CLART STIs A
DETEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO GENÉTICA DE PATOGÉNIOS CAUSADORES DE INFEÇÕES
SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS, STIs
PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO
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CLART STIs A
Amplificação
48 determinações Ref: CS-1112-48
16 determinações Ref: CS-1112-16
CLART STIs A
Deteção
48 determinações Ref: CS-1212-48
16 determinações Ref: CS-1212-16
CLART e CLART-Strip são marcas registadas da GENOMICA
Para mais informações, consultar o web site www.genomica.com
Chlamydia trachomatis é para utilização exclusiva em investigação
CE para os outros microrganismos
GENOMICA, S.A.U.
Alcarria, 7, 28823 Coslada, Madrid, Spain
Telf: +34 91 674 89 90, Fax: +34 91 674 89 91
Versão 1
Fevereiro 2013
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ÍNDICE:
1. QUADRO DE SÍMBOLOS
2. DESCRIÇÃO DO PROTOCOLO
3. COMPONENTES E CONSERVAÇÃO DA EMBALAGEM
3.1. Reagentes de amplificação
3.2. Reagentes de visualização
3.3. Outros componentes
4. MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
4.1. Reagentes e materiais
4.2. Equipamento
5. RECOMENDAÇÕES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULAÇÃO
5.1. Recomendações gerais
5.2. Precauções para a extração e a adição do material extraído no tubo de amplificação
5.3. Precauções para a visualização
6. AMOSTRAS
7. PROTOCOLO DE TRABALHO
7.1. Extração automática do material genético.
7.2. Reação de amplificação
7.3. Visualização do produto amplificado
8. LEITURA DOS RESULTADOS
9. INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
10. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS E DE FUNCIONAMENTO
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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1.-QUADRO DE SÍMBOLOS
Consulte por favor as instruções de utilização
Prazo de validade
Dispositivo para Diagnóstico In Vitro
Lote
25ºC
Conservar à temperatura ambiente
20ºC
8ºC
Conservar entre 4 ºC e 8 ºC
4ºC
-18ºC
Conservar entre –30 ºC e –18 ºC
- 30ºC
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2.-DESCRIÇÃO DO PROTOCOLO
O CLART STIs A deteta a presença de microrganismos causadores de infeções sexualmente
transmissíveis em amostras clínicas (na urina e em zaragatoas).
Os microrganismos detetados são os seguintes:
•
•
•
•
Chlamydia trachomatis: Será distinguida entre dois grupos de serotipos:
o Produtores de linfogranuloma venéreo (LGV), incluindo os serotipos L1, L2 e L3.
o Não produtores de linfogranuloma venéreo (NLGV), incluindo os serotipos D-K.
Será incluída uma deteção genérica de Chlamydia trachomatis para os casos
em que não se consiga efectuar a serotipagem.
Neissera gonorrhoeae
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
A deteção é efetuada através da amplificação de un fragmento específico para cada
microrganismo cujo tamanho oscile entre 100 e 350 pares de bases.
Para evitar os falsos negativos, o tubo de PCR contém um controlo interno de amplificação que
assegura o bom funcionamento do tubo, e um controlo de extração do ADN genómico da amostra,
que assegura que o material genético foi isolado durante o processo de extração.
A deteção do produto amplificado por PCR é efetuada através da utilização de uma plataforma
tecnológica baseada em microarrays de baixa densidade: CLART® (Clinical Array Technology). A
plataforma baseia-se num principio muito simples e eficiente que consiste em incluir um
microarray no fundo de um poço da placa de microtitulação (CLART® Strip-CS) (Figura 1), o que
simplifica todo o processo de hibridização e visualização em relação aos sistemas de microarrays
clássicos.
Figura 1. Plataforma CLART® Strip-CS em forma de tira de 8 poços.
O sistema de deteção CLART STIs A baseia-se na precipitação de um produto insolúvel
naquelas zonas do microarray onde se produz a hibridização dos produtos amplificados com as
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sondas específicas. Durante a PCR, os produtos amplificados são marcados com biotina. Após a
amplificação, estes produtos hibridizam com sondas específicas que estão imobilizadas em locais
conhecidos e concretos do microarray, após o qual são incubados com um conjugado de
estreptavidina-peroxidase. O conjugado liga-se através da estreptavidina com a biotina presente
nos produtos amplificados (que também se encontram ligados às suas sondas específicas) e
atividade peroxidase provoca o aparecimento de um produto insolúvel que na presença do
substrato o-dianisidina, precipita nos locais do microarray onde ocorre a hibridização (Figura 2).
