualidade de vida das pessoas que sofriam de tuberculose,
pneumonia, meningite, s†filis, entre outras infec•–es (PEREIRA & PITA, 2005).
Em 1943, o Waksman encontrou um fungo da fam†lia dos streptomyces com
interessantes propriedades antimicrobianas o qual extraiu um antibi„tico e, em 1945,
patenteou-o como estreptomicina. O antibi„tico mostrou ser eficaz contra a tuberculose e
outras bactˆrias gram-negativas, como as da pneumonia, meningite e tifo. O bioqu†mico
recebeu o pr‚mio Nobel de medicina, em 1952, por sua descoberta da estreptomicina. A
partir de suas muitas amostras de mofo e outros microorganismos, o pesquisador isolou
diversos outros antibi„ticos, inclusive a neomicina (GILLESPIE & HAWKEY, 2006).
19
Atualmente, alˆm dos antibi„ticos isolados de micro-organismos sƒo produzidos
compostos sintˆticos com a•ƒo antimicrobiana, que podem ser utilizados de forma isolada
ou em associa•ƒo com outros medicamentos. As fluorquinolonas sƒo uma importante
classe de antimicrobianos sintˆticos que tem se destacado no combate a diferentes tipos de
bactˆrias, sendo os Šnicos agentes antimicrobianos sintˆticos a competirem com
antibi„ricos β-lact‡micos de uso cl†nico (e.g..: penicilinas e cefalosporinas). Devido ao seu
amplo espectro de atividade antimicrobiana, as fluorquinolonas t‚m sido utilizadas com
sucesso no combate Ž tuberculose, estando sob investiga•ƒo como f…rmacos de primeira
escolha (SOUZA & VASCONCELOS, 2005).
3.5.1 Mecanismos de a‚ƒo dos antibi•ticos
Os cinco principais mecanismos de a•ƒo antimicrobiana sƒo: 1) Inibi•ƒo da s†ntese
da parede celular (antibi„ticos anti-parietais), onde o antibi„tico inibe a s†ntese do
peptidoglicano da parede celular (bactericida); 2) Rea•ƒo com a membrana celular
(intera•ƒo com os fosfol†pidos) que causa o aumento da permeabilidade e perda dos
constituintes celulares (bactericida ou bacteriost…tico); 3) Inativa•ƒo de sistemas
enzim…ticos ou enzimas essenciais, incluindo as envolvidas no processo de produ•ƒo de
energia e s†ntese protˆica de componentes estruturais (bactericida ou bacteriost…tico); 4)
Destrui•ƒo ou inativa•ƒo funcional do material genˆtico, atuando negativamente na s†ntese
dos …cidos nuclˆicos, impedindo a repara•ƒo e replica•ƒo do DNA (bactericida); ou 5)
Inibi•ƒo do metabolismo celular por antibi„ticos antimetab„litos ou an…logos metab„licos,
conhecido como antagonismo competitivo (WALSH, 2000; ALMEIDA et al., 2007).
A membrana citoplasm…tica da bactˆria ˆ uma barreira perme…vel Ž passagem de
+
+
+
+
pequenos †ons como H , K , Na e Ca , alˆm de serem respons…veis pela entrada e sa†da de
diferentes compostos (CANAL, 2010). Essa permeabilidade da cˆlula bacteriana ˆ
importante para v…rias fun•–es celulares tais como, manuten•ƒo da energia no processo de
transdu•ƒo, transporte de solutos, regula•ƒo do metabolismo e controle da pressƒo (COX et
al., 2000 apud ALMEIDA, 2007).
Existe um consenso de que compostos arom…ticos e fen„licos atuam na membrana
citoplasm…tica, alteram sua estrutura e fun•ƒo, alteram o transporte ativo e coagulam o
conteŠdo celular (BURT, 2004 apud ALMEIDA, 2007).
20
Em pesquisa recente do mecanismo de a•ƒo de dois produtos fen„licos, o Eugenol e
Timol, observou-se a fuga de pot…ssio do corpo celular, que ˆ a primeira indica•ƒo de
danos na membrana em micro-organismos. Nesse estudo, as medi•–es da fuga de pot…ssio,
ap„s a exposi•ƒo de cepas bacterianas de Escherichia coli e Staphylococcus aureus aos
agentes antimicrobianos pesquisados, permitiram concluir que o s†tio de a•ƒo do Timol e
do Eugenol ˆ a membrana citoplasm…tica (WALSH & FISCHBACH, 2010).
Os bioensaios de avalia•ƒo de atividade antimicrobina sƒo importantes para
selecionar novos compostos com potencial inibi•ƒo microbiana, para identifica•ƒo do
mecanismo de a•ƒo sƒo necess…rios estudos espec†ficos, como o citado anteriormente.
3.5.2 Antibi•ticos de uso clŠnico
Um antimicrobiano deve matar ou inibir o crescimento do agente infeccioso, sem
danificar os tecidos do hospedeiro, a esse conceito d…-se o nome toxicidade seletiva. A
dose t„xica ˆ a concentra•ƒo que efetivamente destr„i ou elimina a pat„geno. Juntos, estes
dois valores sƒo utilizados para formular o †ndice quimioterap‚utico, que representa a
concentra•ƒo mais elevada (por quilograma de peso do corpo), do f…rmaco tolerado pelo
hospedeiro, dividida pela concentra•ƒo mais baixa (por quilograma peso corporal) da droga
(POMMERVILLE, 2011).
Assim sendo, o melhor resultado dever… ser conseguido pela inibi•ƒo de fun•–es
bacterianas que nƒo estƒo presentes em cˆlulas humanas, por exemplo, a inibi•ƒo de
peptidoglicano em cˆlulas bacterianas pela penicilina (TALARO & CHESS, 2012).
A diferen•a entre a dose necess…ria para o tratamento e a que provoca danos ao
paciente ˆ normalmente grande, tal intervalo ˆ conhecido como †ndice terap‚utico. Os
aminoglicos†deos sƒo exce•–es, porque doses um pouco acima do n†vel terap‚utico podem
ser t„xicas. Embora todos os agentes antimicrobianos tenham potenciais efeitos
indesejados, felizmente efeitos indesejados graves nƒo sƒo frequentes (ENGELKIRK &
DUBEN-ENGELKIRK, 2011).
Os antibi„ticos utilizados no controle bacteriano podem ter efeito bacteriost…tico ou
bactericida: Sƒo bacteriot…ticos quando o agente antimicrobiano inibe o crescimento e/ou a
reprodu•ƒo das bactˆrias; e bactericidas quando o agente destr„i (mata) as cˆlulas
bacterianas. Em sentido amplo, o termo microbicida ˆ empregado para definir agentes que
21
inibem o crescimento de micro-organismos, e microbicida aqueles compostos que matam
microbios (KAR, 2008).
Segundo Trived et al. (2010), a escolha do antibi„tico para o tratamento de
infec•–es depende:
a) Local da infec‚ƒo - concentra•–es suficientes de antimicrobianos pode ser
dif†cil de alcan•ar em alguns locais, como abscessos, osso, …reas com suprimento
inadequado de sangue e alguns locais com baixo pH a•ƒo de certos antibi„ticos (por
exemplo, aminoglicos†deos);
d) Organismo - a identifica•ƒo do organismo patog‚nico prev‚ o hist„rico natural
da infec•ƒo, permitindo a otimiza•ƒo do tratamento;
c) Padrƒo de suscetibilidade - Streptococcus pyogenes ˆ invariavelmente
suscet†veis a penicilina, mas outros organismos, tais como Acinetobacter e Pseudomonas
sƒo resistentes, assim os antibi„ticos devem ser escolhidas conforme o padrƒo de
resist‚ncia dos potenciais agentes patog‚nicos;
d) Gravidade da infec‚ƒo - infec•–es graves exigem que os antibi„ticos sejam
administradod por via parenteral;
e) Hist•rico de alergia - uma resposta alˆrgica prˆvia pode limitar a escolha do
antibi„tico;
f) Efeitos colaterais - a probabilidade de efeitos indesejados pela administra•ƒo de
certo antimicrobiano - por exemplo, aminoglicos†deos que devem ser utilizados com
precau•ƒo em pacientes com doen•a renal prˆ-existente
Existem diversos tipos de antibi„ticos de uso cl†nico, sendo citados a seguir os 12
grupos principais (GILLESPIE & BAMFORD, 2012; CLSI M7-A7, 2006):
a) Penicilinas: Sƒo beta-lact‡micos que atuam inibindo a forma•ƒo de
peptidoglicano em cˆlulas bacterianas. Modifica•–es nas penicilinas ter aumentado seu
espectro de a•ƒo antibacteriana e melhorado a absor•ƒo do medicamento;
b) Cefalosporinas: as cefalosporinas sƒo intimamente relacionadas com as
penicilinas, pois interferem na s†ntese da parede celular de peptidoglicano via inibi•ƒo
de enzimas envolvidas no processo de transpeptida•ƒo. Eles sƒo ativos contra bactˆrias
Gram-positivos, e algumas cepas Gram-negativas, incluindo as Pseudomonas;
c) Monobactamas: Os Monobactims estƒo relacionados com penicilinas e
cefalosporinas. Eles t‚m um amplo espectro de atividade, incluindo bactˆrias anaer„bias.
Por exemplo, o Imipenem e Meropenem t‚m apresentam efeitos antipseudomonas quando
22
administrados por via intravenosa;
d) AminoglicosŠdeos: inibem da tradu•ƒo do mRNA em prote†nas bacterianas,
constituintes do corpo celular;
e)
GlicopeptŠdeos: Tais
como
a
Vancomicina
e
Teicoplanina,
inibem
peptidoglicano de reticula•ƒo em bactˆrias Gram-positivas, e raramente produzem
resist‚ncia, com exce•ƒo de enterococos (enterococos resistentes a glicopˆptidos - GRE), e
em alguns Staphylococcus aureus;
f) Daptomicina: ˆ um novo agente com uma semi-vida longa, muito ativo contra
micro-organismos Gram-positivos. Liga-se Ž membrana celular bacteriana levando Ž r…pida
despolariza•ƒo do potencial de membrana, o que determina a inibi•ƒo da s†ntese de
prote†nas, DNA e RNA, alˆm do extravasamento de conteŠdo citoplasm…tico e morte
bacteriana;
g) Quinolonas: inibem a DNA-girase bacteriana. As quinolonas primitivas nƒo
atingiam n†veis elevados do tecido e foram utilizadas apenas para infec•–es do trato
urin…rio. A modifica•ƒo com flŠor (fluoroquinolonas) tornou-as ativas contra bactˆrias
Gram-negativas, incluindo pat„genos Chlamydia. Ciprofloxacina tem atividade contra
Pseudomonas spp. Quinolonas sƒo bem absorvidas por via oral, sƒo largamente
distribu†dos e penetram nas cˆlulas. Por exemplo, a moxifloxacina que possuem atividade
inibit„ria contra bactˆrias patog‚nica Gram-positivas, incluindo Streptococcus pneumoniae
e Mycobacterium tuberculosis;
h) Macr•lideos: Os macrol†deos (eritromicina, azitromicina e claritromicina) se
ligam ao ribossoma 50S, interferindo na s†ntese protˆica, eles sƒo ativos contra cocos
Gram-positivos, muitos aer„bios como Mycoplasma e Chlamydia (mas nƒo Bacter„ides);
i) Estreptograminas: Sƒo macromolˆculas semi-sintˆticas da mesma fam†lia
dos macrol†deos e lincosaminas que, embora nƒo possuam rela•ƒo qu†mica, apresentam
algumas propriedades semelhantes, como mecanismo de a•ƒo, espectro antimicrobiano,
caracter†sticas farmacocinˆticas e farmacodin‡micas e indica•–es cl†nicas. A quinupristina
e dalfopristina sintetizadas a partir da pristinamicina IA e IIB, respectivamente, utilizados
em conjunto inibem a forma•ƒo da liga•ƒo pept†dica, o que resulta na liberta•ƒo de cadeias
polipept†dicas incompletas. Sƒo ativas contra uma ampla gama de pat„genos Grampositivos e alguns Gram-Negativos, tais como Moraxella, Legionella, Mycoplasma e
Neisseria meningitidis. ‘ utilizado principalmente para o tratamento de bactˆrias grampositivas resistentes a infec•–es (Por exemplo, GRE e glicopept†deos intermedi…rio S.
