UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
Lourimar José de Morais
ANÁLISE QUANTITATIVA DE MASTÓCITO E SUA RELAÇÃO COM A FIBROSE
RENAL NA NEFROPATIA POR IgA
UBERABA
2014
LOURIMAR JOSÉ DE MORAIS
ANÁLISE QUANTITATIVA DE MASTÓCITO E SUA RELAÇÃO COM A FIBROSE
RENAL NA NEFROPATIA POR IgA
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde,
área
de
concentração
“Patologia
Humana” da Universidade Federal do
Triângulo
Mineiro,
como
requisito
parcial para a obtenção do Título de
Mestre em Ciências da Saúde.
Orientadora:
Prof.ª Drª Marlene Antônia dos Reis
Coorientadora:
Prof.ª Drª Maria Laura Pinto Rodrigues
UBERABA
2014
Catalogação na fonte: Biblioteca da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro
M825a
Morais, Lourimar José de
Análise quantitativa de mastócito e sua relação com a fibrose
renal na nefropatia por IgA / Lourimar Jose de Morais.— 2014.
102f.il.: fig., tab.
Dissertação de (Mestrado em Ciências da Saúde), – Universidade
Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba – MG, 2013.
Orientadora: Profª Drª Marlene Antônia dos Reis.
Coorientadora: Profª Drª Maria Laura Pinto Rodrigues
1.Nefropatias. 2. Fibrose. 3. Mastócito. 4. Mastócito – Classificação. I.Reis, Marlene Antônia.dos. II.Universidade Federal do
Triângulo Mineiro. III. Título.
CDU 616-61
LOURIMAR JOSÉ DE MORAIS
ANÁLISE QUANTITATIVA DE MASTÓCITO E SUA RELAÇÃO COM A FIBROSE
RENAL NA NEFROPATIA POR IgA.
Dissertação
apresentada
ao
Curso de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde, área de
concentração “Patologia Humana”
da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro, como requisito
parcial para a obtenção do Título
de Mestre em Ciências da Saúde.
Uberaba (MG), 22 de abril de 2014
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Profª Drª Marlene Antônia dos Reis - Orientador
Professora Associado do Instituto de Ciência Biológicas e Naturais,
Universidade Federal do Triângulo Mineiro – UFTM
______________________________________________
Prof. Dr. Ruy de Souza Lino Junior
Professor Adjunto, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública,
Departamento de Imunologia e Patologia Geral,
Universidade Federal de Goiás – UFG
______________________________________________
Profª Drª Rosana Rosa Miranda Corrêa
Professora Adjunto, do Instituto de Ciência Biológicas e Naturais,
Universidade Federal do Triângulo Mineiro – UFTM
Dedicatória
Aos Meus Pais (in Memorian)
Dedico este trabalho aos meus pais,
José Soares de Morais e Joana Maria de Morais
(in memoriam). Pilar de estruturação do meu eu; tudo
que sou, devo a vocês que para mim é o exemplo de amor
incondicional. Tenho certeza que seus corações estão
repletos de alegria e orgulho.
Que um dia sonhou e hoje, com certeza, compartilha esse
momento comigo.
A saudade é grande...
Agradecimentos
À Deus
Acima de tudo e de todas as coisas...
pela minha existência e escolha dos meus objetivos,
pela força nos momentos difíceis...
Em cada momento de dúvida, nas noites de insônia, e
manhãs de cansaço...
Nos momentos em que abrandava meu coração e me
acalmava,
E assim tinha forças para seguir muito além do que era capaz
de imaginar,
Minha força, meu amparo, minha luz, meu guia.
A minha Orientadora Marlene
Pela colaboração direta e eficiente, experiência,
incentivo e paciência dedicados durante meu processo de
amadurecimento acadêmico, sem o seu apoio não seria
possível realizar este trabalho...
A minha Coorientadora Maria Laura
Pela maneira amigável e simples com que durantes
esses anos todos, me apoiou, me ensinou e me guiou para uma
Formação Humana, científica e agora Docente....
Muito obrigado, além da amizade e companheirismo
seus ensinamentos ficarão para sempre...
Ao meu Orientador do Treinamento Didático Vicente
Sempre presente, pelo seu interesse científico e
abertura para novas idéias, forte incentivo e apoio diante
das minhas limitações no processo de aprendizagem docente,
estou muito agradecido...
A Minha Família
Aos meus irmãos, Ana Cristina, Mideusmar,
Mario Lucio, Luis Henrique, Rosangela,
José Eurípedes,
Aos meus sobrinhos Ricardo, Jéssica, Mario Junior,
Dayanne, Amanda e Ana Laura
Aos meus cunhados Marcio e Toninho e as cunhadas
Regina, e Luzia ...
Em especial agradeço à minha irmã Ana Maria, por
ter me incentivado a realizar essa nova jornada, seu apoio
foi fundamental...
Vocês todos são muito importante para mim...
Vocês são a minha família...
A Disciplina de Patologia Geral
Aos meus amigos com os quais convivo
diariamente, Aloísio Costa, Maria Helena Soares, Liliane
Araújo, Rosana Rosa, Lenaldo Rocha, Vandair Gonçalves,
Pedro Ramalho, Alberto Borba, Sônia Mara, Mere Regina,
Mara Ferraz, Edson Santos, Camila Cavellani e Eliane...
meu muito obrigado...
Aos Amigos da Pós Graduação
Agradeço imensamente toda a colaboração
dos pós graduandos , Maria Helena, Eliângela, Liliane,
Laura, Carla, Fernanda, Carlos, Fabiano, Mariane, Mariana,
Aline , Gracy, Guilerme, Livia, Juliana e Crislaine.
Aos Amigos da Disciplina de Farmacologia
Aos meus queridos amigos,
Beatriz Gerolin, Douglas Cobo e Januário Barbosa, que
foram os meus alicerces nos momentos difíceis e grandes
companheiros nos momentos de descontração;
Que entenderam minha ausência nos momentos em que
me dedicava aos trabalhos ......
Aos Professores,
Beatriz Murta, Karina Devienne, Patricia Zanier e Valter
Marques, pela amizade e apoio constante...
Aos Meus Amigos l
Guilherme, Gustavo, Ronaldo Rocha, Leonardo,
Ricardo, Bernardo, Ronaldo Adriano, Fernando, Renata,
Valdenice, Hércules e todos os amigos dos nossos amigos pela
compreensão nas ausências necessárias para esta conquista...
Ao meu amigo,
Rafael de Souza Navet, pelo apoio e especialmente,
pela amizade sincera...
A Maria T. Andrade,
Minha grande companheira e amiga,
que me ouviu e deu força e carinho nos momentos
difíceis, muito obrigado...
Ao Prof. Javier Emilio Lazo Chica,
Por todos os ensinamentos, pelo apoio técnico,
e logístico que recebemos dando-nos todo o suporte necessário
para o desenvolvimento deste trabalho.
Colaboração eficiente e precisa, sua ajuda foi muito importante
para este trabalho...
Aos Amigos da Patologia Cirúrgica e Especial
Agradeço a todos os amigos e funcionários da
Patologia Cirúrgica, em especial a Profª Renata M.
Etchebehere, pelo apoio, amizade e colaboração neste
trabalho...
Á minha amiga Sueli pela amizade sincera e apoio...
Enfim agradeço a todos aqueles
que de forma direta ou indiretamente contribuíram para o
meu crescimento junto a esse trabalho e a formação dos meus
ideais...
“A coisa mais bela que o homem pode
experimentar é o mistério. É essa a emoção fundamental que
esta na raiz de toda a ciência e de toda a arte.”
(Albert Einstein)
Resumo
RESUMO
Mastócitos são células associadas com inflamação e fibrose e seus números
encontram-se aumentados em nefropatias de diferentes origens, incluindo a
nefropatia por IgA. A nefropatia por IgA é a doença glomerular primária mais comum
de todo o mundo. Fibrose renal, ou mais especificamente, fibrose tubulointersticial é
o resultado final mais freqüente da nefropatia por IgA. Se os mastócitos protegem ou
contribuem para a fibrose renal ainda é desconhecido. Assim, os objetivos deste
estudo foram avaliar a localização de mastócitos no interstício renal, a densidade de
mastócitos em pacientes com nefropatia por IgA de acordo com a classificação de
Oxford e identificar se existe uma relação entre os mastócitos e a fibrose
túbulointersticial. Os mastócitos encontram-se distribuídos difusamente pelo
interstício, principalmente na região peritubular. A mediana da densidade de
mastócitos azul de toluidina positivos em todos os pacientes com nefropatia por IgA
neste estudo foi de 4,2 (0,0-25,0) células/ mm2. O número de mastócitos/mm2 não
apresentou diferença significativa nos pacientes de acordo com as variáveis
patológicas. Em relação aos achados clínicos, a densidade de mastócitos e de
mastócitos degranulados foi maior em pacientes sem hematúria (p<0,05). Um
significante aumento na porcentagem de área total de colágeno foi observada nos
pacientes com mais de 25% de matriz intersticial (p<0,001). Significante correlação
foi encontrada entre a porcentagem de interstício renal e o número de
mastócitos/mm2 (p<0.05) e de mastócitos/mm2 degranulados (p<0.05). Estes
resultados sugerem que os mastócitos podem estar envolvidos no desenvolvimento
da nefropatia por IgA, através da inflamação e fibrose renais.
Palavras -chave: mastócitos, nefropatia por IgA , fibrose túbulo-intersticial,
classificação Oxford .
Abstract
ABSTRACT
Mast cells are associated with inflammation and fibrosis and their numbers are
increased in nephropathies of different origins including IgA nephropathy. IgA
nephropathy is the most common primary glomerular disease worldwide. Renal
fibrosis or more specifically tubulointerstitial fibrosis is the common end point of IgA
nephropathy. Whether the mast cells protect or contribute to renal fibrosis is unclear.
Thus, the purposes of this study were to evaluate the localization of mast cells in
renal interstitium, the density of mast cells in patients with IgAN according to Oxford
classification and to identify the relationship of mast cells to renal tubulointerstitial
fibrosis. Mast cells were found to be distributed diffusely in the interstitium, principally
peritubular region. The median density of toluidine blue positive mast cells in all IgAN
patients was 4.2 (0.0–25.0) cells/mm2. The number of mast cells/mm2 and
degranulated mast cells/mm2 not was significantly different in patients according
pathologic variables. In relation to clinical findings the density of mast cells and
degranulated mast cells was higher in patients without hematuria (p<0.05). A
significant increase in the percentage of total area of collagen was observed in
patients with more than 25% of interstitial matrix (p<0,001). A showed significant
increase in total collagen area percentage was observed in patients over 25% of
interstitial matrix (p<0,001). Significant correlation was found between the percentage
of interstitium renal and numbers of mast cells/mm 2 (p<0.05) and degranulated mast
cells/mm2 (p<0.05). This results suggests that mast cells can be involved in
development of IgA nephropathy, through renal inflammation and fibrosis.
Key Words: Mast cells, IgA nephropathy, tubulointerstitial fibrosis, Oxford
classification.
Lista de Ilustrações
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1.
Distribuição dos 67 pacientes diagnosticados com NIgA primária em relação
ao
gênero,
de
acordo
com
a
Classificação
Internacional
de
Oxford..............................................................................................................69
Figura 2.
Distribuição dos 67 pacientes diagnosticados com NIgA primária em relação à
cor,
de
acordo
com
a
Classificação
Internacional
de
Oxford..............................................................................................................69
Figura 3.
Distribuição dos 67 pacientes diagnosticados com NIgA primária em relação a
idade, de acordo com a Classificação Internacional de Oxford......................70
Figura 4.
Distribuição dos 67 pacientes diagnosticados com NIgA primária em relação
ao número de glomérulos, de acordo com a Classificação Internacional de
Oxford..............................................................................................................73
Figura 5.
Distribuição
da
frequência
da
variável
histopatológica
“escore
de
hipercelularidade mesangial (M)” nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. M0
 0,5; M1 > 0,5................................................................................................74
Figura 6.
