JOSILEIDE DUARTE DE FARIAS
IDENTIFICAÇÃO GENOTÍPICA DO POLIMORFISMO DO SISTEMA
SANGUÍNEO DUFFY (DARC) EM REGIÃO ENDÊMICA DE MALÁRIA
DA AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA, PORTO VELHO - RO
Dissertação apresentada ao Mestrado em
Biologia Experimental da Universidade Federal
de Rondônia – UNIR para obtenção do título de
Mestre em Genética.
Porto Velho – RO
2.003
JOSILEIDE DUARTE DE FARIAS
IDENTIFICAÇÃO GENOTÍPICA DO POLIMORFISMO DO SISTEMA
SANGUÍNEO DUFFY (DARC) EM REGIÃO ENDÊMICA DE MALÁRIA
DA AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA, PORTO VELHO - RO
Dissertação apresentada ao Mestrado em
Biologia Experimental da Universidade Federal
de Rondônia – UNIR para obtenção do título de
Mestre em Genética.
Área de conhecimento: Genética Humana
Orientadora: Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira
Porto Velho – RO
2.003
FICHA CATALOGRÁFICA
FARIAS, J.D.
Identificação Genotípica do Polimorfismo do Sistema Sanguíneo Duffy
(DARC) em Região Endêmica de Malária da Amazônia Ocidental Brasileira,
Porto Velho - RO / FARIAS, Josileide Duarte de. Dissertação de Mestrado –
Mestrado em Biologia Experimental / Fundação Universidade Federal de
Rondônia.
Porto Velho: s.n., 2003. – 55p.
Orientadora: Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira
Palavras-Chave: 1. DARC 2. Suscetibilidade Genética 3. Malária I.Título
IDENTIFICAÇÃO GENOTÍPICA DO POLIMORFISMO DO SISTEMA
SANGUÍNEO DUFFY (DARC) EM REGIÃO ENDÊMICA DE MALÁRIA DA
AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA, PORTO VELHO - RO
JOSILEIDE DUARTE DE FARIAS
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________
Dra. Vera Engracia
Orientadora
_________________________________________________
Dra. Maria Manuela Fonseca Moura
_________________________________________________
Dr. Paulo Afonso Nogueira
Dissertação de Mestrado defendida e aprovada em 12 / 12 / 2003 .
A minha família,
Aos meus pais,
José Capistrano de Farias e Anazilda Duarte de Farias
Por seu amor e incentivo.
Aos meus irmãos,
Por estarem sempre ao meu lado.
AGRADECIMENTOS
A Deus por sempre me acompanhar em todas as jornadas da minha vida.
A Dra. Vera Engracia pela orientação neste trabalho, cuja dedicação foi essencial
para a concretização do mesmo, por ter colaborado direta e continuamente para o
meu aprendizado desde o meu início como Iniciação Científica.
Ao Dr. Mauro Shugiro Tada, pela idealização do projeto Candelária e por suas
sugestões em minha qualificação.
A Dra. Rubiani Pagotto, pelas sugestões e contribuição na minha qualificação.
A Dra. Maria Manuela Moura, pela honra de tê-la como examinadora na defesa da
dissertação e por ter colaborado para o meu aprendizado desde o início da minha
jornada na Universidade.
Ao Dr. Paulo Afonso Nogueira, por ter aceitado fazer parte da banca de defesa.
Aos colegas do laboratório de Genética Molecular Humana Francisca de Holanda,
Izabel Heckmann, Jefferson Castro, Almeida Casseb e Marlene Guimarães por terem
contribuído de uma forma especial para o desenvolvimento deste projeto.
A todos os professores e colegas de mestrado que de algum modo contribuíram no
meu aprendizado.
A Mariluce (kiki), Martinha e Nair pela paciência e suporte nos materiais de
laboratório.
Aos moradores das vilas de Candelária e Bate-Estaca por sua participação que tornou
viável este estudo.
As Instituições UNIR/CEPEM pelo apoio oferecido durante o desenvolvimento desse
projeto.
“A descoberta consiste em ver o que
todos vêem e pensar o que ninguém
pensou”.
Albert von Szent Gvöngvi
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS .................................................................................
i
LISTA DE FIGURAS ................................................................................
iii
LISTA DE FOTOS ....................................................................................
iii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ...................................................
iv
RESUMO ..................................................................................................
v
ABSTRACT ...............................................................................................
vi
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................
01
1.1 Significância Biológica da Proteína Duffy .......................................
01
1.2 Biologia Molecular de DARC ............................................................
02
1.3 Polimorfismo do Sistema Duffy ........................................................
03
1.4 FY Nulo ..............................................................................................
05
1.4.1 Supressão da expressão do promotor GATA em FY*B ...................
05
1.4.2 Diminuição da Expressão de Fyb nos eritrócitos .............................
06
1.5 Breve História da Malária em Rondônia ..........................................
07
1.6 Sistema Duffy e Malária ...................................................................
08
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................
10
3. OBJETIVOS ........................................................................................
11
4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................
12
4.1 Caracterização da População ............................................................
12
4.1.1 Candelária .......................................................................................
12
4.1.2 Bate-Estaca ......................................................................................
13
4.2 Coleta da amostra e dados antropogenéticos ....................................
13
4.3 Acompanhamento dos Casos de Malária ..........................................
14
4.4 Métodos Laboratoriais .......................................................................
14
4.4.1 Extração de DNA .............................................................................
14
4.4.2 Amplificação do DNA por PCR .......................................................
15
4.4.2.1 Polimorfismo de FY*A e FY*B......................................................
15
4.4.2.2 Genótipo nulo (FY-nulo) ...............................................................
16
4.4.3 Análises de Polimorfismos através de RFLPs .................................
17
4.5 Análises Estatísticas ...........................................................................
18
4.6 Análises de Freqüências Alélicas ......................................................
18
4.7 Análises de Famílias ..........................................................................
18
4.8 Padronização dos testes para Duffy ..................................................
19
5. RESULTADOS ....................................................................................
21
5.1 Freqüências Alélicas ..........................................................................
21
5.2 Sistema Duffy .....................................................................................
23
5.3 Infecção por Plasmodium .................................................................
24
5.3.1 Associação de Infecção por Plasmódio e Genótipo Mutantes de
Duffy .........................................................................................................
24
5.3.2 Malária e Antropogenética em Candelária e Bate-Estaca ..............
26
5.4 Segregação do Sistema Duffy em Candelária e Bate-Estaca ...........
26
6. DISCUSSÃO ........................................................................................
28
6.1 Antropogenética .................................................................................
28
6.1.1 Distribuição dos Genótipos Segundo a Faixa Etária ......................
28
6.1.2 Distribuição Alélica e Genotípica Segundo a Etnia ........................
29
6.2 Freqüências ........................................................................................
30
6.2.1 Freqüências Genotípicas e Alélicas ................................................
30
6.3 Mutações ............................................................................................
32
ES
6.3.1 Alelo FY*B ....................................................................................
32
6.3.2 Alelo FY*BG298A ................................................................................
33
6.4 Duffy e Malária ..................................................................................
33
6.4.1 Portadores de Infecção Assintomáticos ...........................................
34
6.4.2 Portadores de Infecção Sintomáticos ..............................................
36
6.4.3 Malária, Duffy e Dados Antropogenéticos ......................................
37
6.5 Fenótipo Nulo ....................................................................................
38
6.5.1 Seleção Positiva e Fixação do alelo Nulo de Duffy ........................
39
6.6 Análise de Segregação .......................................................................
39
7. CONCLUSÕES ....................................................................................
40
BIBLIOGRAFIA .....................................................................................
41
APÊNDICES ............................................................................................
48
I. Localização do Estado de Rondônia .....................................................
49
II. Localização das Vilas de Candelária e Bate-Estaca ...........................
50
III. Termo de Consentimento ....................................................................
51
IV. Questionário de Coleta de Dados Antropogenéticos e de Saúde .......
52
V. Questionário de Coletas de Dados Demográficos e SócioEconômicos ...............................................................................................
53
VI. Protocolo de Extração de DNA – Proteinase K .................................
54
i
LISTA DE TABELAS
Tabela n°.
Página
01.
Polimorfismo do Grupo Sangüíneo Duffy. ..........................................
03
02.
Freqüência dos alelos do lócus FY em diferentes populações..............
04
03.
Distribuição dos doentes com malária pela etiologia e pelo sistema
Duffy do Município de Humaitá, Estado do Amazonas. .....................
05
04.
Seqüência de primers para amplificação de Duffy. .............................
15
05.
Constituição da MIX de PCR identificação do polimorfismo de
Duffy e dos sítios mutacionais G298A e C265T. ................................
06.
Constituição da MIX de PCR para identificação do alelo nulo de
Duffy na região promotora de Duffy. ..................................................
07.
17
Distribuição de observados e esperados e freqüências alélicas do
sistema Duffy na população total de Candelária e Bate-Estaca. ..........
09.
16
Identificação das principais variações encontradas no promotor
GATA-1, e na seqüência codante da proteína Duffy. ..........................
08.
15
21
Distribuição de observados e esperados e freqüências alélicas de
sistema Duffy de indivíduos com e sem parentesco de Candelária e
Bate-Estaca. .......................................................................................... 22
10.
Distribuição dos genótipos de Duffy segundo etnia, idade e sexo na
vila de Candelária e Bate-Estaca........................................................... 23
11.
Distribuição de genótipos Duffy entre indivíduos portadores
sintomáticos e assintomáticos de plasmódio, via PCR, em 18 meses
de seguimento longitudinal (arquivo CEPEM-2003) em Candelária e
Bate-Estaca. .......................................................................................... 24
12.
Distribuição de indivíduos portadores de mutações (T-33C e G298A)
e normais (FY*A e FY*B) nos moradores de Candelária e BateEstaca portadores sintomáticos e assintomáticos de plasmódio e sem
infecção. ...............................................................................................
13.
24
Distribuição de indivíduos portadores de mutação G298A, mutação
T-33C e normais (FY*A e FY*B) nos moradores de Candelária e
Bate-Estaca com ou sem infecção por malária vivax. ..........................
24
ii
14.
Associação dos Genótipos de FY normais e mutantes com infecção
por P. falciparum em Candelária e Bate-Estaca. .................................
15.
Mutação FY*
G298A
25
entre os alelos FY*B em indivíduos brancos e
não brancos (mulatos e negros) que apresentaram ou não infecção
por malária no período de 18 meses de seguimento longitudinal na
amostra de Candelária e Bate-Estaca. ..................................................
16.
Indivíduos que permaneceram assintomáticos para malária vivax e
falciparum nos três cortes de Candelária e Bate-Estaca. .....................
17.
25
25
Associação entre os genótipos Duffy com grupos étnicos e infecção
por plasmódio assintomática e sintomática de Candelária e BateEstaca em 18 meses de seguimento longitudinal. ................................
18.
26
Genótipos de Duffy em indivíduos Brancos ou não brancos (mulatos
e negros) que apresentaram ou não infecção por malária no período
de 18 meses de seguimento longitudinal na amostra de Candelária e
Bate-Estaca. ..........................................................................................
19.
26
Distribuição de genótipos Duffy em famílias anucleares (somente pai
ou somente mãe) com filhos observados em Candelária e BateEstaca. ..................................................................................................
20.
Tipos de casamentos observados em famílias nucleares com ou sem
filhos na vila de Candelária e Bate-Estaca. ..........................................
21.
26
27
Distribuição da população geral do Município de Humaitá, Estado do
Amazonas, pelo sistema Duffy. ...........................................................
31
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura n°.
Página
01.
Porcentagem da distribuição dos genótipos de Duffy em Candelária. .......
21
02.
Porcentagem da distribuição dos genótipos de Duffy em Bate-Estaca. .....
22
03.
Proporção de Crianças e adolescentes (de 0 a 15 anos), jovens (de 16-30
anos) e adultos (acima de 31 amos) nas amostras de Candelária e BateEstaca. .........................................................................................................
29
LISTA DE FOTOS
Foto n°.
01.
Página
Gel de agarose 1%. Confirmação da amplificação da PCR da seqüência
da proteína Duffy. .......................................................................................
02.
Gel de agarose 1%. Confirmação da amplificação da PCR da região
promotora de Duffy. ...................................................................................
03.
20
Gel de agarose 2%. Produtos de PCR digeridos com Mwo I para
identificação do alelo FY*BG298A. ..............................................................
05.
19
Gel de agarose 2%. Produtos de PCR digeridos com Ban I para
identificação do polimorfismo do grupo sangüíneo Duffy. ........................
04.
19
20
Gel de Poliacrilamida 10%. Produtos de PCR digeridos com Sty I para
identificação da mutação no promotor GATA. ..........................................
20
iv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Sigla ou Abreviatura
Significado
5’RACE
5’ – Rapid Amplification of cDNA Ends
cDNA
DNA complementar
CEPEM
Centro de Pesquisa em Medicina Tropical
Cols.