23
aureus [GISA]);
j) Oxazolidinonas: As oxazolidinonas (por exemplo, linezolida) inibem a s†ntese
de prote†nas na Subunidade 50S ribossomal. Elas sƒo mais ativas contra bactˆrias Grampositivas e sƒo utilizados principalmente no tratamento de resist‚ncia infec•–es causadas
por bactˆrias gram-positivas;
k) Metronidazol: A principal caracter†stica do metronidazol ˆ sua ampla atividade
contra os organismos anaer„bicos. Atua por meio de um receptor de elˆtrons, formando
metab„litos t„xicos que danificam o DNA bacteriano; tambˆm sƒo ativos contra algumas
espˆcies de protozo…rios, incluindo Giardia, Entamoeba histolytica e Trichomonas
vaginalis;
l) Tetraciclinas: bloqueiam a liga•ƒo do tRNA ao mRNA causando a inibi•ƒo da
s†ntese protˆica. Eles sƒo ativos contra muitas bactˆrias Gram-positivas e alguns pat„genos
Gram-negativos, Chlamydia, Mycoplasma, Rickettsia e treponemas, Plasmodium e
Entamoeba histolytica;
m) Sulfonamidas e trimetoprim: Sulfonamidas e trimetoprim atuam inibindo a
s†ntese de tetrahidrofolato. Eles sƒo raramente utilizados no tratamento de infec•–es
bacterianas, mas tem um papel importante no controle de Pneumocystis jiroveci e
infec•–es por protozo…rios incluindo a mal…ria.
3.5.3 ResistŽncia a antibi•ticos
Anualmente, milh–es de pessoas morrem em decorr‚ncia de infec•–es causadas por
micro-organismos resistentes aos antibi„ticos atuais (WHO, 2012). A falha na terapia
antimicrobiana causa o aumento da morbilidade e mortalidade, e elevados custos no
tratamento de infec•–es (Garcia, 2011).
Quando um antibi„tico ˆ descoberto e introduzido no mercado, sua utilidade cl†nica
come•a a diminuir atˆ um ponto em que h… um aumento na restri•ƒo de seu uso pelo
surgimento de cepas resistentes (ROCHA et al., 2011). Sendo uma das grandes causas de
aquisi•ƒo de resist‚ncia o uso indiscriminado de novos antibi„ticos em grandes popula•–es
(SILVEIRA et al. 2006).
As bactˆrias comensais resistentes a antimicrobianos produzem reservat„rios de
resist‚ncia que podem ser transmitidos para bactˆrias patog‚nicas (CALIMAN et al.,
2012). O surgimento da resist‚ncia em bactˆrias patog‚nicas pode reduzir a efic…cia de
24
terapias antimicrobianas com antibi„ticos de amplo espectro de a•ƒo (GILLESPIE &
HAWKEY, 2006), o que em alguns casos implica no uso de antibi„ticos seletivos, que em
alguns casos podem ser mais t„xicos ao paciente e possuem custam mais elevado de
produ•ƒo.
A resist‚ncia a antibi„ticos ˆ um problema global, devendo-se dar aten•ƒo aos
genes que confiram esta resist‚ncia as bactˆrias. Os genes de resist‚ncia a antimicrobianos
estƒo localizados em reservat„rios conhecidos como plasm†deos, transposons e integrons,
que permitem a transfer‚ncia g‚nica entre diferentes g‚neros e espˆcies de bactˆrias,
tornando-as resistentes (CANAL, 2010). Os genes que conferem resist‚ncia a v…rias
classes de antimicrobianos e aos desinfetantes sƒo encontrados na forma de cassetes
g‚nicos, estes, por sua vez, constituem um pool de genes (PARTRIDGE et al., 2009).
Figura 11. Mecanismos de resist‚ncia a antibi„ticos (Fonte: adaptado de Gillespie & Bamford
(2012) p.19.
25
Sƒo conhecidos pelo menos tr‚s mecanismos de resist‚ncia a antimicrobianos:
inativa•ƒo, efluxo e adi•ƒo. Na inativa•ƒo a subst‡ncia antimicrobiana ˆ degradada em
outra inerte a cˆlula bacteriana; no efluxo os antibi„ticos sƒo expulsos do corpo celular
(possuem uma prote†na na membrana interna que bombeia o antimicrobiano); e algumas
bactˆrias possuem enzimas que adicionam um composto qu†mico de inativa•ƒo de grupos
de antibi„ticos, para inibir suas atividades; existem ainda bactˆrias com impermeabilidade
natural no envelope celular, o que nƒo permite a alguns antimicrobianos alcan•ar o s†tio de
rea•ƒo, ou que podem promover a altera•ƒo do s†tio de liga•ƒo dos antibi„ticos
(GILLESPIE & BAMFORD, 2012).
O desenvolvimento de novos antimicrobianos possibilita um resguardo cl†nico
contra bactˆrias multirresistentes, principalmente no ambiente hospitalar. Contudo, em tais
estudos deve se considerar a natureza qu†mica e bioqu†mica da subst‡ncia testada, alˆm de
sua intera•ƒo com o organismo patog‚nico, a fim de nƒo induzir a resist‚ncia microbiana.
3.6 POLIFEN•IS
A palavra polifenol significa "muitos fen†is" [Do grego poli = muitos + fenol =
composto qu†mico formado por um anel arom…tico ligado um grupo hidroxila (-OH)]. Os
polifen„is ou compostos fen„licos constituem um grupo heterog‚neo, composto de v…rias
classes de subst‡ncias com propriedade antioxidante. (OLIVEIRA, 2011; BASLI, 2012).
Essas subst‡ncias estƒo presentes em v…rios alimentos e bebidas, mas em especial
na uva e em seus derivados. O suco de uva possui um elevado teor de a•Šcar,
principalmente na forma de glicose e frutose, alˆm de conter nutrientes essenciais,
micronutrientes, vitaminas e uma grande quantidade e variedade de polifen„is (VARGAS
et al., 2008; BASLI, 2012).
Os polifen„is j… foram amplamente estudados em razƒo dos efeitos benˆficos que
propiciam Ž saŠde, como atividade antioxidante na preven•ƒo de rea•–es oxidativas e
forma•ƒo de radicais livres, bem como na prote•ƒo contra danos ao DNA das cˆlulas, com
propriedades
neuroprotetora,
antiinflamat„ria,
anticarcinog‚nica,
antiaterog‚nica,
antitromb„tica, antimicrobiana, analgˆsica e vasodilatadora (AFAQ & KATIYAR, 2011;
CIMINO et al., 2012; EFRAIM et al., 2011).
26
A estrutura b…sica de alguns compostos fen„licos est… representada na Tabela 1.
Tabela 1. Classifica•ƒo dos principais dos compostos fen„licos.
Classe
F•rmula Estrutural
Estrutura QuŠmica
O
C6-C2-C6
Antraquinonas
O
O
C6-C3
Cromonas
O
O
Cumarinas
C6-C3
Flavon„ides
C6-C3-C6
O
C6-C3
Isocumarinas
O
O
O
O
C6-C4
Naftoquinonas
O
O
C6-C1-C6
Xantonas
O
3.6.1 Flavon•ides
Os flavon„ides foram descobertos em 1930, pelo ganhador do pr‚mio Nobel SzentGyrgy, que extraiu da casca do limƒo a citrina, subst‡ncia com a capacidade de regula•ƒo
da permeabilidade dos capilares (SANTOS, 2009).
Inicialmente,
os
flavon„ides
eram
denominados
como
vitamina
P
(de
permeabilidade) e tambˆm por vitamina C2 , visto que algumas das subst‡ncias pertencentes
a esta classe apresentam propriedades semelhantes Žs da vitamina C. Porˆm, dada a nƒo
confirma•ƒo destas subst‡ncias como vitaminas, esta classifica•ƒo foi abandonada em
1950 (VAUZOUR, 2012).
27
Os flavon„ides constituem o maior grupo de compostos fen„licos nas plantas,
abrangendo cerca de metade dos 8 mil compostos fen„licos que ocorrem na natureza.
Consoante as varia•–es no anel heteroc†clico, tambˆm eles podem ser agrupados em
diversas subclasses: flavon„is, flavonas, flavanonas, flavan„is (ou catequinas), isoflavonas,
flavanon„is e antocianidinas (GRASSI et al., 2010).
Essa classe de polifen„is apresenta compostos com 15 …tomos de carbono em seu
nŠcleo fundamental, constitu†do de duas fenilas ligadas por uma cadeia de tr‚s carbonos
entre elas (C6 -O3 -O2 -C6). Nos compostos tric†clicos, as unidades sƒo denominadas nŠcleos
A, B, C e os …tomos de carbono recebem numera•ƒo com nŠmeros ordin…rios nos nŠcleos
A e C, e os mesmos nŠmeros seguidos de linha(') no nŠcleo N (PIMP•O, 2009).
As substitui•–es nos anˆis A e B dƒo origem a diferentes compostos dentro de cada
classe. Estas substitui•–es podem incluir oxigena•ƒo, alquila•ƒo, glicosila•ƒo, acila•ƒo e
sulfata•ƒo. Rea•–es como a glicosila•ƒo tornam os flavon„ides mais solŠveis em …gua e
permitem o seu armazenamento no vacŠolo celular, onde sƒo geralmente encontrados nas
plantas (PIMP•O, 2009; ).
Os flavon„is sƒo compostos amplamente distribu†dos pelas plantas superiores, onde
ocorrem normalmente na forma de glicos†deos, representam um constituinte comum da
dieta humana, sendo encontrados em ch…s, vinhos, pr„polis, mel, em frutas, legumes,
nozes, sementes, caules e flores de plantas, e representam (CUSHNIE & LAMB, 2005).
Os flavon„ides Kaempferol e Quercetina geralmente sƒo encontrados em frutos de
ros…ceas como morangos, framboesas e amoras, que tem demonstrado em diversos estudos
um alto potencial antiinflamat„rio e antioxidante (KIM, 2010). Estudos relatam o
Kaempferol como inibidor da prolifera•ƒo celular e indutor de apoptose em cˆlulas do
c‡ncer pancre…tico (ZHANG, 2008).
Nos Estados Unidos, a ingestƒo dietˆtica di…ria de flavon„ides mistos ˆ estimada
estar na faixa de 500-1000 mg, mas este valor pode ser chegar a v…rios gramas em pessoas
que completam suas dietas com alimentos prepara•–es Ž base de plantas contendo
flavon„ides (CUSHNIE & LAMB, 2005).
28
Figura 12. Estrutura b…sica dos flavon„ides, dois anˆis fenil (A e B) ligados atravˆs
de um anel pirano (C).
Na natureza sƒo encontradas diversas classes de flavon„ides, as principais
estruturas b…sicas destes compostos sƒo ilustradas na Figura 13:
Figura 13. Estruturas b…sicas de algumas classes de flavon„ides.
3.6.2 Efeitos Biol•gicos dos Flavon•ides
Os flavon„ides possuem diversas fun•–es biol„gicas, tais como prote•ƒo das
plantas a raio ultravioleta; prote•ƒo contra insetos, fungos, v†rus e bactˆrias; atra•ƒo de
29
animais para poliniza•ƒo; antioxidantes; controle da a•ƒo de horm•nios vegetais; agentes
alelop…ticos e inibidores de enzimas (OLIVEIRA, 2011). Alˆm de diversos efeitos
biol„gicos importantes, como: antitumoral, antiulcerog‚nica, anti-hemorr…gicas, tratamento
de doen•as circulat„rias, hipertensƒo e cofator de vitamina C, antiinflamat„rio, e
antioxidante (PEDRIALI, 2005).
Como antioxidantes, os flavon„ides podem proteger contra dano oxidativo dos
constituintes celulares e, portanto, limitar o risco de v…rias doen•as degenerativas
associadas ao estresse oxidativo (GRASSI et al., 2010).
a) Atividade antioxidante
Antioxidantes sƒo compostos que podem retardar ou inibir a oxida•ƒo de lip†dios
ou outras molˆculas, evitando o in†cio ou propaga•ƒo das rea•–es em cadeia de oxida•ƒo.
A atividade antioxidante dos flavon„ides ˆ principalmente devida Žs suas propriedades de
„xido-redu•ƒo, as quais podem desempenhar um importante papel na absor•ƒo e
neutraliza•ƒo de radicais livres, quelando o oxig‚nio triplete e singlete ou decompondo
per„xidos (DEG‹SPARI & WASZCZYNSKYJ, 2004).
As flavonas e catequinas parecem ser os flavon„ides mais poderosos para a
prote•ƒo do organismo contra espˆcies reativas de oxig‚nio (ROS). As cˆlulas e tecidos
corporais sƒo continuamente amea•ados pelo dano causado por radicais livres e ROS que
sƒo produzidos durante o metabolismo normal de oxig‚nio ou sƒo induzidas por via
ex„gena (TAPAS et al., 2008).
Os mecanismos end„genos de defesa (ou mediadores de redox tais como:
super„xido dismutase, catalase, peroxidase e metaloprote†nas) podem ser auxiliadas
favoravelmente com a introdu•ƒo de antioxidantes por meio da dieta. As matˆrias-primas
in natura dispon†veis como: frutas, vegetais em geral e condimentos contˆm numerosos
fitoqu†micos alˆm dos compostos fen„licos como, por exemplo, compostos nitrogenados,
caroten„ides, …cido asc„rbico e tocofer„is. Muitos destes fitoqu†micos apresentam
significante capacidade antioxidante e sƒo associados Ž baixa incid‚ncia e baixa
mortalidade de c‡ncer em seres humanos (YILDRIM, 2002; KIM et al., 2010).
