INUMO-HEMATOLOGIA
DOADOR E RECEPTOR
VITÓRIA 2014
Imuno-Hematologia
Conceito: é o estudo relacionado com imunologia de
grupos sanguíneos presentes nas hemácias, e
imunologia de plaquetas e leucócitos.
É o laboratório que que realiza os testes que
determinam os grupos sanguíneos e os anticorpos
contra grupos sanguíneos, e as provas de
compatibilidade pré-transfusionais.
Imuno-Hematologia
Esta relacionado com:
 Presença de antígenos nos glóbulos vermelhos e
anticorpos no sangue.
 Interação entre estes antígenos e anticorpos.
 Determinação de Grupos sangüíneos.
 Seleção de sangue de doadores.
 Transfusão sangüínea.
 Incompatibilidade sanguínea e materno fetal e
 Reação transfusional.
Imuno-hematologia
Importância na Transfusão:
 Definir o fenótipo, sobretudo ABO e RhD dos
doadores e receptores de sangue.
 Pesquisar a presença de anticorpos no plasma do
receptor contra antígeno presente nas hemácias do
doador.
 Evitar reação transfusional – que pode ser leve a
grave, inclusive com morte do receptor.
Antígeno
 Substância que induz uma resposta imune quando introduzida
num indivíduo imunocompetente para o qual ela é estranha e
é capaz de reagir com o produto desta resposta.
 Os Grupos Sanguíneos são antígenos presentes na parte
externa da membrana das hemácias.
 Podem induzir a formação de anticorpos quando
transfundidos em indivíduos que não apresentam o antígeno.
Antígeno
Grupo sanguíneo:
 São estruturas (proteínas e açucares) que
estão presentes na parte externa da
membrana das hemácias.
 São antígenos definidos sorologicamente por
anticorpos imunes.
 Tem que ser herdado dos pais.
Hemácia
Corte da membrana da Hemácia
Aumento do corte da membrana da Hemácia
Proteína
transmembrana
AeB
Matriz de
Fosfolipídios
Representação esquemática dos
Antígenos A e B
Esquema da Membrana com os antígenos
de Grupo Sanguineo
fluido
Dupla Camada
de Fosfolipídios
fluido
Exterior da
Célula
Membrana
Cadeias Glicídicas
Proteínas de
Transporte
Proteína de
Transporte
(Canais)
Sistema de
Proteínas de
Transporte
Proteína de
Reconhecimento
Colesterol
Proteína
Receptora
Fosfolipídios
Citoplasma
Estrutura e Função dos Grupos
Sanguíneos na Membrana da Hemácia
ANTICORPO
É uma proteína produzida em reposta a um
estímulo “não próprio”.
Os anticorpos contra Grupo Sanguíneo são
específicos.
São moléculas de imunoglobulinas (Ig) produzidas
por linfócitos B e secretadas para o plasma.
Funções:
Ligar-se ao antígeno
Funções Efetoras:
> fixar complemento
> ligar-se a vários tipos celulares
QUANTO A OCORRÊNCIA
NATURAIS: Anticorpos produzidos “naturalmente”, sem
contato prévio com Grupo Sanguíneo.
Surjem em resposta a antígenos presentes em bactérias ou
alimentos com estrutura semelhante a dos grupos sangüíneos.
Em geral da classe IgM.
ADQUIRIDOS: Anticorpos adquiridos por resposta imune a
transfusão e/ou gravidez. Em geral da classe IgG.
IgG
Testes de Aglutinação
 Hemaglutinação: é a Técnica empregada nos testes
de imuno-hematologia.
 Porém os testes moleculares são cada vez mais
usados, para genotipagem de grupos sanguíneos,
sobretudo na investigação de casos complexos e
quando não há reagente comercial no mercado.
Hemaglutinação: reação antígeno x anticorpo
Anticorpo
Antígeno (Hemácia)
Aglutinação
Sensibilização e Aglutinação por IgG
Rotina IH de doador de sangue
Técnicas:
 Microplaca: Mais utilizada para doadores, pode ser
para sistemas automatizados ou pipetarem manual.
 Tubo: mais difundida. Muito utilizada para resolver
problemas nos resultados. Realizada em pipetagem
manual e de rotinas pequenas.
 Colunas de aglutinação: gel centrifugação, para
pipetagem manual ou sistema automatizado.