Colaboradores
CONEP
Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
DARC
Duffy Antigen Receptor for Chemokines
DBP
Duffy-binding protein
dNTP
Desoxinucleotídeo
EDTA
ÁcidoEthilenodiaminetetraacetico
EFMM
Estrada de Ferro Madeira-Mamoré
ES
Erythrocyte Silent (eritrócito silencioso)
FUNASA
Fundação Nacional de Saúde
FY
Duffy
gDNA
DNA genômico
GP
Glicoproteína
gp-Duffy
Glicoproteína Duffy
HLA
Antígenos Leucocitários Humanos, em português
IBGE
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IPA
Índice Parasitário Anual
MCP
monocyte chemoattractant protein
MGSA
melanoma growth stimulating activity
nt
nucleotídeo
pb
Pares de bases
PCR
Reação da Polimerase em Cadeia, em português
RANTES
regulated on activation normal T cell expressed, em inglês
RFLP
Polimorfismos de Comprimento de Fragmento de Restrição,
TA
Temperatura de Anelamento
TEMED
N’,N’,N’,N’ -Tetramethylethylenediamina
WK
Weak (fraco)
v
RESUMO
FARIAS, Josileide Duarte de. 2003. Identificação Genotípica do Polimorfismo do
Sistema Sanguíneo Duffy em Região Endêmica de Malária da Amazônia
Ocidental Brasileira, Porto Velho-RO. Dissertação de Mestrado. Fundações
Universidade Federais de Rondônia, 55 p. Porto Velho – RO.
A glicoproteína Duffy é um receptor eritrocitário tanto para quimiocinas
quanto para merozóitos de Plasmodium vivax. A ausência de seus antígenos
eritrocitários designa o fenótipo Fy(a- b-), que proporciona resistência a malária
vivax aos indivíduos deste fenótipo. A detecção de indivíduos que apresentam
infecção assintomática em regiões de alta endemicidade para malária, como
Candelária e Bate-Estaca, Porto Velho – RO, dá indícios de um possível papel de
DARC nesta resposta adaptativa humana. Este fato levou-nos a propor a investigação
das interações entre o Plasmodium e o sistema Duffy. Objetivamos, assim,
determinar as freqüências gênicas do sistema Duffy e a distribuição de mutações que
condicionam o fenótipo Fy(a- b-), e associar os genótipos investigados com
morbidade à malária, além de investigar o papel de DARC na infecção assintomática.
O DNA extraído de leucócitos foi amplificado com primers FY3 e FY4 e o
fragmento de 661pb foi digerido com Ban I e Mwo I para identificação dos principais
genótipos de Duffy. A identificação do genótipo nulo de Duffy ocorreu com primers
FY1 e FY2 e digestão do fragmento de 221pb com Sty I. A visualização ocorreu em
gel de agarose 1-2% corado com brometo de etídio e em gel de poliacrilamida 10%
corado com nitrato de prata 10%. O nível de significância adotado nas análises
estatísticas foi de 5%. O genótipo mais freqüente desta distribuição total foi o
FY*A/FY*B com 39% em Candelária e 30% em Bate-Estaca (109/298 indivíduos).
As distribuições genotípicas e alélicas não estão de acordo com as condições de
equilíbrio de Hardy-Weinberg, tanto para a população em geral, envolvendo os
grupos familiares ( 24 = 32,05, p = 0,0000), como nas subamostras sem parentesco
( 24 = 15,55, p = 0,0037), e com parentesco ( 24 = 18,99, p = 0,0008). Os alelos
FY*BES e FY*BG298A possuem freqüência polimórficas, sendo mais freqüentes em
mulatos. Heterozigotos para o alelo FY*BES são suscetíveis à malária vivax e
falciparum.
vi
ABSTRACT
FARIAS, Josileide Duarte de. 2003. Genotypic Identification of the Duffy Blood
Group System’s Polymorphism in the Malaria Endemic Region of the Western
Amazon, Brazil, Porto Velho-RO. Dissertação de Mestrado. Fundações
Universidade Federais de Rondônia, 55 p. Porto Velho – RO.
The Duffy blood group antigens were first recognized as the erythrocyte
receptor of chemokines and malaria parasites. Fy(a- b-) individuals resist to
Plasmodium vivax infection because they lack DARC on their erythrocytes. The
detention of individuals that present asymptomatic infection in regions of high
endemicity for malaria, as Candelária and Bate-Estaca, Porto Velho-RO, gives
indications of a possible DARC’s role in this human adaptative response. This fact
led us to propose the investigation of the interactions between the Plasmodium and
the Duffy system. We intend, thus, to determine the genics frequencies of the Duffy
system and the distribution of mutations that condition phenotype Fy(a- b -), and to
associate the genotypes investigated with morbity to the malaria. Besides, we also
investigate the DARC’s role in the asymptomatic infection. The extracted DNA of
leukocytes was amplified with primers FY3 and FY4 and the fragment of 661pb was
digested with Ban I and Mwo I in order to identify the main genotypes of Duffy. The
identification of the null genotype of Duffy occurred with primers FY1 and FY2 and
digestion of fragment of 221pb with Sty I. The visualization occurred in gel of
agarose 1-2% with etídio bromide and in gel of poliacrilamide 10% with nitrate of
silver 10%. The level of significance adopted in the statistical analyses was 5%. The
genotype most frequent of this total distribution was the FY*A/FY*B with 39% in
Candelária and 30% in Bate-Estaca (109/298 individuals). The genotypics and alelics
distributions are not in accordance with the conditions of Hardy-Weinberg, as much
for the population in general, involving the familiar groups ( 24 = 32,05, p = 0,0000),
as in undersample without relationship ( 24 = 15,55, p = 0,0037), and with
relationship ( 24 = 18,99, p = 0,0008). The aleles FY* BES and FY* BG298A possess
polymorphics frequency being more frequent in mulattos. Heterozygous individuals
for the alele FY* BES are susceptible to the malaria vivax and falciparum.
Introdução
1. INTRODUÇÃO
O sistema Duffy (FY) distinguiu-se por ter sido o primeiro grupo sangüíneo
mapeado em um loco autossômico (Donahue e cols., 1968; Mathew e cols., 1994).
Os locos FY e Rh são sintênicos, presentes no cromossomo 1. O loco Rh está
próximo à extremidade do braço curto e FY encontra-se no braço longo, sendo
primeiramente designado na região 1q2125 por análise de ligação (Dracopoli e
cols., 1991). Collins e cols. (1992) reduziram a região fixada para 1q2223 usando
análises múltiplas de pareamento. Esta região foi confirmada por fluorescência e
hibridação in situ. (Mathew e cols., 1994). O homólogo de FY em ratos também está
localizado no cromossomo 1 (Luo e cols., 1997). O cDNA de FY foi originalmente
clonado a partir de um mRNA “non-spliced” (transcrito primário) e seqüenciado,
sendo constituído por 2 éxons e um íntron (Chaudhuri e cols., 1995; Chaudhuri e
cols., 1997; Pogo e Chaudhuri, 2000).
O produto gênico Duffy (Fy) é uma glicoproteína (GP) transmembrana
composta por 336 aminoácidos, com peso molecular teórico de 35-43 kDa, sendo um
receptor heptahélico transmembranário (Hadley e Peiper, 1997; Iwamoto e cols.,
1996). Esta proteína foi o primeiro antígeno reconhecido em eritrócitos através de
reações imunológicas, sendo descrito por Cutbush e cols. (1950) o antígeno Fya e o
antígeno Fyb por Ikin e cols (1951). Alguns casos de incompatibilidade na transfusão
sangüínea e doença hemolítica do recém-nascido são devidos à presença de
anticorpos contra antígenos Duffy (Parasol e cols., 1998).
1.1 Significância Biológica da Proteína Duffy
A significância biológica de GP Duffy, a qual transporta determinante
antigênico, tornou-se claro quando foi demonstrado que esta proteína é receptor para
certos parasitas da malária e um novo membro da superfamília de receptores de
quimiocinas (Miller e cols., 1976; Pogo e Chaudhuri, 2000).
Introdução
2
A GP Duffy foi identificada também como receptor para várias citocinas, sendo
o sistema Duffy renomeado para Antígeno Duffy Receptor de Quimiocinas (Duffy
Antigen Receptor for Chemokines, DARC, em inglês). DARC pode ter importantes
funções fisiológicas nos processos homeostáticos em algumas regiões do cérebro e
em processos envolvendo quimiocinas inflamatórias (Neote e cols., 1994; Chaudhuri
e cols., 1995; Horuk e cols., 1996; Hadley e Paiper, 1997).
As quimiocinas têm sido identificadas e caracterizadas por seus efeitos na
migração de leucócitos durante processos inflamatórios (ver Murphy, 1994, para
revisão), cuja função é mediada por sinalização transmembrânica através de
receptores para quimiocinas. Na sua maioria, os receptores de quimiocinas são
ligantes relativamente específicos. DARC é um receptor promíscuo, ligando-se a
uma variedade de quimiocinas, de ambas famílias CC (regulated on activation
normal T cell expressed - RANTES, monocyte chemoattractant protein - MCP-1) e
CXC (IL-8, melanoma growth stimulating activity - MGSA). DARC pode agir nos
eritrócitos como um nítido receptor para mediadores inflamatórios (Neote e cols.,
1993; Horuk e cols., 1993).
1.2 Biologia Molecular de DARC
Iniciadores de extensão e análises 5’RACE em humanos revelaram a presença
de um éxon usptream contendo um códon metionina de início de tradução e seis
códons para resíduos adicionais de aminoácidos. O polimorfismo responsável pelos
fenótipos Fya e Fyb é codificado no códon 42 do exon 2 (Hadley e Peiper, 1997;
Iwamoto e cols., 1996).
Inicialmente, pensava-se que o gene Duffy possuía um único éxon, codificando
uma proteína de 338 aminoácidos com um N-terminal de MASSGYLQ (Chaudhuri e
cols., 1993). Entretanto, dois tipos de mRNA de Duffy foram descritos, tornando a
designação do número de aminoácidos problemática. O transcrito menos abundante
codifica uma proteína de 338 resíduos e é atualmente chamada de menor ou forma .
Foi descoberto primeiro e é usado para clonagem, e o transcrito mais abundante,
chamado de forma maior ou forma
, codifica uma proteína de 336 resíduos
Introdução
3
(Iwamoto e cols., 1996; Pogo e Chaudhuri, 1997). Fisiologicamente, as propriedades
da gp-Duffy codificada tanto pelo transcrito maior quanto pelo menor são idênticas,
permitindo, semelhantemente, a adesão de quimiocinas e de parasitas da malária
(Rios e cols., 2000).
Estudos subseqüentes revelaram a presença de um pequeno éxon upstream
(éxon 1) que codifica sete aminoácidos (Iwamoto e cols., 1995). A unidade de
transcrição Duffy engloba 1572 nucleotídeos, incluindo o éxon 1 com 55
nucleotídeos (nt), um único íntron com 479 nt, e o éxon 2 com 1038 nt (Pogo e
Chaudhuri, 2000).
1.3 Polimorfismo do Sistema Duffy
Foram identificados três fenótipos em indivíduos brancos usando-se antisoro
anti-Fya e anti-Fyb: Fy(a+ b-), Fy(a- b+) e Fy(a+ b+). Estes fenótipos são produtos de
alelos codominantes compreendendo os genótipos FY*A/FY*A, FY*B/FY*B e
FY*A/FY*B, respectivamente (Cutbush e cols., 1950; Ikin e cols., 1951; Sanger e
cols., 1955).
Utilizando-se diferentes metodologias, como testes de imunofluorescência, foi
observado que alguns indivíduos brancos expressam um produto antigênico de Fyb
de fraca intensidade, sendo representado pelo alelo FY*BWK ou FyX (Hadley e
Peiper, 1997; Parasol e cols., 1998; Pogo e Chaudhuri, 2000; tabela 01) .
Tabela 01.
Polimorfismo do Grupo Sangüíneo Duffy (Pogo e Chaudhuri, 2000).
Antisoro
Anti-Fya
Anti-Fyb
Anti-Fya/ Anti-Fyb
—
Antígenos
Fya
Fyb
Fya/ Fyb
—
Fenótipos
Fy(a+ b-)
Fy(a- b+)
Fy(a+ b+)
Fy(a- b-)
Anti-Fy3
Anti-Fy5
Anti-Fy6‡
Fyb
Fy3
Fy5 (+Rh) †
Fy6
Fy(a- b+wk)
Fy3
Fy5
Fy6
* O alelo é silencioso apenas no eritrócito.
† Fy5 requer a presença do polipeptídeo Rh
‡ O antígeno é determinado pelo anticorpo monoclonal murine
Alelos
FY*A/FY*A
FY*B/FY*B
FY*A/FY*B
FY*BES/FY*BES* ou
FY*A0/FY*A0
FY*B0/FY*B0
FY*BWK/FY*BWK
FYA ou FYB
FYA ou FYB
FYA ou FYB
Introdução
4
Os alelos FY*A e FY*B diferem por uma única substituição de base no
nucleotídeo 125 do cDNA (A em FY*B e G em FY*A), resultando em um
polimorfismo no resíduo do aminoácido 42, com ácido aspártico (Asp) no produto
protéico Fyb e Glicina (Gli) em Fya (Chaudhuri e cols., 1993). A presença de uma
guanina neste local gera o sítio palindrômico de restrição 5’ GGYRCC 3’ para a
enzima Ban I em FY*A, sendo possível a identificação de FY*A e FY*B por
polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) com esta enzima
(Chaudhuri e cols., 1993; Iwamoto e cols., 1995; Parasol e cols., 1998).