30
O potencial de atividade antioxidante dos flavon„ides, que atuam na elimina•ƒo de
radicais livres, tem sido relatado na seguinte ordem: Mircetina > Quercetina > Rametina >
Morin > Diosmetina > Naringenina > Apigenina > Catequina > 5,7-di-hidroxi-3',4',5'Trimetoxiflavona > Robinin > Kaempferol > Flavonol (TAPAS et al., 2008).
b) A‚ƒo antitumoral
O c‡ncer ˆ considerado uma das maiores causas de morte no mundo e ˆ definido
como uma doen•a gen•mica, surgindo como consequ‚ncia de altera•–es cumulativas no
material genˆtico (DNA) de cˆlulas normais, as quais sofrem transforma•–es atˆ se
tornarem malignas (DANTAS et al., 2009).
Estudos epidemiol„gicos t‚m mostrado que com o aumento da ingestƒo de frutas e
vegetais experimenta uma redu•ƒo de 50% no risco de c‡nceres e trato digestivo
respirat„rias. Assim, o consumo de geniste†na pode prevenir o desenvolvimento de
tumores e promover a forma•ƒo de novos vasos sangu†neos, evitando assim, a chegada de
nutrientes e oxig‚nio para cˆlulas novos tumores (MART“NEZ-FL’REZ et al., 2002).
A geste†na tambˆm regular as rea•–es do estrog‚nio e seus receptores, diminuindo,
desse modo, o risco de c‡ncer de mama. De fato, tem sido mostraram que os flavon„ides
podem inibir monooxigenase dependentes do citocromo P-450, indicando potencial na
inativa•ƒo de carcin„genos; tambˆm relatam que chalconas e flavanonas sƒo indutores das
quinonas redutases e podem prevenir hepatomas (MART“NEZ-FL’REZ et al., 2002).
O c‡ncer pode ser considerado uma doen•a genˆtica uma vez que ˆ desencadeado
por altera•–es no DNA da cˆlula. No entanto, ao contr…rio das demais s†ndromes genˆticas
humanas, o c‡ncer nƒo ˆ necessariamente uma doen•a heredit…ria. Os c‡nceres humanos
sƒo, na sua maioria, de origem som…tica resultantes da intera•ƒo de fatores genˆticos e
ambientais (BEHLING et al., 2004).
No caso do c‡ncer heredit…rio, as muta•–es germinativas estƒo diretamente
associadas Ž predisposi•ƒo familial para o desenvolvimento de tumores e, nesses casos
espec†ficos, o c‡ncer pode ser considerado uma doen•a genˆtica e heredit…ria
(MART“NEZ-FL’REZ et al., 2002).
31
Estudos epidemiol„gicos t‚m apontado menor incid‚ncia de c‡ncer de colo, de
endomˆtrio e de ov…rio em pa†s do oriente, decorrente da dieta rica em alimentos contendo
altas concentra•–es de flavon„ides (ZHANG et. al., 2008).
Estudos experimentais prop–em a divisƒo da carcinog‚nese em tr‚s est…gios:
inicia•ƒo, promo•ƒo e progressƒo. O est…gio de inicia•ƒo ˆ caracterizado por altera•ƒo do
material genˆtico, que pode ou nƒo resultar em muta•ƒo. O est…gio de promo•ƒo,
caracterizado pela conversƒo da cˆlula iniciada em prˆ-maligna, ˆ um processo longo e
revers†vel, sendo este um ponto estratˆgico para a•ƒo de agentes quimiopreventivos. A
progressƒo da cˆlula prˆ-maligna para cˆlula maligna ocorre em consequ‚ncia de dano
adicional ao cromossomo. O resultado ˆ a divisƒo celular incontrolada, resultante do
aumento da autonomia celular. A atua•ƒo dos flavon„ides, em especial as antocianinas,
nessas diversas fases pode estar relacionada Ž sua a•ƒo antioxidante, ao aumento da
resposta imune ou ainda Ž modula•ƒo da expressƒo do gene supressor tumoral. Entretanto,
os est…gios da carcinog‚nese em que os flavon„ides podem agir ainda nƒo estƒo
estabelecidos (VOLP et al., 2007)
Os flavon„ides representam um grande grupo de fitoqu†micos que sƒo conhecidos
por exercerem uma atividade antitumoral. Assim, estudos investigativos t‚m demonstrado
que os poss†veis mecanismos de inibi•ƒo da carcinog‚nese por polifen„is estejam
relacionados com o aumento da expressƒo de super„xido dismutase, inibi•ƒo da
cicloxigenase e lipoxigenase, indu•ƒo de apoptose e repressƒo do ciclo celular, como
demonstrado em cˆlulas carcinog‚nicas humanas in vitro (MACHADO, 2006).
c) Atividade antiinflamat•ria
O processo inflamat„rio encontrado em diversas patologias ˆ uma resposta do
organismo frente a uma infec•ƒo ou injŠria tecidual, e compreende basicamente dois
mecanismos de defesa: a) resposta inespec†fica (resposta inata), respons…vel pelas
caracter†sticas da regiƒo inflamada (vermelhidƒo, edema, calor, dor e perda de fun•ƒo); e
b) uma resposta imunol„gica, na qual h… produ•ƒo de anticorpos espec†ficos contra um
determinado agente agressor (COUTINHO et. al. 2009).
32
Estudos dos efeitos dos flavon„ides sobre os processos inflamat„rios demonstraram
que os integrantes deste grupo funcional apresentam a capacidade de inibir a ativa•ƒo de
uma sˆrie de enzimas. Desse modo, deixam de ativar as Isoformas de Indu•ƒo de ’xido
N†trico (iNOS) e a ciclo-oxigenase (COX-2) e assim nƒo sƒo produzidas as subst‡ncias
envolvidas no processo inflamat„rio, tais como Prostaglandinas e ’xido N†trico
(GONZ‹LEZ-GALLEGO et al., 2007).
A exposi•ƒo das cˆlulas aos pat„genos e a lesƒo tecidual resultam na produ•ƒo e na
libera•ƒo de diversos mediadores qu†micos, respons…veis pelo processo inflamat„rio.
Dentre os mediadores da inflama•ƒo, encontram-se histamina, metab„litos do …cido
araquid•nico (prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos), fator de ativa•ƒo plaquet…ria,
bradicinina, „xido n†trico, neuropept†deos e citocinas (COUTINHO et al. 2009).
d) Atividade hormonal
Sƒo v…rios os fatores que contribuem para o desenvolvimento da osteoporose, entre
eles se destacam a idade, o sexo e a ra•a, que sƒo principais determinantes a perca de
massa „ssea e ao risco de fraturas. Estudos relatam que fatores genˆticos afetam as
varia•–es na massa „ssea em diferentes grupos ˆticos e raciais. Indiv†duos da ra•a negra
possuem maior pico de massa „ssea e, portanto, sƒo menos predispostos a sofrerem de
osteoporose que brancos e asi…ticos (ARAG•O, 2004).
Quanto maior a sobrevida do indiv†duo, maior ˆ o risco de desenvolver
osteoporose. Na menopausa, que se inicia entre 45 e 55 anos de idade, ˆ evento singular
que ocorre devido Ž defici‚ncia estrog‚nica, trazendo uma sˆrie de transforma•–es ao
organismo feminino. As mulheres passam a enfrentar perdas „sseas, sintomas
vasomotores, altera•–es cardiovasculares, distŠrbios sexuais e psicol„gicos, altera•–es
urin…rias, genitais e dermatol„gicas (ARAG•O, 2004).
Alˆm do mais, estudos t‚m demonstrado que a suplementa•ƒo alimentar por
isoflavonas de mulheres na prˆ-menopausa ocasiona riscos m†nimos Ž saŠde. Notou-se que
a prepara•ƒo isoflavona de soja, utilizada no estudo, afetou positivamente o funcionamento
da tir„ide, e controle da produ•ƒo de o estr„genos, tanto por via end„gena ou ex„gena, e
que nƒo ocorreu aumento das concentra•–es de globulina, o que normalmente resultaria na
33
compensa•ƒo por produ•ƒo de tiroxina (STEINBERG et al., 2011), que poderei resultar na
necessidade de reposi•ƒo hormonal.
Um estudo da preven•ƒo de c‡ncer de mama em mulheres na prˆ-menopausa, que
incluiu na dieta isoflavonas da soja, observou um modesto aumento na densidade da mama
das pacientes em compara•ƒo ao controle. Tais resultados indicaram a exist‚ncia de
atividade hormonal de flavon„ides em mulheres que fizeram uso de isoflavona na prˆmenopausa (HOOPER et al., 2010). Um estudo anterior j… havia revelado em mulheres
uma atividade hormonal moderada produzida por isoflavonas em gonadotrofinas e
estradiol (HOOPER et al., 2009).
e) Atividade antiviral
Diversos estudos t‚m revelado a atividade antiviral nos flavon„ides existentes na
pr„polis. As fra•–es de pr„polis afetam a replica•ƒo do v†rus tais como virus Vaccinia
(var†ola das vacas) e a respons…vel pela doen•a de Newcastle (peste avi…ria). Os
flavon„ides Crisina e Kaempferol t‚m demonstrado boa atividade na inibi•ƒo de
replica•–es de v…rios v†rus de herpes, adenov†rus, rotav†rus (ADELMANN et al., 2005).
H… relatos de flavon„ides como crisina, acacetina, e apigenina sƒo capazes de inibir
a ativa•ƒo de HIV-1 em modelos de infec•ƒo latente, por meio de um mecanismo que,
provavelmente, inclui a inibi•ƒo da transcri•ƒo viral (GEKKER et al., 2005).
Os flavon„ides Quercetina e Rutina, encontrados no mel e na pr„polis
demonstraram atividade antiviral contra os v†rus HSV (herpes simplex virus), o virus
Sincicial respirat„rio, poliov†rus e v†rus Sindbis (SINV), sendo proposto como mecanismo
de a•ƒo a inibi•ƒo da polimerase virais, do …cido nuclˆico e prote†nas do caps†deo
(VIUDA-MARTOS, 2008).
f) Atividade antimicrobiana
Diversos estudos t‚m avaliado a atividade antimicrobiana de flavon„ides em
associa•ƒo com antibi„ticos de uso cl†nico. Os resultados t‚m desmonstrado um aumento
potencial antibacteriano destes antibi„ticos, como ˆ o caso da amoxicilina, clavulina e
ampicilina (EGERT & RIMBACH, 2011).
34
Estudos t‚m demonstrado a existencia de atividade antimicrobiana em flavon„ides
comercias, tais como: Apigenina, Galangina, Pinocembrina, Ponciretina, Genkwanina,
Naringina, Naringenina, Galato Epigalocatequina e seus derivados, Luteolina, Luteolina,
Quercetina e seus derivados, Kaempferol e seus derivados, Isoflavonas; Flavanonas; e
Calconas (AKHLAGHI & BANDY, 2012).
Nos Šltimos anos, diversos extratos de plantas com um hist„rico de uso na
medicina popular estƒo sendo selecionados para avalia•ƒo de atividade antibacteriana por
muitos grupos de pesquisa. Os flavonoides contidos em extratos das espˆcies vegetais L.
vetulina, L. acida e L. microcarpa foram relatados para possuir atividade antibacteriana
(OUATTARA et al., 2011).
A pr„polis tem sido analisada desde 1980, e amostras coletadas tem demonstrado
altas concentra•–es de flavonoides com atividade antimicrobiana. Existem duas principais
teorias propostas para explicar esta capacidade: uma ˆ devido Ž a•ƒo do hidrog‚nio contido
no per„xido de mel, que ˆ produzido pela oxida•ƒo da glicose na presen•a de luz e de
calor, e a outra hip„tese ˆ de que esta atividade ocorre sem o perocido, e que independente
da luz e do calor para inibir o crescimento microbiano. Esta atividade sem peroxido, que
permanece inalterado atˆ mesmo durante longos per†odos de armazenamento, depende da
flor que foi a fonte de nˆctar usada e, portanto nem todos os mˆis possuem esta atividade
(VIUDA-MARTOS et al., 2008).
Muitos grupos de pesquisa ter ido um pouco mais longe e ou isolada e identificada
a estrutura de flavonoides que possuem atividade antibacteriana, ou quantificar a
actividade de flavon„ides dispon†veis comercialmente. Exemplos de tais flavon„ides sƒo
apigenina, galangina, pinocembrina, ponciretina, genkwanina, sophoraflavanone G e dos
seus derivados, naringina e naringenina, epigalocatequina galato e seus derivados, luteolina
e luteolina 7-gluc„sido, a quercetina, o 3-O-e metilquercetina v…rios glicos†deos de
quercetina e kaempferol e seus derivados (CUSHNIE & LAMB, 2005).
Diversos estudos t‚m identificado atividade antimicrobiana em calconas e flavonas
naturais e com substitutos sintˆticos. Combina•–es de flavonas (rutina, quercetina e morin)
t‚m demonstrado maior atividade sinergˆtica contra micro-organismos Gram-negativos
como a S. aureus (ALVAREZ et al., 2008).