Hemaglutinação na Investigação imunológica
eritrocitária
•Pesquisa:
•Antígenos eritrocitário
•Anticorpos antieritrocitários
•Autoanticorpos
•Aloanticorpos
•Definir a especificidade do Anticorpo
Investigação imunológica eritrocitária
Placas opalinas
Antissoro + hemácias
Hemácias (reagentes) + soro
Homogeneizar e ler
Tubos
Antissoro + hemácias
Hemácias(reagentes ) + soro
Potencialização da reação:
Incubação 37C, centrifugação, leitura
Meios potencializadores
•Macrotécnicas / Manuais
(Rouger & Salmon, 1981)
Investigação imunológica eritrocitária
•Microplacas
•Antissoro + hemácias
•Hemácias (reagentes) + soro
•Potencialização da reação:
Incubação 37, agitação,
centrifugação, agitação
meios potencializadores
Microtécnica / Automação
Investigação imunológica eritrocitária
Colunas de aglutinação
• Microtubos com meio específico que permite a separação das
diferentes populações de células
– Meios potencializadores
– Anti Ig
GV + amostra
Incubação
Microtécnicas /Automação
centrifugação
(Lapierre, 1990; Reis et al., 1993)
Principais Variações das técnicas
suporte
tubos
Vidro ou descartável
microplaca
Poliestireno 96 cavidades
coluna
Cartão plástico 6 a 8 micro tubos
Centrífuga
tubos
Sorológica ou tubos de hemólise
microplaca
Com rotor de microplaca
coluna
Específica de cartão
Principais Variações das técnicas
Tempo médio de centrifugação
tubos
15 segundos
microplaca
1 a 2 mim.
coluna
9 a 10 mim. De acordo com o fabricante
Concentração da suspensão de hemácias
tubos
2,5 a 5%
microplaca
1 a 3%
coluna
0,8 a 1,2% ou 2,5 a 5%
Principais Variações das técnicas
Volume da suspensão de hemácias
tubos
1 gota (50µl)
microplaca
1 gota (50µl)
coluna
10 µl, 25 µl ou 50 µl
Volume do soro ou plasma
tubos
100 µl
microplaca
50 µl
coluna
25 µl a 50 µl de acordo com teste
Principais Variações das técnicas
Diluição Reagentes
tubos
Reagente sem diluir
microplaca
coluna de
aglutinação
Pré dispensado, puro ou diluído de acordo com
a validação
Em geral pré dispensado ou diluído de acordo
com a validação
tubos
Potencializador de reação
Salina, enzimas, LISS, PEG, albumina bovina 22%
microplaca
Salina, enzimas, LISS ou albumina bovina
coluna de
aglutinação
Enzimas ou LISS
Rotina de doador de sangue
No Brasil a legislação (Portaria 2.712, de 12 de
novembro DE 2013 e Resolução RDC 57 de 16 de
fevereiro de 2010) Regulamento Sanitário para
Serviços que desenvolvem atividades relacionadas ao
ciclo produtivo do sangue, determinam para exames
Imuno-Hematológicos de amostra de doadores de
sangue:
 Fenotipagem ABO: Direta e Reversa.
 Fenotipagem RhD: com pesquisa de D fraco.
 Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI).
Rotina de doador de sangue
Fenotipagem ABO:
 O grupo ABO deve ser determinado testando-se os
glóbulos vermelhos com reagentes anti-A,
anti-B e anti-A,B. Caso sejam usados anti-soros
monoclonais, a utilização do soro anti-A,B não é
obrigatória.
 A tipagem reversa deve ser sempre realizada,
testando-se o soro ou plasma com suspensão de
glóbulos vermelhos conhecidos A1 e B e,
opcionalmente, A2 e O.
Rotina IH de doador de sangue
Fenotipagem ABO:
 Uma unidade de sangue não deve ser liberada para
utilização até que qualquer discrepância entre a
tipagem direta e reversa tenha sido resolvida.
Rotina IH de doador de sangue
Fenotipagem RhD: com pesquisa de D fraco.
 O antígeno Rh(D) deve ser determinado colocandose os eritrócitos do paciente em contato com soro
anti-Rh (Anti-D); deve ser sempre efetuado um
controle da tipagem Rh, utilizando-se para isto sorocontrole de Rh do mesmo fabricante do soro anti-D.
 Se a reação for negativa para a presença do antígeno
D, deve ser efetuada técnica para a exclusão de D
fraco.
Rotina IH de doador de sangue
Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI):
 Deve ser realizada nos doadores a pesquisa de
anticorpos séricos irregulares, empregando-se
métodos que evidenciem a presença de anticorpos
clinicamente significativos.