Produto marcado
Sondas sobre a array
biotina
Hibridização
Conjugado
Incubação
com o conjugado
Reação de revelação
Precipitaçã
do substrato
Figura 2: Esquema do método de visualização. As sondas, imobilizadas sobre a superfície, capturam os
seus produtos amplificados complementares marcados com biotina. Através da biotina, liga-se ao
conjugado, neste caso estreptavidina-HRP (peroxidase de rábano, HorseRadish Peroxidase). O
substrato o-dianisidina através da ação da HRP, produz um precipitado sobre o local de hibridização.
3.-COMPONENTES E CONSERVAÇÃO DA EMBALAGEM
O dispositivo CLART STIs A contém reagentes suficientes para a análise de 16 ou 48
amostras clínicas. Os reagentes incluídos na embalagem estão agrupados em várias caixas,
dependendo da temperatura na qual se devem conservar. Todos os reagentes são estáveis nas
condições indicadas de conservação até ao prazo de validade da embalagem.
6
3.1. Reagentes de amplificação
São espedidos e conservados a -20 ºC.
•
Tubos de Amplificação (tubo branco) prontos a usar. Contêm 45 µl de mistura de
reação. Descongelar apenas o número preciso de tubos de amplificação que se
irão processar nesse momento e conservar os restantes a -20ºC.
Amplificação de Chlamydida trachomatis LGV, Chlamydida trachomatis NLGV,
Chlamydida trachomatis genérica, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis e
Mycoplasma genitalium. Também inclui a amplificação de um controlo de
amplificação e de extração.
Na embalagem do dispositivo inclui-se um indicador adesivo e irreversível de
temperatura; o aparecimento de uma cor vermelha na janela de visualização indica que
em algum momento os produtos ultrapassaram a temperatura de conservação de –20oC
e não devem utilizar-se.
3.2. Reagentes de visualização
O dispositivo de visualização é expedido a 4º C.
ADVERTÊNCIA!: Após receber a embalagem, as tiras CLART® Strips (CS) devem ser
conservadas à temperatura ambiente.
•
•
•
•
•
•
•
Tiras CS (incluindo as sondas específicas). São fornecidas num envelope térmico
selado. Conservar sempre fechado (máx. 25ºC), à temperatura ambiente e
protegido da luz.
SH (Solução de Hibridização). Conservar a 4ºC
DC (Diluente de Conjugado). Conservar a 4 ºC.
CJ (Conjugado). Conservar a 4 ºC.
RE (Solução de Revelação). Conservar a 4 ºC e protegido da luz.
TL (Tampão de Lavagem). Conservar a 4 ºC.
Suporte e tampa para tiras de 8 poços.
3.3 Outros componentes
Para a captura e posterior processamento da imagem são necessários os seguintes
componentes:
•
Leitor CAR (Clinical Array Reader): permite a leitura e interpretação automática até 12
tiras de arrays CS, isto é, até um máximo de 96 amostras. É fabricado e distribuído
pela GENOMICA para ser utilizado exclusivamente com os dispositivos de diagnóstico.
7
•
Adaptador metálico que se coloca sobre o suporte (tubos/placas) do CAR, antes da
leitura.
•
SAICLART®:: software desenvolvido e validado pela GENOMICA para o processamento
de imagens.
•
Software específico do dispositivo CLART
GENOMICA.

STIs A desenhado
esenhado e validado pela
CAR
(Clinical Array Reader)
4. MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
Encontra-se
se abaixo a lista de materiais necessários
necessários mas não fornecidos.
fornecidos
4.1. Reagentes
gentes e materiais
- Água
gua destilada.
- Luvas descartáveis.
descartáveis
- Pontas
ontas de pipeta com filtro
fi
ou pipetas de deslocação
ão positivas.
positivas
- Recipiente com gelo picado.
- Tubos tipo eppendorf de 1,5 ml autoclavados.
- Grelhas
elhas para tubos de 1,5 ml.
- Suporte
porte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml.