35
Por exemplo, Wang e colaboradores t‚m
complexado
a 5-hidroxi-7,4-
Dimethoxyflavone com uma sˆrie de metais de transi•ƒo e mostraram que este processo
aumenta a actividade antibacteriana. Outro grupo relatou aumento antibacteriano atividade
de 3-metilenoflavanonas quando o anel B contido substituintes bromo ou cloro
(CUSHNIE & LAMB, 2005).
g) Toxicidade dos flavon•ides
Estudos de toxidade t‚m demonstrado que os flavon„ides possuem baixa
toxicidade, e a sua combina•ƒo com antibi„ticos convencionais pode ser uma alternativa ao
tratamento de bactˆrias resistentes. Em diversos trabalhos ˆ relatado a dose letal 50 (DL50 )
dos flavon„ides, na sua forma aglicona, como sendo igual a 2 g/kg do peso do animal,
quando administrados por via intravenosa em ratos (DUTHIE & ORRICE, 2012).
Devido Ž baixa solubilidade dos flavon„ides agliconas em …gua, o curto tempo de
resid‚ncia dos flavon„ides no intestino, e ao baixo coeficiente de absor•ƒo, nƒo ˆ poss†vel
para os seres humanos sofrer efeitos t„xicos agudos no consumo de flavon„ides, com
exce•ƒo de uma rara ocorr‚ncia de alergia (DUTHIE & ORRICE, 2012; MEOTTI, 2006).
Estudos toxicol„gicos prˆliminares demonstraram que a administra•ƒo constante de
doses extremamente altas de flavon„ides causa altera•–es morfol„gicas na membrana dos
hepat„citos, com necrose celular e morte do animal. Alˆm disso, foi observado um efeito
mutag‚nico por alguns flavon„ides. A atividade t„xica e mutag‚nica dos flavon„ides ˆ
atribu†da, principalmente, Ž forma•ƒo de ep„xidos durante sua biotransforma•ƒo. Porˆm,
em geral, as muta•–es sƒo reparadas antes de conduzirem a um distŠrbio. Desta forma, o
risco de consequ‚ncias patol„gicas ocorridas pela muta•ƒo atravˆs do consumo de
flavon„ides ˆ considerado baixo (HAVSTEEM, 2002).
Outro estudo toxicol„gico avaliou os efeitos da exposi•ƒo de ratos a altas
concentra•–es de flavon„ides em ratos, durante tr‚s semanas, o que resultou em altera•–es
morfol„gicas na estrutura da membrana dos hepat„citos, que levam Ž necrose das cˆlulas e,
eventualmente, Ž morte do animal. Assim, embora os flavon„ides sejam normalmente
absorvidos pelo organismo humano e provavelmente constituam uma das drogas
conhecidas mais seguras, em concentra•–es elevadas, podem se tornar subst‡ncias t„xicas
(MEOTTI, 2006).
36
3.6.3 Quercetina
A quercetina (3,3’,4’,5,7-pentahidroxiflavona), ˆ o flavon„ide de maior ocorr‚ncia
na dieta humana, sendo encontrada em frutas, verduras, vinho, suco de frutas, ch…s, etc.
Este flavon„ide pode ser obtido em plantas a partir de glicos†deos (a•Šcares e derivados)
por meio de extra•ƒo, seguida de hidr„lise para libertar a aglicona e subsequente
purifica•ƒo (HARWOOD et al., 2007).
Em decorr‚ncia da preval‚ncia de Quercetina na dieta humana e suas potenciais
aplica•–es cl†nicas e nutricionais, este flavon„ide foi avaliado extensivamente durante os
Šltimos anos, em uma variedade de estudos de toxicidade, tais como: genotoxidade,
toxicidade reprodutiva, toxidade aguda, cr•nica e subcr•nica (OKAMOTO, 2005).
A estrutura qu†mica da Quercetina ˆ essencial tambˆm para sua atividade, ela
participa de rea•–es formando complexos com metais, desta forma, afetando o transporte,
reatividade, biodisponibilidade e toxicidade dos †ons met…licos. No seu esqueleto qu†mico
h… tr‚s poss†veis s†tios de quela•ƒo de metais que competem entre si, e podem ser
classificados da seguinte forma: catecol > α-hidroxicarbonila > β-hidroxicarbonila. A
quercetina tem v…rios elementos estruturais caracter†sticos de fun•–es antioxidantes: (1) as
duas hidroxilas em posi•ƒo orto no anel B - grupo catecol, (2) a presen•a da dupla liga•ƒo
entre o C2 e C3 e (3) as hidroxilas substitu†das em C3 e C4 em proximidade com a
carbonila em C4 (AMSTALDEN, 2011).
OH
3'
HO
8
7
1
9
A
6
5
OH
O
2
C
10
4
1'
OH
4'
2'
B
5'
6'
3
OH
O
Figura 14. Estrutura qu†mica do flavon„ide Quercetina.
37
Um estudo de repara•ƒo do DNA comprovou a capacidade da quercetina em
reduzir danos em cˆlulas Caco-2 (adenocarcinoma coloretal) quando expostas a doses de
1 μmol/L do composto. Entretanto, observou-se o efeito inverso quando aplicadas doses de
100 μmol/L. Neste mesmo trabalho, os autores observaram a indu•ƒo da produ•ƒo de 8oxiguanina DNA glicosilase (hOGG1), uma enzima envolvida no reparo do DNA, o que
sugere que o flavon„ide, em baixas concentra•–es, pode prevenir o dano e aumentar a
repara•ƒo do DNA. Tambˆm, notou-se que altas doses (acima de 50 μmol.L-1 ) a
Quercetina pode apresentar efeitos pr„-oxidante e citot„xico, que sƒo caracter†sticas
promissoras na terapia tumoral, uma vez que os efeitos pr„-oxidantes t‚m uma tend‚ncia
de iniciar a apoptose nas cˆlulas (morte programada), contribuindo no tratamento do
c‡ncer (MIN & EBELER, 2009).
3.7 COMPLEXOS MET‡LICOS DE INTERESSE BIOL•GICO
De acordo com sua atividade biol„gica, os metais podem ser divididos em dois
grupos: a) metais essenciais (Na, K, Mg, Ca, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Mo, e W),
representados por aqueles que apresentam fun•–es biol„gicas conhecidas e espec†ficas; e
b) metais nƒo essenciais (Ag, Cd, Sn, Au, Hg, Ti, Pb, Bi e Al), sem fun•–es metab„licas
conhecidas (BEVERIDGE et al., 1996).
O metais Ca, P, Na, K, Cl e Mg sƒo conhecidos como macronutrientes, pois por
serem elementos indispens…veis a s†ntese do meio intracelular devem ser ingeridos em
quantidades maiores de 100 mg por dia; enquanto os elementos Cr, Co, Cu, I, Ferro, Mo,
Mg, Se, Si, Zn e F os valores exigidos sƒo menores de 100 mg/dia, conhecidos como
micronutrientes ou oligoelementos (MURRAY et al., 2009).
Os metais essenciais desempenham diversos papˆis no metabolismo dos seres
vivos. Os elementos de transi•ƒo ligam-se firmemente a macromolˆculas, particularmente
prote†nas, e estƒo envolvidos em processos como cat…lise enzim…tica de hidr„lise ou
rea•–es de oxida•ƒo e/ou redu•ƒo. Outras fun•–es conhecidas sƒo os mecanismos de
controle de rea•–es, a estabiliza•ƒo de estruturas, a neutraliza•ƒo de cargas e o controle de
pressƒo osm„tica (MURRAY et al., 2009).
O estudo de complexos met…licos para uso na quimioterapia teve grande impulso
depois da descoberta das propriedades antitumorais do cis[(diaminodicloro)platina(II)],
38
cis[Pt(NH3 )2 Cl2 ], comumente chamado “cisplatina”, e que ˆ um dos compostos mais
utilizados no tratamento do c‡ncer hoje em dia (FONTES et al., 2005).
Esse complexo foi primeiramente descrito por Reiset em 1844, entretanto, as
propriedades antitumorais de compostos contendo platina s„ foram descobertas mais de um
sˆculo ap„s. Em 1969, o f†sico Barnet Rosenberg estava trabalhando na Universidade do
Estado de Michigan, nos Estados Unidos, procurava estudar os efeitos do campo elˆtrico
em uma cultura de bactˆrias Escherichia coli (FONTES et al., 2005).
Rosenberg observou que a divisƒo celular era inibida, e durante o processo, as
cˆlulas de E. coli, como nƒo podiam se dividir, cresciam formando filamentos alongados.
partir desta investiga•ƒo, Rosenberg afirmou que tais complexos poderiam agir de maneira
semelhante para inibir a divisƒo celular em cˆlulas tumorais. Desde entƒo, complexos de
platina t‚m sido tem…tica relevante ao longo da hist„ria da Qu†mica Bioinorg‡nica
(LOPES, 2009).
Atualmente, a cisplatina (CDDP) ˆ um dos f…rmacos mais efetivos e potentes na
terapia antitumoral, apresentando espectro de a•ƒo contra v…rios tumores s„lidos, incluindo
c‡ncer de pulmƒo, cabe•a e pesco•o, carcinoma de ov…rio (GIUBERTI, 2007).
Cl
Cl
H
H
Pt
H
N
N
H
H
H
Figura 15 - Estrutura tridimensional da cisplatina.
Um estudo demonstrou que a presen•a do flavon„ide floranol em um complexo
met…lico com †ons Cu(II) contribuiu para impedir a forma•ƒo de radicais livres, comuns na
rea•ƒo de oxi-redu•ƒo de LDL pelo metal Cobre (BOTELHO et al., 2007).
Diversos estudos t‚m revelado um aumento significativo de atividades biol„gicas
de flavon„ides ap„s complexa•ƒo. A coordena•ƒo com †ons met…licos pode potencializar
39
as atividades: antioxidante, antimicrobiana, antitumoral, antiviral, etc (GAMBINO et al.,
2011; BASTOS et al., 2010; SILVA et al., 2009; MOHAMMADI et al., 2005;
HAVSTEEN, 2002).
Uma nova estratˆgia de produ•ƒo de f…rmacos prop–e Ž coordena•ƒo de †ons
met…licos a antibi„ticos, com tr‚s frentes de estudo, a primeira tem por objetivo criar um
mecanismo de reversƒo da resist‚ncia microbiana, e, por conseguinte promover o
desenvolvimento de novas drogas com um mecanismo de a•ƒo desconhecido pelas
bactˆrias patog‚nicas, enquanto a terceira ao mesmo tempo tentar reduza a toxicidade do
†on met…lico na forma de complexo (ROCHA at al., 2011).
3.7.1 G€lio
O principal interesse cl†nico deriva da observa•ƒo que propriedades metab„licas do
g…lio sƒo similares aquelas do Fe(III), como raio i•nico, eletronegatividade, afinidade
eletr•nica, geometria de coordena•ƒo e afinidade pelos mesmos tipos de ligantes, pois
ambos mostram quase a mesma capacidade de liga•ƒo com quelatos e prote†nas. Os mais
importantes carreadores do ferro, transferrina e lactoferrina, nƒo distinguem o g…lio desse
elemento e, possivelmente, uma parte de g…lio no plasma sangu†neo esteja na forma de
complexos com estas prote†nas (MELNIKOV et. al., 2008).
O g…lio ˆ o segundo metal mais utilizado no tratamento de c‡ncer, depois da
platina. Utilizado em terapias antitumorais na forma de sais: o nitrato de g…lio e o cloreto
de g…lio. O nitrato de g…lio constitui o sal de g…lio mais utilizado para efeitos terap‚uticos
sendo ativo contra linfomas e tumores na bexiga, enquanto o cloreto de g…lio ˆ usado com
a cisplatina no tratamento do c‡ncer nos pulm–es (PARRILHA, 2012).
A administra•ƒo de g…lio em doses terap‚uticas na corrente sangu†nea resulta numa
satura•ƒo de pelo menos 90% das transferrinas do soro, que passam a receber quantidades
aproximadamente equivalentes de Ga3+ e Fe3+. Este excesso de g…lio resulta numa redu•ƒo
da dose de ferro fornecida Žs cˆlulas com a consequente quebra do n†vel de hemoglobina e
aumento dos receptores de transferrina nos linf„citos sangu†neos e nas cˆlulas. As cˆlulas
tumorais, caracterizadas por um crescimento descontrolado e acelerado, apresentam um
nŠmero mais elevado de receptores de transferrina e assim, o fornecimento de g…lio ˆ
superior nas cˆlulas tumorais. A escassez do ferro e a substitui•ƒo direta do Fe3+ por Ga3+
40
pelo centro dinuclear diminui a atividade da enzima redutase ribonucle„tica, respons…vel
pela conversƒo dos ribonucle„tidos em desoxirribonucle„tidos, como resultado as cˆlulas
cancer†genas sƒo imobilizadas na fase S, o que causa a morte celular (MATOS, 2009).