A freqüência de Fya na Grã-Bretanha é de 42%, e na maior parte de outras
populações de origem européia possui uma freqüência similar, tendo Fya freqüência
proporcional à de Fyb nestas populações. Na Ásia é consideravelmente alta,
chegando a 100% em algumas populações (Mallinson e cols., 1995; Moulds e cols.,
1998; tabela 02). A maior parte dos negros ocidentais e cerca de 68% dos negros
americanos não expressam Fya ou Fyb em seus eritrócitos (Mourant e cols., 1976).
Tabela 02. Freqüência dos
Populações
Caucasianos
Negros
Chineses
Japoneses
Tailandeses
Australianos
alelos do lócus FY em diferentes populações.
FY*A
0,42
0,10
0,95
0,90
0,92 - 1,0
0,97
FY*B
0,57
**
0,05
0,10
0,0 - 0,08
---
FY*BES
--**
---------
** Os dados não permitem a separação precisa de FY*B e FY*B ES sendo a
freqüência para ambos alelos de 0,87 (Moulds e cols., 1998).
Salzano e cols. (1980), estudando 23 sistemas genéticos sangüíneos entre
populações indígenas da região sul do Brasil, observaram uma freqüência alélica do
antígeno Fya do sistema Duffy de 0,710 entre os indígenas e 0,616 entre mestiços,
totalizando 225 indivíduos analisados entre índios e mestiços. Em 1997, Salzano
observou, em populações indígenas Xavantes no estado de Mato Grosso, região
Centro-Oeste do Brasil, a freqüência alélica de Fya de 0,447 (59 indivíduos) em um
total de 85 indivíduos analisados. Santos e cols. (1998), observaram, em 6 grupos de
populações indígenas da Amazônia, a freqüência alélica de 0,681 de Fya.
Em 1981 Colauto e cols. descreveram a prevalência de 11,5% para os fenótipos
Fy(a-b-) em 104 indivíduos no município de Humaitá no estado do Amazonas, região
Introdução
5
Norte do Brasil (tabela 03). Foi também observado em doadores negróides e
caucasóides, na cidade de São Paulo, que um terço deles era Duffy-negativo, sendo
este fenótipo definido por teste sorológico padrão (Cavasani, e cols., 2001; Novaretti
e cols., 2000).
Tabela 03. Distribuição dos doentes com malária pela etiologia e pelo sistema Duffy de grupo
sangüíneo do Município de Humaitá, Estado do Amazonas (Colauto e cols., 1981).
Sistema Duffy
Etiologia
Plasmodium vivax
Plasmodium falciparum
Fy( a+ b-)
N.º (%)
5 (31,25)
4 (44,44)
9 (36,00)
Fy(a- b+)
N.º (%)
6 (37,50)
4 (44,44)
10 (40,00)
Fy(a- b-)
N.º (%)
0 (00,00)
1 (11,12)
1 ( 4,00)
Fy(a+ b+)
N.º (%)
5 (31,25)
0 (00,00)
5 (20,00)
Total
N.º (%)
16 (100,00
9 (100,00)
25 (100,00)
Nunes e Moura (1999) investigaram fatores genéticos de resistência à malária
através de reações imunológicas de Duffy em Rondônia, norte do Brasil, observando
uma distribuição análoga entre os alelos FY*A e FY*B, e uma proporção de 33% de
indivíduos heterozigotos para estes alelos; além disso, foram detectados 6% de
indivíduos Duffy-negativos nas três amostras analisadas.
1.4 FY Nulo
A ausência de Fya e Fyb nos eritrócitos designa o fenótipo Duffy negativo,
Fy(a- b-). O fenótipo Fy(a- b-) é, entretanto, extremamente raro entre indivíduos
brancos e populações asiáticas (Issitt, 1985). O genótipo designado FY/FY é
considerado responsável pela maioria dos casos de eritrócitos Fy(a- b-) na população
negra (Tounamille e cols., 1995).
1.4.1 Supressão da expressão do Promotor GATA-box eritrocitário em FY*B
Tournamille e cols. (1995) encontraram uma mutação no gene Duffy de
indivíduos negros Fy(a- b-), que não estava na região codificadora do gene, mas na
região promotora usptream ao códon metionina de iniciador de tradução.
Este fenótipo é determinado por um genótipo cuja seqüência gênica é idêntica a
do FY*B caracterizando o alelo FY*BES (Erythrocyte Silente). Nos indivíduos de fenótipo
Fy (a- b-) esta seqüência permanece silenciosa nas células hematopoéticas, mas é
transcrita e expressa nas células endoteliais das veias pós-capilares (Hadley e Peiper,
1997). Chaudhuri e cols. (1995) encontraram mRNA da glicoproteína Duffy presente
no pulmão, baço e cólon, mas não na medula óssea de indivíduos negros americanos
Introdução
6
de fenótipo Fy(a- b-), o que leva à formulação da hipótese de regulação eritrocitária
específica de mRNA GP Duffy como base para este fenótipo.
Uma das causas do fenótipo FY (nulo) é a substituição de T por C no sítio motif
GATA box, na região promotora do alelo FY*B (-33T  C), segundo Tournamille e
cols. (1995). A seqüência TTATCT está presente nos alelos A e B, e é uma
seqüência consenso para ligação com fatores GATA de transcrição. Esta mutação
interrompe o local para o fator de transcrição eritrocitário GATA-1, resultando em
um alelo silencioso de FY*B, nos eritrócitos (Tournamille e cols., 1995). A mutação
no promotor GATA box gera um sítio de restrição para Sty I, seguindo a
identificação desta mutação por RFLP.
Inicialmente, o fenótipo nulo de Duffy estava associado ao alelo FY*B.
Zimmerman e cols. (1999) descreveram a mesma mudança (T-33C) que ocorre no
promotor de FY*B ligada ao alelo FY*A, numa população de Papua em Nova Guiné,
caracterizando dessa forma o alelo nulo Duffy em FY*A (FY*Anulo). Essa mutação
parece ter origem mais recente que FY*BES. A detecção do fenótipo nulo em FY*A
sugere que a emergência de novo alelo está envolvida com seleção do polimorfismo
eritrocitário, diferentemente da fixação ocorrida com o alelo FY*BES, frente à
ausência do P. vivax na África. A emergência de um alelo independente Duffynegativo em uma região de Papua, Nova Guiné, altamente endêmica para malária
vivax fornece créditos para a teoria que malária vivax pode agir como um agente
seletivo.
Esta recente emergência do alelo FY*Anulo proporciona estudos sobre
suscetibilidade à malária e sobre fatores de fixação deste alelo em populações
etnicamente diversificadas.
1.4.2 Diminuição e Supressão da Expressão de Fyb na seqüência codante de GPDuffy
Algumas raras mutações e deleções anti-sense em FY*A e FY*B também
resultam em fenótipo Fy(a- b-) (Mallinson e cols., 1995; Rios e cols., 2000). Outra
mutação, encontrada entre indivíduos judeus não-Ashkenazi, em negros brasileiros e
europeus, foi identificada na seqüência codificadora do alelo FY*B, FY*BC265T
Introdução
7
(Parasol e cols., 1998; Reid e cols., 1998; Olsson e cols., 1998; Tournamille e cols.,
1998; Yazdanbakhsh e cols., 2000).
A mutação FY*BC265T é responsável pela notável diminuição da expressão de
Fyb, resultando no fenótipo FyWK (weak) (Tournamille e cols., 1998; Yazdanbakhsh e
cols., 2000). FyWK não pode ser detectado rotineiramente por pesquisa de
aglutinação, aparecendo como um fenótipo Fy(b-), e métodos especiais são
requeridos para distinção entre Fy(b-) e FYWK (Murphy e cols., 1997).
A mutação FY*BC265T quando encontrada simultaneamente na seqüência
codante da GP Duffy com outra mutação previamente descrita, FY*BG298A, resulta
no silenciamento do antígeno Fyb nos eritrócitos (Neote e cols, 1994; Mallinson e
cols., 1995, Parasol e cols., 1998). Estas mutações podem ser responsáveis por
alguns casos de Fy(b-) de indivíduos que possuem o promotor GATA FY*B tipo
selvagem. Parasol e cols. (1998) identificaram ambas mutações em indivíduos judeus
não-Ashkenazi Fy(b-) e em indivíduos negros brasileiros que possuíam o promotor
GATA FY*B tipo selvagem.
A mutação FY*BG298A modifica o resíduo de aminoácido 100 (Chaudhuri e
cols., 1993), devido à substituição Ala
Thr, causando uma modesta mudança nas
propriedades do receptor. A mutação FY*BC265T converte o resíduo de aminoácido
89 Arg
Cis no primeiro loop citoplasmático do receptor. Esta substituição
representa uma considerável mudança na natureza química da região e pode afetar o
comportamento do sistema Duffy e sítios antigênicos extracelulares.
1.5 Breve História da Malária em Rondônia
O estado de Rondônia tem sido responsável por grande parte dos casos de
malária registrados no Brasil nos últimos anos (50% dos casos de 1988 e 20% dos
casos em 1997/8). Nos últimos 150 anos, quatro grandes epidemias foram recordes
no Estado de Rondônia (Sawyer, 1988). Episódios conspícuos de imigração foram
traços comuns destas epidemias. A primeira epidemia teve início em 1880. A maior
parte dos imigrantes era lavradores oriundos dos estados do nordeste brasileiro, que
fugiam da seca em sua terra (Sawyer, 1988; Pinto, 1993). A segunda epidemia
Introdução
8
ocorreu na metade do século XIX e flagelou os trabalhadores da estrada de ferro
Madeira-Mamoré. Neste caso, muitos imigrantes eram de países do Caribe,
particularmente Granada e Barbados (Pinto, 1993). A terceira epidemia, que ocorreu
no período da borracha e no início da II Guerra Mundial, vitimando voluntários do
chamado exército da borracha, também consistia principalmente de lavradores do
nordeste Brasileiro (Sawyer, 1988; Deane, 1988). A presente população nativa de
Rondônia é descendente destes imigrantes e da população indígena local. A quarta e
última epidemia explodiu em 1970, com o incentivo dado pelo governo federal aos
programas de assentamento da região norte do Brasil, oferecendo terra livre; com
esse incentivo houve grande fluxo migratório de indivíduos vindos das regiões
centro-oeste, sul e sudeste, além de outros países (Marques, 1986; Marques 1987). A
grande maioria dos imigrantes nunca tinha sido exposta à malária, caracterizando
assim uma população não imune.
Atualmente, a malária continua vitimando a população de Rondônia. Em
Porto Velho, capital do Estado, áreas periurbanas, rurais e pequenas vilas apresentam
elevados índices de casos de malária no estado. Este tipo de malária não é
responsável pelas medidas de controle, enfatizando-se a necessidade da compreensão
das características epidemiológicas e dinâmicas de transmissão (Marques e
Gutierrez, 1994).
1.6 Sistema Duffy e Malária
Haldane, em 1949, foi o primeiro a propor a hipótese pela qual indivíduos com
distúrbios eritrocitários podiam proteger-se contra infecções fatais de malária,
sobretudo as causadas pelo Plasmodium falciparum. Miller e cols. (1975), tentaram
relacionar essa resistência a anticorpos eritrocitários, observando in vitro que
eritrócitos Duffy negativos eram refratários à invasão do Plasmodium vivax,
enquanto que todas as outras hemácias eram suscetíveis, qualquer que fosse o grupo
sangüíneo. A freqüência do fenótipo Fy(a- b-) entre os negros coincidia com
resistência ao P. vivax, sugerindo que o genótipo FY/FY poderia ser o fator de
resistência. Miller e cols. (1976), estudando a infecção pelo P. vivax, em voluntários
Introdução
9
humanos, observaram que os indivíduos Duffy negativos eram resistentes, enquanto
que os Duffy positivos eram suscetíveis, concluindo que o genótipo FY/FY era o
fator de resistência.
Malária é uma doença causada pelo parasita Plasmodium, que após a infecção
propaga-se através do sangue de seus hospedeiros vertebrados. Discute-se a
resistência adaptativa a infecções de malária em humanos como sendo conferida por
vários polimorfismos de grupos sangüíneos. Uma associação bem documentada entre
um traço genético benigno em humanos e redução da prevalência da malária envolve
o grupo sangüíneo Duffy e antígenos de Plasmodium vivax (Mourant e cols., 1976;
Livingstone 1984). A gp Duffy é um receptor tanto para quimiocinas quanto para
merozoítos de P. vivax. O P. vivax é responsável pela malária terçã benigna, uma
forma de malária menos severa do que a infecção resultante da forma de P.
falciparum.
É também conhecida a relação entre o antígeno Duffy e o P. knowlesi, parasita
em símios, e P. vivax, sendo identificados os respectivos ligantes de adesão ao
antígeno Duffy (Pogo e Chaudhuri,1995; Horuk e cols.,1996).
A interação entre os merozoítos de P. vivax com a glicoproteína Duffy dos
eritrócitos humanos é realizada através do Duffy Antigen Receptor for Chemokines
(DARC). Esta interação é essencial para a invasão, confirmando assim, que os
parasitas possuem proteínas de ligação que são específicas para receptores de seu
hospedeiro. No parasita, esta ligação é realizada pela proteína de ligação do P. vivax,
o ligante Duffy-binding protein (DBP), identificado por Wertheimer & Barnewell
(1989).