Distribuição da frequência da variável histopatológica “hipercelularidade
endocapilar (E)” nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. E0=ausente;
E1=presente....................................................................................................74
Figura 7.
Distribuição da frequência da variável histopatológica “glomeruloesclerose
segmentar (S)” nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. S0=ausente;
S1=presente...................................................................................................75
Figura 8.
Distribuição da frequência da variável histopatológica “atrofia tubular/fibrose
intersticial (T)” nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. T0=0-25%; T1=2650%; T2>50%..................................................................................................75
Figura 9.
Distribuição da frequência da variável histopatológica “infiltrado inflamatório
(INF)”
nos
67
pacientes
com
nefropatia
por
IgA.
INF0=ausente;
INF1=presente...............................................................................................76
Figura 10.
Distribuição da frequência da variável histopatológica “lesões vasculares (LV)”
nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. LV0=ausente; LV1=presente......76
Figura 11.
Distribuição da frequência da variável histopatológica “crescente (C)” nos 67
pacientes com nefropatia por IgA. C0=ausente; C1=presente.......................77
Figura 12.
Distribuição da frequência da variável histopatológica “adesão (AD)” nos 67
pacientes com nefropatia por IgA. AD0=ausente; AD1=presente..................77
Figura 13.
Distribuição da frequência da variável histopatológica “atrofia tubular (AT)”
nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. AT0=ausente; AT1=presente........78
Figura 14
Secções histológicas de córtex renal, de pacientes com nefropatia por IgA,
corados pela coloração do azul de toluidina, pH 5,0.. Observar os mastócitos
exibindo coloração metacromática apresentando coloração violeta (a) seta
longa. E também mastócitos apresentando coloração púrpura (b) cabeça de
seta, localizados no interstício tubular............................................................80
Figura 15.
Secções histológicas de córtex renal, de pacientes com nefropatia por IgA,
corados pela coloração do azul de toluidina, pH 5,0, exibindo coloração
metacromática. Observar os mastócitos localizados no interstício tubular (a e
b) e próximos aos vasos (c). Notar também que estas células podem estar
granuladas (a) ou degranuladas (b)................................................................81
Figura 16.
Controle positivo para mastócitos, secções histológicas de pele de pacientes
autopsiados no HC/UFTM, corados pelo Azul de Toluidina, pH 5, exibindo
coloração metacromática. (a) Observar os mastócitos localizados no
interstício e próximos aos vasos. Em (B) mastócitos granulados e em (c)
mastócitos degranulados................................................................................82
Figura 17.
Secções histológicas de córtex renal corados com Tricrômico de Masson de
pacientes com nefropatia por IgA. Observar a matriz intersticial corada em
azul pela reação histoquímica. Notar que na fiagura (a), a área intersticial
encontra-se expandida. Em (b) observa-se uma matriz interstiticial discreta ou
normal..............................................................................................................87
Figura 18.
Distribuição dos 67 pacientes diagnosticados com Nefropatia por IgA Primária
em relação a Porcentagem de matriz intersticial cortical renal quantificada F0
(0-25%); F1 (26-50%); e F2 (>50%)................................................................88
Figura 19.
Distribuição dos 67 pacientes diagnosticados com Nefropatia por IgA Primária
em relação a Porcentagem de matriz intersticial cortical renal quando
quantificada F0 (0-25%); F1 (26-50%)+F2 (>50%)........................................88
Figura 20.
Densidade de mastócitos no compartimento intersticial renal F0 (0-25%); F1
(26-50%); e F2 (>50%) nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. Os valores
foram expressos como mediana (min-max)...................................................89
Figura 21.
Densidade de mastócitos degranulados no compartimento intersticial renal F0
(0-25%); F1 (26-50%) + F2 (>50%), nos 67 pacientes com nefropatia por IgA.
Os valores foram expressos como mediana (min-max).................................89
Figura 22.
Correlação entre a densidade de mastócitos totais e a percentagem de matriz
no compartimento intersticial cortical renal nos 67 pacientes com nefropatia
por IgA primária. Valores de (r=0,2768) e p<0,05, teste de correlação de
Pearson...........................................................................................................90
Figura 23.
Correlação entre a densidade de mastócitos degranulados e a percentagem
de matriz no compartimento intersticial cortical renal nos 67 pacientes com
nefropatia por IgA primária. Valores de (r=0,2710) e p<0,05, teste de
correlação de Pearson....................................................................................90
Lista de Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Características dos pacientes com nefropatia por IgA, no momento da biópsia
nativa..............................................................................................................71
Tabela 2.
Densidade de mastócitos e densidade de mastócitos degranulados em
pacientes com nefropatia por IgA de acordo com as variáveis patológicas, no
momento
da
biópsia
renal...............................................................................................................85
Tabela 3.
Densidade de mastócitos e de mastócitos degranulados em pacientes com
nefropatia por IgA de acordo com os achados clínicos, no momento da
biópsia
renal
nativa..............................................................................................................86
Listas de Abreviaturas e Siglas
AD0 – Adesões ausentes
AD1 – Adesões presentes
AT – Azul de toluidine
AT/FI – Atrofia tubular fibrose intersticial
AT0 – Atrofia tubular ausente
AT1 - Atrofia tubular presente
BFGF - (Fator de Crescimento Básico do Fibroblasto
BR - Biópsia Renal
C0 – Crescentes ausentes
C1 – Crescentes presentes
CEP - Comitê de Ética em Pesquisa
CM – Células mesangiais
Cr - Creatinina
E0 – Hipercelularidade endocapilar ausente
E1 – Hipercelularidade endocapilar presente
F - Fibrose
GalNac - Acetilgalactosamina
GM-CSF – Fator estimujlador de colonia do macrofago e granulócito
GNP - Glomerulonefrite Primária
HAS - Hipertensão Arterial Sistêmica
HE - Hematoxilina e Eosina
Ics-IgA – Imunocomplexos de imunoglobulina A
IECA - Inibidor da Enzima Conversora de Angiotensina
IgA – Imunoglobulina A
IgAm - Imunoglobulina A monomérica
IgAp - Imunoglobulina A polimérica
IgAS – Imunoglobulina A secretória
IgE – Imunoglobulina E
ILs – Interleucinas
INF0 – Infiltrado inflamatório ausente
INF1 – Infiltrado inflamatório presente
IRA - Insuficiência Renal Aguda
IRC - Insuficiência Renal Crônica
IRCT - Insuficiência Renal Crônica Terminal
kDa – Kilodalton
LV0.- Lesões Vasculares ausentes
LV1 – Lesões vasculares presentes
M0 – Hipercelularidade mesangial <0,5
M1 – Hipercelularidade mesangial >0,5
MBG – Membrana Basal glomerular
MC – Mastócitos
MCP-1 – Proteína quimiotactil do monócito 1
MEC – Matriz extra celular
NeuNAc – Acetilneuraminico
NIgA - Nefropatia por IgA
NIgAP – Nefropatia por IgA Primária
pp-GalNAc-Ts – polipeptídeo N-acetilgalactosaminiltransferase
RIgp – Receptor epitelial de imunoglobulina poliméria
S0 – Glomeruloesclerose segmentar ausente
S1 – Glomeruloesclerose segmentar presente
TGFB - Fator de Crescimento Transformação Beta
TNFα – Fator de necrose tumoral alfa
VEGF - Fator de Crescimento Endotelial Vascular
Sumário
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ................................................................................................. 37
1.1
Estrutura Anatômica e Fisiologia Renal............................................................ 38
1.2
Glomérulo ......................................................................................................... 40
1.2.1 Estrutura ........................................................................................................... 40
1.2.2 Barreira de filtração glomerular ........................................................................ 41
1.3
Túbulos............................................................................................................. 41
1.4
Interstício ......................................................................................................... 43
1.5
Fibrose Renal nas Doenças glomerulares Crônicas ....................................... 43
1.6
Nefropatia por IgA ........................................................................................... 45
1.6.1 Estrutura da IgA – Fisiopatogenia ................................................................... 48
1.6.2 Subclasse da IgA ............................................................................................ 49
1.6.3 O-Glicosilação da IgA1 .................................................................................... 49
1.6.4 Síntese da IgA ................................................................................................. 50
1.6.5 O-glicosilação Aberrante da IgA1 na NIgA ...................................................... 51
1.6.6 Anticorpos Anti-glicanos .................................................................................. 52
1.6.7 Classsificação de Oxford para a Nefropatia por IgA ........................................ 54
1.7
Mastócitos ....................................................................................................... 54
1.7.1 Mastócitos no Rim ........................................................................................... 58
2
HIPÓTESE E OBJETIVOS .............................................................................. 59
2.1
Hipótese ........................................................................................................... 60
2.2
Objetivos .......................................................................................................... 60
3
MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................. 61
3.1
Pacientes.......................................................................................................... 62
3.2
Coleta de Dados ............................................................................................... 62
3.3
Biópsias Renais................................................................................................ 63
3.4
Escore Histológico ............................................................................................ 63
3.5
Análise Histoquímica ........................................................................................ 63
3.6
Quantificação dos Mastócitos e da Fibrose Tubulointerticial ............................ 64
3.7
Análise Estatística ............................................................................................ 66
4.
RESULTADOS ................................................................................................. 67
4.1
Características Clínicas e Demográficas dos Pacientes com Nefropatia
por IgA ...................................................................................................................... 68
4.2
Características Histopatológicas ...................................................................... 72
4.3
Distribuição e Densidade de Mastócitos nos Tecidos Renais de pacientes com
Nefropatia por IgA ..................................................................................................... 79
4.4
Densidade de Mastócitos e de mastócitos Degranulados de Acordo com as
Varáveis Patológicas e as Características Clínicas................................................... 83
4.5
Quantificação da Matriz Extracelular Intersticial (F) em Pacientes com
Nefropatia por IgA e a Densidade de Mastócitos ...................................................... 83
4.6
Correlação entre a Fibrose e os Mastócitos ..................................................... 90
5.
DISCUSSÃO ................................................................................................... 96
6.
CONCLUSÕES ................................................................................................ 98
REFERÊNCIAS ............................................................................................ 100
ANEXOS....................................................................................................... 115
1-Introdução
1.1 ESTRUTURA ANATÔMICA E FISIOLOGIA RENAL
Os rins são órgãos pares localizados na região poesterior do abdomem
portartanto são órgãos retroperitoniais, situados entre a décima segunda vértebra
toráxica e a terceira vértebra lombar, sendo o rim direito mais inferior devido á
localização do fígado, anatomicamente complexos, consistindo de muitos diferentes
tipos de células especializadas, arranjadas em um padrão tridimensional altamente
organizado (DANGELO E FATTINI, 1998).
Em adulto o rim humano mede aproximadamente 11,5cm de comprimento,
por 7,5cm de largura e 2,5cm de espessura, cada um pesando em torno de 150 a
170g, (GRAAFF; RHEES, 1991).
O rim apresenta um formato de um grão de feijão, de coloração avermelhada,
com duas faces, a face anterior e a posterior, bordas lateral e medial côncova onde
encontramos uma região endentada denominada hilo renal, através da qual
atravessam, a artéria e a veia renal, os vasos linfáticos, o suprimento nervoso e o
ureter (GUYTON E HALL, 1997).
O rim apresenta também dois polos o inferior e o superior onde encontramos
a glândula supra renal pertecente ao sistema endócrino e com um importante papel
hormonal na regulação da função renal (GUYTON E HALL, 1997).
A unidade funcional do rim é denominada néfron. Segundo Guyton H et. Al.
1997, cada rim humano tem em média um milhão de néfrons, e cada um destes é
capaz de formar urina. Cada néfron consiste de um glomérulo e um longo túbulo,
que é composto de uma única camada de células epiteliais (GRAAFF; RHEES,
1991). O néfron é segmentado em partes distintas, túbulo proximal, alça de Henle,
túbulo distal, ducto coletor (SILVERTHORN, 2003).