Estudos com complexos de g…lio t‚m demonstrado atividade antimicrobiana contra
isolados cl†nicos de cepas de sens†vel Ž meticilina S. aureus (MSSA), Staphylococcus
aureus resistente meticilina (MRSA), sens†vel Ž meticilina Staphylococcus epidermidis
(MSSE) e resistentes Ž meticilina S. epidermidis (MRSE) na fase logar†tmica ou
estacion…ria, e em biofilmes (BALDONI et al., 2010).
3.7.2 Cobre
O cobre ˆ um componente essencial de muitas enzimas end„genas antioxidantes,
atuando na elimina•ƒo de radicais livres que participam do processo da carcinog‚nese.
Estudos indicaram que o metal (como sais de cobre) nƒo ˆ genot„xico o que o habilita a ser
utilizado em terapias antitumorais (VALKO et al., 2006).
O cobre um dos maiores espectro de atividade antimicrobiana conhecidos:
a) fungos: Actinomucor elegans, Aspergillus N‡ger, Penicillium chrysogenum, Rhizopus
niveus; b) bact‹rias: Campylobacter jejuni, Proteus, Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Streptococcus grupo D, Pseudomonas aeruginosa, Bacterium linens, Bacillus
megaterium,
Bacillus
Achromobacter
fischeri,
subtilis,
Listeria
Brevibacterium
erythrogenes
monocytogenes,
Tubercle
Photobacterium
bacillus,
phosphoreum;
(STEINDL et al., 2012; ZHU et al., 2012; SANTO et al., 2012; GYAWALI et al., 2011;
GRASS et al., 2010; WARNES et al., 2011; KONG et al., 2010; RUPARELIA et al., 2008
e 2008; WHEELDON et al., 2008; ABUSHELAIBI et al., 2005; FAžNDEZ et al., 2004)
As propriedades antimicrobianas do cobre sƒo conhecidas h… mais de cinco
mil‚nios. No antigo Egito usaram tubos de cobre para transportar a …gua. H… registros
hist„ricos, de que em 1885, vinicultures franceses exterminaram fungos de uma videira
utilizando um Bordeaux (mistura contendo o sulfato de cobre). O cobre ˆ importante para a
melhoria da saŠde pŠblica, sendo conhecidas suas propriedades anti-pat„genicas, sendo o
tubo de cobre amplamente utilizado em encanamentos, porque ajuda a preservar a pureza
da …gua pot…vel. O cobre tem efeito antimicrobiano que pode inibir o densenvolvimento de
41
micro-organismos na …gua pot…vel, tais como: bactˆrias, v†rus, algas, e outros parasitas
infecciosos (ABUSHELAIBI, 2005).
A respira•ƒo tambˆm ˆ afetada por †ons de cobre e super„xido sobre as superf†cies
de cobre. A E. faecalis possui um citocromo BD na membrana que ˆ conhecida por se ligar
de cobre(II), o que causa a inibi•ƒo de determinados citocromos pela altera•ƒo associadas a
conforma•ƒo de transfer‚ncia eletr•nica de redutases. Isto pode explicado pela respira•ƒo
ser afetada tƒo rapidamente em in„culo seco. Por outro lado, um bloco respirat„rio pode
resultar na acumula•ƒo de subst‡ncias t„xicas intermedi…rias. Embora a atividade de
ATPase de membranas de cˆlulas de Enterococcus seja afetada por cobre solŠvel, os
nossos resultados sugerem que poucos danos a membrana enterococcal ocorre nas
superf†cies de cobre atˆ ap„s as morte celular. ‘ pouco prov…vel que a parede espessa dos
micro-organismos Gram-positivos ajude a manter a integridade da cˆlula, protegendo a
membrana do contato direto com o cobre, uma vez que a absor•ƒo de †ons de cobre ˆ
r…pida e contribui rapidamente para a destrui•ƒo de DNA e inibi•ƒo respirat„ria, mas
morfologia bacteriana parece afetar o mecanismo de toxicidade do cobre (WARNES &
KEEVIL, 2011)
Um estudo de avaliar os efeitos antimicrobianos de ligas de cobre contra
S. ent€rica demonstrou que em compara•ƒo com o a•o inoxid…vel, todas as ligas cobre
apresentaram atividade antimicrobiana contra S. enterica, como o teor de cobre nas ligas
ocorreu o aumento da atividade antimicrobiana. Mesmo as cepas resistentes a cobre s„
sobreviveram por curtos per†odos de tempo nas ligas com elevado teor de cobre. As ligas
met…licas apresentaram melhor a•ƒo inibit„ria em condi•–es secas. As cˆlulas de
Salmonella foram mais sens†veis Žs ligas de cobre, na aus‚ncia de compostos org‡nicos
(ZHU et al., 2012).
42
4 MATERIAIS E MŒTODOS
4.1 MATERIAIS
4.1.1 Reagentes e solventes
Os reagentes e solventes empregados nas s†nteses e an…lises foram adquiridos de
fontes
comerciais e utilizados sem purifica•ƒo prˆvia: Quercetina [3,3',4',5,7-
pentahidroxiflavona] (Sigma), nitrato de g…lio(III) (Sigma-Aldrich), solu•ƒo tampƒo pH
4,5, Metanol PA (F Maia) e grau espectrosc„pio (Din‡mica), DMSO grau espectrosc„pio
(Vetec), Etanol PA (Din‡mica).
4.1.2 Materiais utilizados
Visando analisar o comportamento dos compostos em diferentes grupos bacterianos
foram selecionadas para este trabalho as bactˆrias: a) gram-positivas: Staphylococcus
aureus e Enterococcus faecalis e b) gram-negativas: Escherichia coli e Pseudomonas
fluorescens (Tabela 2). Para uso nos bioensaios as bactˆrias foram reconstitu†das em …gua
destilada estˆril, semeadas em meio de cultura Muller-Hinton e incubadas a 37™C por 24
horas.
Tabela 2. Ilustra as cepas bacterianas utilizadas na avalia•ƒo de atividade antimicrobiana.
CEPA BACTERIANA
C•DIGO
Pseudomonas fluorescens
ATCC SP 13525
Escherichia coli
ATCC SP 11229
Enterococcus faecalis
ATCC SP 19433
Staphylococcus aureus
ATCC SP 25923
MARCA / LOTE
BAC-FAR (CCCD) LOTE L 1566
Julho/2011
BAC-FAR (CCCD) LOTE L 1503
Agosto/2011
BAC-FAR (CCCD) LOTE L 1499
Julho/2012
BAC-FAR (CCCD) LOTE L 1047
Julho/2011
As cepas bacterianas foram replicadas conforme o fabricante, sendo utilizadas nos bioensaios ap„s a terceira
incuba•ƒo, de acordo com a norma M7-A7 da CLSI (2006).
ATCC = American Type Culture Collection.
43
Para o controle da concentra•ƒo do in„culo bacteriano, empregado no teste de
sensibilidade a antimicrobiano por disco difusƒo, foram utilizados discos antimicrobianos
comerciais contendo antibi„ticos de uso cl†nico, conforme ilustrado na Tabela 3:
Tabela 3. Ilustra os discos antimicrobianos utilizados na avalia•ƒo de atividade
antimicrobiana.
Antibi•tico
Conte•do por disco
Marca / Di•metro
AZTREONAM (AZT)
30 Ÿg
CEFAR / 6,25 mm
CEFTAZIDIMA (CAZ)
30 Ÿg
CEFAR / 6,25 mm
CLORANFENICOL (CLO)
10 Ÿg
CEFAR / 6,25 mm
IMIPENEM (IPM)
10 Ÿg
CEFAR / 6,25 mm
TETRACICLINA (TET)
30 Ÿg
CEFAR / 6,25 mm
VANCOMICINA (VAN)
30 Ÿg
CEFAR / 6,25 mm
Os discos antimicrobianos foram armazenados sob refrigera•ƒo a 4š C, e utilizados nos bioensaios conforme
recomenda a norma M7-A7 da CLSI (2006).
Foram utilizados os seguintes reagentes e solventes: Meio de cultura Agar Muller
Hinton 500 g da marca HIMEDIA, Lotes 0000131020 e 00128764; Suabes confeccionados
em haste em pl…stico com ponta de algodƒo estˆril individual em papel grau cirŠrgico, da
marca ABSORVE, lotes 18092 e 23007; ‹lcool et†lico P.A. da marca CIN‘TICA, Lote
18366 28/JUN/2011; ‹lcool met†lico P.A. da marca CHEMCO, Lote 24247; Quercetina da
marca SIGMA, lote Q495110G 23/03/2010; Tubos de ensaio com tampa, 16X160 mm com
capacidade para 20 mL, da marca LABORGLAS; Papel de filtro qualitativo da marca J.
PROLAB, com gramatura 80 g/m2 , espessura de 205 μm, com maioria dos poros
possuindo 14 μm e permeabilidade ao ar de 14 l/s m2 .
4.1.3 Equipamentos utilizados
Foram utilizados os seguintes aparelhos e equipamentos: espectrof•tometro
UV-Vis da marca VARIAN, modelo Cary 50. Autoclave vertical da marca Phoenix
Luterco. Estufa para secagem e esteriliza•ƒo marca MARCONI, modelo MA033. Estufa
para incuba•ƒo da marca Deleo. Agitador de tubos da marca PHOENIX, modelo AP56.
44
Paqu†metro Digital da marca KING TOOLS, modelo 300 mm, precisƒo de 0,01 mm.
Refrigerador vertical marca CONSUL, modelo biplex CRM45 frost free.
4.2 MŒTODOS
4.2.1 Metodologias utilizadas nos bioensaios
As metodologias aplicadas aos bioensaios de atividade antimicrobiana foram
elaboradas conforme as normas contidas nos manuais de Metodologia dos Testes de
Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Dilui‚ƒo para Bact‹ria de Crescimento
Aer•bico e Padroniza‚ƒo dos Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos por Discodifusƒo (M7-A7 e M2-A8, respectivamente). Essas tˆcnicas sƒo recomendadas pelo
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e utilizada pela Ag‚ncia de Vigil‡ncia
Sanit…ria (ANVISA) em testes de sensibilidade a antimicrobianos.
As normas da CLSI foram adaptadas para este estudo: sendo utilizados solventes
org‡nicos na solubiliza•ƒo dos complexos met…licos e seus ligantes, e para o ajuste das
dilui•–es nos bioensaios.
4.2.2 Determina‚ƒo da Concentra‚ƒo Inibit•ria MŠnima (CIM)
Inicialmente, foram realizadas dilui•–es da subst‡ncia teste (ligantes org‡nicos e
complexos met…licos) no solvente em que apresenta melhor solubilidade, sendo ajustadas
concentra•–es derivadas de dilui•–es em sˆrie 2:1 (1000, 500, 250, 125, 62,5) e com
valores intermedi…rios (600, 400, 300, 200), sendo numeradas nove solu•–es teste nas
concentra•–es: 1000 μg/mL, 600 μg/mL, 500 μg/mL, 400 μg/mL, 300 μg/mL, 250 μg/mL,
200 μg/mL, 125 μg/mL, 62,5 μg/mL (Figura 16).
Em seguida, foram produzidos in„culos a partir das col•nias bacterianas com tempo
de incuba•ƒo recente, nƒo superior a 24 horas. Com o aux†lio de uma al•a de platina
(bacteriol„gica), retirou-se 4 col•nias bacterianas com a mesma morfologia, e diluiu-se em
tubo de ensaio contendo 4,0 mL de …gua salina (0,8% de NaCl dilu†do em …gua destilada),
utilizando-se um agitador de tubos tipo vortex.
O in„culo produzido foi ajustado Ž solu•ƒo padrƒo de 0,5 McFarland, previamente
preparada, que corresponde ao padrƒo de turva•ƒo da bacteria Escherichia coli a uma
45
concentra•ƒo de 1,5 x 108 UFC/mL (unidades formadoras de col•nias por mililitro).
Quando o in„culo nƒo alcan•ava a turva•ƒo padrƒo eram acrescentadas col•nias
bacterianas, e quando superava a escala nefelomˆtrica era adicionada …gua salina. Esta
solu•ƒo foi entƒo dilu†da em caldo Luria-Bertani1 para obter um in„culo com concentra•ƒo
de 5 x 105 UFC/mL (Figura 16).
Para a determina•ƒo da CIM foi distribu†do em cada tubo de ensaio, previamente
esterilizado, a al†quota de 1,0 mL de cada solu•ƒo teste (nas concentra•–es especificadas
no primeiro par…grafo deste item) e 1,0 mL da suspensƒo bacteriana ajustada (5 x 105
UFC/mL), exceto o tubo de controle negativo.
Os tubos de ensaio com a solu•ƒo teste foram incubados a 35š 2 por 20 horas.
Ap„s este per†odo foi avaliada a presen•a de turva•ƒo nos tubos, que indicam o
crescimento bacteriano.
A partir desta aferi•ƒo ˆ poss†vel encontrar o intervalo em que est… o valor da
concentra•ƒo inibit„ria m†nima, que ˆ a menor concentra•ƒo de composto capaz de inibir o
crescimento microbiano.