Conseqüentemente, os determinantes Fya, Fyb, ou os dois, são necessários para
a invasão dos eritrócitos, in vivo, pelos merozoítos do P. vivax. Isto explica a alta
incidência de indivíduos Fy(a- b-) nas populações da África Ocidental e Etiópia,
justamente devido a resistência à infecção que este fenótipo proporciona à invasão do
P. vivax, levando à ausência ou baixa endemicidade de malária vivax nestas
populações (Hadley e Peiper, 1997).
Evidentemente, a presença da gp-Duffy em células vermelhas não se torna
essencial para uma existência saudável. A mutação no promotor GATA eritrocitário,
que impede a transcrição de Duffy nos eritrócitos é considerada como uma vantagem
seletiva em áreas endêmicas para malária.
Justificativa 10
2. JUSTIFICATIVA
A alta prevalência de alelos mutantes de um número de proteínas eritrocitárias
ou de outros tecidos, em determinadas regiões globais, tem oferecido indícios de que
estes alelos podem ter sido selecionados por seus efeitos protetores contra doenças
infecciosas. Devido à elevada freqüência destes alelos em áreas endêmicas de
malária, tem sido proposto que certos polimorfismos aumentam a proteção contra
esta doença (Allison, 1969; Pereira-Silva e Engracia, 2002, para revisão).
A genética de resistência/suscetibilidade a infecção por Plasmodium falciparum
tem sido estudada por vários grupos através de estudos de associação (ver Feitosa e
cols., 2002, para revisão). Em certas regiões da África, acima de 70 % dos casos de
malária grave estão associados com morte em 15 a 30% dos casos, dependendo da
rapidez e qualidade do tratamento (Dessein e cols., 2001). Flatz e cols. (1964)
sugeriram que indivíduos resistentes à malária vivax, quando infectados pelo P.
falciparum, tendem a desenvolver uma malária mais severa do que indivíduos não
resistentes, o que implica numa prévia adaptação do sistema imunológico destes
indivíduos Duffy não nulo à infecção pelo P. falciparum.
O Estado de Rondônia é ainda considerado como região endêmica para
malária pela FUNASA (Fundação Nacional de Saúde). A detecção de indivíduos que
apresentam infecção assintomática em regiões de alta endemicidade para malária,
como os bairros de Candelária e Bate-Estaca, de Porto Velho, RO, dá indícios de um
possível papel de DARC nesta resposta adaptativa humana. Este fato leva-nos a
propor a investigação das interações entre o Plasmodium e o sistema sangüíneo
Duffy, na manifestação dos fenótipos de Malária observados em Rondônia.
Objetivos 11
3. OBJETIVOS
Nossos objetivos são dirigidos a determinar as variáveis demográficas e
genéticas que podem estar associadas tanto à infecção como ao desenvolvimento da
Malária. Assim, propusemos-nos determinar:
1. As freqüências gênicas do Sistema Duffy em amostras dos bairros Candelária
e Bate-Estaca, de Porto Velho-RO;
2. A distribuição de mutações Fy Nulo no GATA Box e a mutação FY*BG298A
nos indivíduos destas frações amostrais;
Também associar:
3. Os genótipos investigados com morbidade à malária;
4. Os genótipos investigados com outros fatores genéticos e ambientais, como
sexo, idade e etnia;
E investigar:
5. O papel de DARC na observação de fenótipo infecção assintomática tanto em
malária vivax como falciparum.
Materiais e Métodos 12
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Caracterização da População
Porto Velho, capital de Rondônia, com uma área de 58.310 Km2, localiza-se
a 63°54’14’’ de longitude oeste e 08°45’43’’ de latitude sul (Apêndice I). Sua
estimativa populacional é de 334.000 habitantes (Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística – IBGE, Senso 2000).
A amostra refere-se a indivíduos residentes no município de Porto Velho,
Estado de Rondônia, moradores das vilas de Candelária e Bate-Estaca (Apêndice II).
Localizadas a 8º47’08’’ de latitude sul e 63º55’04’’ de longitude oeste as vilas de
Candelária e Bate-Estaca encontram-se geograficamente situadas em um dos bairros
da capital de Rondônia, o bairro Triângulo, um dos mais antigos de Porto Velho.
4.1.1 Candelária:
Candelária possui uma população que apresenta baixos índices de migração,
encontrando-se entre as primeiras localidades a serem habitadas por imigrantes na
região do município de Porto Velho no início do século XX.
Vila Candelária, apesar de está localizada em região periurbana, possui
características ribeirinhas, como baixa migração e presença de população autóctone.
É considerada uma região de grande incidência para malária com IPA
correspondente a 349 casos por 1000 habitantes no ano 2002. Outra característica de
Candelária é a sua proximidade com o rio Madeira, fator este que influência no modo
de vida desta comunidade.
A amostra de Candelária constituiu-se de 32 grupos familiais, com alto grau
de parentesco entre elas. Foram analisados 225 indivíduos. A região de Candelária é
unida geograficamente à vila de Candelária, Bate-Estaca possui uma população com
características bem diferentes.
Materiais e Métodos 13
4.1.2 Bate-Estaca:
A vila Bate-Estaca formou-se recentemente, à cerca de duas décadas, após o
surgimento do cemitério de Santo Antônio, o que influenciou grandemente no fluxo
migracional desta população, apresentando assim índices migracionais mais elevados
do que a vila de Candelária. Semelhantemente a Candelária, Bate-Estaca possui
características ribeirinhas e encontra-se próximo à cachoeira do Teotônio o que
incentiva os hábitos de população rural como a pescaria e pequenos cultivos. Esta
localidade, conta ainda, com um igarapé, o Bate-Estaca. Este se distancia cerca de
trezentos metros da região de estudo, que também apresenta áreas inundáveis durante
o período de chuvas, fato devido à construção da Estrada de Ferro Madeira-Mamoré
(EFMM), que ocasiona o represamento de águas pluviais e fluviais às margens do rio
Madeira.
Bate-Estaca constituiu-se de 15 grupos familiais, diferentemente de
Candelária, sua população não é constituída por grandes grupos de famílias e na sua
maioria apresentam-se como famílias isoladas e que permanecem por 2 ou 3 anos
nessa região. Foram analisadas 73 amostras.
4.2 Coleta da amostra e dados antropogenéticos
O projeto obedeceu às normas da resolução 196 da CONEP (aprovado com o
Registro CONEP de n 3349). Todas as amostras de sangue foram coletadas em
domicílio, após obtenção formal de consentimento por escrito (Apêndice III) e
esclarecimento sobre os objetivos da pesquisa. Também foram registrados dados
antropogenéticos e de saúde (Apêndice IV), além de dados demográficos e sócioeconômicos (Apêndice V).
A partir das amostras de sangue coletadas em tubos Vacutainer com EDTA
(cerca de 5 ml por indivíduo) foi extraído o DNA genômico. Os procedimentos de
separação e armazenamento de alíquotas das fases do sangue seguiram técnicas
rotineiras, sendo as alíquotas armazenadas em tampão de glicerol.
A coleta foi realizada por uma equipe composta por médicos e pesquisadores
do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical (CEPEM), ao longo de 18 meses, nos
Materiais e Métodos 14
quais foram realizados três cortes transversais para Candelária e dois cortes para
Bate-Estaca em diferentes datas, sendo: 1.º corte, abril de 2001; 2.º agosto de 2001; e
3.º corte março de 2002.
4.3 Acompanhamento Longitudinal de Malária
A malária na região das vilas de Candelária e Bate-Estaca foi acompanhada
longitudinalmente durante os 18 meses, que compreenderam os anos de 2001 e 2002,
pela equipe de pesquisa do CEPEM e com o apoio da equipe FUNASA que atua no
posto médico na vila de Candelária diariamente, com exceção de finais de semana,
possibilitando o registro dos casos de portadores sintomáticos de plasmódio vivax ou
falciparum dos indivíduos envolvidos na pesquisa por detecção de plasmódio através
do exame de lâminas.
A malária assintomática vivax e/ou falciparum foi detectada durante os três
cortes através da técnica de PCR, sendo a equipe do Laboratório de Imunologia do
CEPEM responsável pela pesquisa de portadores assintomáticos de plasmódio.
4.4 Métodos Laboratoriais
4.4.1 Extração de DNA
O DNA foi extraído, segundo protocolo descrito por Higuchi (1989), a partir
de 500 μl de sangue total, logo após a coleta, sendo em seguida armazenado a – 20°C
até o momento da análise (Apêndice VI). O sangue remanescente foi centrifugado e
armazenado, sendo a fase leucocitária (Buffer Coat) tratada com glicerol tamponado
(Citrato de potássio tribásico 0,1 M; fosfato de sódio monobásico dihidratado 0,345
M; fosfato de sódio bibásico anidro 0,0344 M; glicerol 60 % e água destilada 40 %) e
armazenada – 20°C, para futuras análises.
Materiais e Métodos 15
4.4.2 Amplificação do DNA por PCR
As reações de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) foram desenvolvidas
nos termocicladores Progene, modelo Techne, e Eppendorf, modelo Mastercycler,
onde a mistura de reação passou por 3 ciclos de temperaturas: uma temperatura de
desnaturação, entre 92-94ºC, e uma temperatura de Annealing (TA), para hibridação
que variou de acordo com os oligonucleotídeos iniciadores (ver tabela 04) de 58 a
60°C, e uma temperatura de extensão ou elongamento, na qual a síntese de DNA foi
realizada, e que em geral é fixada em 72ºC.
Tabela 04.
Primers
FY1*
FY2**
FY3*
FY4**
Seqüência de primers para amplificação de Duffy
Seqüência
AggCTTgTgCAggCAgTg
ggCATAgggATAAgggACT
CCCTCTTgTgTCCCTCCCTTT
CAgAgCTgCgAgTgCTACCTA
TA
58°C
58°C
66°C
62°C
Região Alvo
Promotor
Promotor
Seq. codante
Seq. codante
Referência
Tournamille e cols., 1995
Tournamille e cols., 1995
Parasol e cols., 1998
Parasol e cols., 1998
* Primer Sense
** Primer Anti-Sense
4.4.2.1 Polimorfismo de FY*A e FY*B
A identificação dos alelos FY*A e FY*B foi realizada através da técnica de
PCR (foto 01) que amplifica um fragmento de 661 pares de bases (pb) que possui o
sítio de polimorfismo de Duffy e os possíveis sítios mutacionais G298A e C265T na
seqüência codante de Duffy que posteriormente são identificados com enzimas de
restrição.
A PCR foi padronizada para um volume de 40 µl por reação usando gDNA não
quantificado, 250 nM de cada primer, 200 µM da cada dNTP, 1.0 U de Taq
polimerase, cujo protocolo resume-se na tabela 05, e confirmada em agarose 1%.
Tabela 05.
Constituição da MIX de PCR identificação do polimorfismo de Duffy
e dos sítios mutacionais G298A e C265T.
Reagente
Conc. Inicial
Conc. Final**
FY 3
250 nM
25 M
FY 4
250 nM
25 M
Tampão de reação*
10 X
1X
dNTPs
2 mM
200 M
MgCl2*
50 mM
1,2 mM
Taq Polimerase
1U
5 U/ l
gDNA
Não quantificado
4 μl
H20
—
q.s.p. 40 l
* Tampão de reação: (200mM Tris-HCl pH 8.4; 500mM KCl); MgCl2 (50mM)
** As concentrações são dadas por reação.
Materiais e Métodos 16
Programa de PCR 1:
 94ºC por 4 minutos para desnaturação do DNA;
Seguido por 30 ciclos de amplificação
 94ºC, 1 minuto;
 60ºC, 1 minuto;
 72ºC, 1 minuto
E uma extensão final de
 72ºC por 10 minutos.
4.4.2.2 Genótipo nulo (FY-nulo)
A identificação do genótipo nulo de Duffy deu-se via PCR com amplificação
de um fragmento 221 pb da região promotora de Duffy (foto 02) que poderá ou não
conter o sítio mutacional T-33C, responsável pelo alelo nulo. Resumidamente, o
protocolo utilizado foi o seguinte:
Esta PCR foi padronizada para um volume de 25 µl por reação usando gDNA
não quantificado, 250 nM de cada primer, 200 µM da cada dNTP, 1.0 U de Taq
polimerase (tabela 06), e confirmada em agarose 1%.
Tabela 06.
Constituição da MIX de PCR para identificação do alelo nulo de Duffy na
região promotora de Duffy.
Reagente
FY 1
FY 2
Tampão de reação*
dNTPs
MgCl2*
Taq Polimerase
gDNA
H20
Conc. Inicial
16,39 M
16,37 M
10 X
2 mM
50 mM
5 U/ l
Não quantificado
q.s.p. 25 l
Conc. Final**
250 nM
250 nM
1X
200 M
1,2 mM
1U
4 μl
—
* Tampão de reação: (200mM Tris-HCl pH 8.4; 500mM KCl); MgCl2 (50mM)
** As concentrações são dadas por reação.
Materiais e Métodos 17
Programa de PCR 2:
 94ºC por 5 minutos para desnaturação do DNA;
Seguido por 30 ciclos de amplificação
 94ºC por 30 segundos;
 58ºC por 30 segundos;
 72ºC por 30 segundos;
E uma extensão final de
 72ºC por 5 minutos.
4.4.3 Análises de Polimorfismos através de RFLPs com produtos de PCR
Para a identificação de FY*A e FY*B, foram utilizados 10 µl de produto de
PCR (DNA amplificado pelos primers FY3 e FY4) e digerido com enzima de
restrição Ban I, foto 03.