Cada região com uma aparência celular típica e características funcionais
especiais. Os néfrons são reunidos compactamente para formar o parênquima renal,
o qual pode ser dividido em regiões. Os néfrons não se regenera, por isso quando
lesados, seu número diminui. Após os 40 anos de idade, o número de néfrons
funcionantes diminui cerca de 10% a cada década, mas ocorrem adptações nos
néfrons remanescentes que possibilitam excretar quantidades adequada de água,
eletrolitos e bases nitrogenadas (GUYTON E HALL, 1997).
A camada externa do rim, denominada de córtex, contém todos os glomérulos
e uma grande quantidade de túbulos proximais e de túbulos distais. A secção
interna, a medula renal, consiste principalmente de arranjos paralelos de alças de
Henle e ductos coletores, que se organizam em formato de cone, sendo denominada
de pirâmide renal. O rim humano apresenta tipicamente de 7 a 9 pirâmides renais,
as quais estendem-se para a pelve renal. As extremidades das pirâmides medulares
são denominadas papilas. A medula é importante para concentrar a urina; o fluido
extracelular nesta região dos rins tem maior quantidade de solutos que o plasma,
com as maiores concentrações de soluto alcançando as extremidades papilares.
O processo de formação da urina começa no tufo capilar glomerular, onde um
ultrafiltrado do plasma é formado sem proteínas. Quase todas as substâncias do
plasma exceto as celulas e as proteínas, são filtradas livremente. O filtrado é
coletado na cápsula de Bowman e entra no túbulo renal para ser transportado ao
longo de um trajeto, sendo sucessivamente modificado pela exposição à seqüência
de segmentos epiteliais tubulares especializados, com diferentes funções de
transporte. Os túbulos contorcidos proximais absorvem aproximadamente dois
terços do filtrado glomerular . O fluido remanescente ao final dos túbulos contorcidos
proximais entra na alça de Henle, retorna ao córtex e passa bem próximo a seu
glomérulo de origem, no aparelho justaglomerular, penetrando então no túbulo
contorcido distal e finalmente no ducto coletor. Este ducto retorna para a medula e o
fluido é então drenado para a pelve renal, através das papilas renais. Ao longo dos
túbulos, a maior parte do filtrado glomerular é absorvido. Algumas substâncias,
entretanto, são secretadas pelas células tubulares e adicionadas a este fluido.
(GUYTON E HALL, 1997).
Cerca de 180 litros de plasma são filtrados por dia e aproximadamente 1,5
litros são eliminados na forma de urina, caracterizando a importânciado processo de
reabsorção, lembrando que temos cerca de 3 litros de plasma circulante. O produto
final, a urina, entra na pelve renal e no ureter, acumula-se na bexiga, e é finalmente
excretado do corpo (Briggs, Kriz, Schnermann, 2005).
O rim humano apresenta organização estrutural complexa e alguns de seus
compartimentos serão a seguir detalhados.
1.2 GLOMÉRULO
1.2.1 Estrutura
O glomérulo é uma estrutura com um formato arredondado, constituída de
capilares. Internamente, estes capilares são revestidos por células endoteliais e,
externamente, por células epiteliais glomerulares especializadas, denominadas
podócitos. Os podócitos são altamente diferenciados, formando um arranjo de
processos sobre a camada externa destes capilares, fixando-se a eles através da
membrana basal. Uma cápsula epitelial externa, denominada cápsula de Bowman,
atua como uma bolsa para capturar o filtrado produzido e direcioná-lo para o início
dos túbulos proximais. O mesângio glomerular mantém as alças capilares juntas,
sendo formado por um pedículo de células mesangiais e por uma matriz mesangial
(Briggs, Kriz, Schnermann, 2005).
1.2.2 Barreira de filtração glomerular
A formação de urina começa na barreira de filtração glomerular. O filtro
glomerular, através do qual o ultrafiltrado deve passar, consiste de três camadas: o
endotélio fenestrado, a membrana basal glomerular (MBG) interveniente, e a
camada de podócitos. Esta “membrana” complexa é livremente permeável à água e
pequenos solutos dissolvidos, mas retém a maioria das proteínas e outras grandes
moléculas, assim como todos os elementos figurados do sangue.
O principal determinante da passagem através do filtro glomerular é o
tamanho molecular. Uma molécula como a inulina (5 kDa) passa livremente através
do filtro, e uma pequena proteína como a mioglobulina (16,9 kDa) é filtrada em
grande extensão. Substâncias de tamanho maiores são retidas com maior eficiência.
A quantidade filtrada torna-se muito pequena quando o tamanho molecular encontrase acima de 60 a 70 kDa. A filtração também depende da carga iônica, e proteínas
carregadas negativamente, como a albumina, são retidas em maior quantidade do
que poderia ser predito somente por seu tamanho molecular. Em certas doenças
glomerulares, proteinúria desenvolve-se devido a uma perda da seletividade de
cargas da barreira de filtração glomerular (Briggs, Kriz, Schnermann, 2005).
1.3 TÚBULOS
A organização estrutural das células epiteliais tubulares renais varia
consideravelmente ao longo do néfron e, até certo ponto, correlaciona-se com a sua
função. As células tubulares proximais apresentam uma estrutura altamente
desenvolvida, com longas microvilosidades, numerosos mitocôndrios, canalículos
apicais e uma rede de interdigitações celulares extensa. Estas características estão
relacionadas com suas funções: reabsorção de dois terços do sódio e da água
filtrados, bem como de glicose, potássio, fosfato, aminoácidos e proteínas. A
próxima porção dos néfrons é a alça de Henle. A porção descendente da alça e a
porção fina do segmento ascendente são constituídas por células permeáveis. O
restante do segmento ascendente é a porção espessa e contem células com
numerosas mitocôndrias. A extremidade espessa do segmento ascendente da alça
de Henle alcança o glomérulo do néfron, a partir do qual o túbulo se originou.
Células especializadas nesta extremidade formam a macula densa, uma das
estruturas que compõem o aparelho justaglomerular. O aparelho justaglomerular
aninha-se ao glomérulo, no local aonde a arteríola aferente penetra. O aparelho
justaglomerular consiste de: i) células justaglomerulares, que são células musculares
lisas granulosas, modificadas, existentes na camada média da arteríola aferente,
produtoras de renina; ii) macula densa, uma região especializada do túbulo distal
quando ele retorna para o pólo vascular de seu glomérulo, constituída de células
tubulares dispostas de maneira mais aglomerada e com distintos padrões de
interdigitações entre membranas adjacentes; e iii) células não granulares, as quais
se situam em uma área próxima a arteríola aferente, a macula densa e o glomérulo.
O aparelho justaglomerular é um pequeno órgão endócrino, sendo as células
justaglomerulares a principal fonte de produção de renina no rim. O túbulo contorcido
distal, que se inicia na macula densa, apresenta um epitélio com poucas
microvilosidades e sem a presença de uma borda em escova distinta. Os túbulos
distais juntam-se para formar os ductos coletores que passam através do córtex
renal e da medula para esvaziarem-se na pelve renal (Robbins, et.al., 1999).
1.4 INTERSTICIO RENAL
Em todos os órgãos parenquimatosos, incluindo o rim, o interstício encontrase localizado entre as membranas basais das células epiteliais e os capilares. No
córtex renal, este espaço intersticial é compacto, situado entre os capilares
peritubulares fenestrados e as membranas basais das células tubulares e das
cápsulas de Bowman. Este compartimento apresenta elevada relevância funcional
em rins saudáveis e doentes. O interstício é constituído por tipos celulares diferentes
e por uma matriz extracelular. Os fibroblastos compõem a maior proporção de
células intersticiais renais e são considerados o esqueleto renal, pois mantêm a
arquitetura tridimensional tecidual, sendo as principais células produtoras de matriz
extracelular. Células dendríticas também existem em números substanciais no
interstício renal (Kaissling, Hir, 2008), em consonância com sua função de sentinela.
No interstício saudável, outros tipos celulares são encontrados ocasionalmente.
Entretanto, em condições inflamatórias, várias células infiltram o interstício, como
linfócitos, monócitos, macrófagos e mastócitos (Colvin et al., 1974; Eddy, 2005;
Pavone-Macaluso, 1960; Sakamoto-Ihara et al., 2007).
1.5 FIBROSE RENAL NAS DOENÇAS GLOMERULARES CRÔNICAS
As doenças glomerulares crônicas apresentam alterações histológicas
comuns, que incluem perda da arquitetura dos capilares glomerulares e
peritubulares, proliferação celular e acumulação difusa de matriz, levando a atrofia
tubular e a fibrose, intersticial e glomerular, extensivas (Nath,1992). A acumulação
de colágeno e moléculas relacionadas no interstício é definida como fibrose
intersticial renal.
Os vários tipos de glomerulonefrites primárias podem ser basicamente
caracterizados da seguinte maneira:
i) Inicialmente ocorre um processo de ativação celular, provavelmente
conseqüente ao alto grau de proteinúria existente, com produção de moléculas que
propagam a lesão renal (Burton, Harris, 1996; Remuzzi, Bertani, 1998). Os
endotélios dos capilares peritubular e glomerular facilitam a migração de células
mononucleares para o interstício e para o glomérulo (Cattell, 1994; Klahr, Schreiner,
Ichikawa, 1988). No interstício, estas células se transformam em macrófagos. Além
da inflamação intersticial e da ativação das células tubulares, outro fator importante
para a fibrose renal é o aparecimento de miofibroblastos e a ativação dos
fibroblastos intersticiais residentes (Desmouliere, Darby, Gabbiani, 2003);
ii) Durante o processo inflamatório são liberados fatores solúveis que
promovem efeitos pró-fibróticos. Diversos fatores de crescimento e citocinas têm
sido implicados neste processo, com papéis fundamentais sugeridos para o fator de
crescimento e transformação beta (TGF) (Floege, Grone, 1995), fator de
crescimento de tecido conjuntivo (Ito et al., 1998), angiotensina II (Harris, Cheng,
1996) e endotelina-1 (Zoja et al., 1995);
iii) Após a fase de sinalização, inicia-se o acúmulo de proteínas da matriz no
interstício renal. Neste momento, a síntese de proteínas da matriz está aumentada.
Por outro lado, observa-se também uma diminuição evidente do “turnover” de matriz.
A diminuição do “turnover” de matriz pode ser devido à produção renal de inibidores
de proteases, como os inibidores teciduais de metaloproteinases e inibidores do
ativador do plasminogênio, os quais inativam as proteases renais que normalmente
regulam o “turnover” de matriz (Eddy, 1996, 2000);
iv) A última fase que caracteriza as doenças renais progressivas é a fase de
destruição renal, conseqüente à excessiva acumulação de matriz. Neste momento,
os túbulos e os capilares peritubulares são obliterados. O número de néfrons
intactos declina progressivamente, resultando em uma continua redução na filtração
glomerular (Eddy, 2000).
Padrões de fibrose intersticial diferem e provavelmente não apresentam
causas ou conseqüências idênticas. O desenvolvimento da fibrose intersticial parece
ter mecanismos complexos e tipicamente inter-relacionados com os processos
primários, associados com a perda da função renal e progressão da doença renal
até o estágio final.
1.6 NEFROPATIA POR IgA
A nefropatia por IgA (NIgA) ou doença de Berger foi primeiramente descrita
por Berger e Hinglais (1968), sendo a forma mais frequente de doença glomerular
primária em todo o mundo. A NIgA acorre em pessoas de qualquer idade,
acometendo principalmente adultos jovens entre 10 e 30 anos (D’Amico, 1987).
Depósitos mesangiais glomerulares de complexos contendo IgA1, e menos
frequentemente de C3, IgG e IgM, são a característica morfológica fundamental,
acompanhada por glomerulonefrite proliferativa mesangial, expansão da matriz e
características clínicas de lesão renal que incluem hematúria e proteinúria (Barrat,
Feehally, 2005; D’Amico, 2000).