Em cada ensaio foram incubados tubos de Controle Negativo (menor concentra•ƒo
do composto e caldo LB sem in„culo); e de Controle Positivo (caldo LB e suspensƒo
bacteriana ajustada). Para cada composto foram realizadas tr‚s incuba•–es utilizando os
solventes puros, objetivando verificar a exist‚ncia de atividade antimicrobiana frente Žs
cepas bacterianas.
Os bioensaios foram realizados em duplicata com tr‚s repeti•–es para cada cepa
bacteriana; quando detectado erro ou contamina•ƒo o resultado foi descartado e o teste
refeito.
1
Caldo Luria-Bertani
Ingredientes: Triptona 10 g; Extrato de Levedura 5 g; NaCl 10 g. Preparo: Dissolve-se os componentes em
um 1,0 litro de …gua destilada ou deionizada sob agita•ƒo e calor, ap„s esteriliza-se a solu•ƒo resultante em
autoclave a temperatura de 121-124™C e pressƒo de 1 atm por 15 minutos. (SAMBROOK & RUSSELL,
2001)
46
Figura 16. Ilustra a metodologia utilizada para determina•ƒo da CIM. Fonte: Pr„prio autor.
47
4.2.3 Determina‚ƒo da Concentra‚ƒo Bactericida MŠnima (CBM)
Em conjunto aos procedimentos para determina•ƒo da Concentra•ƒo Inibit„ria
M†nima, foram iniciados os procedimentos para determina•ƒo da Concentra•ƒo Bactericida
M†nima pelo mˆtodo de plaqueamento em meio de cultura (Figura 17).
Figura 17. Ilustra a metodologia utilizada para determina•ƒo da CBM. Fonte: Pr„prio autor.
48
Em conjunto aos procedimentos para determina•ƒo da CIM, foram iniciados os
procedimentos para determina•ƒo da Concentra•ƒo Bactericida M†nima (CBM). Ap„s o
per†odo de incuba•ƒo para determina•ƒo da CIM foi retirada uma al†quota de 0,1 mL de
cada tubo de ensaio, inclusive do controle positivo, negativo (sem in„culo). Os in„culos
foram distribu†dos sobre a superf†cie do meio de cultura em placas de petri, com o aux†lio
de uma al•a de Drigalski pr„ximo ao Bico de Bunsen.
As placas de petri inoculadas foram incubadas a temperatura de 35š+/-2 por 20
horas. As placas foram incubadas a temperatura de 35š+/-2 por 20 horas. Ap„s este per†odo
foi observado Ž presen•a de col•nias bacterianas em cada placa.
A CBM foi determinada como sendo a menor concentra•ƒo do composto capaz de
impedir o crescimento microbiano em meio de cultura (forma•ƒo de col•nias bacterianas).
Os bioensaios foram realizados em duplicata com tr‚s repeti•–es para cada cepa
bacteriana; quando detectado erro ou contamina•ƒo o resultado foi descartado e o teste
refeito.
4.2.4 Teste de sensibilidade a antimicrobiano (TSA)
O teste de sensibilidade a antimicrobiano foi realizado conforme o mˆtodo de disco
difusƒo em meio de cultura Muller-Hinton (mˆtodo de Kirby-Bauer), utilizando discos de
papel de filtro estˆreis saturados com as solu•–es teste avaliadas.
Primeiramente, foram obtidos discos de papel filtro com 6 mm de di‡metro (com
aux†lio de um perfurador de papel), sendo separados 40 discos em placas de petri com
tampa, as quais foram esterilizadas durante 15 minutos em autoclave a 121šC e pressƒo de
1 atm. Em seguida, os discos foram secos em estufa a 100šC por 45 minutos, e
impregnados com 4,0 mL da solu•ƒo teste a ser avaliada, conforme a CIM determinada nos
bioensaios.
Em seguida, foi distribu†do 20,0 mL de meio de cultura em placas de petri estˆreis.
Ap„s a solidifica•ƒo do meio, as placas foram deixadas com a tampa entreaberta por dois
minutos na estufa de incuba•ƒo, posteriormente tampadas e viradas, e quando nƒo
utilizadas armazenadas sob refrigera•ƒo.
49
As placas com meio de cultura podem ser conservadas em geladeira a 4š C por atˆ
uma semana (Obs.: antes do uso as placas contendo meio de cultura devem ser retiradas da
geladeira e colocadas em estufa a 25šC por cerca de 30 minutos).
Ap„s os procedimentos preparat„rios para TSA, foram produzidos in„culos a partir
das col•nias bacterianas com tempo de incuba•ƒo recente, nƒo superior a 24 horas. Com o
aux†lio de uma al•a de platina (bacteriol„gica), retirou-se 4 col•nias bacterianas com a
mesma morfologia, e diluiu-se em tubo de ensaio contendo 4,0 mL de …gua salina (0,8% de
NaCl dilu†do em …gua destilada), utilizando-se um agitador de tubos tipo vortex (Figuras
18a e 18b).
O in„culo produzido foi ajustado a escala nefelomˆtrica de 0,5 McFarland, que
corresponde ao padrƒo de turva•ƒo da bacteria Escherichia coli a uma concentra•ƒo a
1,5 x 108 UFC/mL. Quando o in„culo nƒo alcan•ava a turva•ƒo eram acrescentadas
col•nias bacterianas, e quando superava a escala nefelomˆtrica …gua salina.
Posteriormente, foi realizada a inocula•ƒo do meio de cultura, inserindo-se um
suabe estˆril no tubo de ensaio contendo o in„culo bacteriano ajustado (1,5 x 10 8
UFC/mL). Em seguida, pressionou-se o suabe contra a parede do tubo para retirar o
excesso, e distribui-se o in„culo sobre a superf†cie do meio de cultura, com uma inclina•ƒo
de aproximadamente 60š, espalhando-o em tr‚s dire•–es diferentes, duas em ‡ngulo reto
(Figuras 18c e 18d). Logo depois, as placas foram colocadas para secar em estufa de
incuba•ƒo a uma temperatura de 35šC durante 10 minutos (Figura 18e).
Em seguida, foram colocados em cada placa de petri 5 discos antimicrobianos
impregnados com o composto. Um disco foi disposto no centro da placa de petri e os
outros quatro ao redor, atentando-se para que a dist‡ncia do centro a outro disco nƒo fosse
inferior a 20 mm, e que o disco nƒo ficasse pr„ximo Ž borda da placa (Figura 18f).
As placas foram incubadas em estufa a uma temperatura de 35šC durante
18 horas. Ap„s este per†odo foram realizadas medi•–es dos halos de inibi•ƒo produzidos ao
redor dos discos (incluindo di‡metro do disco), com o auxilio de um paqu†metro digital.
Foram considerados como resultado positivo as zonas de inibi•ƒo superiores a 7 mm de
di‡metro (Figuras 18g e 18h).
Para o controle negativo ou ambiental foram inseridas em cada incuba•ƒo uma
placa de petri contendo apenas o meio de cultura Muller-Hinton sem in„culo, para
50
averiguar alguma contamina•ƒo durante o procedimento. Para o controle da concentra•ƒo
do in„culo foram incubadas, em cada bioensaio, duas placas de petri contendo discos
antimicrobianos padronizados (Tabela 3).
Os bioensaios foram realizados em triplicata com tr‚s repeti•–es, e quando
detectada contamina•ƒo os resultados foram descartados e o teste foi refeito. A mˆdia da
medida dos halos de inibi•ƒo obtida para cada composto foi calculada.
Figura 18. Etapas do teste de sensibilidade a antimicrobiano. Fonte: Figuras 18a a 18f
reproduzidas do manual LABORCLIN (2011), demais pr„prio autor.
51
Figura 19. Ilustra a forma de medi•ƒo dos halos de inibi•ƒo. Fonte: Pr„prio autor.
4.2.5 An€lise EstatŠstica
Os resultados obtidos nos Testes de Sensibilidade a Antimicrobiano pelo mˆtodo de
disco difusƒo foram analisados estatisticamente utilizando as ferramentas dispon†veis no
software BioEstat 5.0. Os gr…ficos estat†sticos foram produzidos a partir do programa
OriginPro 8.5 e SigmaPlot 12.0.
As medidas dos halos de inibi•ƒo foram avaliadas estatisticamente por meio de
an…lise de vari‡ncia (ANOVA) pelo teste de Tukey (p<0,05) em cada bioensaio; e as
mˆdias das medidas dos halos foram comparadas entre si pelo teste de Kruskal-Wallis
(p<0,05), que ˆ um teste nƒo-paramˆtrico apropriado para compara•–es de 3 ou mais
amostras independentes (AYRES et al., 2007).
52
4.2.6 Padrƒo de turbidez do in•culo
Conforme recomenda a norma M7-A7 da CLSI, Metodologia dos Testes de
Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Dilui•ƒo para Bactˆria de Crescimento
Aer„bico, para os bioensaios de sensibilidade antimicrobiana, foi criado um padrƒo de
turva•ƒo de acordo com escala nefelomˆtrica de McFarland. Para este fim foi preparada
uma solu•ƒo de BaSO4 , equivalente a solu•ƒo padrƒo McFarland de 0,5, seguindo os
procedimentos descritos na sequ‚ncia:
Primeiramente, acrescenta-se uma al†quota de 0,5 mL de uma solu•ƒo aquosa 0.048
mol/L de BaCl2 (1,175% p/v BaCl2 • 2H2 O) a 99,5 mL de uma solu•ƒo aquosa 0,18 mol/L
de H2 SO4 (1% v/v), sendo a mistura agitada constantemente para manter a suspensƒo.
Em
seguida,
verifica-se
a
densidade
da
solu•ƒo
padrƒo
usando
um
espectrofot•metro UV-Vis, com fonte de luz de 1 cm e cubetas apropriadas para
determinar a absorb‡ncia. Nesse caso, a absorb‡ncia correta no comprimento de onda de
625 nm deve variar de 0,08 a 0,13 para a solu•ƒo padrƒo McFarland de 0,5, que equivale a
turva•ƒo do in„culo bacteriano de Escherichia coli a concentra•ƒo de 1,5 x 10 8 UFC/mL
(unidades formadoras de col•nia por mililitro).
Posteriormente, uma al†quota de 4,0 mL da suspensƒo de sulfato de b…rio ˆ
transferida para um tubo de ensaio com tampa de rosca, hermeticamente fechado, do
mesmo material e tamanho usado para cultivar e diluir o in„culo bacteriano usado nos
bioensaios. O tubo de ensaio contendo o padrƒo de turva•ƒo deve ser armazenado em local
escuro, e a temperatura ambiente atˆ o momento do uso.
Antes do uso a solu•ƒo do padrƒo de turba•ƒo deve ser agitada vigorosamente num
misturador mec‡nico tipo v„rtex, verificando a uniformidade de turbidez. O controle de
sulfato de b…rio deve ser substitu†do sempre que constatada altera•ƒo em sua densidade
padrƒo, o qual pode ser confirmado pelo espectrofot•metro UV-Vis.
53
4.3 SˆNTESES DOS COMPOSTOS QUˆMICOS
4.3.1 Complexo Met€lico 1: Quercetina e Šons de Ga(III)
A s†ntese do complexo de quercetina e †ons Ga(III) foi obtida pela metodologia
proposta por Sim–es (2012), a qual reagiu o flavon„ide quercetina com o sal nitrato de
g…lio(III) em uma estequiometria 3:1. Essa s†ntese foi realizada da seguinte forma: a uma
solu•ƒo de 0,042 g de nitrato de g…lio em 10 mL de …gua, com agita•ƒo e aquecimento,
adicionou-se uma solu•ƒo do flavon„ide quercetina (0,151 g) que foi solubilizada em
aproximadamente 10 mL de etanol.
A solu•ƒo amarelada resultante foi colocada em agita•ƒo e aquecimento por
20 minutos, sendo adicionada tr‚s gotas de uma solu•ƒo tampƒo pH 4,5 (…cido
acˆtico/acetato de s„dio), o que resultou na mudan•a de colora•ƒo para laranja.
Manteve-se a solu•ƒo em refluxo por 4 horas, e ap„s algumas 10 horas se obteve a
forma•ƒo de um s„lido amorfo de colora•ƒo esverdeada, que foi filtrado e devidamente
seco. A Figura 20 ilustra a estrutura proposta para o complexo mononuclear de Ga(III).
Figura 20 - Ilustra a estrutura qu†mica proposta para o complexo 1 (SIM”ES, 2012).
Os resultados de CHN (an…lise elementar de Carbono, Hidrog‚nio e Nitrog‚nio) e
espectroscopia no infravermelho indicam a forma•ƒo de um complexo met…lico
mononuclear com grau de pureza adequado para a utiliza•ƒo nos bioensaios. A an…lise
54
elementar de CHN para GaC45 H39 O27 : MM = 1.081,51 g mol-1 ; calculado: C = 49,98 % e H
= 3,63 %; encontrado: C = 49,41 % e H = 3,51 %.