- Solução
olução salina (0.9% NaCl).
4.2. Equipamento
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- Microcentrífuga.
- Termociclador.
- Câmara de fluxo laminar para o laboratorio de extração.
- Três micropipetas ajustáveis entre 1-20 µl, 20-200 µl e 200-1000 µl para o
laboratório de pre-PCR.
- Uma micropipeta ajustável entre 1-20 µl, para adicionar o material
genético aos tubos de amplificação.
- Três micropipetas ajustáveis entre 1-20 µl , 20-200 µl e 200-1000 µl para o
laboratório de pós-PCR.
- Bloco de aquecimento com agitação ajustável a 25°C, 30°C e 59º C.
Compatível com placas de 96 poços.
- Vórtex.
- Sistema de vácuo.
5.- RECOMENDAÇÕES E PROCEDIMENTOS DE MANIPULAÇÃO
Muito importante de modo a evitar contaminações! Ler cuidadosamente antes de iniciar
a técnica.
5.1. Recomendações gerais
1. A técnica deve efetuar-se em duas áreas separadas fisicamente, para evitar a
contaminação das amostras com o produto anteriormente amplificado. Cada uma das
áreas deve ter o seu próprio material de trabalho identificado (pipetas, pontas, tubos,
grelhas, luvas, etc.) e nunca devem ser utilizadas fora destas áreas.
1. Área pre-PCR: Nesta área é efetuada a preparação das amostras, a extração
do ADN e a adição do material extraído aos tubos de amplificação. A
manipulação das amostras deve efetuar-se numa câmara de fluxo laminar.
2. Área pós-PCR: Nesta área é efetuada a amplificação e a visualização do
produto amplificado. O material desta área nunca deve entrar em contacto com
a área de extração. Evitar ir para a área de pre-PCR após ter estado a trabalhar
na área de visualização.
2. Utilizar sempre luvas. É aconselhado substituir as luvas com uma determinada
frequência e obrigatoriamente de cada vez que começar a trabalhar nas áreas
anteriormente descritas. Deve-se sempre utilizar novas luvas quando se adiciona o ADN
aos tubos de amplificação.
3. Limpar as zonas de trabalho (bancadas de laboratório, câmara de fluxo laminar,
grelhas, pipetas e termociclador) em profundidade com lixívia diluída a 10% a seguir a
cada processamento de amostras, e obrigatoriamente desinfetar as áreas de trabalho em
caso de contaminação. É aconselhado limpar o termociclador e o termomixer, antes e
depois da sua utilização, nas mesmas condições.
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4. Utilizar sempre pontas com filtro e pipetas de deslocação positiva para evitar
contaminações devidas à micropipeta. Deve ser utilizado um conjunto de pipetas em cada
área.
5. Utilizar material de laboratório autoclavável e descartável.
6. Nunca misturar reagentes de dois tubos diferentes, mesmo que pertençam ao mesmo
lote.
7. Fechar os tubos de reagente imediatamente após utilização de modo a evitar a
contaminação.
8. Eliminar a ponta da micropipeta após pipetagem.
9. A GENOMICA não pode ser considerada responsável pelos resultados obtidos com este
dispositivo se forem utilizadas outras amostras que não as indicadas.
5.2. Precauções para a extração e adição do material extraído aos tubos de amplificação.
•
•
•
•
Utilizar sempre luvas.
Limpar as superfícies de trabalho das câmaras de fluxo laminar com lixívia diluída a
10%.
Ligar a câmara de fluxo laminar e a luz UV pelo menos 20 minutos antes de iniciar
a extração. Apagar a luz UV quando se está a trabalhar dentro da câmara.
A preparação das amostras antes da sua extração, deve efectuar-se dentro da
câmara de fluxo laminar.
5.3 Precauções para a visualização
1. Evitar que a ponta da pipeta ou do sistema de vácuo toque no fundo do poço, uma vez
que tal poderá danificar o microarray que se encontra no fundo/poço.
2. Aconselha-se a adicionar todas as soluções às paredes do poço CS, nunca diretamente
ao fundo.
3. É conveniente não adicionar a solução SH até à adição de produtos desneutralizados de
PCR.
