AVALIAÇÃO DA TÉCNICA DE MICROPLACA
NAS FENOTIPAGENS ABO E Rh(D) DE DOADORES
DE SANGUE NA HEMOCLÍNICA DE BRASÍLIA
Mesiano, C. A. M.; Cruz, C. B. S.; Ruggiero, L. A.
HEMOCLÍNICA – Clínica de Hematologia e Hemoterapia Ltda. Brasília, D.F.
Setor de Imuno-hematologia
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO
Os Serviços de Hemoterapia vêm implementando novas técnicas de fenotipagens
ABO e Rh(D) para doadores de sangue a fim de obter um melhor custo-benefício. A
Hemoclínica, Clínica de Hematologia e Hemoterapia de Brasília, implementou a
técnica de hemaglutinação em microplaca, através de um estudo comparativo com a
técnica em tubo, com o objetivo de reduzir os custos técnicos e operacionais sem
prejudicar a qualidade dos resultados dos exames e viabilizando uma técnica de
fácil execução para atender a crescente demanda de exames.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram analisados 9.965 fenotipagens ABO e Rh(D) de doadores de sangue no
período de abril de 2002 a abril de 2003, comparando-se a técnica de
hemaglutinação em tubo, bastante utilizada pelos serviços de hemoterapia com a
técnica de hemaglutinação em microplaca. Para realização da técnica de
hemaglutinação em microplaca foram adquiridos: uma centrífuga de microplaca
Jouan, modelo B4i com capacidade para duas microplacas; um multipipetador de
volume ajustável (20-200 microlitros) de 12 canais Rainin, modelo L12-200; um
pipetador monocanal de 10 microlitros Lio Serum; microplacas de poliestireno 96
poços de fundo em U e um plano inclinado a 70º confeccionado em acrílico. A
técnica consiste em diluir hemácias em salina 0,9% e soros reagentes diluídos em
LISS (Low ionic Strength Salt Solution) (tabela 1). A melhor diluição para os soros
reagentes foi determinada pelo maior título do reagente onde foi observada a
aglutinabilidade das hemácias com intensidade de reação 4+, para isso é necessário
que os soros sejam previamente testados pelo controle de qualidade. No período de
análise eram utilizados soros reagentes anti-A, anti-B, anti-A,B, Anti-D
monoclonal, Anti-D policlonal e controle Rh(D) da marca ASEM-NPBI, onde se
determinou suas diluições ideais (tabela 1). As microplacas são pipetadas com 200
microlitros de salina e 50 microlitros de soros reagentes (figura 1), então se realiza
a fase de diluição em salina pipetando-se 10 microlitros das hemácias a serem
testadas, a fase de pipetagem das hemácias pipetando-se 25 microlitros em cada
soro reagente (figura 2), a fase de centrifugação a 95,2g (figura 3) e submete-se a
microplaca ao plano inclinado a 70º. Após aguardar cerca de 2’, fase de leitura,
onde o resultado positivo visualiza-se como aglutinação centralizada ou espalhada
e o resultado negativo como hemácias escorridas verticalmente (figura 4).
Técnica
Diluição das
hemácias em
salina
Diluição anti-A, Diluição anti-D,
anti-B e antianti-D
A,B em LISS
policlonal e
controle Rh(D)
em LISS
Tempo de
realização da
rotina de 37
amostras/ dia
(minutos)
Tubo
3,0 - 5,0%
Soros
Concentrados
Soros
Concentrados
150
Microplaca
4,8%
4,2%
6,3%
70
Tabela 1. Comparativo entre as técnicas em tubo e microplaca
Figura 1. Microplaca com reagentes
Figura 2. Microplaca com hemácias
Figura 3. Fase de centrifugação
Figura 4. Fase de leitura
RESULTADOS E CONCLUSÃO
Em 9.965 fenotipagens ABO e Rh(D) analisadas nas duas técnicas
(microplaca e tubo), 100% dos exames apresentaram resultados
concordantes, incluindo os resultados de subgrupos onde a técnica em
microplaca apresentou uma maior sensibilidade, facilitando assim suas
identificações. Na análise do tempo da realização da rotina, a técnica em
microplaca apresentou uma redução de 53,3% em relação à técnica em
tubo, fato decorrente da utilização do multipipetador de 12 canais, da
capacidade da centrífuga Jouan (possibilitando centrifugar 24 tipagens em
apenas 1 minuto) e da facilidade para realização das leituras dos resultados.
Houve também uma grande redução no custo operacional, já que a técnica
em microplaca permite a diluição dos soros reagentes enquanto a técnica
em tubo utiliza soros concentrados (tabela 1). A implementação da técnica
em microplaca na rotina proporcionou maior confiabilidade na execução
dos testes, além de maior sensibilidade na leitura quando comparada à
técnica em tubo, mostrando-se viável na rotina de fenotipagens ABO e
Rh(D) de doadores de sangue devido ao seu baixo custo, facilidade de
execução e resultados reprodutíveis, agregando dados positivos quanto à
mudança de rotina em um serviço.
ABSTRACT
A Hemoclínica visando à redução de custos técnicos e operacionais, sem
prejudicar a qualidade dos resultados dos exames, resolveu implementar a
técnica de hemaglutinação em microplaca para as fenotipagens ABO e
Rh(D), substituindo a técnica de . hemaglutinação em tubo. Para a
introdução da técnica de hemaglutinação em microplaca foram adquiridos:
uma centrífuga de microplaca Jouan, modelo B4i; um multipipetador de 12
canais Rainin, modelo L12-200, microplacas de poliestireno 96 poços de
fundo em U e plano inclinado a 70º. A validação da técnica em microplaca
foi realizada entre abril de 2002 e abril de 2003. Nesse período foram
realizadas 9965 fenotipagens utilizando-se as duas técnicas (tubo e
microplaca) em paralelo e os resultados obtidos mostraram-se
concordantes. A melhor diluição para as fenotipagens foi determinada pelo
maior título do reagente onde foi observada a aglutinabilidade das hemácias
com intensidade de reação 4+. A determinação dos fenótipos ABO e Rh(D)
foi padronizada utilizando-se 25 microlitros de suspensão de hemácias a 4,8
% e 50 microlitros de anti-soros; centrifugação a 95,2g; 1 minuto e leituras
realizadas em plano inclinado. Observou-se que para cada tipagem
sanguínea houve uma economia de reagentes em torno de 20 vezes, maior
segurança para a realização dos exames e uma redução de tempo de 53,3 %.
A implementação da técnica em microplaca na rotina proporcionou maior
confiabilidade na execução dos testes, além de maior sensibilidade na
leitura quando comparada à técnica em tubo, mostrando-se viável na rotina
de fenotipagens ABO e Rh(D) de doadores de sangue devido ao seu baixo
custo, facilidade de execução e resultados reprodutíveis, agregando dados
positivos quanto à mudança de rotina em um serviço.