Imuno-Hematologia
Rotina do doador de sangue
Recebimento da amostra;
Preparo da amostra;
Colocar os reagentes nas placas;
Colocar as amostras nas placas;
Centrifugar as placas;
Leitura dos resultados;
Liberação dos resultados;
Imuno-Hematologia
Rotina transfusional – prova cruzada
Recebimento da amostra e o pedido;
Preparo da amostra;
Classificação ABO, Rh e PAI do paciente;
Selecionar e reclassificar a bolsa de CH;
Fazer a prova cruzada;
Liberar os resultados e a bolsa para transfusão.
Testes pré transfusionais
Objetivos:
Compatibilizar a amostra de sangue do
receptor com o sangue do doador a ser
transfundido.
Detectar anticorpos clinicamente significantes.
Otimizar o aproveitamento do sangue
transfundido.
Evitar reação transfusional.
Testes pré transfusionais
Como é realizado?
Através de testes laboratoriais realizados nas
Agencias Transfusionais.
Testes de Imuno-Hematologia.
Método: Testes de aglutinação.
Técnica: Em tubo, microplaca ou gel
centrifugação.
ABO Direta
RhD
ABO Reversa
Reagentes utilizados na Classificação Sanguínea ABO/RhD
Tubo 1+
Tubo 3+
Tubo 4+
Aglutinação em micro tubos de
GEL Sefadex
Micro tubos em gel de sefadex
TESTES PRÉ TRANSFUSIONAIS:
Classificação e triagem do doador
 Classificação ABO e Rh do receptor.
 Pesquisa de anticorpo irregular no receptor (PAI) –
no caso de positivo deve ser seguido de
identificação do anticorpo.
 Checar os registros anteriores (manual ou
computador).
Seleção da bolsa
 Classificação ABO,RhD e PAI do doador (prévio)
 Reclassificação ABO/RhD da bolsa
 Prova cruzada.
HEMOSC
6. Procedimentos realizados
6.1 POP atualizado e disponível
Nível
II
Deve ter um sistema de atualização periódica.
Deve estar disponível (cópia física ou eletrônica) a todos os
colaboradores que utilizam a técnica, que devem ser treinados
para cada POP.
Deve ter nome de quem escreveu e de quem aprovou o POP.
6. Procedimentos realizados
Nível
6.1 POP atualizado e disponível
II
6.1.1 Procedimentos executados conforme POP III
Procedimento Operacional Padrão – POP
São “manuais” escritos para cada procedimento utilizado e a
técnica realizada no laboratório.
Deve conter os detalhes de cada técnica e a maneira de fazer,
incluindo os princípios e objetivos, o material, equipamentos e
reagentes necessários, a identificação e preparo da amostra, a
dispensação dos reagentes, a interpretação dos resultados, a
liberação e as formas de registros.
No caso de problemas encontrados deve também dar
orientações de como resolver ou como encaminhar.
6.2 Realiza/registra tipagem ABO direta a cada doação
Método:_____________________________________
6.3 Realiza/registra tipagem ABO reversa a cada doação
Método:_____________________________________
III
III
Fenotipagem ABO:
Direta ou dos Glóbulos: testa as hemácias diretamente
contra reagentes anti-A, anti-B e/ou anti-AB.
Reversa ou do plasma: Testa o plasma contra hemácias
reagentesA1 e B.
No sistema ABO existe o antígeno ABO na membrana da
Hemácia e anticorpos “naturais no plasma”.
Classificação Direta
Classificação Reversa
Fenotipagem ABO em placa
Fenotipagem ABO em placa
Anti
A
B
AB
Direta
Fenotipagem ABO em placa
A1
B
Reversa
Anti
A
B
AB
Direta
6.5 Realiza/registra procedimento de resolução de discrepância
ABO / Rh
III
As discrepâncias tem que ser resolvidas antes
da liberação das bolsas.
No sistema ABO é quando a classificação
Direta e a Reversa não combinam.
O
A
Discrepância de classificação
6.4 Realiza/registra a determinação do tipo RhD a
cada doação.
Método:________________________________
III
6.4.1 Realiza/registra pesquisa de D fraco e/ou categoria, quando
necessário
III
6.4.2 Utilizam na rotina os soros para anti-D e controle de Rh do
mesmo fabricante
Método:_________________________________
III
Anti soro antiRh(D)
Controle Rh
Rh(D) – Normal
Rh(D) – Fraco
Rh(D) – parcial
Rh(D) – parcial fraco
Normal
Normal
Variante
Variante
Normal
Reduzido
Normal
Reduzido
Legenda:
Epítopo
Antígeno
Variantes do Antígeno D
 Pesquisa de D fraco é realizado quando o teste de RhD der
resultado negativo na fase de TA.