4. O array não deve permanecer seco.
5. Após a incubação com a solução CJ, é muito importante lavar bem o microarray para
evitar que caíam resíduos deste, os quais podem reagir com a solução RE, produzindo um
precipitado inespecífico que pode levar a falsa interpretação do resultado.
6. Evitar as bolhas da superfície do microarray ao adicionar qualquer solução.
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7. Ao visualizar a imagem no leitor, confirmar que aparecem os marcadores de posição e
que não há bolhas de ar ou manchas que interfiram na leitura. Caso contrário, limpar o
fundo do poço com um papel de celulose impregnado de álcool.
6. AMOSTRAS:
O dispositivo CLARTSTIs A foi desenhado e validado para ser utilizado com amostras de
urina e zaragatoas (vaginal, cervical, uretral, anal e faríngea). A GENOMICA não poderá ser
considerada responsável por quaisquer resultados com outro tipo de amostras.
Conservar as amostras a 4º C sempre que se queiram processar num tempo inferior a 48h.
Caso contrário, devem permanecer congeladas a -20ºC.
7. PROTOCOLO DE TRABALHO
7.1. Extração automática em NucliSENSTM EasyMag DNA da Biomerieux
•
Para as amostras de zaragatoa, se o meio de conservação for líquido, colher 1 ml para
a extracção do ADN. Se for conservado em meio seco, adicionar 1,5 ml de solução
salina (0,9% de cloreto de sódio) e agitar vigorosamente num vortex durante 1
minuto. Colher 1 ml para a extracção do ADN.
•
Para amostras de urina, agitar o recipiente e colher 1 ml da amostra para a extracção
do ADN.
•
Em ambos os casos: transferir 1 ml da amostra para o extractor.
•
Para cada série de amostras a analisar, incluir um controlo negativo de extração (0,9%
de solução salina) para verificar que as amostras não foram contaminadas durante a
extracção, amplificação e visualização, o que poderia levar a um resultado falso
positivo.
•
Efetuar no equipamento EasyMag DNA uma lise interna e extração, em conformidade
com as instruções do fabricante descritas no manual do equipamento de extração
automática. O volume de eluição deve ser de 25 µl.
Se for utilizado outro sistema de extração, o volume de eluição deve ser otimizado no
intervalo de 20-30 µl.
7.2. Reação de amplificação
Recomendações específicas para a amplificação:
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• Trabalhar na área pre-PCR, utilizando sempre a câmara de fluxo laminar e
seguindo as recomendações descritas no ponto 5.1.
• Adicionar o ADN, utilizando sempre a câmara de fluxo laminar e seguindo as
recomendações do ponto 5.1. Durante o processo manter os tubos separados e em
gelo.
1. Descongelar um tubo de amplificação (branco) para cada amostra a analisar. Mantê-los
no gelo e não utilizar temperaturas superiores a 37ºC para a descongelação.
2. Centrifugar os tubos de amplificação durante uns segundos para que todo o líquido
chegue ao fundo do tubos (se não tiver adaptadores de microcentrífuga, podem utilizar-se
tubos maiores depois de lhes ter retirado a tampa).
3. Adicionar 5 µl do ADN extraído das amostras ao tubo de amplificação e misturar várias
vezes com a micropipeta. Deixar os tubos no gelo.
4. Programar no termociclador os seguintes ciclos de temperaturas:
1 ciclo
45 ciclos:
1 ciclo
95ºC 15 min
95ºC 30 seg
63ºC 60 seg
72ºC 60 seg
72ºC 10 min
5. Iniciar o programa e colocar os tubos de amplificação no termociclador quando no bloco
tiver excedido os 90º C. Deste modo, minimizam-se as possíveis amplificações
inespecíficas devidas a incubação abaixo da temperatura de hibridização.
7.3. Visualização do produto amplificado em CLART® Strip (CS)
Recomendações específicas antes de iniciar a visualização:
O PROTOCOLO DESCRITO DEVE SER SEMPRE UTILIZADO NA ÁREA PÓS-PCR. NUNCA LEVAR
O PRODUTO AMPLIFICADO PARA A ÁREA PRE-PCR.
1. Ligar o CAR (Clinical Arrays Reader) antes de iniciar o processo. A autocalibração do
equipamento leva alguns minutos e é também necessário introduzir o número das
amostras de cada poço no programa antes da leitura.