4.3.2 Ligante Sint‹tico H2bbppd
O ligante sintˆtico N,NŒ,N,NŒ-bis[2-hidroxi-3,5-di-terc-butilbenzil)(2-piridilmetil)]1-3-diaminopropano, identificado neste trabalho como H2bbppd (Figura 21a) foi
sintetizado (CABEZA et al. 2010) a partir de uma rea•ƒo de amina•ƒo redutiva, onde se
reagiu 1,3-diaminopropano com 2-piridinacarboxialde†do, obtendo-se uma imina que foi
reduzida Ž respectiva amina com NaBH4 .
Em seguida, reagiu-se a amina com o precursor CMTBF sintetizado como descrito
por dos Anjos (2005). O ligante foi obtido na forma de um „leo esverdeado, que foi
recristalizado em isopropanol, atˆ a precipita•ƒo de um p„ branco.
Os resultados dA an…lise elementar de CHN e espectroscopia no infravermelho e
1
RMN H indicam a forma•ƒo do ligante com grau de pureza adequado para a utiliza•ƒo
nos bioensaios e na s†ntese do complexo de Cu(II). A an…lise elementar de CHN para
C45 H64 N4 O2: MM = 693 g mol-1 ; C = 77,99; H = 9,31; N = 8,08 %. Encontrada:
C = 77,51; H = 9,42; N = 8,20 %. IV (KBr), em cm-1 : 3400-3300 (OH); 2956 (C-H, t-butil);
1596, 1477 (C=N,C=C , arom…ticos); 1394 (O-H, fenol); 1362 (C-H, terc-butil);
1237 (C-O, fenol); 879 (C-H, arom…ticos); 756 (C-H piridina).
4.3.3 Complexo Met€lico 2: H2bbppd e Šons Cu(II)
O complexo met…lico foi sintetizado, conforme a metodologia descrita por Favarin
et al. (2010): a partir de uma solu•ƒo de Acetato Cuprico - Cu(CH3 COO)2 .H2 O (0,10 g; 0,5
mmol) em 20 mL de metanol, sob agita•ƒo e leve aquecimento, adicionou-se uma solu•ƒo
metan„lica do ligante sintˆtico H2bbppd (0,35 g; 0,5 mmol; 10 mL de metanol). A solu•ƒo
pŠrpura resultante permaneceu sob agita•ƒo e aquecimento por aproximadamente 15
minutos. Em seguida adicionou-se Perclorato de Pot…ssio - KClO4 (0,07 g; 0,5 mmol).
Deixou-se reagir, sob agita•ƒo e aquecimento, atˆ a redu•ƒo do volume Ž metade,
entƒo se filtrou e deixou em repouso. Ap„s dois dias Ž temperatura ambiente, houve a
forma•ƒo de um precipitado pŠrpura microcristalino o qual foi filtrado e lavado com
55
metanol e ˆter et†lico gelados, e posteriormente seco. Ao complexo met…lico mononuclear
foi proposta a estrutura qu†mica ilustrada na Figura 21b.
Os resultados dA an…lise elementar de CHN e espectroscopia no infravermelho
indicam a forma•ƒo de um complexo met…lico mononuclear com grau de pureza adequado
para
a
utiliza•ƒo
nos
bioensaios.
A
an…lise
elementar
de
CHN
para
-1
CuC45 H63 N4 O2.ClO4 .CH3 OH: MM = 887,03 g/mol ; C = 62,29; H = 7,61; N = 6,32 %.
Encontrada: C = 62,63; H = 7,52; N = 6,46 %. IV (KBr), em cm-1 : 3400-3300 (O-H); 2956
(C-H, terc-butil); 1610-1445 (C=N,C=C, arom…ticos); 1390 (O-H, fenol); 1362 (C-H, tercbutil); 1234 (C-O, fenol); 1096 ( Cl-O, ClO4 ); 880 (C-H, arom…ticos); 763 (C-H, piridina).
N
N
N
Cu
N
O
O
H
B
A
Figura 21 – As estruturas qu†micas para: o ligante sintˆtico H2bbppd (a) e o complexo 2
(b) (CABEZA et al., 2010; FAVARIN et al., 2010)
Tabela 4. Tabela de solubilidade dos compostos.
SOLVENTES UTILIZADOS
Etanol
Metanol
DMSO
‡gua
Quercetina
SOLžVEL
PARCIALMENTE
PARCIALMENTE
INSOLžVEL
H2bbppd
PARCIALMENTE
SOLžVEL
PARCIALMENTE
INSOLžVEL
Complexo Met…lico 1
PARCIALMENTE
SOLžVEL
PARCIALMENTE
INSOLžVEL
Complexo Met…lico 2
SOLžVEL
SOLžVEL
SOLžVEL
INSOLžVEL
H2bbppd = Ligante
diaminopropano.
sintˆtico
Œ
N,N ,N,NŒ-bis[2-hidroxi-3,5-di-terc-butilbenzil)(2-piridilmetil)]-1-3-
OS
56
5. RESULTADOS E DISCUSS’ES
5.1 CARACTERIZA„…O
a) Complexo 1: Quercetina e Šons Ga(III)
O complexo foi preparado, pelo grupo de pesquisa de S†ntese e Caracteriza•ƒo de
Complexos Met…licos da UEMS - Unidade Universit…ria de Navira†, a partir do ligante
natural quercetina e nitrato de g…lio(III) em pH 4,5. A confirma•ƒo do complexo foi obtida
a partir de caracteriza•–es viA an…lise elementar de CHN e espectroscopia no IV,
conforme descrito na se•ƒo experimental (SIM”ES, 2012).
b) Ligante H2bbppd e Complexo 2 [H2bbppd e Šons Cu(II)]
O ligante sintˆtico N,NŒ,N,NŒ-bis[2-hidroxi-3,5-di-terc-butilbenzil)(2-piridilmetil)]1-3-diaminopropano e seu complexo met…lico contendo †ons Cu(II) tambˆm foram
sintetizados pelo grupo de pesquisa de S†ntese e Caracteriza•ƒo de Complexos Met…licos
da UEMS - Unidade Universit…ria de Navira†. A confirma•ƒo do complexo foi obtida a
partir de caracteriza•–es de an…lise elementar de CHN, espectroscopia no IV, conforme
descrito na se•ƒo experimental (CABEZA et al., 2010; FAVARIN et al., 2010).
5.2 BIOENSAIOS
5.2.1 Concentra‚ƒo Inibit•ria MŠnima e Concentra‚ƒo Bactericida
MŠnima
Inicialmente, foram realizadas duas rotinas de bioensaios frentes a cepas
bacterianas utilizando a quercetina pura dilu†da em etanol e metanol. Estes bioensaios
objetivaram avaliar a atividade antimicrobiana do flavon„ide e produzir padr–es de
refer‚ncia, possibilitando a compara•ƒo com resultados de bioensaios utilizando
complexos met…licos sintetizados a partir deste ligante natural.
Os resultados demonstram suscetibilidade das cepas testadas ao flavon„ide
quercetina, apresentando valores de CIM diferentes quando utilizado como solvente o
etanol (400 μg/mL) e o metanol (500 μg/mL). Provavelmente, devido a solubilidade da
57
quercetina em diferentes solventes, assim como descrito por Razmara et al. (2010), que
determinou a seguinte ordem de solubilidade: ETANOL > METANOL > ‹GUA.
O efeito da quercetina sobre o crescimento bacteriano foi semelhante quando
utilizado o mesmo solvente nas dilui•–es, o que pode indicar um mesmo mecanismo de
a•ƒo frente a bactˆrias Gram-positivas e negativas.
Diversos estudos t‚m relatado que a atividade antimicrobiana dos flavon„ides pode
estar relacionada Ž sua habilidade de formar complexos com prote†nas solŠveis
extracelulares e com a parede celular, ou ainda pelo car…ter lipof†lico destes compostos,
que podem ser capazes de causar a ruptura da membrana celular dos micro-organismos
(SARTORI, 2005).
Bem como, os flavon„ides sem grupos hidroxila ligados ao anel B (Figura 15)
possuem maior atividade contra micro-organismos, o que indica que o s†tio de a•ƒo destes
compostos possa ser a membrana dos micro-organismos. Este fato refor•a a hip„tese de
que o s†tio de a•ƒo dos flavon„ides seja a membrana plasm…tica (COWAN, 1999).
Alˆm do mais, nas bactˆrias a permeabilidade da membrana est… associada Ž perda
dos †ons e a redu•ƒo do potencial da membrana (TROMBETA et al., 2005). E, danos na
membrana celular podem causar o extravasamento de macromolˆculas, acarretando um
colapso das fun•–es celulares e consequentemente a morte bacteriana (TORTORA et al.,
2003).
Os valores da CIM para o complexo met…lico 1 indicam um aumento da atividade
antimicrobiana da quercetina ap„s a complexa•ƒo com †ons de Ga(III), bem como sugerem
que o composto compartilha o mesmo mecanismo de a•ƒo de seu ligante (Tabela 7).
Os resultados obtidos com o complexo met…lico 2 sugerem um aumento da
atividade antimicrobiano ap„s a complexa•ƒo do sintˆtico H2bbppd com †ons de Cu(II).
Estudos demonstram que complexos met…licos com †ons cobre penetram mais facilmente
na parede celular bacteriana, pela desnatura•ƒo protˆica de componentes do grupo
sulfidrila (GOULART, 2011), destruindo a parede celular bacteriana.
O fato de alguns complexos nƒo serem mais ativos que os ligantes pode ser devido
Ž baixa solubilidade, instabilidade, diminui•ƒo do car…ter lipof†lico do complexo obtido ou
a fatores relacionados ao mecanismo de a•ƒo. Antibi„ticos frequentemente exibem mais de
um s†tio de coordena•ƒo e a introdu•ƒo de um †on met…lico em um determinado s†tio pode
inativar o f…rmaco ao invˆs de potencializar sua atividade (ROCHA et al., 2011).
58
A an…lise dos resultados admite duas hip„teses para o mecanismo de a•ƒo dos
complexos met…licos avaliados: 1) Modifica•ƒo na membrana plasm…tica que causou perda
de constituintes celulares; 2) Inibi•ƒo da s†ntese de constituintes da parede celular. Sendo
necess…ria a realiza•ƒo de estudos espec†ficos para a determina•ƒo destes mecanismos.
Nƒo foram encontrados na literatura critˆrios para categorizar a atividade
antimicrobiana de compostos fen„licos e complexos met…licos utilizados neste trabalho.
Contudo, diversos trabalhos t‚m empregado uma classifica•ƒo baseada nos resultados da
CIM para avaliar a atividade antimicrobiana de extratos vegetais e suas fra•–es, como:
BOA - CIM inferior a 100 Ÿg/mL; MODERADA - CIM entre 100 e 500 Ÿg/mL; FRACA CIM entre 500 e 1000 Ÿg/mL; e INATIVA quando a CIM for superior a 1000 Ÿg/mL
(Holetz et al., 2002; Dalmarco, 2010). Desse modo, avaliou-se a atividade antimicrobiana
dos complexos met…licos 1 e 2 como BOA e a de seus ligantes como MODERADA.
O efeito inibit„rio dos complexos met…licos 1 e 2 foi determinado como
BACTERICIDA, conforme sugerido por Berche et al. (1988), que na propor•ƒo entre
CBM/CIM ≤ 4 o agente ser… bactericida, e quando > 4 bacteriost…tico (Abou et al., 2013;
Konatˆ et al., 2012). Alˆm disso, os compostos avaliados inibiram o crescimento de
bactˆrias Gram-positivas (e.g. S. aureus e E. faecalis) e Gram-negativas (e.g. E. coli e P.
fluorescens), o que indica um amplo espectro da atividade, e abre perspectivas de que os
mesmos possam ser utilizados como futuros f…rmacos.
A microbiologia reconhece que as bactˆrias Gram-negativas possuem mecanismos
especializados em expulsar subst‡ncias estranhas para fora da cˆlula (bomba de efluxo),
limitando o acesso do agente antimicrobiano ao seu s†tio de a•ƒo, prevenindo o acŠmulo de
antibi„tico no interior da cˆlula, e inibindo a a•ƒo do antimicrobiano (Reichling et al.,
2005). Apresentam, ainda, no espa•o periplasm…tico com enzimas capazes de inativar
f…rmacos (β-lactamases) tornando a cˆlula resistente a eles (SILVA, 2011).
De modo an…logo, as bactˆrias Gram-positivas protegem sua membrana
citoplasm…tica com uma parede celular espessa. As muitas camadas de peptidoglicanos
impedem a passagem de compostos hidrof„bicos, devido Ž presen•a de a•Šcares e
amino…cidos (SARTORI, 2005).
Nesse sentido, vem ganhando espa•o no campo acad‚mico pesquisas que busquem
produzir compostos com amplo espectro de atividade, e que ainda apresentem mecanismos
de a•ƒo desconhecidos pelas bactˆrias patog‚nicas.
59
Tabela 5. Resultados da Concentra•ƒo Inibit„ria M†nima (CIM) e Concentra•ƒo Bactericida
M†nima (CBM) em μg/mL dos compostos.