 Deve ser realizado através de incubação a 37°C.
 O controle Rh deve ser realizado junto, e deve ser sempre
negativo.
 Controle Positivo é discrepância e neste caso o fenótipo D é
indeterminado.
 D parcial ou categoria é uma variante de D que apresenta uma
alteração na expressão do antígeno D.
 O resultado para definir pode ser por anti-soros anti-D
monoclonais.
 O uso de dois reagente anti-D, de dois clones diferentes é
importante para se fazer a suspeita de D parcial.
 Resultado de certeza é por biologia molecular.
6.6 Realiza/registra pesquisa anticorpos irregulares a cada doação
Método:____________________________
III
6.6.1 Identificação e registro de anticorpos irregulares (caso se
aplique)
Método:____________________________
INF
Anticorpos irregulares são todos os anticorpos
outros que não os anti-A e anti-B, naturais, encontrados
no plasma.
Podem ter significado clinico
Podem causar reação transfusional imediata ou tardia
Diminuem a sobrevida da hemácia transfundida
Devem ser realizados no doador e no receptor de sangue,
antes da transfusão.
O teste deve incluir uma fase de AGH.
Princípio do teste
PAI – realizado em três fases:
1 - Temperatura Ambiente (TA)
2 - Fase de incubação a 37°C
3 - Fase de AGH
Hemácias Reagentes
para PAI
Soros Anti Globulina Humana
AGH
Soro de Coombs
Regentes de coombs e
controle de coombs
Controle Interno da PAI
Controle PAI positivo
6.7 Protocolos dos testes imuno-hematológicos com nome do
fabricante e reagente, número do lote e prazo de validade III
6.8 Insumos utilizados registrados e/ou autorizados pelo órgão de
saúde competente, dentro do prazo de validade e armazenados de
acordo com a especificação do fabricante III
Bula, instrução de uso e validade
6.10 Utiliza anti-soros monoclonais
6.11 Utiliza anti-soros policlonais
INF
INF
Monoclonais: a partir de um único clone de linfócito B
- Produzidos por processo industrial, com células humanas
e de animais fusionadas.
- Mais potentes, mais específicos, altos títulos.
Policlonais: a partir de vários clones de linfócitos B
- Produzidos a partir de sensibilização de humanos.
- Precisa de “voluntários” para produzir o anticorpo.
- Deve ser coletado, processado e purificado industrialmente
- Difícil de encontrar comercialmente.
Reagentes: Monoclonal X Policlonal
Ag
Ag
Antígeno
cels B
Anticorpos
Monoclonal
Policlonal
6.13 Controle de qualidade lote a lote dos reagentes utilizados, antes
do uso, a fim de comprovar se os mesmos estão dentro do padrão
estabelecido pelo fabricante.
III
6.14 Resultados dos testes imuno-hematológicos arquivados de
forma a manter a sua integridade pelo período proposto na
legislação vigente
III
Pode ser arquivo eletrônico.
Pode ser arquivo com
cópia física.
Período mínimo
de 20 anos.
6.15 Realiza/registra CQI – Controle de Qualidade Interno III
6.15.1 Adota/registra medidas corretivas quando identificadas não
conformidades.
III
Registro dos
controles de
qualidade
interno diário
dos reagentes
6.16 Participa / registra de AEQ – Avaliação Externa da Qualidade
Programa: _______________________________
II
6.16.1 Adota/registra medidas corretivas quando identificadas
não conformidades.
III
6.17 Resultados dos testes imuno-hematológicos interfaciados ao
sistema informatizado do serviço
INF
6.17.1 Na ausência do interfaciamento, ou outra forma eletrônica
devidamente validada, ao liberar os resultados estes são conferidos
por mais de uma pessoa.
III
6.17 Resultados dos testes imuno-hematológicos interfaciados ao
sistema informatizado do serviço
INF
6.17.1 Na ausência do interfaciamento, ou outra forma eletrônica
devidamente validada, ao liberar os resultados estes são conferidos
por mais de uma pessoa.
III
6.18 Calibração de pipetas e termômetros dentro do
prazo de validade
II
Pipetas automáticas Monocanal
OBRIGADO
[email protected]
OBRIGADO!
[email protected]