2. Assegurar-se de que antes de iniciar a hibridização o termomixer das placas atingiu os
56ºC durante, pelo menos, 1 hora.
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3. Aquecer a SH (solução de hibridização) à temperatura ambiente.
4. Preparar a solução de lavagem antes de cada análise, não reutilizar soluções preparadas
anteriormente ou resíduos.
5. Utilizar uma ponta com filtro diferente para cada poço e substituí-la de cada vez que
adicionar um reagente.
6. No caso de utilizar bombas de vácuo equipadas com pentes de 8 pontas para aspirar as
soluções, eliminar os pentes após cada utilização ou descontaminá-los com uma solução
de lixívia diluída a 10% após cada análise. Garantir que a bomba aspira adequadamente e
que não deixa resíduos no fundo do poço.
7. Aspirar completamente as diferentes soluções dentro dos poços sem tocar no array.
VISUALIZAÇÃO:
1. Desnaturação: Colocar os tubos amplificados no termociclador quando este tiver
alcançado 95º C e incubar os tubos durante 10 minutos. Não ultrapassar os 10 min. para
evitar que os tubos se abram e que possa ocorrer a contaminação.
Retirar os tubos da incubação a 95º C e colocá-los imediatamente num recipiente com
gelo.
2. Preparação da Solução TL diluída:
Para cada tira CS (8 poços no total), preparar 10 ml de solução de lavagem diluída,
adicionando 1 ml de Solução TL a 9 ml de água destilada, agitar suavemente.
3. Pré-lavagem das CS: antes de iniciar a análise, é necessário lavar as CS adicionando 200 µl
de Solução TL diluída a cada poço. Misturar 10 a 15 vezes com a pipeta multicanal, tendo
em conta que não se deve tocar na superfície do array. É recomendado efetuar esta
lavagem enquanto as amostras amplificadas estão a ser desnaturadas e mantêm a
solução de lavagem nos poços até as amostras serem adicionadas aos mesmos. Eliminar
a Solução TL diluída com pipeta ou preferencialmente com bomba de vazio.
O array deve ficar isento de resíduos de solução, mas nunca deve ficar seco. Adicionar a
solução seguinte imediatamente.
4. Hibridização: Antes de utilizar a Solução SH, aquecê-la a 56ºC até desaparecerem os
cristais. Após os produtos PCR terem sido desnaturados, adicionar 100 µl de solução de SH
(evitar que se forme espuma) a cada poço das CS. Adicionar a cada poço 5 µl de produto
de PCR desnaturado to tubo de amplificação que se tenha utilizado por amostra.
Misturar várias vezes para que se misture com a solução de hibridização SH, com cuidado
de não tocar no fundo do poço. Recomenda-se introduzir cada tira de forma independente
e separada do resto para evitar as contaminações. Incubar a tira coberta com a tampa de
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plástico transparente no termomixer de placa tapado durante 1 hora a 56º C, agitando a
550 rpm.
Após esta incubação, retirar a placa e eliminar a Solução SH das CS com a pipeta ou bomba
de vácuo: O array deve ficar isento de soluções. Adicionar a solução seguinte
imediatamente. Deixa-se o termomixer da placa programado a 30ºC para posterior
utilização na etapa 6. Pode retirar-se a tampa para que a temperatura baixe mais
rapidamente.
5. Dupla lavagem: adicionar 200 µl de Solução TL diluída a cada poço do CS, misturar 10 a 15
vezes com a pipeta multicanal. Eliminar a Solução TL diluída com a pipeta ou
preferencialmente com a bomba de vácuo multicanal sem deixar resíduos. Repetir a
operação. Esta etapa deve efetuar-se com pontas diferentes para cada poço em ambas
as lavagens. Se ao chegar a esta etapa, o termomixer não tiver atingido os 30º C, deixamse os poços com esta solução até que o termomixer atinja a temperatura.
6. Bloqueio e conjugado: é recomendado centrifugar a solução CJ durante 10 segundos antes
de utilizá-la. Em seguida, preparar a solução CJ diluída como segue: para cada tira CS,
adiciona-se 1 ml de solução DC e 7.5 µl de Solução CJ.