Composto
EtOH
MeOH
QEtOH
QMeOH
CM1
H2bbppd
CM2
Solvente
Etanol
Metanol
Etanol
Metanol
Metanol
Etanol
Etanol
Concentra‚ƒo Inibit•ria MŠnima e
Concentra‚ƒo Bactericida MŠnima (μg/mL)
Bact‹rias Gram-Negativas
Bact‹rias Gram-Positivas
S. aureus
E. faecalis
E. coli
P. fluorescens
CIM
CBM CIM CBM CIM CBM CIM CBM
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
400
1000
400
1000
400
1000
400
1000
500
>1000 500 >1000 500 >1000 500 >1000
250
500
250
500
250
500
250
500
250
500
250
500
250
500
250
500
125
250
125
250
125
250
125
250
EtOH = Solvente etanol puro; MeOH = Solvente metanol puro; QEtOH = Quercetina dilu†da em Etanol;
QMeOH = Quercetina dilu†da em Metanol; CM1 - Complexo met…lico 1; H2bbppd = Ligante sintˆtico
H2bbppd; CM2 = Complexo met…lico 2. R = Nenhuma inibi•ƒo de crescimento bacteriano foi observada
5.2.2 Teste de Sensibilidade a Antimicrobiano
A interpreta•ƒo dos resultados dos testes de sensibilidade a antimicrobiano deve ser
realizada em conjunto com os valores da concentra•ƒo inibit„ria m†nima, objetivando
avaliar o potencial de inibi•ƒo bacteriana dos compostos testados.
Um antimicrobiano ideal deve possuir as seguintes caracter†sticas: a) que seja
t„xico para o micro-organismo patog‚nico, mas nƒo t„xica Žs cˆlulas hospedeiras; b)
microbicida em vez de microbiost…tico; c) relativamente solŠveis, com mesmas fun•–es
quando altamente dilu†do em flu†dos corporais; d) facilmente transportado para o s†tio da
infec•ƒo; e) que nƒo perturbe a saŠde do hospedeiro causando alergias ou predisposi•ƒo do
hospedeiro a outras infec•–es; e f) que possua pre•o razo…vel de produ•ƒo (TORTORA
et al., 2010).
A an…lise estat†stica detectou uma distribui•ƒo normal dos dados, nƒo sendo
observados valores discrepantes (outliers). Os dados obtidos nos testes de sensibilidade a
antimicrobiano (TSA) foram submetidos Ž An…lise de Vari‡ncia-ANOVA, seguido do teste
de Tukey (dados paramˆtricos); sendo as mˆdias comparadas pelo teste de Kruskal Wallis,
seguido do teste de Dunn (dados nƒo-paramˆtricos). O intervalo de confian•a foi de 95%,
sendo considerado estatisticamente diferente quando p > 0,05. A distribui•ƒo dos dados
podem ser observada na figura 22.
60
Figura 22 - Ilustra diagramas em caixa dos resultados do teste de sensibilidade a
antimicrobiano utilizando diferentes compostos. A = Quercetina dilu†da em etanol; B =
Quercetina dilu†da em metanol; C = Ligante sintˆtico H2bbppd; D = Complexo met…lico 1; E =
Complexo met…lico 2.
O complexo met…lico 1 apresentou efeito inibit„rio superior a seu ligante, com
halos de inibi•ƒo maiores utilizando metade da concentra•ƒo empregada no bioensaio com
a quercetina (CIM de 250 μg/mL). A menor suscetibilidade ao composto foi observada
61
frente Ž Escherichia coli, com valores relativamente menores, o que nƒo descarta a
utiliza•ƒo deste composto no tratamento de infec•–es provocadas por esta cepa.
Tabela 6. Di‡metro do halo de inibi•ƒo, mˆdia e desvio padrƒo (mm), pela a•ƒo do flavon„ide
quercetina dilu†do em diferentes solventes.
SOLVENTE UTILIZADO
Bact‹ria Gram-Positiva (ATCC)
Staphylococcus aureus (25923)
Enterococcus faecalis (19433)
MŒDIA
CIM (μg/mL)
Bact‹ria Gram-Negativa (ATCC)
Escherichia coli (11229)
Pseudomonas fluorescens (13525)
MŒDIA
CIM (μg/mL)
Etanol
Metanol
400
500
11,43 1,17 Aa 9,84 1,24 Aa
14,20 1,67 Ba 10,37 0,57 Ab
12,81
10,10
400
500
11,80 2,80 Aa 10,50 1,70 Ab
13,14 1,42 Ba 10,28 0,66 Ab
12,47
10,39
Mˆdias seguidas pela mesma letra maiŠscula nas colunas e minŠsculas nas linhas nƒo diferem significamente
entre si, pelo teste de Kruskal-Wallis com 95% de confian•a.
Tabela 7. Di‡metro do halo de inibi•ƒo, mˆdia e desvio padrƒo (mm), pela a•ƒo da quercetina
dilu†da em metanol e complexo met…lico 1.
COMPOSTO UTILIZADO
Bact‹ria Gram-Positiva (ATCC)
Staphylococcus aureus (25923)
Enterococcus faecalis (19433)
MŒDIA
CIM (μg/mL)
Bact‹ria Gram-Negativa (ATCC)
Escherichia coli (11229)
Pseudomonas fluorescens (13525)
MŒDIA
CIM (μg/mL)
QMeOH
500
9,84 1,24 Aa
10,37 0,57 Aa
10,10
500
10,50 1,70 Ab
10,28 0,66 Aa
10,39
CM1
250
13,26 1,16 Ab
12,58 1,53 Ab
12,94
250
10,90 1,82 Bb
13,36 1,38 Ab
12,13
Mˆdias seguidas pela mesma letra maiŠscula nas colunas e minŠsculas nas linhas nƒo diferem significamente
entre si, pelo teste de Kruskal-Wallis com 95% de confian•a. QMeOH = Quercetina dilu†da em Metanol;
CM1 = Complexo met…lico 1 dilu†do em metanol.
O mecanismo de a•ƒo inibit„ria do complexo 1 pode estar relacionado Ž habilidade
do †on g…lio de penetrar no corpo celular das bactˆrias atravˆs de mecanismos de transporte
de ferro, reduzindo a absor•ƒo deste, e interferindo no metabolismo do Fe e na s†ntese do
DNA e de prote†nas essenciais (KANEKO et al., 2007).
62
Os resultados do TSA com o complexo met…lico 2 demonstraram maior atividade
antimicrobiana que o ligante livre, com halos de inibi•ƒo relativamente maiores utilizando
metade da concentra•ƒo utilizada para o bioensaio com o ligante (CIM de 125 μg/mL).
A maior suscetibilidade foi observada frente Ž bactˆria Enterococcus faecalis,
apresentando halo de inibi•ƒo de 18,68 mm (Tabela 8). Indicando um potencial
farmacol„gico no controle de crescimento desta bactˆria, citada como a primeira das tr‚s
principais causas de infec•–es hospitalares (WILLEY, 2008).
Tabela 8. Di‡metro do halo de inibi•ƒo, mˆdia e desvio padrƒo (mm), pela a•ƒo do Ligante
Sintˆtico H2bbppd e complexo met…lico 2.
COMPOSTO UTILIZADO
Bact‹ria Gram-Positiva (ATCC)
CIM (μg/mL)
H2bbpppd
250
CM2
125
Staphylococcus aureus (25923)
10,63
Enterococcus faecalis (19433)
MŒDIA
11,15 1,64 Aa 18,68 2,68 Bb
10,89
14,81
250
125
Bact‹ria Gram-Negativa (ATCC)
CIM (μg/mL)
1,39 Aa 10,95
0,74 Aa
Escherichia coli (11229)
12,56
Pseudomonas fluorescens (13525)
MŒDIA
12,74 2,50 Ba 13,76 0,95 Cb
12,65
12,86
2,40 Ba 11,96
2,54 Ab
Mˆdias seguidas pela mesma letra maiŠscula nas colunas e minŠsculas nas linhas nƒo diferem significamente
entre si, pelo teste de Kruskal-Wallis com 95% de confian•a. H2bbppd = Ligante sintˆtico H2bbppd dilu†do
em etanol; CM2 = Complexo met…lico 2 dilu†do em etanol.
Os complexos met…licos 1 e 2 apresentam caracter†sticas de antimicrobianos, tais
como: baixa concentra•ƒo inibit„ria m†nima (CIM ≤ 250 Ÿg/mL), efeito bactericida e
amplo espectro da atividade.
No entanto, para confirma•ƒo do potencial farmacol„gico destes compostos sƒo
necess…rios estudos de avalia•ƒo da toxicidade. Uma vez que, os estudos de toxicidade
auxiliam na triagem de uma grande variedade de compostos com atividade biol„gica para
definir seu potencial de aplica•ƒo terap‚utica mensurando a toxicidade apresentada dos
poss†veis futuros f…rmacos (Carballo et al., 2002).
O gr…fico comparativo demonstra uma maior atividade antimicrobiana do ligante
sintˆtico H2bbpppd frente Žs cepas bacterianas Gram-negativas (E. coli e P. Fluorescens),
63
sendo observado um comportamento totalmente distinto pela a•ƒo do complexo met…lico 2,
sintetizado a partir desse ligante. O que pode indicar que o complexo met…lico 2 apresenta
um mecanismo de inibi•ƒo diferente a do seu ligante (Figura 23).
Tambˆm pode ser observado no gr…fico que os complexos met…licos 1 e 2
apresentaram menor atividade antibacteriana frente a Escherichia coli em compara•ƒo aos
resultados com outras bactˆrias, que pode estar relacionada aos mecanismos de resist‚ncia
da espˆcie, como exemplo o reservat„rio de genes de resist‚ncia a antibi„ticos, que permite
a evolu•ƒo em formas resistentes aos medicamentos (TORTORA, 2010).
O complexo 2 com †ons Cu(II) foi o composto que apresentou a maior atividade
antibacteriana frente a todas as bactˆrias. Essa atividade pode ser resultado da estabilidade
do complexo met…lico com o ligante sintˆtico.
Figura 23 - Ilustra resultados do teste de sensibilidade a antimicrobiano. QEtOH = Quercetina dilu†da em
etanol; QMeOH = Quercetina dilu†da em metanol; H2bbpppd = Ligante sintˆtico H2bbppd; CM1 =
Complexo met…lico 1; CM2 = Complexo met…lico 2.
64
A cepa Pseudomonas fluorescens demonstrou ser eficiente para avaliar a atividade
antibacteriana de complexos met…licos e de seus ligantes org‡micos. Pois apresentou alta
sensibilidade aos compostos testados na determina•ƒo da CIM e CBM, e halos de inibi•ƒo
no TSA entre 10,39 e 13,76 mm. Alˆm do mais, possui „timo crescimento microbiano,
com col•nias de f…cil visualiza•ƒo.
65
6 CONCLUS…O
Este trabalho buscou avaliar metodologias de baixo custo capazes de determinar a
CIM e CBM, e realizar o TSA, de acordo com normas para teste de sensibilidade
antimicrobiana com antibi„ticos e metodologias empregadas em estudos de atividade
antimicrobiana com extratos vegetais.
Os resultados demonstraram boa efici‚ncia e reprodutividade das metodologias
utilizadas para a avalia•ƒo da atividade antimicrobiana dos complexos met…licos e
respectivos ligantes livres (nƒo coordenados). Os dados produzidos nos bioensaios sƒo
quantitativos e/ou qualitativos, relacionados Ž suscetibilidade das cepas bacterianas aos
compostos testados.
Foram utilizadas bactˆrias gram-negativas (Pseudomonas fluorescens e Escherichia
coli) e gram-positivas (Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis), com o objetivo de
testar a a•ƒo das subst‡ncias avaliadas em cˆlulas com diferentes morfologias. No entanto,
os resultados indicam nƒo existir diferen•a estat†stica da atividade antimicrobiana do
composto relacionada ao grupo em que pertence a bactˆria.
A an…lise dos resultados revelou atividade antimicrobiana nos complexos met…licos
de quercetina com †ons Ga(III) e do ligante sintˆtico H2bbppd com †ons de Cu(II) superior
a de seus ligantes. Os valores de CIM obtidos para estes complexos demonstram potencial
para o uso farmacol„gico.
Os resultados obtidos demonstraram que a cepa Pseudomonas fluorescens
apresenta alta sensibilidade aos compostos testados, „timo crescimento microbiano, com
col•nias de f…cil visualiza•ƒo; o que sƒo „timas caracter†sticas para um organismo teste
nesse tipo de pesquisa.
66
7 PERSPECTIVAS FUTURAS
Os resultados de atividade antimicrobiana obtidos pelos complexos met…licos 1 e 2
os qualificam para estudos posteriores sobre o mecanismo de inibi•ƒo do crescimento
promovidos por estes compostos.
O uso de tˆcnicas de microscopia eletr•nica de varredura, e bioensaios a n†vel de
DNA bacteriano podem contribuir para a identifica•ƒo do mecanismo de inibi•ƒo das
bactˆrias utilizadas neste trabalho.
Estudos de toxicidade dos complexos met…licos 1 e 2 para definir seu potencial de
aplica•ƒo terap‚utica em futuros f…rmacos.
67
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