Outras características histopatológicas e clínicas são extremamente variáveis,
refletindo na intensidade, no tempo de curso e na apresentação clínica desta
nefropatia. Não existem tratamentos completamente efetivos, e 15 a 25% dos
pacientes progridem para doença renal em estágio final, aproximadamente 10 anos
ou mais após o diagnóstico da doença (D’Amico, 2004).
Os mecanismos envolvidos na deposição mesangial de IgA e o princípio da
lesão glomerular inflamatória permanecem desconhecidos. A falta de um completo
entendimento da patogênese da nefropatia por IgA implica na inexistência de
qualquer tratamento conhecido para modificar a deposição mesangial de IgA.
Opções de tratamento viáveis são frequentemente direcionadas para eventos
inflamatórios ou imunes no glomérulo e no compartimento túbulo-intersticial
(D’Amico, 2004).
Recorrência de depósitos de IgA em pacientes com nefropatia por IgA, após
serem submetidos a um transplante com rins normais, indica que anormalidades
circulantes, muito mais que no próprio órgão, são cruciais para o desenvolvimento
desta nefropatia (Berger, 1975). O nível de IgA sérica está aumentado duas a três
vezes em aproximadamente metade de todos os pacientes com nefropatia por IgA
(Montenegro, Monteiro, 1999). A extensão e intensidade da lesão glomerular em
resposta a deposição mesangial de IgA são extremamente variáveis.
O diagnóstico de NIgA é fundamentado pela realização da biópsia para
avaliação do córtex renal por técnicas imunohistoquímicas (Jennette J. 1988). IgA é
a imunoglobulina que se deposita predominante no mesangio glomerular,
exclusivamente da subclasse IgA1 e aparece tanto nas formas monomérica como
polimérica (Monteiro R, 1984). A imunoglobulina G (IgG) pode ser encontrada em codeposição com a IgM ou ambas em aproximadamente
75% dos doentes.
Normalmente C3 é encontrado nas áreas com IgA juntamente com outros
componentes da ativação do complemento pela via alternativa (Rauterberg EW,
1987).
A NIgA afeta indivíduos de todas as idades, sendo mais comumente
diagnosticada nas segunda e terceira décadas de vida (McGrogan A, 2011). Afeta os
dois sexos com uma incidência maior no sexo masculino (Yu HH, 2011). Proteinúria
assintomática e hematúria são apresentações clínicas características (D'Amico G,
1985). Hematúria macroscópica pode ser isolada ou normalmente apresenta-se
concomitantemente com processos infecciosos (Novak J, 2012). É uma doença
crônica com impacto variado e significativo para muitos doentes, embora seja uma
doença de progressão lenta, cerca de 25-50% dos doentes progridem para
insuficiência renal crônica terminal (IRCT) 25 anos após o diagnóstico (D'Amico G,
1985).
Em alguns países é responsável por 10% dos doentes que necessitam de
terapia de substituição renal (D'amico G, 1988). Em doentes transplantados, cerca
de 60 % desenvolve novamente a doença num período de 5 anos após a cirurgia
(Odum J, 1994). Por outro lado, cerca de um terço dos doentes entram em remissão
clínica (resolução da hematúria microscópica e normalização dos valores de
creatinina sérica) vários anos após a biópsia diagnóstica (Chauveau D, 1993).
Interessante, que os depósitos imunes desaparecem dentro de 2 a 3 meses
se rins de indivíduos com doença subclínica são transplantados para doentes com
doença renal terminal devido a outras causas que não NIgA (Silva FG, 1982).
A prevalência da NIgA varia substancialmente entre as várias etnias (Levy M,
1988).É comum em Asiáticos comparativamente com os Caucasianos, sendo
raramente diagnosticada em indivíduos com descendência Africana (Hall Y, 2004).
Frequências elevadas também foram descritas em Americanos Nativos e na
Oceânia (Hoy WE, 1993; Smith SM, 1995).
No entanto, como o diagnóstico definitivo é feito por biópsia renal e as suas
práticas e indicações variam nos diferentes países, a verdadeira incidência e a
causa da NIgA é desconhecida (Donadio JV, 2002).
A NIgA é uma doença complexa com uma base genética que não obedece os
padrões de herança Mendeliana. É provavelmente determinada pela ação de
múltiplos genes e fatores ambientais que atuam independentemente ou através de
interações complexas gene-gene e gene-ambiente. Os fatores de risco ambientais
para NIgA continuam desconhecidos (Kiryluk K, 2010). Embora a NIgA seja
considerada uma doença esporádica, vários casos de NIgA familiar já foram
descritos em todo o mundo (O'Connell PJ, 1987; Karnib HH, 2007).
O agrupamento familiar, as profundas diferenças na prevalência entre as
diferentes etnias e a variação inter individual no curso e prognóstico da doença
apontam para a presença de fatores genéticos importantes na predisposição para a
NIgA (Kiryluk K, 2010).
1.6.1 Estrutura da IgA - Fisiopatogenia
A IgA é a imunoglobulina mais abundante no corpo e nas secreções mucosas,
é estruturalmente similar à IgM tendo a mesma capacidade de formação de
polímeros onde as imunoglobulinas estão ligadas entre si por uma proteína de
junção, a cadeia J. Posteriormente as IgA poliméricas ligam-se ao receptor epitelial
de imunoglobulina polimérica (RIgp), comum aos dois isotipos, que medeia o
transporte transepitelial e são secretadas como IgA secretória (IgAS) (Woof JM,
2005).
1.6.2 Subclasses de IgA
Existem duas subclasses de IgA, IgA1 e IgA2, podendo apresentar tanto nas
formas monomérica (IgAm) como polimérica (IgAp) (Kerr M. 1990). A IgA do soro é
representada principalmente pela subclasse IgA1 na sua forma monomérica. Apenas
uma pequena percentagem das IgA no soro se apresentam na sua forma polimérica.
Já nas secreções mucosas predomina a forma polimérica (Novak J, 2001). A
quantidade de IgA1 e IgA2 nas mucosas reflete a distribuição de suas células
secretoras pelos tecidos correspondentes (Pakkanen SH, 2010). O trato respiratório,
glândulas salivares e lacrimais, e o trato intestinal superior contêm mais células
secretoras de IgA1, enquanto há um predomínio ligeiro de células secretoras de
IgA2 no cólon e no trato genital feminino (Woof JM, 2005).
1.6.3 O-glicosilação da IgA1
Diferença estrutural importante entre a IgA1 e IgA2 é a região flexível, onde a
IgA1 tem uma estrutura única rica em prolina, serina e treonina, e possui cadeias
características de oligossacarídeos ligadas a terminais O (Putnam FW, 1979). Há
outra forma distinta de glicosilação das proteínas, os carboidratos ligados a
terminais-N. Os O-glicanos estão geralmente associados com proteínas de ligação à
membrana e são menos frequentemente observados em proteínas secretórias,
enquanto os N-glicanos são mais comuns e normalmente consistem em cadeias
complexas ramificadas (Arnold JN, 2007).
A IgA1 é uma das poucas proteínas que possui ambos os glicanos, ligados a
terminais O e N. A região flexível da IgA1 está localizada entre os domínios CH1 e
CH2 da cadeia pesada da molécula e é constituída por 17 a 26 aminoácidos e nove
locais potenciais de O-glicosilação (D'amico G, 1988; Arnold JN, 2007; Senior BW,
2005). Desses nove resíduos, normalmente não mais do que seis são glicosilados.
Regiões flexíveis com quatro ou cinco glicanos são mais comuns (Tarelli E, 2004).
Cadeias
de
açucares
ligadas
ao
O
são
estruturas
compostas
por
N-
acetilgalactosamina (GalNAc - N-Acetylgalactosamine) em O-ligação com serina ou
treonina, normalmente extendidas com galactose (Gal) na configuração β1,3, que
podem ser sialilados pela introdução do ácido N-acetilneuramínico (NeuNAc - Nacetylneuraminic acid) nas configurações α2,6 e/ou α2,3 (Woof JM, 2005; Novak J,
2008.
A síntese dos O-glicanos é iniciada pela adição de GalNAc a resíduos de
serina ou treonina através da atividade da UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina: o
polipéptido N-acetilgalactosaminiltransferase (pp-GalNAc-Ts), especialmente ppGalNAc-T2 (Iwasaki H, 2003). As cadeias de O-glicanos estão provavelmente
envolvidas na proteção da região flexível, que é vulnerável à digestão por inúmeras
protéases produzidas por microrganismos patogénicos (Kilian M, 1996), e também
na manutenção da estrutura da molécula, mantendo a porção Fc espacialmente
distante da porção Fab (Baenziger J, 1974; Putnam FW, 1979). No entanto a
glicosilação variável da região flexível das IgA1 da origem a várias propriedades
químicas e biológicas únicas desta molécula, não compartilhadas pela IgA2.
1.6.4 Síntese da IgA
A grande maioria das IgA são produzidas nas mucosas, particularmente no
intestino, e secretadas como IgA secretória (IgAS), com apenas uma pequena
percentagem a entrar em circulação. A IgA em circulação é produzida na medula
óssea com alguma contribuição do baço e gânglios linfáticos. A produção de IgA
nestes dois níveis, mucoso e sistémico, está intrinsecamente ligada e regulada entre
si, sendo interdependentes, constituindo o chamado “eixo mucosa-medula óssea”
(Suzuki Y, 2007).
1.6.5 O-glicosilação aberrante das IgA1 na NIgA
Dentre as anormalidades encontradas no sistema imune IgA em pacientes
com NIgA, a O-glicosilação aberrante na região flexível das IgA1 é o achado mais
consistente e tem sido implicado como um mecanismo central no desenvolvimento
da doença. Segundo Mestecky et al., 1993, demonstrou especificamente, que nos
doentes com NIgA a cadeia lateral de carboidratos das IgA1 eram deficientes de
galactose. Outros estudos, demonstraram conclusivamente que a O-glicosilação
deficiente das IgA1 é uma anormalidade característica da NIgA Smith AC, 2006; Hiki
Y, 1998), sendo rara nos indivíduos saudáveis. Estas imunoglobulinas aberrantes
também foram identificadas na urina de doentes com NIgA mas não em doentes
com proteinúria glomerular devido a outras causas que não NIgA (Matousovic K,
2006).
Moléculas de IgA1 ligam-se menos eficazmente aos receptores ASGP-R com
diminuição da clearence (Moldoveanu Z, 2007). A IgA1 mau galactosilada (IgA1-DG)
tem uma afinidade aumentada para a matriz extracelular, como a fibronectina,
colagénio tipo IV, o que promove a deposição glomerular (Kokubo T, 1998). Existe
uma tendência para se auto-agregar e formar complexos antigénio-anticorpo com
IgG, que são específicas para os péptidos da região flexível (Tomana M, 1999).
Outros estudos demonstraram que estas IgA1 auto-agregadas ou integradas
em imuno complexos induzem a proliferação mesangial, a ativação do complemento,
alteram a expressão das integrinas, aumentam a resposta inflamatória e potenciam a
síntese dos componentes da matriz extracelular (Wang Y, 2004; Novak J, 2005). A
ligação da IgA às células mesangiais (CM) leva à síntese de citocinas proinflamatórias como IL-1, IL-6 e o fator de necrose tumoral α TNF-α (Wang Y, 2004;
Monteiro RC, 2002).
O mecanismo que leva à superprodução de IgA1 com O-glicosilação
aberrante na NIgA ainda necessita ser elucidado. Uma análise mais recente mostrou
que combinações de haplótipos específicas em C1GalT1 e ST6GalNAc2 estão
associadas à predisposição para a NIgA e prognóstico renal (Zhu L, 2009).
Entretanto a origem exata dos defeitos enzimáticos de glicosilação continua
controverso se a desgalactosilação das IgA1 é uma consequência direta das
alterações funcionais na atividade da C1GalT1/Cosmc e ST6GalNAc2 (Narita I,
2008).