A mutação em G298A em FY*B foi analisada com produto de PCR
amplificados com primers FY3 e FY4 e digerido com enzima de restrição Mwo I,
foto 04 (Parasol e cols., 1998).
Os fragmentos de restrição são analisados por eletroforese em gel de agarose
2% e tampão de eletroforese TBE 10x (Tris-HCl 0,89 M; Ácido Bórico 0,89 M e
EDTA 10mM). A corrida eletroforética ocorre com a aplicação de 10µl do produto
amplificado misturados a 3µl de tampão de corrida (Azul de Bromofenol 0,05%;
Glicerol 30%; TBE 10X). Os fragmentos são corados com brometo de etídio e
visualizados em luz UV. O limite de detecção é de cerca de 10 ng/bandas de ácido
nucléico. Após identificação, o gel é fotografado para registro dos resultados.
Tabela 07. Identificação
das principais variações encontradas no promotor GATA-1, e
na seqüência codante da proteína Duffy.
Variação
Identif. de FY*A e FY*B
GATA
Mutação FY*BG298A
* New England - Biolabs
Volume
10µl
10µl
10µl
Primers
FY3 e FY4
FY1 e FY2
FY3 e FY4
Enzima*
Eletroforese
Ban I Agarose 2%
Sty I
Acrilamida 10%
Mwo I Agarose 2%
Materiais e Métodos 18
A identificação da mutação GATA foi feita utilizando-se 10 l de produto de
PCR (DNA amplificado com primers FY1 e FY2) e o submetendo a digestão com
Sty I (Parasol e cols., 1998) overnight e eletroforese em gel de poliacrilamida 10%
(Poliacrilamida 30%; TBE 10X; Pessulfato de potássio 10%; TEMED), corados com
AgNO3 10% (nitrato de prata), foto 05.
4.5 Análises Estatísticas
As estimativas de freqüências gênicas e genotípicas e respectivos desviospadrão foram obtidos por verossimilhança máxima, através dos programas FREGEN,
da programoteca GENIOC (Cabello e Krieger, 1997) e do programa BioEstat 2.0. O
nível de significância adotado foi de 5%.
4.6 Análises de Freqüências Alélicas
As freqüências alélicas foram realizadas reunindo as populações de
Candelária e Bate-Estaca, sendo subdivididas em dois grupos de indivíduos com
parentesco e indivíduos sem parentesco.
4.7 Análises de Famílias
A família foi à unidade analisada no processamento dos dados que constaram
de:
 Família nuclear (pai e mãe) com ou sem filhos;
 Família não nuclear (somente pai ou somente mãe);
 Todos os filhos relatados por um dos membros da família e registrados pelo
entrevistador.
Materiais e Métodos 19
4.8 Padronização dos testes para Duffy
A análise genotípica do sistema Duffy foi inicialmente realizada com a
amplificação da região polimórfica na seqüência codante de GP Duffy para
identificação dos principais genótipos de Duffy, seguindo-se a identificação das
mutações G298A e da mutação do promotor GATA no alelo FY*B como mostrado
nas fotos abaixo.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
661 pb
Foto 01. Gel de agarose 1%. Confirmação da amplificação da PCR da seqüência da proteína
Duffy. Lane 1: Controle Branco de Reação; Lanes de 1 a 14 produtos de PCR. Marcador de Peso
Molecular de 100 pb.
M 1 2 3 4
5 6 7 8
221 pb
Foto 02. Gel de agarose 1%. Confirmação da amplificação da PCR da região promotora de
Duffy. Lane 1: Controle Branco de Reação; Lanes de 2 a 8 produtos de PCR. Marcador de
Peso Molecular de 50 pb.
Materiais e Métodos 20
M 1
2
3
4
5 6 7 8
565 pb
353 pb
212 pb
661 pb
Foto 03. Gel de agarose 2%. Produtos de PCR digeridos com Ban I para identificação do
polimorfismo do grupo sangüíneo Duffy. Lane 1: Produto de PCR não digerido; Lanes 2 e 4: FY*A/
FY*A; Lanes de 3, 5, 6 e 7: FY*A/ FY*B; Lane 8: FY*B/ FY*B. Marcador de Peso Molecular de 100
pb.
M
1
2
3
4
5
6
7
8
661 pb
518 pb
451 pb
Foto 04. Gel de agarose 2%. Produtos de PCR digeridos com Mwo I para identificação do alelo
FY*BG298A. Lane 1: Produto de PCR não digerido; Lanes 2 e 7: amostras homozigotas para o alelo
G298A
normal; Lane 8: amostra heterozigota para FY*B
. Marcador de Peso Molecular de 100 pb.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
221 pb
82 pb
77 pb
65 pb
62 pb
Foto 05. Gel de Poliacrilamida 10%. Produtos de PCR digeridos com Sty I para identificação da
mutação no promotor GATA. Lane 1: Produto de PCR não digerido; Lanes 2, 5, 6, 7 e 16: amostras
homozigotas para o alelo normal; Lane 3, 9, 10, 11, 12, 14 e 15: amostras –33/-33; Lanes 4, 8 e 13:
heterozigotos. Marcador de Peso Molecular de 100 pb.
Resultados 21
5. RESULTADOS
5.1 Freqüências Alélicas
As análises de freqüências alélicas foram realizadas com a população total de
Candelária e Bate-Estaca e com indivíduos que possuem parentesco e indivíduos sem
parentesco da mesma amostra.
Tabela 08. Distribuição de observados e esperados e freqüências alélicas do sistema Duffy na
população total de Candelária e Bate-Estaca.
Genótipo
FY*A/FY*A
FY*A/FY*B
FY*B/FY*B
FY*A/FY*BES
FY*B/FY*BES
FY*BES/FY*BES
FY*A/FY*BG298A
FY*B/FY*BG298A
FY*BES/FY*BG298A
Total
Obs
44
109
66
9
12
14
14
24
6
298
Esp
41,00
102,50
64,50
20,50
25,50
3,00
16,50
20,50
4,00
Freqüência Alélica
χ2
(p) G.L.
FY*A
0,37 0,019 32,055* 0,0000; 4
FY*B
0,47 0,020
FY*BES
0,09 0,009
FY*BG298A 0,07 0,011
298,00
* significante ao nível de 5%.
Figura 01. Porcentagem da distribuição dos genótipos de Duffy em Candelária.
Resultados 22
Figura 02. Porcentagem da distribuição dos genótipos de Duffy em Bate-Estaca.
Tabela 09. Distribuição de observados e esperados e freqüências alélicas do sistema Duffy de
indivíduos com e sem parentesco de Candelária e Bate-Estaca.
Genótipo
FY*A/FY*A
FY*A/FY*B
FY*B/FY*B
FY*A/FY*BES
FY*B/FY*BES
FY*BES/FY*BES
FY*A/FY*BG298A
FY*B/FY*BG298A
FY*BES/FY*BG298A
Total
Sem Parentesco Com Parentesco
Obs
Esp
Obs
Esp
17
14,50
27
26,50
38
39,30
71
63,00
30
26,80
36
38,00
2
6,20
7
14,50
3
8,50
9
17,00
5
0,70
9
2,00
6
5,80
8
10,50
8
7,90
16
12,50
2
1,30
4
3,00
111 111,00 187
187,00
† significante ao nível de 5%.
Alelo
FY*A
FY*B
FY*BES
FY*BG298A
χ2
(p) G.L
Freqüência e Desvio Padrão
Sem Parentesco Com Parentesco
0,36 0,030
0,37 0,025
0,49 0,032
0,45 0,026
0,08 0,014
0,10 0,013
0,07 0,018
0,08 0,014
15,546†
18,997†
0,0037; 4
0,0008; 4
Resultados 23
5.2 Sistema Duffy
Tabela 10. Distribuição dos genótipos de Duffy segundo etnia, idade e sexo na vila de Candelária e Bate-Estaca.
Genótipo
Cor Sexo 0 - 10 11 - 20 21 - 30 31 - 40 41 - 50 51 - 60 61 - 70 71 ou + Total
M
----1
1
1
----1
4
Branco
F
1
2
2
2
------1
8
M
3
2
4
3
1
--1
--14
FY*A/FY*A
Mulato
(N = 44)
F
6
4
2
1
--------13
M
1
1
1
--1
------4
Negro
F
1
--------------1
M
1
5
--1
3
1
----11
Branco
F
5
4
2
2
2
------15
M
9
12
7
4
4
------36
FY*A/FY*B
Mulato
(N = 109)
F
8
9
7
5
6
2
1
2
40
M
1
4
------------5
Negro
F
--1
--1
--------2
M
1
1
----3
----1
6
Branco
F
----2
2
3
------7
M
3
6
6
3
--1
--1
20
FY*B/FY*B
Mulato
(N = 66)
F
8
5
9
3
2
1
2
--30
M
------------------Negro
F
--1
--1
1
------3
M
------------------Branco
F
------------------ES
M
--2
------------2
FY*A/FY*B
Mulato
(N = 9)
F
2
1
2
------1
--6
M
------------------Negro
F
--1
------------1
M
------------------Branco
F
----1
----------1
ES
M
2
2
1
----------5
FY*B/FY*B
Mulato
(N = 12)
F
3
------1
----1
5
M
------------------Negro
F
1
--------------1
M
------------------Branco
F
------------------ES
ES
M
1
--1
--2
------4
FY*B /FY*B
Mulato
(N = 14)
F
1
1
3
----------5
M
--------2
----1
3
Negro
F
--1
--------1
--2
M
--1
--1
--------2
Branco
F
--1
--1
1
----1
4
M
----2
--2
------4
FY*A/FY*BG298A
Mulato
(N = 14)
F
2
--1
1
--------4
M
------------------Negro
F
------------------M
------1
1
------2
Branco
F
------1
------1
2
M
1
1
2
----1
----5
FY*B/FY*BG298A
Mulato
(N = 24)
F
2
2
1
----------5
M
1
1
--1
--------3
Negro
F
2
4
--1
--------7
M
----1
----------1
Branco
F
----1
----------1
M
--2
------------2
FY*B/FY*BES/G298A
Mulato
(N = 6)
F
1
----1
--------2
M
------------------Negro
F
------------------Total
67
77
59
37
36
6
6
10
298
Resultados 24
5.3 Infecção por Plasmodium
Tabela 11. Distribuição de genótipos Duffy entre indivíduos portadores sintomáticos e assintomáticos
de plasmódio, via PCR, em 18 meses de seguimento longitudinal (arquivo CEPEM-2003)
em Candelária e Bate-Estaca; controle de indivíduos sem infecção por malária.
Genótipos
FY*A/FY*A
FY*A/FY*B
FY*B/FY*B
FY*A/FY*BES
FY*B/FY*BES
FY*BES/FY*BES
FY*A/FY*BG298A
FY*B/FY*BG298A
FY*BES/FY*BG298A
Total
Assintomáticos
vivax falcipara mista
4
8
--13
21
4
6
10
6
--1
--4
--1
--3
--2
2
--1
5
----3
--27
57
10
Total
12
38
22
1
5
3
4
6
3
94
vivax
8
17
4
2
4
----3
1
39
Sintomáticos
falcipara
mista
3
2
10
13
3
8
1
1
--------1
--5
2
----23
26
Sem
Infecção
22
41
31
6
5
11
10
11
3
140
Total
13
40
15
4
4
--1
10
1
88
5.3.1 Associação de Infecção por Plasmódio e Genótipos Mutantes de Duffy
Tabela 12. Distribuição de indivíduos portadores de mutações (T-33C e G298A) e normais (FY*A e
FY*B) nos moradores de Candelária e Bate-Estaca portadores sintomáticos e
assintomáticos de plasmódio e sem infecção.
Infecção
Genótipo
Sintomáticos
Assintomáticos
Não
vivax falciparum vivax falciparum infecção
Total
Port. de Mutação
10
7
4
18
46
85
Normal
29
39
16
23
23
27
39
57
94
140
201
286
Total
2
4;
p
3,94*;
0,413
*NS
Tabela 13. Distribuição de indivíduos portadores da mutação G298A, mutação T-33C e normais (FY*A e FY*B)
nos moradores de Candelária e Bate-Estaca com ou sem infecção por malária vivax.
Infecção
Genótipo
Não mutantes
Mutantes G298A
Mutantes T-33C
Total
Infecção
Não Infecção
Total
52
7
7
66
94
24
22
140
146
31
29
206
2
2;
p
2,96; 0,227
Resultados 25
Tabela 14. Associação dos Genótipos de FY normais e mutantes com infecção por P. falciparum em
Candelária e Bate-Estaca.
Genótipo
FY*A/FY*A
FY*A/FY*B
FY*B/FY*B
Mutantes Heterozigotos
Mutantes Homozigotos
Total
Assintomáticos
8
21
10
12
6
57
Sintomáticos
3
10
3
7
0
23
2
Total
11
31
13
19
6
80
4;
p
3,43;
0,4885
Tabela 15. Mutação FY*BG298A entre os alelos FY*B em indivíduos brancos ou não brancos (mulatos e
negros) que apresentaram ou não infecção por malária no período de 18 meses de
seguimento longitudinal na amostra Candelária e Bate-Estaca.