Eliminar a Solução TL diluída sem deixar resíduos de solução e adicionar a cada poço da CS
100 µl de Solução diluída. Incubar durante 15 minutos exatos no termomixer a 30oC,
agitando a 550 rpm. Após esta incubação, retirar a placa e eliminar a solução rapidamente
com pipeta ou bomba de vácuo multicanal. (Deixar programado o termomixer a 25o C para
utilização posterior na etapa 8. Pode retirar-se a tampa para que baixe mais rapidamente
a temperatura).
7. Tripla Lavagem: adicionar imediatamente 200 µl de Solução TL diluída a cada poço da CS,
misturar 10 a 15 vezes com a pipeta multicanal e eliminar completamente a solução com a
pipeta de vácuo. Repetir a operação mais duas vezes.
É muito importante evitar resíduos da Solução CJ, uma vez que podem reagir com a
Solução RE originando um sinal inespecífico.
8. Revelação com Solução RE: Remover a Solução TL diluída completamente e adicionar 100
µl de solução RE a cada poço da CS e incubar 10 minutos a 25oC no termomixer sem
agitação.
Advertência! É muito importante utilizar o termomixer sem agitação
9. Eliminar a Solução RE completamente com a pipeta de vácuo. O array deve permanecer
seco.
10. CAR (Clinical Array Reader): Colocar o adaptador no CAR e a placa em cima. Depois da
bandeja estar fechada, a leitura é automaticamente efetuada.
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8. LEITURA DOS RESULTADOS
O procedimento dos dados obtidos a partir de cada uma das análises, efetua-se de forma
automática. O equipamento de leitura e análise irá fornecer um relatório com indicação
dos resultados.
O monitor apresenta um quadro com duas colunas, na coluna da esquerda apresentam-se
as espécies que se encontram caracterizadas no array. Na coluna da direita, o resultado
analítico: positivo, negativo, não conclusivo, sem ADN ou inibido.
9. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Um dos inconvenientes da deteção por amplificação genómica são os falsos negativos
devidos, a uma qualidade inadequada do ADN extraído da amostra (por colheita
insuficiente da amostra, por degradação do ADN devido a uma conservação incorreta, ou
por perda do ADN da amostra durante a sua extração), ou pela presença de inibidores do
ADN polimerase nas amostras em que se pretende analisar a presença do microrganismo
(hemoglobina, sais, etc).
Com o dispositivo CLART STIs A eliminaram-se estes falsos negativos adicionando ao tubo
de amplificação um controlo interno, que indica a eficiência da reacção de amplificação.
Também está incluído no tubo um controlo de extração para detetar os falsos negativos
devido a falhas na extração.
Em cada conjunto de análises, um controlo de extração negativo deve ser incluído para
verificar que as amostras não foram contaminadas durante a extração, amplificação e
visualização, o que poderia provocar um falso positivo.
O tubo de amplificação contém os seguintes oligonucleótidos:
•
Um par de oligonucleótidos que amplificam um fragmento do gene CFTR humano
como controlo de extração do ADN do paciente.
•
Um par de oligonucleótidos que amplificam um plasmídeo modificado incluído no
tubo de amplificação e que se utiliza como controlo de amplificação da reação de
PCR.
•
Oligonucleótidos específicos para os alvos dos patogéneos a detetar.
O tubo de reação foi concebido de modo a favorecer a amplificação dos microrganismos
em relação aos outros dois controlos. Entre estes dois controlos, a amplificação do ADN
genómico será efetuada preferencialmente por comparação com o controlo de reação de
amplificação.
Este design deve-se a:
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O controlo de extração é necessário para a confirmação de um verdadeiro resultado
negativo, visto que dá a informação da presença do ADN do paciente na amostra, mesmo
que não tenha havido amplificação de nenhum patogénico.
O controlo interno da amplificação só será essencial quando não for encontrada nenhuma
amplificação no tubo, porque irá ajudar a distinguir entre um PCR inibido e uma amostra
onde não está presente o ADN.
Há duas possibilidades que dão lugar a um resultado INVÁLIDO:
o
o
Presença de inibidores na amostra, em cujo caso se deverá repetir todo o processo
desde a extração.
Falha no tubo de amplificação, em cujo caso se deverá repetir todo o processo
desde a amplificação.
Há duas possibilidades que podem levar a um resultado NÃO CONCLUSIVO, em cujo caso
se deverá repetir todo o processo desde a visualização:
•
Nos casos em que as réplicas de um sonda no array sejam muito distintas entre si.