A IgA1 é produzida por células B maduras, enquanto a IgD, outro isotipo de
imunoglobulina que possui cadeias laterais de O-glicanos, é sintetizada em estágios
precoces do desenvolvimento dos linfócitos B. Segundo, Smith et al., demonstraram
que a desglicosilação não era partilhada pela IgD e que o defeito na glicosilação
surge num estágio avançado do desenvolvimento dos linfócitos B, sendo normal nas
linhagens nativas nos doentes com NIgA. Estas observações isolam os defeitos de
O-glicosilação a determinado tipo de células específicas e indicam que o distúrbio
primário é mais provavelmente secundário a uma imunorregulação aberrante do que
propriamente a defeitos enzimáticos da glicosilação (Kiryluk K, 2010).
1.6.6
Anticorpos anti-glicanos
Em pacientes diagnosticados com NIgA os níveis de ICs-IgA são elevados
(Schena FP 1989). Enquanto a IgA1-DG, por si só, é insuficiente para produzir a
NIgA, os anticorpos IgG e IgA1 podem desempenhar um papel importante na
patogénese pela formação de imunocomplexos contendo IgA1 (Tomana M, 1999;
Novak J, 2005). Os níveis séricos destes anticorpos IgG específicos para os glicanos
estão correlacionados com a proteinúria e com os níveis urinários de ICs-IgA1 nos
doentes com NIgA (Suzuki H, 2009). A caracterização molecular destes autoanticorpos revelou uma substituição de aminoácido específica de alanina para serina
na região variável da cadeia pesada das IgG1. Verificou-se que a mutação na região
variável do gene IGH (IgG Vh) é mais frequente em doentes com NIgA
comparativamente com os controles saudáveis. Esta substituição aumenta a força
de ligação das IgG às moléculas de IgA1 e favorece a formação de ICs (Suzuki H,
2008; 2009). A formação destes imunocomplexos pode igualmente representar o
caso em que o anticorpo IgG correto se encontra no local errado no momento errado
(Barratt J, 2009). Existe uma associação descrita entre a hematúria macroscópica e
infeções do trato respiratório superior, normalmente tidas como patognomónicas de
NIgA (Lomax-Smith JD, 1985).
Níveis elevados de ICs-IgA1 circulantes estão associados a episódios de
atividade clínica da doença, marcada por hematúria macroscópica (Novak J 2005;
Coppo R, 1982; 2004).
Em pacientes com NIgA, é possível que uma proporção dos anticorpos antimicrobianos específicos para os glicanos se liguem erradamente a antigénios Tn e
sialil-Tn das IgA1-DG presentes em circulação em níveis elevados, resultando na
formação rápida de imunocomplexos, embora uma relação entre os níveis
aumentados de ICs-IgA e episódios de hematúria macroscópica tenha sido
demonstrada (Novak J 2005; Feehally J, 1986).
1.6.7. Classificação de Oxford para a Nefropatia por IgA
Muitos investigadores tentaram incorporar as características patológicas das
biópsias renais em classificações patológicas da nefropatia por IgA, mas nenhum
deles obteve aceitação generalizada.
Em 2009, um grupo de nefropatologistas e nefrologistas da Rede
Internacional da Nefropatia por IgA e da Sociedade de Patologia Renal publicou uma
nova classificação para a nefropatia por IgA – a classificação de Oxford (Cattran et
al., 2009, Roberts et al., 2009). Este grupo identificou quatro características
patológicas que, independentemente uma das outras e dos parâmetros clínicos dos
pacientes como o grau de proteinúria, a função renal ou a presença de hipertensão
arterial, poderiam predizer as conseqüências da nefropatia por IgA. Estas variáveis
foram: a) o escore de hipercelularidade mesangial – M0 (50% ou menos dos
glomérulos com hipercelularidade mesangial) e M1 (mais de 50% dos glomérulos
com hipercelularidade mesangial); b) hipercelularidade endocapilar – E0 (ausente) e
E1 (presente); c) esclerose segmentar – S0 (ausente) e S1 (presente) e d) atrofia
tubular/fibrose intersticial – T0 (0-25%), T1 (26-50%) e T2 (mais de 50%).
Segundo Etner e Floege (2009), o agrupamento dos pacientes com nefropatia
por IgA em diferentes classes de acordo com a evolução da doença, finalmente
reflete a considerável variação observada nestes pacientes na prática clínica diária.
1.7 MASTÓCITOS
Os mastócitos foram descritos pela primeira vez, em 1878, por Paul Ehrlich, ainda
estudante de medicina. (Ehrlich P, 1879). Ehrlich observou que algumas células,
denominadas de plasmócitos pelos histologistas, em determinado momento, se
enchiam de grânulos. Estes grânulos apresentavam coloração vermelha quando o
corante utilizado era o azul de anilina (Mota, 1995). Desta forma ficou definida a
diferença entre os plasmócitos e as células coradas metacromaticamente, desde
então chamadas de mastócitos (mastüng). Assim, classicamente, os mastócitos são
detectados por métodos histoquímicos, em secções histológicas, utilizando a
propriedade metacromática. A metacromasia é uma resposta à interação do corante
com a heparina ácida, um constituinte dos grânulos dos mastócitos (Krishnaswamy
et al., 2001).
Mastócitos são derivados de células multipotentes progenitoras da medula
óssea, sendo CD34(+) (Kitamura et al., 1977). Em certo momento, os progenitores
dos mastócitos humanos deixam a medula óssea e tornam-se células agranulares,
indiferenciadas, existentes na circulação periférica. Apresentam diferenciação
terminal nos tecidos, amadurecendo sob a influência dos microambientes locais
(Galli, 1990; Knudsen, Johansen, 1990).
O receptor para imunoglobulina E (IgE) e o c-kit (receptor para o fator de
células tronco – receptor SCF) são receptores característicos dos mastócitos. O c-kit
se liga ao fator de células tronco (SCF), um fator de crescimento específico para
mastócitos, produzido pelos fibroblastos (Galli et al.,1995; Valent, 1995). Essas
interações entre o SCF, um fator quimiotáctil, e o c-kit são cruciais para o
crescimento e maturação destas células, pois o SCF promove a diferenciação de
células precursoras pluripotenciais e também induz a liberação de mediadores
(Vliagoftis et al., 1997).
Os mastócitos distribuem-se normalmente nos tecidos conjuntivos. São
especialmente numerosos na pele, no sistema respiratório e no trato gastrointestinal,
adjacentes a vasos sanguíneos e linfáticos (Bienenstock et al., 1989). Segundo Galli
(1993), os locais de distribuição dos mastócitos têm relação com a proximidade de
parasitas e outros patógenos, além de antígenos ambientais que entram em contato
com a pele e superfícies mucosas.
Os mastócitos humanos podem ser classificados, de acordo com a sua
composição de proteases, em mastócitos contendo triptase (Schwartz et al., 1981),
quimase (Schechter et al., 1983) ou ambas as enzimas. A produção de mediadores
inflamatórios outros que a histamina, como o fator de crescimento fibroblástico (FGF)
e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Gruntzkau et al., 1998) foi
demonstrada “in vitro” para os mastócitos. Estas células também secretam fator de
crescimento e transformação  (TGF-), citocina critica para a fibrose renal (Inazaki
et al., 2004; Tamaki, Okuda, 2003). Os mastócitos formam uma população
heterogênea de células, com diferenças aparentes em seu desenvolvimento,
conteúdo de mediadores, ultraestrutura e habilidade para interagir com o ambiente
local (Bloom, 1984). Estas células, nos diferentes sítios anatômicos, ou em um
mesmo sitio, podem ter diferenças substanciais na sensibilidade a agentes que
induzem ativação e liberação de mediadores ou a agentes farmacológicos. A
distribuição tecidual e a vasta gama de mediadores lipídicos, proteases,
proteoglicanos e citocinas, identificados como produtos dos mastócitos humanos,
evidenciam o potencial de contribuição destas células em eventos biológicos
diversos (Schwartz, 1989).
A histamina, produzida pela ação da enzima histidina-decarboxilase, atua
através de três tipos de receptores específicos: H1, H2 e H3. Nos receptores H1 e H3,
a histamina exerce efeitos do tipo inflamatório, atuando como uma potente amina
vasoativa, aumentando a permeabilidade vascular e a secreção de muco,
contribuindo para o recrutamento de células circulantes. Os efeitos mediadores pelo
receptor H2, são do tipo antiinflamatório, funcionando como um sistema de
retrorregulação (FALUS, A., MERETEY, K., 1992).
As proteases neutras são enzimas proteolíticas. A quimase, presente em
maior quantidade na subpopulação MCTC estimula a secreção mucosa nos
brônquios, enquanto que a Triptase é liberada juntamente com a histamina, durante
a degranulação e ativa o fibrinogênio, a colagenase e o C3 por via alternativa. O
proteoglicano dominante nos mastócitos é a heparina. Uma vez liberada, ela pode
afetar a estabilidade ou a função de outros mediadores mastocitarios. Atua como
anticoagulante e anticomplemento, melhora a ligação do colágeno com a
fibronectina, auxiliando o remodelamento tecidual e ativando numerosos fatores de
crescimento (KRISHNASWAMY, G., et al.,2001).
Dentre os mediadores lipídicos de nova geração, existem os leucotrienos
(LTB4, LTC4 e LTE4), as prostaglandinas (PDD2) e o PAF. A PGD2 regula
negativamente a degranulação do mastócito, enquanto que o fator de agregação
plaquetária - PAF tem ação broncoconstrictora direta. Os leucotrienos têm efeitos
semelhantes aos da histamina, porém mais potentes tardios e prolongados
(CHURCH MK., LEVISHAFER, FJ., 1997).
Os mastócitos humanos também sintetizam e liberam um painel de citocinas
multifuncionais como a IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, IL-16, TNFα (Fator de
Necrose Tumoral alfa), GM-CSF (Fator Estimulador de Colônia do Macrófago e
Granulócito) e também alguns dos mais poderosos fatores de crescimento como o
BFGF (Fator de Crescimento Básico do Fibroblasto, o VEGF (Fator de Crescimento
Endotelial Vascular) e o TGFβ (Fator de Crescimento e Transformação beta), além
de quimiocinas como MIP-1α (proteína inflamatória do macrófago 1 alfa), MCP-1
(Proteína Quimiotáctil do Monócito 1) e RANTES (Regulador da Ativação Normal de
Célula T expressa e Secretada) (CHURCH, MK., et al, 1991; AOKI, M., et al, 2003).
Estas citocinas não apenas regulam a produção de IgE e outras respostas
imunes, mas também afetam a inflamação, a homeostase, a hematopoise, a
angiogênese, a remodelagem tecidual (GALLI, SJ., et al., 1991)
1.7.1 Mastócitos no Rim
A pesquisa para a presença de mastócitos no rim não existiu até
aproximadamente 1996, embora os trabalhos de Pavone-Macaluso (1960) e Colvin
et al. (1974) já relatassem um aumento no número de mastócitos no interstício de
várias doenças renais humanas. Esta célula foi relegada pelo mundo da nefrologia
durante muito tempo, conforme Roberts e Brenchley afirmaram em 2000. Poucos
trabalhos, tanto em animais de experimentação como em material humano, foram
conduzidos para investigar o papel dos mastócitos na progressão das doenças
renais, especialmente na nefropatia por IgA.
2-Hipótese e Objetivos
2.1 HIPÓTESE
O papel dos mastócitos no contexto das doenças renais ainda é pouco
conhecido e estudado.
Assim, levantou-se a hipótese de que a densidade de mastócitos e a
densidade de mastócitos degranulados correlacionam-se com a fibrose intersticial
renal na nefropatia por IgA.
2.2 OBJETIVOS
Os objetivos deste estudo foram:

Avaliar dados demográficos e clínicos dos pacientes diagnosticados com
nefropatia por IgA;

Quantificar os mastócitos granulados e degranulados no compartimento
intersticial renal em pacientes com nefropatia por IgA primária, através de
reações histoquímicas;

Verificar a localização dos mastócitos no compartimento intersticial renal
em pacientes com nefropatia por IgA primária;

Quantificar a fibrose túbulo-intersticial nos pacientes com nefropatia por
IgA primária;

Correlacionar a fibrose túbulo-intersticial com o número de mastócitos
existentes.