Alelos
Número total de FY*B
Total de FY*BG298A
% mutantes entre FY*B
Branco
Infecção Não Infecção
40
33
04
07
10
21
Não Branco
Infecção Não Infecção
157
146
16
16
10
11
Tabela 16. Indivíduos que permaneceram assintomáticos para malária vivax e falciparum
durante os três cortes na amostra Candelária e Bate-Estaca.
Genótipos
FY*A/FY*A
FY*A/FY*B
FY*B/FY*B
FY*A/FY*BES
FY*B/FY*BES
FY*BESY*BES
FY*A/FY*BG298A
FY*B/FY*BG298A
FY*BES/FY*BG298A
Total
Vivax
1°, 2° e 3° 1° e 2°
------01
--01
------------01
----------01
02
Falcípara
1° e 2º
1° e 3º
01
----01
01
--------------01
--01
------04
01
Total
01
01
01
------02
01
--06
Resultados 26
5.3.2 Malária e Antropogenética em Candelária e Bate-Estaca
Tabela 17. Associação entre os genótipos de Duffy com grupo étnico (B= branco, M= mulato e N= negro) e
infecção por plasmódio assintomática e sintomáticos de Candelária e Bate-Estaca em 18 meses de
seguimento longitudinal; controle de indivíduos sem infecção por malária.
Genótipos e Etnia
FY*A/FY*A
FY*A/FY*B
FY*B/FY*B
FY*A/FY*BES
FY*B/FY*BES
FY*BES/FY*BES
FY*A/FY*BG298A
FY*B/FY*BG298A
FY*BES/FY*BG298A
Total
B
3
5
2
--------1
1
12
vivax
M
6
21
7
2
4
--2
1
--43
N
3
4
1
--1
----2
--11
falciparum
B
M
N
2
7
2
10
19
2
2
9
2
--2
----3
1
--2
1
1
2
--1
4
5
2
1
--18
49
13
B
--3
4
------------7
mista
M
2
13
10
1
------1
--27
N
--1
----------1
--2
Total
25
78
37
5
9
3
5
16
4
182
Sem Infecção
B
M
N
7
14
1
10
31
--5
25
1
1
4
1
--5
----7
4
4
6
--3
6
2
--3
--30
101
9
Total
22
41
31
6
5
11
10
11
3
140
Tabela 18. Genótipos de Duffy em indivíduos brancos ou não brancos (mulatos e negros) que
apresentaram ou não infecção por malária no período de 18 meses de seguimento
longitudinal na amostra Candelária e Bate-Estaca.
Genótipos
FY*A/FY*A
FY*A/FY*B
FY*B/FY*B
FY*A/FY*BES
FY*B/FY*BES
FY*BES/FY*BES
FY*A/FY*BG298A
FY*B/FY*BG298A
FY*BES/FY*BG298A
Total
Branco
Infecção Não Infecção
5
7
16
10
8
5
------1
--1
1
4
1
3
2
--33
31
Não Branco
Infecção Não Infecção
17
15
52
31
27
26
4
5
6
5
3
10
3
6
12
8
1
3
125
109
Total
44
109
66
9
12
14
14
24
06
298
5.4 Segregação do Sistema Duffy em Candelária e Bate-Estaca
Tabela 19. Distribuição de genótipos Duffy em famílias anucleares (somente pai ou somente mãe)
com filhos observados em Candelária e Bate-Estaca.
Pai
--------------FY*A/FY*B
FY*B/FY*B
Pais
Filhos
Total
Mães *A/*A *A/*B *B/*B *B/*BES *BES/*BES *A/*BG298A *B/*BG298A *B/*BES/G298A
Mãe
FY*A/FY*A
1
----1†
----------1
FY*A/FY*B
9
5
10
2
3
1
--1
--22
FY*B/FY*B
5
--3
4
2
----1
1†
11
FY*A/FY*BES
1
1
----2
--------3
FY*B/FY*BES
1
------2
--------2
FY*BES/FY*BES
2
1†
2†
--1
----2†
--6
FY*B/FY*BG298A
1
--1
--------2
--3
--3
1
1
3
----------5
--1
----1
----------1
Total
24
8
17
11
10
1
--6
1
54
† exclusão
Tabela 20. Tipos de Casamentos observados em famílias nucleares (pai e mãe) com ou sem filhos na Vila de Candelária e Bate-Estaca.
Pai
FY*A/FY*A
FY*A/FY*A
FY*A/FY*A
FY*A/FY*B
FY*A/FY*B
FY*A/FY*B
FY*A/FY*B
FY*A/FY*B
FY*A/FY*B
FY*B/FY*B
FY*B/FY*B
FY*B/FY*B
FY*B/FY*B
FY*BES/FY*BES
FY*BES/FY*BES
FY*BES/FY*BES
FY*BES/FY*BES
FY*BES/FY*BES
FY*A/FY*BG298A
FY*B/FY*BG298A
FY*B/FY*BG298A
FY*BES/FY*BG298A
Mãe
FY*A/FY*B
FY*B/FY*B
FY*A/FY*BES
FY*A/FY*A
FY*A/FY*B
FY*B/FY*B
FY*BES/FY*BES
FY*A/FY*BG298A
FY*B/FY*BG298A
FY*A/FY*A
FY*A/FY*B
FY*B/FY*B
FY*B/FY*BES
FY*A/FY*A
FY*A/FY*B
FY*A/FY*BG298A
FY*B/FY*BG298A
FY*BES/FY*BG298A
FY*B/FY*B
FY*A/FY*A
FY*B/FY*B
FY*A/FY*BES
† exclusão
Total de
Casais
4
3
1
2
6
3
1
1
1
2
3
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
40
Genótipos dos Filhos
*A/*A
*A/*B
*B/*B
*A/*BES
*BES/*BES
*A/*BG298A
*B/*BG298A
*B/*BES/298A
2
----2
3
----1
--1†
----------------1†
------10
5
4
2
2
7
6
------1
4
--------------1
1
----33
1†
----1†
1
--1†
------5
3
------2†
------------14
--------------------3†
----1
----------------4
--------------2†
------------------1
--------3
--------------------------------------2
----2
--------------1†
--------------1
------------2
--------------------------------2
----------2
Total de
Filhos
8
4
2
5
11
6
1
4
--2
12
3
--1
--3
2
1
2
3
----70
Discussão 28
6. DISCUSSÃO
6.1 Antropogenética
O fenótipo eritrocitário Fy(a- b-) é raro em populações caucasianas, porém é
o fenótipo predominante nas populações negras. Em contraste, a considerável
quantidade de informações disponíveis dos fenótipos Duffy eritrocitários em várias
populações (Mourant e cols., 1976; Roychoudhury e cols., 1988) é pouco conhecida,
bem como a distribuição populacional dos principais genótipos FY. Também faltam
informações na prevalência das mutações FY*BG298A e FY*BC265T em vários grupos
étnicos (Parasol e cols., 2001). Frente a estas considerações, a interação entre os
genótipos de Duffy e dados antropogenéticos, em nossa amostra, contribuiu com
informações adicionais sobre a freqüência e distribuição das mutações em FY e de
seus genótipos (tabela 10, e discussão a seguir).
6.1.1 Distribuição dos Genótipos Segundo a Faixa Etária
A amostra de Bate-Estaca apresentou uma proporção maior de crianças de (0
a 15 anos) que de jovens (16 a 30 anos) e adultos (acima de 31 anos) e Candelária
uma proporção um pouco maior de jovens do que de adultos e crianças, observados
na figura 03. A distribuição dos genótipos de Duffy, segundo a faixa etária, não foi
significante (
2
2
= 2,57; p= 0,2766). O genótipo FY*A/FY*B foi mais freqüente em
todas as classes de idade, seguido dos genótipos FY*B/Y*B e FY*A/FY*A,
respectivamente. Devido a menor proporção de indivíduos em idade adulta não se
pode relacionar os genótipos mutantes com a faixa etária.
Discussão 29
Figura 03. Proporção de Crianças e adolescentes (de 0 a 15 anos), jovens (de 16-30 anos) e
adultos (acima de 31 amos) nas amostras de Candelária e Bate-Estaca.
6.1.2 Distribuição alélica e genotípica segundo a Etnia
A maioria dos indivíduos de Candelária e Bate-Estaca pertence à categoria
étnica mulata, sendo seguidos por indivíduos brancos e negros, respectivamente.
O alelo FY*A é mais freqüente em populações de origem européia e em
asiáticos (Mallinson e cols., 1995; Moulds e cols., 1998; Pittoni, V e cols., 2002;
tabela 02), enquanto o alelo FY*B é mais freqüente em negros (Mourant e cols.,
1976). A freqüência do alelo FY*B em Candelária e Bate-Estaca foi maior em
indivíduos não brancos (mulatos e negros) que em indivíduos brancos, enquanto o
alelo FY*A distribuiu-se uniformemente entre as três etnias (tabela 10, sem
estatísticas).
Observamos maior freqüência do genótipo FY*A/FY*B entre indivíduos não
brancos.
Nenhum
indivíduo
declarado
branco
apresentou
o
genótipo
FY*BES/FY*BES, como descrito em outros estudos (Mourante e cols., 1976; Issitt,
198;Tabela 185).
Os alelos FY*BES e FY*BG298A foram mais freqüentes em indivíduos mulatos
que em indivíduos negros. Provavelmente devido aos casamentos interétnicos serem
bastante freqüentes nas populações brasileiras. Observou-se que dois indivíduos
declarados
brancos
eram
heterozigotos
para
estes
alelos,
podendo
ser
Discussão 30
FY*BES/FY*BG298A ou FY*B/FY*BES/G298A, o que nos leva a propor uma
classificação étnica baseada apenas em fatores genéticos (marcadores étnicos), e não
em observações visuais, como o que foi realizado.
Os fenótipos Duffy são considerados marcadores de determinação de padrões
de migração e mistura étnica (Parasol e cols., 2001). A população brasileira apresenta
um alto grau de miscigenação com a contribuição de portugueses, espanhóis,
holandeses, negros e índios, e posteriormente, italianos, alemães, etc. Rondônia, em
particular, apresenta um nível de miscigenação bem elevado se comparado com
outros estados brasileiros (Ferreira e cols., 2002). Vários processos migratórios
foram responsáveis pela mistura étnica observada neste estado (Ferreira, 1987;
Oliveira, 2000), fato este que explica o alto índice de miscigenação detectado em
nossos trabalhos.
6.2 Freqüências
Para a compreensão da distribuição dos fenótipos de malária em Rondônia
começamos um estudo das freqüências alélicas e genotípicas do sistema Duffy e suas
associações com malária, como descrito em Materiais e Métodos.
6.2.1 Freqüências Genotípicas e Alélicas
Uma visão geral da dinâmica dos genótipos de Duffy pode ser obtida nas
figuras 01 e 02. O genótipo mais freqüente desta distribuição total foi o FY*A/FY*B
com 39% em Candelária e 30% em Bate-Estaca (109/298 indivíduos).
Os resultados obtidos em nossa amostra seguem a mesma distribuição
observada por Nunes e Moura (1999) em amostras de Montenegro e Triunfo,
assentamentos agrícolas, e Portuchuelo, vilarejo ribeirinho, localidades próximas a
Porto Velho, assim como a de dados existentes na literatura, em diferentes populações
(Moulds e cols., 1998; ver tabela 02, Introdução; Tounamille e cols., 1998; Parasol e
cols., 2001)
Discussão 31
As análises de freqüência dos alelos e dos genótipos de FY em Candelária,
Bate-Estaca indicam que as distribuições genotípicas e alélicas não estão de acordo
com as condições de equilíbrio de Hardy-Weinberg, tanto para a população em geral,
envolvendo os grupos de famílias (
2
nas sub-amostras sem parentesco (
2
com parentesco (
2
4
4
4
= 32,05; p = 0,0000; N total; tabela 08), como
= 15,55; p = 0,0037; N = 111; tabela 09), e
= 18,99; p = 0,0008; N = 187; tabela 09). Nestas três
distribuições os desvios podem ser atribuídos à alta freqüência do genótipo
homozigoto que envolve o alelo mutante FY*BES. Esta distribuição não está de
acordo com o observado na literatura (Colauto e cols., 1981; Moulds e cols., 1998;
Shimizu e cols., 2000; Cavasini e cols., 2001; Parasol e cols., 2001, entre outros). A
subdivisão da amostra em indivíduos com e sem parentesco evitou que houvesse
sobreposição de genes, o que poderia explicar, se fosse o caso, a alta significância
dos desvios detectados. Isto fica evidente quando observamos os dados da tabela 09
(indivíduos sem parentesco): os alelos mais freqüentes do loco Duffy (FY*A e
FY*B) apresentaram freqüências alélicas iguais a 0,36 e 0,49, respectivamente. A
freqüência do alelo nulo FY*BES foi igual a 0,08, mais alta que a observada por
Parasol e cols. (2001) em judeus esquizofrênicos Ashkenazi (0,04; N = 59) e nãoAshkenazi (0,05; N = 50). Colauto e cols. (1981) observaram uma proporção de
10,27% (N = 94) (Humaitá, Estado do Amazonas, ver tabela 21) de indivíduos que
apresentaram o fenótipo Fy(a- b-), sendo sua população constituída por índios,
ribeirinhos e indivíduos de área urbana. Não podemos comparar, entretanto, nossos
resultados com estes de outra população Amazônica devido a ausência de detecção
molecular do alelo mutante nos trabalhos de Colauto e cols.