•
Quando a intensidade do sinal de absorvência não normalizada se encontre no
limite de deteção da técnica, cujo intervalo foi estabelecido pelo programa para
cada tipo de microrganismo.
10. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS E DE FUNCIONAMENTO
10.1 Controlo de interferências conhecidas:
Um dos inconvenientes da deteção por amplificação genómica são os falsos negativos
devidos a, uma qualidade inadequada do ADN extraído (por quantidade insuficiente da
amostra, degradação do ADN, perda do ADN, conservação incorreta), ou à presença de
inibidores do ADN polimerase nas amostras a processar (álcool, sais, etc.). Para evitar
estas interferências, devem seguir-se as indicações dos pontos 5, 6 e 7 deste folheto
informativo.
10.2 Especificações técnicas:
Parâmetros Analíticos:
•
Sensibilidade analítica. A sensibilidade analítica determinou-se através da
amplificação de diluições em série do ADN de plasmídeos recombinantes para
cada um dos microrganismos detetados no dispositivo. Cada um destes
continha o produto amplificado (incluindo a parte complementar às sondas
específicas de deteção) do ADN genómico de estirpes tipo de coleção. A
visualização efetuou-se em CS e deu os seguintes resultados (Quadro 1):
Microrganismo
16
Cópias/5 ul
Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis NLGV
Mycoplasma genitalium
Trichomonas vaginalis
Chlamydia trachomatis LGV
Chlamydia trachomatis
genérica
10
2
10
Quadro 1. Relação do número de cópias de plasmídeo recombinante necessárias para obter uma
sensibilidade de 100% na deteção de cada uma dos microrganismos.
•
Especificidade analítica. Foram efetuadas experiências de especificidade com
todos os plasmídeos recombinantes, observando-se que não se produz
deteção inespecífica de microrganismos diferentes dos que se querem
determinar. Assim, considera-se que a técnica alcança uma especificidade
analítica de 100%.
Parâmetros de utilidade diagnóstica:
Para determinar os parâmetros diagnósticos do dispositivo, realizou-se uma avaliação
comparativa da técnica CLART STIs A com as técnicas de referência de cultura e/ou PCR.
Para esta avaliação, colaborou-se com os seguintes laboratórios:
•
•
•
•
•
Departamento de Microbiologia, Hospital Universitario Germans Trias i Pujol,
Badalona, Espanha.
Centro Médico OpenHouse, Madrid, Espanha.
Hospital Monte Naranco, Oviedo, Espanha.
Centro Sanitario Sandoval, Madrid, Espanha.
Hospital Virgen de la Macarena, Sevilha, Espanha.
A presença de cada um dos microrganismos que foram detetados com o dispositivo foi
analisada a partir de material genético de amostras de urinas e de zaragatoas. Foi analisado
um total de 326 amostras: 49 amostras de urina e 277 amostras de zaragatoas. Os
microrganismos analisados estão descritos no Quadro 2.
Para cada amostra, o resultado foi considerado verdadeiro quando houve concordância
entre a técnica de referência e CLART® STIs A. As discordâncias entre ambas as técnicas,
resolveram-se da seguinte forma:
- Um resultado positivo pela técnica de referência e negativo por CLART® STIs A: a
técnica de referência foi considerada com os dados corretos, e considerada falsa
negativa para CLART® STIs A.
- Resultado negativo pela técnica de referencia e positivo por CLART® STIs A: a
discrepância será discutida por Nested-PCR específica e sequenciação. O resultado
obtido é o que se considera como verdadeiro.
17
Quadro 2. Parâmetros de diagnóstico de sensibilidade e especificidade para o dispositivo CLART®
STIs A para amostras de urina
VP
VN
FP
FN
Sensibilidade
(%)
Especificidade
(%)
VPP
(%)
VPN
(%)
40
CTgenérica.:1
LGV:1
NLGV: 38
9
0
0
100
100
100
100
8
41
0
0
100
100
100
100
8
40
1
0
100
88.9
100
97.6
0
49
0
0
-**
100
100
-**
N amostras = 49*
Chlamydia
trachomatis
Neisseria
gonorrhoeae
Mycoplasma
genitalium
Trichomonas
vaginalis
CT: Chlamydia trachomatis
LGV: Chlamydia trachomatis linfogranuloma venéreo
NLGV: Chlamydia trachomatis no linfogranuloma venéreo
VP: Verdadeiro positivo
VN: Verdadeiro negativo
FP: Falso positivo
FN: Falso negativo
VPP: Valor preditivo positivo
VPN: Valor preditivo negativo
* O número de amostras analisadas não coincide com o número de microrganismos analisados, visto
que nestas 49 amostras, havia algumas negativas, amostras com mono-infeção e amostras com coinfeção.