3-Materiais e Métodos
3.1 PACIENTES
Biópsias renais de pacientes diagnosticados com nefropatia por IgA primária,
que se submeteram a este procedimento por indicações clínicas, analisadas no
Serviço de Nefropatologia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, entre
janeiro de 2009 a dezembro de 2010, foram incluídas neste estudo.
Os critérios de inclusão deste estudo foram os seguintes: (i) não apresentar
evidências para a púrpura de Henoch-Schonlein ou lupus eritematoso sistêmico; (ii)
não apresentar nenhuma evidência de uma doença sistêmica superposta
envolvendo o rim, como a nefropatia diabética; (iii) na análise da imunofluorescência,
mostrar deposição de IgA mesangial difusa.
Os critérios de exclusão deste estudo foram: i) pacientes com idade inferior a
18 anos; ii) biópsias com números de glomérulos menor que 8; e iii) pacientes com
diagnóstico de nefropatia por IgA inconclusivo e iv) pacientes que apresentavam
evidências de outras nefropatias associadas. Todos os dados histológicos e clínicos
foram registrados em planilhas.
Assim, 67 pacientes foram incluídos neste estudo. O estudo foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Triângulo Mineiro,
protocolado sob o número 999.
3.2 COLETA DE DADOS
Os registros médicos foram revistos e parâmetros laboratoriais, clínicos e
demográficos como idade, gênero, pressão sanguínea, creatinina sérica, proteína
urinária, presença de hematúria e presença de hipertensão arterial foram
registrados. Hipertensão arterial foi definida como pressão sanguínea sistólica maior
que 140mmHg e pressão sanguínea diastólica maior que 90mmHg.
3.3 BIÓPSIAS RENAIS
Biópsias renais percutâneas enviadas para o Serviço de Nefropatologia foram
processadas rotineiramente para microscopia de luz, para imunofluorescência e para
microscopia eletrônica, conforme procedimentos padrões. O diagnóstico de
nefropatia por IgA foi realizado por um único nefropatologista.
3.4 ESCORE HISTOLÓGICO
Todos os laudos das biópsias renais de cada paciente envolvido neste estudo
foram revistos por um único investigador. Os dados morfológicos foram coletados e
as variáveis histopatológicas presentes anotadas. A planilha de escore foi baseada
na classificação de Oxford para a nefropatia por IgA, como se segue: escore de
hipercelularidade mesangial ≤ 0,5 (M0) ou > 0,5 (M1); glomeruloesclerose segmentar
ausente (S0) ou presente (S1); hipercelularidade endocapilar ausente (E0) ou
presente (E1); atrofia tubular/fibrose intersticial ≤ 25% (T0), de 26 a 50% (T1) ou
>50% (T2). Outras cinco variáveis patológicas extraídas dos laudos de biópsias
foram também classificadas: infiltrado inflamatório ausente (INF0) ou presente
(INF1), lesões vasculares ausentes (LV0) ou presentes (LV1), crescentes ausentes
(C0) ou presentes (C1), adesões ausentes (AD0) ou presentes (AD1) e atrofia
tubular ausente (AT0) ou presente (AT1).
3.5 ANÁLISE HISTOQUÍMICA
Os fragmentos das biópsias renais foram fixados em paraformaldeído 4%,
tamponado em fosfato, por 24 horas, à temperatura ambiente, desidratados em
sequência crescente de alcoóis, diafanizados em xilol, infiltrados e incluídos em
parafina. Secções histológicas seriais, com 2µm de espessura, foram obtidas e
então desparafinizadas, rehidratadas e lavadas em água destilada. Para detectar os
mastócitos, as secções histológicas foram coradas com azul de toluidina, à
temperatura
ambiente.
Brevemente,
as
secções
foram
incubadas
com
permanganato de potássio 0,5%, por 2 minutos, lavadas três vezes em água
destilada, incubadas com bissulfito de sódio 1%, lavadas em água corrente por 3
minutos e em água destilada três vezes. Finalmente, as secções foram colocadas
em solução de azul de toluidina não alcoólico 0,02%, por 5 minutos, e lavadas em
água destilada três vezes. Após coradas, as secções foram desidratadas,
diafanizadas e montadas. Mastócitos degranulados foram determinados pela
presença do conteúdo granular extruído (Singh et al., 1999). Como controle positivo
para a reação histoquímica, secções de pele humana foram utilizadas, obtidas de
necropsias realizadas no Hospital de Clínicas pela disciplina de Patologia Geral da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro. A presença de matriz extracelular
intersticial renal foi observada pela área com coloração positiva para as fibras
colágenas, que se coram em azul com a utilização do método do tricrômico de
Masson.
3.6
QUANTIFICAÇÃO
DOS
MASTÓCITOS
E
DA
FIBROSE
TUBULOINTERSTICIAL
Todas as avaliações morfológicas e morfométricas foram realizadas por um
único investigador, que não conhecia os dados a respeito das características dos
pacientes envolvidos neste estudo. Secções de biópsias renais foram examinadas
com microscopia de campo claro (Nikon Eclipse i50; Nikon Instruments, USA) e uma
câmera foi utilizada para capturar as imagens. Estas imagens foram processadas
pelo programa Image-Pro PluS (versão 6.0; Media Cybernetics, USA) e
armazenadas como arquivos JPG. Foram realizadas análises das imagens
armazenadas, utilizando-se uma macro especialmente desenvolvida para o
programa Image J, do National Healthy Institute (NHI).
Para quantificar os mastócitos no compartimento tubulointersticial quatro
campos, não sobrepostos, selecionados randomicamente, foram capturados
utilizando uma objetiva de 40x. O número total de mastócitos azul de toluidina
positivos e o número total de mastócitos azul de toluidina positivos degranulados
foram contados e expressos como o número de células positivas por 1mm 2 de área
tecidual.
A fibrose tubulointersticial foi obtida através do tecido intersticial corado
positivamente para colágeno, em secções coradas com a técnica do tricrômico de
Masson. Para quantificar a fibrose sete campos, não sobrepostos, selecionados
randomicamente, foram capturados utilizando uma objetiva de 40x. Nesta análise, a
área de superfície com coloração positiva para o colágeno foi quantificada por
pontos e expressa como porcentagem de área superficial envolvida.
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram expressos como mediana e variação (máximo-mínimo) para
as variáveis contínuas e como porcentagens para as variáveis categóricas. Variáveis
contínuas foram comparadas pelo teste t não pareado independente e pelo teste U
de Mann-Whitney, quando a distribuição não foi normal.
As variáveis categóricas foram comparadas utilizando-se o teste do 2 (quiquadrado) ou o teste exato de Fisher. A relação entre variáveis contínuas foi obtida
pelo coeficiente de correlação de Spearman.
Detecção de outliers foi analisada com o teste de Grubber (GraphPad
Software Inc.). Valores de p menores que 0,05 foram considerados estatisticamente
significantes. A análise estatística foi realizada utilizando-se a versão 5,0 do
programa Prism GraphPad (GraphPad Software Inc.)
4-Resultados
4.1 CARACTERISTICAS CLÍNICAS E DEMOGRÁFICAS DOS PACIENTES COM
NEFROPATIA POR IgA
Dentre as características dos pacientes diagnosticados com nefropatia por
IgA, no momento da biópsia nativa, 52,24% eram mulheres (figura 1), 77,61% dos
pacientes eram brancos e 11,94% não brancos (figura 2). Quando a distribuição de
cor foi analisada em relação aos gêneros, esta prevalência não se alterou, com
81,25% dos pacientes do sexo masculino e 74,29% do sexo feminino de cor branca.
A mediana da idade no momento da biópsia foi de 34 (18-67) anos e as mulheres
apresentaram idade significativamente maior (p<0,05) (figura 3). As características
clínicas do 67 pacientes encontram-se sumarizadas na tabela 1.
Figura 1 – Distribuição dos 67 pacientes diagnosticados com NIgA primária em
relação ao gênero, de acordo com a Classificação Internacional de Oxford.
Figura 2 – Distribuição dos 67 pacientes diagnosticados com NIgA primária em
relação à cor, de acordo com a Classificação Internacional de Oxford.
Figura 3 – Distribuição dos 67 pacientes diagnosticados com NIgA primária em
relação a idade, de acordo com a Classificação Internacional de Oxford.
Tabela 1 – Características dos pacientes com nefropatia por IgA, no momento da
biópsia nativa
Todos os
pacientes
1472 (48-5000)
(n=48)
Mulheres
Homens
1100 (705000)
(n=23)
1480 (48-4427)
(n=25)
1.05 ± 0.31
(n=41)
1.01 ± 0.34
(n=23)
1.11±0.26
(n=18)
Função renal
Normal
Reduzida
130/80
(100/60160/100)
(n=43)
n
43
10
130/80
(100/60160/100)
(n=25)
n
23
5
140/90
(110/67270/120)
(n=19)
n
20
5
Hipertensão
Ausente
Presente
n
26
32
n
15
17
n
11
15
Proteinúria
Ausente
Presente
n
7
42
n
2
28
n
5
24
Hematúria
Ausente
Presente
n
5
55
n
3
31
n
2
24
Excreção de proteina
urinária (mg/24h)
(mediana)
Creatinina sérica
(mg/dL)
(média, DP)
Pressão sanguínea
(mediana)
4.2 CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS
A mediana de glomérulos por biópsia foi de 14 (8-42), (figura 4). Na
população estudada, 44,8% (n=30) dos pacientes apresentaram proliferação
mesangial (M1; figura 5), 13,4% (n=9) proliferação endocapilar (E1; figura 6), 71,6%
(n=48) esclerose segmentar (S1; figura 7), 20,9% (n=14) fibrose tubulointersticial
moderada (T1, 26-50% de córtex fibrosado) e somente 1,5% (n=1) com fibrose
tubulointersticial acentuada (T2, >50% do córtex fibrosado; figura 8). Como T2 foi
observado somente em um caso no presente estudo, os grupos T1 e T2 formaram
um único grupo, para análises posteriores. Infiltrado inflamatório (INF1; figura 9),
predominantemente de mononucleares, foi observado em 51 casos (76,1%) e lesões
vasculares (LV1; figura 10) discretas, principalmente com espessamento da íntima
arterial, estavam presentes em 44 pacientes (65,7%). A freqüência de crescentes
(C1; figura 11) foi baixa, observada em somente 2 casos (3,0%). Adesões (AD1;
figura 12) e atrofia tubular (AT1, figura 13) mostraram uma ocorrência significante
(49 casos; 73,1%).
Figura 4 – Distribuição dos 67 pacientes diagnosticados com NIgA primária em
relação ao número de glomérulos, de acordo com a Classificação Internacional de
Oxford.
60
n=37 (52,2%)
% de pacientes
50
n=30 (44,8%)
40
30
20
10
0
M0
M1
% de pacientes
Figura 5 – Distribuição da frequência da variável histopatológica “escore de
hipercelularidade mesangial (M)” nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. M0  0,5;
M1 > 0,5.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
n=58 (86,6%)
n=91 (3,4%)
E0
E1
Figura 6 – Distribuição da frequência da variável histopatológica “hipercelularidade
endocapilar (E)” nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. E0=ausente;
E1=presente.
n=48 (71,6%)
80
% de pacientes
70
60
50
40
n=19 (28,4%)
30
20
10
0
S0
S1
% de pacientes
Figura 7 – Distribuição da frequência da variável histopatológica “glomeruloesclerose
segmentar (S)” nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. S0=ausente; S1=presente.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
n=52 (77,6%)
n=14 (20,9%)
n=1 (1,59%)
T0
T1
T2
Figura 8 – Distribuição da frequência da variável histopatológica “atrofia
tubular/fibrose intersticial (T)” nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. T0=0-25%;
T1=26-50%; T2>50%.
n=51 (76,1%)
80
% de pacientes
70
60
50
40
30
n=16 (23,9%)
20
10
0
INF0
INF1
Figura 9 – Distribuição da frequência da variável histopatológica “infiltrado
inflamatório (INF)” nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. INF0=ausente;
INF1=presente.