Tabela 21. Distribuição da população geral do Município de Humaitá, Estado do Amazonas, pelo
sistema Duffy de grupo sangüíneo (Colauto e cols., 1981).
Sistema Duffy
Grupos
Fy( a+ b-)
Fy(a- b+)
Fy(a+ b+)
Total
N.º
(%)
N.º
(%)
N.º
(%)
N.º
(%)
63 (69,23)
17 (18,68)
11 (12,09)
91 (100,00)
H.R.M.
21 (50,00)
18 (42,86)
3 ( 7,14)
42 (100,00)
I
10 (76,92)
2 (15,39)
1 ( 7,69)
13 (100,00)
U
Total
94 (64,38)
37 (25,35)
5 (20,00)
146 (100,00)
H.R.M. = habitantes do Rio Madeira; U = zona urbana (bairro da Olaria); índios da Tribo
Tenhairim, habitantes do Km 126 da rodovia Transamazônica; p < 0,05
Outro alelo mutante detectado por nós, com freqüência polimórfica (0,07), foi
o FY*BG298A. Entretanto não podemos comparar nossos dados com os da literatura
Discussão 32
porque são inexistentes. Os trabalhos de Parasol e cols. (1998 e 2001), que nos
serviram de referência para os estudos moleculares, não fizeram nenhum estudo de
distribuição de freqüência populacional.
A freqüência polimórfica dos alelos FY*BES e FY*BG298A pode ser devida a
um processo adaptativo desta população frente à Seleção, ou seja, à alta
endemicidade de Malária na região. Entretanto, não descartamos como sendo
também conseqüência de Efeito Fundador, desde que a região estudada é uma das
mais antigas de Rondônia e cuja história de povoamento revela a presença de
famílias pioneiras que se instalaram aqui por ocasião da construção da Ferrovia
Madeira-Mamoré (Ferreira, 1987). Segundo Ferreira (1987), os negros de Candelária
são oriundos de uma única família. A alta freqüência de heterozigotos, tanto para o
alelo FY*BES quanto para o alelo FY*BG298A (tabelas 08 e 09) também seja
conseqüência do efeito de dosagem gênica, fato este observado também por
Zimmerman e cols. (1999) em Papua, Nova Guiné.
6.3 Mutações
6.3.1 Alelo FY*BES
O alelo FY*BES, em homozigose, proporciona resistência total à malária
vivax, e parcial em heterozigose (Miller e cols., 1976; Mason e cols., 1977; Michon e
cols., 2001). A distribuição observada em Candelária foi de 6% de homozigotos para
este alelo, 3% de heterozigotos FY*A/FY*BES e 1% de heterozigotos FY*A/FY*BES
(figura 02). Em Bate-Estaca este alelo apresentou um padrão diferente daquele
observado em Candelária. O genótipo FY*B/FYBES foi encontrado em 14% dos
indivíduos da amostra, 4% de heterozigotos FY*A/FY*BES e 1% para o homozigoto
FY*BES/FY*BES (figura 03). As tabelas 08 e 09, já discutidas acima, confirmam a
possível influência da malária na adaptação deste alelo em Rondônia.
Discussão 33
6.3.2 Alelo FY*BG298A
Parasol e cols. (1998) descreveram a mutação G298A em Askenazi e nãoAshenazi, e em negros brasileiros, que apresentavam fenótipo Fy(a- b-). A análise
molecular revelou a presença simultânea das mutações G298A e C265T (não
investigada neste trabalho) na seqüência codante da proteína Duffy associadas ao
alelo FY*B, sendo estas mutações responsáveis pelo fenótipo Fy(a- b-) nestes
indivíduos.
A presença da mutação G298A foi observada tanto em Candelária, quanto em
Bate-Estaca (tabelas 08 e 09). Os genótipos FY*A/ FY*BG298A e FY*B/FY*BG298A
apresentaram-se em proporções idênticas de 5% (figura 02); este resultado não foi
observado em Bate-Estaca (figura 03) provavelmente devido ao menor número de
indivíduos dessa população. O heterozigoto FY*B/FY*BG298A foi encontrado em 16%
da amostra e o heterozigoto FY*A/FY*BG298A em 4%.
6.4 Duffy e Malária
A alta freqüência, em determinadas regiões do globo terrestre, de alelos
mutantes de proteínas eritrocitárias, estimulou estudos sobre a manutenção desses
alelos por vantagens seletivas. Um esboço da influência das doenças infecciosas na
constituição do genoma humano foi feito por Garrod, 1931 (em Pereira-Silva e
Engracia, 2002, para revisão), que sugeriu que as doenças infecciosas podem ter
exercido grande força seletiva no modelamento da individualidade bioquímica. Nos
últimos anos muitos dos trabalhos sobre a genética da suscetibilidade/resistência à
malária têm contribuído tanto para a compreensão da patogênese como para o
controle da doença. O polimorfismo do gene da cadeia
da Globina, mantido por
mecanismos de polimorfismo balanceado, foi o primeiro a ser correlacionado com
resistência a formas graves de malária falciparum (Allison, 1954). Hill e cols (1991),
analisando crianças do Oeste da África, mostraram que haplótipos do sistema de
antígenos leucocitários HLA da classe I e um da classe II, comuns nesta região da
Discussão 34
África, mas raros em outros grupos populacionais, estavam independentemente
associados com proteção contra a malária cerebral e anemia severa, respectivamente.
Através de análises de genótipos FY em várias populações podem se
estabelecer haplótipos FY para estudos de doenças complexas, como a malária, que é
uma importante força seletiva para adaptações sustentadas pela genética humana,
conhecida desde os primórdios da civilização humana.
Michon e cols. (2001) observaram uma significante redução na adesão ao
DBP (Duffy Binding Protein) aos eritrócitos FY*A/FY*Anulo dos indivíduos de
Papua, Nova Guiné. Este genótipo conferiu uma diminuição de 50% da expressão do
antígeno Duffy nos seus eritrócitos quando comparados aos indivíduos que são
Duffy-positivo. O mesmo foi observado em eritrócitos de heterozigotos
(FY*B/FY*Bnulo, FY*A/FY*Bnulo) em alguns grupos de doadores norte-americanos.
Estes resultados sustentaram as observações de Zimmerman e cols. (1999) sobre a
associação entre os heterozigotos FY*A/FY*Anulo e uma redução da infecção por P.
vivax.
A manifestação da Malária humana é devido à freqüência de exposição do
indivíduo ao Plasmodium. Porém há fatores adaptativos (inatos) que influenciam a
resposta imune, responsável pelos fenótipos Sintomático e Assintomático da malária,
como é o caso do Sistema Duffy : no caso do P. vivax, a ausência de isoantígenos do
sistema sangüíneo Duffy impede a penetração do merozoíto na hemácia, impedindo a
infecção, dando o caráter de loco de Resistência ao Sistema Duffy.
A malária é um fator seletivo que se faz presente desde a fundação de Porto
Velho, contribuindo para a fixação de genes de Resistência na população. A
miscigenação advinda de casamentos interétnicos e a presença de malária
provavelmente são as causas da alta freqüência observada de determinados alelos FY
nesta população.
6.4.1 Portadores de Infecção Assintomática
A infecção assintomática tem sido um fator de disseminação de malária em
regiões de alta endemicidade, caracterizando uma adaptação humana, ainda não
geneticamente identificada. Investigado desde longa data. Não tendo sido, entretanto,
Discussão 35
detectado, provavelmente devido à metodologia de detecção dos fenótipos de
malária, que, somente a partir de 1980 foi beneficiado por técnicas moleculares
(PCR), o fenótipo Assintomático foi pela primeira vez descrito nesta região por
Alves e cols., 2002 (localidades ribeirinhas endêmicas para malária do Estado de
Rondônia).
Semelhantemente ao observado em outras regiões do Estado de Rondônia, em
Candelária e Bate-Estaca também foi observado, via PCR, indivíduos portadores
assintomáticos de plasmódio (tabelas 11), pela equipe médica do CEPEM liderada
pelo Dr. Mauro S. Tada. Todas as nossas observações referem-se ao período de 18
meses de acompanhamento longitudinal.
A vila de Candelária apresentou 16% de assintomáticos vivax contra 55% de
não portadores de plasmódios. Em Bate-Estaca foram observados 14% de
assintomáticos para o mesmo plasmódio e 64% de não portadores. Quanto à infecção
assintomática por P. falciparum, foram observados em Candelária 27% de indivíduos
portadores e 50% de não portadores de plasmódio. Bate-Estaca apresentou 24% de
indivíduos portadores assintomáticos e 68% de não portadores de P. falciparum, ver
tabela 11.
Dentre os principais genótipos de Duffy associados aos fenótipos de Malária
observados (vivax, falciparum e mista), o genótipo FY*A/FY*B foi o mais freqüente
em Candelária e Bate-Estaca, seguindo-se dos genótipos FY*A/FY*A e
FY*B/FY*B, respectivamente (tabela 11). Dado já esperado, desde que o loco Duffy
é loco de Resistência.
Entre os indivíduos portadores assintomáticos de P. vivax em Candelária e
Bate-Estaca, apenas um possuía o genótipo FY*B/FY*BES. Este dado encontra-se de
acordo com os obtidos por Michon e cols. (2001), sobre a heterozigose de indivíduos
Duffy-negativos e malária vivax. Também foram observados dois indivíduos
FY*A/FY*BG298A e um com genótipo FY*B/FY*BG298A. Não foram observados
indivíduos homozigotos Duffy-negativos, o que corresponde aos dados descritos na
literatura.
Nos indivíduos portadores assintomáticos de P. falcifarum de Candelária e
Bate-Estaca observou-se: Candelária: três indivíduos com genótipo FY*BES/FY*BES
e nenhum heterozigoto para este alelo nulo de Duffy; Bate-Estaca: apesar de número
amostral pequeno, detectamos um indivíduo com genótipo FY*A/FY*BES e quatro
Discussão 36
com genótipo FY*B/FY*BES, mas nenhum indivíduo homozigoto para o alelo FY*B
nulo. O genótipo FY*A/FY*BG298A foi observado em dois indivíduos nas duas
amostras e o genótipo FY*B/FY*BG298A em 6 indivíduos (tabela 11).
Também foram observados portadores assintomáticos de plasmódio com
infecção mista, sendo os genótipos FY*A/FY*B e FY*B/FY*B os únicos
observados.
Ao longo dos três seguimentos longitudinais, apenas um indivíduo
permaneceu assintomático durante os três períodos de cortes, possuindo genótipo
FY*A/FY*BG298A. Quatro indivíduos permaneceram assintomáticos no 1° e 2°
cortes, e um no 1° e 3° corte (tabela 16).
A infecção assintomática detectada em Candelária e Bate-Estaca é um fator
que influencia diretamente o alto índice de malária da região. Os indivíduos
detectados como portadores servem como reservatórios para o parasita,
possibilitando a contínua transmissão de plasmódios nesta região. Entre estes
indivíduos não houve uma preferência entre os principais genótipos FY, desde que
estes são os de maior ocorrência na amostra.
6.4.2 Portadores de Infecção Sintomática
A malária vivax foi observada em 29% dos indivíduos na vila de Candelária e
22% na vila de Bate-Estaca. Nos casos de malária falciparum, foram registrados 23%
dos casos em Candelária e 8% em Bate-Estaca, tabela 11. Em Bate-Estaca, a
ocorrência de casos de malária vivax foi maior do que a de malária falciparum, o
mesmo não ocorrendo em Candelária, que apresentou proporções semelhantes entre
os dois tipos de infecção.
Semelhante à infecção assintomática, o genótipo FY*A/FY*B foi mais
freqüente entre os indivíduos com malária sintomática, sendo seguido por
FY*B/FY*B e FY*A/FY*A, respectivamente.
O alelo FY*BES não foi observado em homozigose entre os fenótipos de
malária sintomática. A presença de heterozigotos para este alelo foi maior, sendo que
quatro indivíduos apresentaram genótipo FY*A/FY*BES, e dois desses tinham
Discussão 37
malária vivax. O genótipo FY*B/FY*BES foi observado em quatro indivíduos com
malária vivax.
Quanto ao alelo FY*BG298A, foi observado apenas um indivíduo com genótipo
FY*A/FY*BG298A, sendo este relacionado com infecção sintomática por P.
falciparum. O genótipo FY*B/FY*BG298A foi observado em dez indivíduos, sendo
três com infecção por P. vivax, dois com infecção mista e cinco com infecção por P.
falciparum.
A heterozigose entre os alelos FY*BES e FY*BG298A (homozigose de
mutantes) foi observada em apenas um indivíduo com infecção sintomática vivax.
Não foi possível, dado o pequeno número da amostra, e ao pouco tempo de
seguimento longitudinal, determinar o papel fisiológico dessas mutações Duffy
(FY*BES e FY*BG298A) na infecção por P. vivax.
Não foi possível associar fenótipos de Infecção por P. falciparum com
genótipos de Duffy (tabela 14). Os dados da literatura são escassos, mas a reação
cruzada vivax-falciparum, estudada por Flatz e cols. (1964) é problema que ainda
merece investigação.
6.4.3 Malária, Duffy e Dados Antropogenéticos
Na associação entre malária, Duffy e dados antropogenéticos observou-se que
houve maior freqüência do genótipo FY*A/FY*B entre indivíduos não brancos
(mulatos e negros) com ou sem infecção por malária na amostra Candelária e BateEstaca (tabela 18).