** Trichomonas vaginalis não está presente na urina; portanto não foi possível analisar amostras
positivas para este microrganismo. A deteção é específica para este microrganismo, uma vez que não
se detetam falsos positivos.
Quadro 3. Parâmetros de diagnóstico de sensibilidade e especificidade para o dispositivo CLART®
STIs A para amostras de zaragatoas
Nº de amostras
= 277*
Chlamydia
trachomatis
Neisseria
gonorrhoea
Mycoplasma
genitalium
Trichomonas
Sensibilidade
(%)
Especificidade
(%)
VPP
(%)
VPN
(%)
**
97.7
100
100
99.6
***
98
99.6
98
99.6
**
85.7
100
100
99.6
1
98.1
100
100
99.6
VP
VN
FP
FN
42
CT.: 8
LGV: 4
NLGV:
30
234
0
1
49
226
1
1
6
270
0
1
53
223
0
18
vaginalis
CT: Chlamydia trachomatis
LGV: Chlamydia trachomatis linfogranuloma venéreo
NLGV: Chlamydia trachomatis sem linfogranuloma venéreo
VP: Verdadeiro positivo
VN: Verdadeiro negativo
FP: Falso positivo
FN: Falso negativo
VPP: Valor preditivo positivo
VPN: Valor preditivo negativo
* O número de amostras analisadas não coincide com o número de microrganismos analisados, visto
que nestas 277 amostras, existiam algumas negativas, amostras com mono-infeção e amostras com
co-infeção.
** Não se pôde confirmar a presença do microrganismo na amostra com Nested-PCR e/ou PCR
específica.
*** Amostra positiva por sequenciação para Neisseria flava
-Especificidade diagnóstica.
A técnica foi validada com amostras de urina e amostras de zaragatoa tanto negativas como
positivas para outros microrganismos não contemplados no dispositivo, e os resultados
demonstraram que não há reacção cruzada com os mesmos.
-Repetibilidade e reprodutibilidade diagnóstica por tipo de amostra.
A reprodutibilidade e repetibilidade diagnóstica processou-se desde a extração da amostra
até à visualização em CS.
%
Urina
Repetibilidade (n=6)
Reprodutibilidade (n=8)
Zaragatoa
Repetibilidade (n=41)
Reprodutibilidade (n=46)
100
100
99.2
97.1
19
11. REFERÊNCIAS BILBIOGRÁFICAS
1. “Gardnerella, Trichomonas vaginalis, Candida, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma
hominis and Ureaplasma urealyticum in the genital discharge of symptomatic fertile and
asymptomatic infertile women”. Erminia Casari, Antonella Ferrario, Emanuela Morenghi,
Alessandro Montanelli. New Microbiologica, 33, 69-76, 2010.
2. “Global strategy for the prevention and control of sexually transmitted infections: 2006 2015 : breaking the chain of transmission”. WHO
3. “Sexually Transmitted Diseases in the United States, 2008 National Surveillance Data for
Chlamydia, Gonorrhea, and Syphilis” CDC.
4. “Persistent increase in the incidence of acute male urethritis diagnosed in general
practices in France”. Véronique Massari, Yves Dorléans and Antoine Flahault. British
Journal of General Practice 2006; 56: 110–114.
5. “Mycoplasma genitalium presence, resistance and epidemiology in Greenland” Dionne C.
Gesink, Gert Mulvad, Ruth Montgomery-Andersen, Upaluk Poppel, Stephan MontgomeryAndersen, Aka Binzer, Lee Vernich, Gillian Frosst, Flemming Stenz, Elizabeth Rink, Ove
Rosing Olsen, Anders Koch and Jørgen Skov Jensen. Int J Circumpolar Health 2012, 71:
18203.
20