80
n=44 (65,7%)
% de pacientes
70
60
50
40
n=23 (34,3%)
30
20
10
0
LV0
LV1
Figura 10 – Distribuição da frequência da variável histopatológica “lesões vasculares
(LV)” nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. LV0=ausente; LV1=presente.
120
% de pacientes
100
n=65 (97%)
80
60
40
20
0
n=2 (3%)
C0
C1
Figura 11 – Distribuição da frequência da variável histopatológica “crescente (C)” nos
67 pacientes com nefropatia por IgA. C0=ausente; C1=presente.
n=49 (73,1%)
80
% de pacientes
70
60
50
40
n=18 (26,7%)
30
20
10
0
AD0
AD1
Figura 12 – Distribuição da frequência da variável histopatológica “adesão (AD)” nos
67 pacientes com nefropatia por IgA. AD0=ausente; AD1=presente.
n=49 (73,1%)
80
% de pacientes
70
60
50
40
30
n=18 (26,7%)
20
10
0
AT0
AT1
Figura 13 – Distribuição da frequência da variável histopatológica “atrofia tubular
(AT)” nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. AT0=ausente; AT1=presente.
4.3 DISTRIBUIÇÃO E DENSIDADE DE MASTÓCITOS NOS TECIDOS RENAIS DE
PACIENTES COM NEFROPATIA POR IgA
Mastócitos foram detectados em secções de córtex renal, de pacientes
diagnosticados com nefropatia por IgA, pela coloração do azul de toluidina. As
células que exibiam a clássica coloração metacromática, apresentando cor púrpura
ou violeta, foram identificadas como mastócitos (figura 14A e B). A intensidade de
coloração para os grânulos citoplasmáticos variou de célula para célula. Os
mastócitos encontravam-se distribuídos difusamente no interstício, entre os túbulos
renais (figura 15A e B) ou próximos aos vasos sanguíneos (figura 15C), sendo
83,9% do total de mastócitos localizados preferencialmente na região peritubular.
Mastócitos não foram detectados dentro de glomérulos em nossas amostras nem em
áreas onde as células inflamatórias se concentravam. Em relação à morfologia
nuclear, os mastócitos observados apresentaram núcleo alongado, poligonal ou
ovalado. Quanto à integridade dos limites celulares dos mastócitos, as células
identificadas como granuladas (figura 15A) foram aquelas que estavam intactas e
nenhum grânulo foi observado no exterior das mesmas. Já os mastócitos
degranulados (figura 15B) apresentavam alguns grânulos ou quase todo o seu
conteúdo granular liberado para fora da célula. Do total de mastócitos identificados
em todas as biópsias, 57,2% encontravam-se degranulados. A mediana da
densidade de mastócitos azul de toluidina positivos nos pacientes com nefropatia
por IgA foi 4,2 (0,0-25,0) células/mm2. A coloração foi azul de toluidina positiva para
os mastócitos pois corremos juntos com todos os casos o controle positivo para
mastocitos, sendo secções de pele de indivíduos necropsiados no HC/UFTM (figura
16).
Figura 14 – Secções histológicas de córtex renal, de pacientes
com nefropatia por IgA, corados pela coloração do azul de
toluidina, pH 5,0.. Observar os mastócitos exibindo coloração
metacromática apresentando coloração violeta (a) seta longa. E
também mastócitos apresentando coloração púrpura (b) cabeça
de seta, localizados no interstício tubular.
Figura 15 – Secções histológicas de córtex renal, de pacientes com
nefropatia por IgA, corados pela coloração do azul de toluidina, pH 5,0,
exibindo coloração metacromática. Observar os mastócitos localizados no
interstício tubular (a e b) e próximos aos vasos (c). Notar também que
estas células podem estar granuladas (a) ou degranuladas (b).
Figura 16 – Controle positivo para mastócitos, secções histológicas
de pele de pacientes autopsiados no HC/UFTM, corados pelo Azul
de Toluidina, pH 5, exibindo coloração metacromática. (a) Observar
os mastócitos localizados no interstício e próximos aos vasos. Em
(B) mastócitos granulados e em (c) mastócitos degranulados
4.4 DENSIDADE DE MASTÓCITOS E DE MASTÓCITOS DEGRANULADOS DE
ACORDO COM AS VARIÁVEIS PATOLÓGICAS E AS CARACTERÍSTICAS
CLÍNICAS
O número de mastócitos/mm2 e de mastócitos degranulados/mm2 não foi
significativamente diferente nos pacientes de acordo com as variáveis patológicas
(Tabela 2). Em relação aos achados clínicos (Tabela 3), a densidade de mastócitos
e de mastócitos degranulados foi maior nos pacientes sem hematúria (p<0,05).
4.5 QUANTIFICAÇÃO DA MATRIZ EXTRACELULAR INTERSTICIAL (F) EM
PACIENTES COM NEFROPATIA POR IgA E A DENSIDADE DE MASTÓCITOS
A matriz extracelular intersticial renal foi quantificada pela visualização da
quantidade total de colágeno presente no compartimento intersticial do tecido renal.
Podemos notar que o interstício renal encontra-se expandido, e apresenta coloração
positiva para colágeno de forma evidente (figura 17A), ou discreta, com coloração do
colágeno reduzido (figura 17B). Dezoito pacientes apresentaram menos de 25% da
área de córtex renal analisada, ocupada pela matriz intersticial e foram classificados
como F0. Fibrose intersticial foi observada em 49 pacientes (F1+F2); deste total,
somente um paciente apresentou fibrose acentuada (F2, mais de 50% do córtex
fibrosado), (figura 18).
A área intersticial cortical renal média quantificada, dos indivíduos com
nefropatia por IgA, foi de 0,067±0,015mm2. Quando os grupos F0 e F1+F2 foram
subdivididos em relação ao gênero, não existiram diferenças significativas entre as
áreas intersticiais masculina (0,068±0,017mm2) e feminina (0,066±0,013mm2;
p=0,608). As medianas das áreas intersticiais nos grupos F0 e F1+F2 foram de
0,053mm2 (0,045-0,054) e de 0,070mm2 (0,062-0,082). O grupo F1+F2 apresentou
um aumento significante na porcentagem de área total de colágeno quando
comparado com a porcentagem de área total de colágeno do grupo F0, sendo esta
diferença altamente significativa (p <0,001), (figura 19).
A densidade de mastócitos em relação à variável matriz extracelular
intersticial cortical renal quantificada foi de 18,7(11,5-35,7) e de 19,6(6,6-53,4)
mastócitos/mm2 nos grupos F0 e F1, respectivamente (p>0,05), (figura 20). A
densidade de mastócitos degranulados/mm2 foi de 8,2(6,0-20,4) em F0 e de
10,7(3,4-30,3) em F1, não sendo esta diferença estatisticamente significante
(p>0,05) figura 21). Em relação ao nível de degranulação, também não existiram
diferenças significativas entre F0 e F1 (F0: 0,5±0,3; F1: 0,5±0,3).
4.6 CORRELAÇÃO ENTRE A FIBROSE E OS MASTÓCITOS
Correlação significativa foi encontrada entre a porcentagem de área de
interstício renal e o número de mastócitos/mm2 (p<0,05) e entre a área de interstício
renal e o número de mastócitos/mm2 degranulados (p<0,05).
Houve uma correlação positiva entre a área de matriz extracelular e a
densidade de mastócitos (r=0,213; p=0,0469), (figura 22) e de mastócitos
degranulados (r=0,269; p=0,0278), (figura 23).
Entretanto, a densidade de mastócitos e a densidade de mastócitos
degranulados não se correlacionaram com a idade, a creatinina sérica e o nível de
proteína urinária de 24 horas.
Tabela 2 – Densidade de mastócitos e densidade de mastócitos degranulados em
pacientes com nefropatia por IgA de acordo com as variáveis patológicas, no
momento da biópsia renal
Mastócitos/mm2
Variáveis patológicas
Mastócitos
degranulados/mm2
n
Mediana (minmax)
n
Mediana (minmax)
36
29
0,0 (0,0-16,6)
4,2 (0,0-20,8)
0,949
37
30
0,0 (0,0-20,8)
0,0 (0,0-16,6)
0,8087
58
08
2,1 (0,0-25,0)
6,2 (0,0-12,5)
0,4562
58
9
0,0 (0,0-16,6)
4,2 (0,0-20,8)
0,1549
19
48
0,0 (0,0-16,6)
4,2 (0,0-25,0)
0,8058
18
48
0,0 (0,0-12,5)
0,0 (0,0-20,8)
0,7091
51
14
4,2 (0,0-20,8)
2,1 (0,0-16,6)
0,7975
52
15
0,0 (0,0-16,6)
0,0 (0,0-20,8)
0,6263
Infiltrado inflamatório
Ausente (INF0)
Presente (INF1)
p
16
49
4,2 (0,0-20,8)
0,0 (0,0-16,6)
0,1628
16
50
4,2(0,0-16,6)
0,0(0,0-16,6)
0,2069
Lesão vascular
Ausente (LV0)
Presente (LV1)
p
22
44
0,0 (0,0-12,5)
4,2 (0,0-25,0)
0,2013
21
44
0,0 (0,0-4,2)
2,1 (0,0-16,6)
0,0581
Crescentes
Ausente (C0)
Presente (C1)
p
65
02
19,4(10,1-50,0)
13,6(5,2-22,0)
0,519
65
02
10,0(4,3-29,2)
7,3(3,5-11,0)
0,593
18
0,0 (0,0-16,6)
18
0,0 (0,0-16,6)
Escore
hipercelularidade
mesangial
≤ 0,5 (M0)
> 0,5 (M1)
p
de
Hipercelularidade
endocapilar
Ausente (E0)
Presente (E1)
p
Glomeruloesclerose
segmentar
Ausente (S0)
Presente (S1)
p
Atrofia
tubular/fibrose
intersticial
≤ 25% (T0)
>25% (T1)
p
Adesões
Ausente (A0)
Presente (A1)
p
Atrofia tubular
Ausente (AT0)
Presente (AT1)
p
48
4,2 (0,0-25,0)
0,5035
49
0,0 (0,0-20,8)
0,8461
18
48
0,0 (0,0-16,6)
4,2 (0,0-25,0)
0,2886
17
49
0,0 (0,0-12,5)
4,2 (0,0-20,8)
0,1620
Tabela 3 – Densidade de mastócitos e de mastócitos degranulados em pacientes
com nefropatia por IgA de acordo com os achados clínicos, no momento da biópsia
renal nativa
Mastócitos/mm2
Achados clínicos
Mastócitos
degranulados/mm2
n
Mediana (minmax)
n
Mediana (minmax)
Função renal
Normal
Reduzida
p
42
10
0,0 (0,0-16,6)
2,1 (0,0-16,6)
0,5592
43
10
0.0 (0.0-16.6)
2,1 (0,0-16,6)
0,5824
Hipertensão
Ausente
Presente
p
25
31
4,2 (0,0-16,6)
0,0 (0,0-20,8)
0,7096
26
32
0,0 (0,0-16,6)
0,0 (0,0-20,8)
0,9245
Proteinúria
Ausente
Presente
p
07
52
4,2 (0,0-12,5)
0,0 (0,0-25,0)
0,9594
07
52
4,2 (0,0-12,5)
0,0 (0,0-20,8)
0,6367
5
54
12,5 (0,0-16,6)
0,0 (0,0-16,6)
0,0361*
Hematúria
Ausente
5
12,5 (4,2-16,6)
Presente
55
0,0 (0,0-33,3)
p
0,0115*
*Hematúria ausente x hematúria presente
Figura 17 – Secções histológicas de córtex renal corados com
Tricrômico de Masson de pacientes com nefropatia por IgA. Observar a
matriz intersticial corada em azul pela reação histoquímica. Notar que
em A, a área intersticial encontra-se expandida, o que não
visualizamos em B.
Figura 18. Porcentagem de matriz intersticial cortical renal (F0; F1 e F2) nos 67
pacientes com nefropatia por IgA.
Figura 19 - Porcentagem de matriz intersticial cortical renal (F0; F1+ F2) nos 67
pacientes com nefropatia por IgA
Densidade (MC/mm2 )
25
20
15
10
5
0
-5
F0
2
+F
1
F
Figura 20 – Densidade de mastócitos no compartimento intersticial renal (F0; F1+F2)
nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. Os valores foram expressos como mediana
(min-max).
Densidade (MC/mm2 )
20
15
10
5
0
2
F1
+F
F0
-5
Figura 21 – Densidade de mastócitos degranulados no compartimento intersticial
renal (F0; F1+F2) nos 67 pacientes com nefropatia por IgA. Os valores foram
expressos como mediana (min-max).
Figura 22 – Correlação entre a densidade de mastócitos totais e a percentagem de
matriz no compartimento intersticial cortical renal nos 67 pacientes com nefropatia
por IgA.
Figura 23 – Correlação entre a densidade de mastócitos degranulados e a
percentagem de matriz no compartimento intersticial cortical renal nos 67 pacientes
com nefropatia por IgA.
5-Discussão
Através da utilização de secções renais de pacientes com nefropatia por IgA,
o presente estudo investigou a associação entre os mastócitos renais e a presença
de fibrose túbulo-intersticial. A acumulação de células inflamatórias no interstício
cortical renal desempenha um papel essencial na formação da fibrose túbulointersticial nas doenças renais crônicas progressivas (Okada, Kalluri, 2005;
Rodriguez-Iturbe et al., 2001). Silva et al. (2012) evidenciaram que o número
aumentado de macrófagos na região túbulo-intersticial pode servir como um fator
preditor para um pior prognóstico em pacientes com nefropatia por IgA. Entretanto, a
contribuição
dos
mastócitos
para
a
fibrose
túbulo-intersticial
sempre
foi
negligenciada. De fato, além de linfócitos e monócitos/macrófagos, mastócitos estão
presentes no compartimento túbulo-intersticial em pacientes com glomerulonefrites
(Hiromura et al., 1998). Mastócitos são ricos em fatores de crescimento, proteases e
mediadores inflamatórios. Uma vez ativados, mastócitos podem liberar vários tipos
de substâncias como o TGF-ß, quimase, triptase, histamina, renina e TNF-α pelo
processo de degranulação (Metz et al., 2007; Nakae et al., 2007; Moon et al., 2010;
Silver et al., 2004), sendo a quimase e a triptase as duas principais proteinases
existentes nestas células. Estudos demonstraram que estas duas enzimas
desempenham papéis muito importantes na função dos mastócitos (Balakumar,
Reddy, Singh, 2009). De acordo com a produção destas duas proteases, os
mastocitos humanos são classificados em dois subtipos (Ehara, Shigematsu, 2003):
mastócitos que produzem tanto triptase como quimase e mastócitos que produzem
somente quimase. Diferentes resultados foram descritos de acordo com o subtipo de
mastócito no tecido renal humano (Goto et al., 2002; Ehara, Shigematsu, 1998, Tóth
et al., 2000), sugerindo que os subtipos de mastócitos sejam dependentes das
doenças (Ehara, Shigematsu, 2003). Independente do fato dos mastócitos serem
quimase ou triptase positivos, os mediadores existentes em seus grânulos podem
ser capazes de contribuir para a evolução da fibrose renal. Certamente, a liberação
destas substâncias pode provocar a lesão renal. Em consonância com estes
achados, o presente estudo demonstrou uma significante correlação entre a
densidade de mastócitos e de mastócitos degranulados e o grau de fibrose
intersticial, expresso como a porcentagem de área de córtex renal apresentada pelos
pacientes, sugerindo o envolvimento dos mastócitos na evolução da nefropatia por
IgA.
Mastócitos podem ser ativados por diversas maneiras. A via clássica de
ativação de mastócitos é através da ligação ao receptor para IgE. Mas, os
mastócitos podem também ser ativados através da via alternativa, a via do
complemento. Estudos in vitro demonstraram que C3a é o mais potente
quimioatrativo e ativador de mastócitos (Nilsson et al., 1996; Hartmann et al., 1997).
Embora os depósitos de IgA no mesângio glomerular sejam o achado diagnóstico
principal na nefropatia por IgA, deposição de C3 mesangial é também
frequentemente observada. O complemento poderia então ser uma via de ativação
de mastócitos, que uma vez degranulados poderiam, através dos mediadores
existentes em seus grânulos, contribuir para o processo de fibrose túbulo-intersticial
diretamente ou ainda indiretamente, ativando outras células inflamatórias infiltrantes,
intensificando dessa forma a reação iniciada.
A freqüência das características histopatológicas da população estudada foi
predominantemente M0, E0, S1 e T0. Os outros fatores avaliados evidenciaram
predominância de infiltrado inflamatório, de lesões vasculares, adesões e atrofia
tubular. As crescentes, entretanto, apresentaram uma freqüência muito baixa, da
mesma forma que na classificação de Oxford (Cattran et al., 2009, Roberts et al.,
2009). A densidade dos mastócitos e dos mastócitos degranulados também foi
analisada segundo a classificação de Oxford. Não foram observadas diferenças em
nenhum dos parâmetros da referida classificação, em relação à densidade de
mastócitos e de mastócitos degranulados. Surpreendentemente, nem o parâmetro
atrofia tubular/fibrose intersticial apresentou diferenças significativas entre os grupos
T0 e T1 (Tabela 2). Também, o presente estudo não evidenciou diferenças na
densidade de mastócitos, quando a matriz extracelular intersticial renal foi
quantificada, entre os pacientes F0 (0-25% de matriz) e F1 (com 26 a 50% de matriz
intersticial), quando a lesão túbulo-intersticial torna-se óbvia. Em relação aos
parâmetros clínicos utilizados neste estudo, o número de mastócitos/mm2 e de
mastócitos degranulados/mm2 foi significativamente maior (p<0,05) no grupo que
não apresentou hematúria (Tabela 3).
A nefropatia por IgA geralmente afeta adultos jovens, com idade inferior a 30
anos (Nair, Walker, 2006). Em nosso estudo a mediana da idade dos pacientes com
nefropatia por IgA foi de 34 anos, com uma diferença estatisticamente significativa
entre os sexos, com as mulheres apresentando idade mais elevada. Estas
mudanças na proporção da faixa etária podem ser causadas por um aumento na
expectativa de vida humana, com o consequente aumento da proporção de
pacientes mais velhos. Diferentemente dos dados da literatura (Wyatt et al., 1995;
Feehally, Cameron, 2011; Neves et al., 2012), os nossos resultados também
demonstraram
um
predomínio
do
sexo
feminino,
com
um
aumento
de
aproximadamente 10%. Estes dados devem ser interpretados cautelosamente,
devido a limitação de estudos baseados em populações no Brasil.
Utilizando a coloração do azul de toluidina, os mastócitos foram identificados
em biópsias renais de pacientes com nefropatia por IgA, independentemente do fato
dos espécimes terem sido fixados com formaldeído, fixador utilizado na rotina das
biópsias renais. A fixação com formaldeído é conhecida por reduzir o número de
mastócitos corados pela técnica do azul de toluidina (Wingren, Enerback, 1983), pois
alguns tipos de mastócitos são sensíveis ao formaldeído. A mediana da densidade
de mastócitos azul de toluidina positivos nos pacientes com nefropatia por IgA foi 4,2
(0,0-25,0)
células/mm2.
Assim,
estes
valores
encontrados
podem
estar
subestimados, não refletindo a real densidade de mastócitos nos pacientes deste
estudo. Em relação à localização dos mastócitos no córtex renal, esta foi similar a
prévios estudos (Ehara, Shigematsu, 2003), com estas células presentes
principalmente no interstício tubular, não sendo detectados mastócitos nos
glomérulos.
Os mastócitos são células com papéis dicotômicos. Em determinadas situações
podem controlar ou dispersar a inflamação (Caughey, 2007). Estes papéis
dicotômicos exercidos pelos mastócitos podem ser conseqüência da grande
heterogeneidade apresentada por estas células. O microambiente nos quais os
mastócitos residem determina a sua expressão gênica e o seu fenótipo. Assim,
variações nas condições deste microambiente, como por exemplo a presença de
diferentes tipos de citocinas, poderiam interferir diretamente com os mastócitos.
Fibrose renal é um dinâmico e complicado processo caracterizado pela inflamação
intersticial inicial, ativação de células tubulares e transformação de células epiteliais.
Fibrose renal apresenta acumulação e deposição excessiva de componentes da
matriz extracelular (Liu, 2006), levando à deposição de colágeno e a uma superregulação das enzimas que degradam matriz, as quais poderiam diminuir a fibrose
túbulo-intersticial (Liu,2006). Assim, a resposta dual dos mastócitos, danosa ou
protetora, pode ser reflexo de sua capacidade em alterar seu fenótipo, em função do
microambiente em que se encontra (Galli et al., 2005). Esta capacidade explica os
seus diferentes papéis. Desta forma a avaliação da contribuição dos mastócitos para
a fibrose renal é extremamente complexa, pois depende do conhecimento do microambiente, que pode ser dependente do estágio da doença fibrótica.
6-Conclusão
Conclusão
O presente trabalho nos permitiu concluir que existe uma correlação positiva e
significativa entre a densidade de mastócitos e de mastócitos degranulados e a
intensidade da fibrose intersticial renal nos pacientes com nefropatia por IgA.
Concluímos também que o aumento do número de mastócitos é uma
característica consistente da fibrose renal, e uma maior densidade de mastócitos
correlaciona-se de maneira positiva com a extensão da fibrose intersticial nos
pacientes diagnosticados com nefropatia IgA primária deste estudo.
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Anexos
Anexo A – Classificação de Oxford para a Nefropatia por IgA – Ano 2009
No.
Biópsia
BR090104
BR090110
BR090217
BR090223
BR090226
BR090234
BR090255
BR090304
BR090313
BR090331
BR090337
BR090457
BR090461
BR090522
BR090545
BR090551
BR090619
BR090633
BR090639
BR090701
BR090716
BR090730
BR090740
BR090816
BR090831
BR090834
BR090850
BR090919
BR090925
BR090930
BR090942
BR090948
BR091049
BR091061
BR091067
BR091076
BR091136
BR091148
BR091206
BR091251
Hipercelularidade Hipercelularidade Glomeruloesclerose
Fibrose intersticial / Atrofia
Mesangial
Endocapilar
Segmentar
Tubular
≤0,5
>0,5
Ausente Presente Ausente Presente Discreta Moderada Acentuada
M0
M1
(0-25%) (26-50%)
(>50%)
(E0)
(E1)
(S0)
(S1)
T0
T1
T2
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
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X
X
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X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Anexo B - Classificação de Oxford para a Nefropatia por IgA – Ano 2010
Hipercelularidade
Mesangial
No.
Biópsia
≤0,5
>0,5
M0
M1
Hipercelularidade
Endocapilar
Ausente Presente Ausente
(E0)
BR100249
X
X
BR100316
X
X
BR100322
X
X
BR100408
X
X
BR100427
X
BR100445
X
Glomeruloesclerose
Segmentar
(E1)
(S0)
Fibrose intersticial /Atrofia
Tubular
Presente Discreta Moderada Acentuada
(S1)
X
(0-25%)
T0
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
BR100474
X
X
X
BR100477
X
X
X
X
BR100647
X
X
X
X
BR100677
X
X
BR100707
BR100719
X
BR100807
X
X
X
BR100839
X
BR100842
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
BR101001
X
X
X
BR101028
X
X
X
X
X
X
X
X
X
BR101133
X
X
X
BR101142
X
X
BR101157
X
BR101167
X
X
BR101234
X
X
X
X
X
X
X
X
X
BR101107
BR101255
X
X
BR100864
BR101055
X
X
X
X
X
X
X
X
X
BR100739
X
X
(26-50%)
(>50%) T2
T1
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X