Como já mencionado anteriormente, a alta freqüência de mulatos na amostra
deve-se ao alto grau de miscigenação, portanto, sendo os genótipos de FY excelentes
marcadores étnicos. Estes dados sugerem que na população em estudo os genótipos
FY estão amplamente distribuídos entre as três classes étnicas analisadas.
Discussão 38
6.5 Fenótipo Nulo
O mecanismo genético que condiciona o fenótipo nulo de Duffy tem sido
base de discussão desde vários anos (Miller e cols., 1976; Livingstone, 1984;
Chaudhuri e cols., 1993; Pereira da Silva e Engracia, 2002, para revisão). Mas
apenas em 1995 Mallinson e cols. iniciaram a descrição da base molecular de Duffy,
e do fenótipo Fy(a- b-). O grupo de Mallinson, através de reações imunológicas,
observou uma reduzida expressão de Fyb, chamado então de FYX, e sugeriram que o
antígeno FYX resulta da redução dos níveis de GP Fy(b+) na superfície celular
quando comparado ao nível normal de Fyb, e que este nível é afetado pelo gene de
expressão anormal.
Tournamille e cols. (1995) identificaram a mutação que interrompe a
transcrição do mRNA de Duffy, nos eritrócitos na seqüência motif do promotor
GATA-1. Primeiramente, esta mutação foi identificada como T-46C para o mRNA
de 338 resíduos de aminoácidos, e posteriormente, como T-33C, após a descoberta
do mRNA de 336 resíduos, sendo este o mais abundante dos mRNA de Duffy
(Hadley e Peiper, 1997; Pogo e Chaudhuri, 1997; Iwamoto e cols., 1996; Chaudhuri
e cols., 1993).
A identificação das mutações G298A e C265T feita por Parasol e cols. (1998)
em judeus e em negros brasileiros foi, posteriormente, associada ao alelo FYX por
Parasol e cols., (2001). Observa-se que a diminuição da expressão do antígeno Fyb
ocorre devido a presença da mutação C265T (Tournamille e cols., 1998;
Yazdanbakhsh e cols., 2000). A mutação G298A não foi observada em negros sulafricanos, sendo observada em negros brasileiros (Olsson e cols., 1998; Parasol e
cols., 1998).
Em nossa amostra a presença de um indivíduo homozigoto mutacional
FY*BES e FY*BG298A sintomático para P. vivax sugere que ao menos uma dessas
duas não está relacionada com o processo de infecção por Plasmódio.
Discussão 39
6.5.1 Seleção Positiva e Fixação do alelo Nulo de Duffy
Hamblim & Di Rienzo (2000) concentraram seus estudos numa população
sub-Saariana da África e europeus, em que o alelo nulo está virtualmente fixado,
analisando a variação existente ao redor da mutação na região promotora GATA.
Assumiu-se que a mutação FY*BES foi ela mesma o alvo da seleção, e não um gene
vizinho a ela. A variabilidade encontrada na população africana apresentou-se ao
redor de 50% mais diversificada do que a encontrada em europeus. A região Duffy
foi de duas a três vezes mais variável nos italianos que nos africanos. A população
africana desviou-se significantemente do esperado por ação neutra na fixação do
gene, não sendo identificados os fatores de fixação. Não fizemos uma análise
detalhada como a dos trabalhos citados. Entretanto, a porcentagem de mutantes em
indivíduos brancos não infectados foi expressivamente mais alta que em indivíduos
não brancos não infectados (21 e 11%, respectivamente, tabela 15). Este dado
contraditório possivelmente seja devido à má classificação étnica realizada, ou então
a mutação G298A é um marcador de resistência à malária em indivíduos brancos.
6.6 Análise de Segregação
A análise de segregação dos alelos de Duffy foi realizada em famílias
nucleares (pai e mãe com ou sem filhos) e anucleares (somente pai ou somente mãe).
Através desse tipo de análise observamos que a segregação dos alelos de Duffy
encontra-se em conformidade com as leis de Mendel. Detectamos ainda que os
genótipos de alguns filhos não estão de acordo com os dos pais, indicando exclusão
de paternidade e/ou maternidade, sendo alguns destes filhos já declarados pelos pais
como adotivos durante o processo de coleta de dados e entrevista (tabelas 19 e 20).
Conclusões 40
7. CONCLUSÕES
As distribuições genotípicas e alélicas não estão de acordo com as condições de
equilíbrio de Hardy-Weinberg.
A freqüência do alelo FY*B em Candelária e Bate-Estaca foi maior em
indivíduos não brancos (mulatos e negros) que em indivíduos brancos.
Os alelos FY*BES e FY*BG298A têm freqüência polimórfica, sendo estes mais
freqüentes em indivíduos mulatos que em indivíduos negros. A freqüência do
alelo FY*BG298A em indivíduos brancos não infectados foi expressivamente mais
alta que em não brancos.
Nenhum indivíduo declarado branco apresentou o genótipo FY*BES/FY*BES,
correspondendo aos dados descritos na literatura.
Indivíduos heterozigotos para o alelo FY*BES são suscetíveis à malária vivax e
falciparum.
O genótipo FY*A/FY*B foi o mais freqüente em todos os fenótipos de malária
analisados, e que a etnia negra, branca e indígena, características da região, estão
amplamente miscigenadas, proporcionando o elevado número de mestiços em
nossa amostra.
A segregação dos alelos Duffy aparentemente encontra-se em conformidade com
as leis de Mendel.
Não foi possível associar malária falciparum com genótipos Duffy. Mas, quanto
à influência de genótipos nulos de Duffy na manifestação da malária falciparum
(malária grave), a ausência deste fenótipo malárico pode ser devido à reação
cruzada, ou à facilidade e rapidez de diagnóstico e tratamento de casos de pessoas
portadoras, em estado febril, dentre elas, os infectados por Plasmodium.
Referências Bibliográficas 41
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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APÊNDICES
Apêndices 49
I – Localização do Estado de Rondônia
Apêndices 50
II – Localização das Vilas de Candelária e Bate-Estaca
Apêndices 51
III – Termo de Consentimento
GOVERNO DO ESTADO DE RONDÔNIA
SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE
CENTRO DE PESQUISA EM MEDICINA TROPICAL
CEPEM – BR 364 KM 4,5 78900-970
TERMO DE CONSENTIMENTO
Eu,________________________________________________ dou meu livre
consentimento para coleta de uma pequena quantidade do meu sangue (10 ml) que
serão utilizados na pesquisa "Caracterização de Populações Humanas em
Rondônia Através de Análises de Polimorfismos de DNA". Fui informado que se
trata de uma pesquisa que procura a presença de alterações em meu sangue, que
podem não apresentar sintomas. Disseram-me que corro pequeno risco, relativo a
coleta de sangue. Mas este sangue será coletado por pessoa experiente (médico ou
auxiliar de enfermagem) do serviço de saúde, sem que haja risco real.
Fui informado ainda de que não terei benefício direto se o estudo do meu
sangue for norma, porém se houver alteração serei informado em minha residência,
receberei orientações médicas e, se eu autorizar, novos exames poderão ser
realizados em mim e em meus familiares.
Porto Velho, _____ de _______________ de 2.0___.
Assinatura: ________________________________________________________________
ENTREVISTADOR: _______________________________________________________________
Apêndices 52
IV – Questionário de Dados Antropogenéticos e de Saúde
QUESTIONÁRIO
Família nº_________________
Endereço: CANDELÁRIA, RUA________________________.
DATA: _____/_____/_____
Nº FNS_______________
DATA TEMPO TEMPO ORIGEM
REGT.
NASC DE RO BAIRRO ÉTNICA PARENT CEPEM SEXO
PC1
PC1
PC1
PC1
PC1
PC1
PC1
PC1
PC1
PC1
NOME
HISTÓRICO DE ASCENDÊNCIA:
CONSTRUÇÃO:
PAREDE:
ALVENARIA ( )
MADEIRA ( )
CIMENTO ( )
PALHA ( )
PISO:
MADEIRA ( )
TETO:
TELHA DE BARRO ( ) AMIANTO ( )
TELA NAS JANELAS: SIM ( )
CERÂMICA ( )
BATIDO ( )
PALHA ( )
ZINCO ( )
NÃO ( )
NÚMERO DE CÔMODOS:_________________________
BANHEIRO: DENTRO ( )
TIPO DE TRATAMENTO:
FORA ( )
ESGOTO ENCANADA ( )
FOSSA SÉPTICA ( ) FOSSA NEGRA ( )
ÁGUA POTÁVEL: CAERD ( )
FOSSA ASSÉPTICA ( )
PERIDOMICILIO ( )
POÇO ( ) IGARAPÉ ( ) COMÉRCIAL ( )
TRATAMENTO: FILTRO ( ) FERVURA ( )
HIPOCLORITO ( ) SEM TRATAMENTO ( )
ÁGUA DE USO GERAL: CAERD ( ) POÇO ( ) IGARAPÉ ( )
ANIMAIS: SIM ( ) NÃO ( ) ESPÉCIE:_____________________ QUANT.: __________________
PERIDOMICÍLIO:
ÁREA:_______________________________
Nº DE EDÍCULAS:_____________________
POMAR:
SIM ( )
GALINHEIRO:
SIM ( )
HABITADA(S) POR____________PESSOAS
NÃO ( )
NÃO ( ) ENTULHOS:
SIM ( )
RECIPIENTES DE COLEÇÃO DE ÁGUA: SIM ( ) NÃO ( )
LIXO: NO TERRENO ( ) DE BAIXO DA CASA ( )
NÃO ( )
SUJA ( )
NÃO HÁ LIXO ( )
Apêndices 53
V – Questionário de Dados Demográficos e Sócio-econômicos
ENTREVISTADOR:__________________________________________________
Identificação do Indivíduo:
Data da coleta:
Local da coleta:
Data da chegada a Rondônia:
Data de chegada a Porto Velho:
Registro:
Sexo: M
F
Idade:
Etnia:
Nome:
Endereço:
Bairro:
Ponto de referência:
Telefone para contato:
Local de nascimento:
Ascendência:
Estado:
Materna:
Paterna:
Dados Sócio-Econômicos:
Ocupação principal:
Endocruzamento:
Filhos:
S
Tipo de Construção:
Renda Familiar: ≤ 200
N
Tabagismo: S
Grau de Instrução:
N
Média de cigarro dia:
Estado Civil:
≤ 500
≤1000
≥ 1001
Bebida: S N
Média de
álcool/dia:
Apêndices 54
VI – PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA – PROTEINASE K
I - Material e Equipamentos
Microcentrífuga
Micropipeta (c/ 1 ponteira/amostra)
Microtubos de polipropileno tipo "Eppendorf" de 1,5 ml
II - Reagentes e Soluções
TAMPÃO PARA LISE DE ERITRÓCITOS
Tris/HCl 0,5 M pH 7,6
Sacarose 0,32 M
MgCl2 1M
Triton X-100 1%
TAMPÃO PARA LISE DE LEUCÓCITOS
Tris/HCl 0,5 M pH 8,5
KCl 2M
MgCl2 0,5 mM
NP-40 0,45%
Tween 20 (ou 80) 0,45%
PROTEINASE K
10 mg/ml
III – Procedimentos
1. As amostras de sangue devem ser colhidas em tubos Vacutainer com EDTA
Volume de 3 a 5 ml (nunca menos do que 2 ml).
2. Proceder alternativamente de acordo com o tipo de amostra:
a) sangue total: colocar 500 l de sangue total em microtubo;
b) sangue total glicerolizado: transferir 50 l da papa de hemácias para
um microtubo de 1,5 ml;
c) Buffy Coat (BC): transferir 50 l de buffy coat para um microtubo de
1,5 ml;
d) Sangue total hemolisado: transferir 300
l para microtubo e
centrifugar. Separar o sobrenadante, se sobrar sedimento, proceder
Apêndices 55
com ele a partir do item 3; caso contrário, usar o sobrenadante a partir
do item 7.
3. Acrescentar 1 ml do tampão de lise de eritrócitos (lise 1).
4. Centrifugar a 6000G por 1 minuto e descartar o sobrenadante.
5. Os procedimentos 3 e 4 devem ser repetidos até que o precipitado fique
límpido, indicando ausência de contaminação com a hemoglobina.
Normalmente 3 vezes são suficientes.
6. Ressuspender o precipitado em 300
l de tampão de lise de leucócitos,
adicionar 5 l de Proteinase K(10 mg/ml) e deixar pelo menos 1 hora a 65ºC
e mais 3 horas a 37ºC (preferencialmente à noite).
7. Aquecer a 94ºC por 10 minutos para inativar a proteinase K, estocar a –20ºC.
Este DNA tem se demonstrado de ótima qualidade para PCR.
a) Acrescentar 75
l de NaCl 5,6 M autoclavado aos 300
l de tampão de
leucócitos;
b) Inverter cuidosamente várias vezes;
c) Centrifugar durante 5 minutos a 6000 rpm;
d) Transferir o sobrenadante para outro eppendorf de 1,5 ml;
e) Adicionar a este sobrenadante transferido 900
l de etanol 95% gelado (de
preferência a –20ºC);
f) Agitar cuidadosamente o tubo e deixar por no mínimo 2 horas em freezer a –
20ºC;
g) Centrifugar durante 5 minutos a 6000 rpm;
h) Descartar o sobrenadante, deixando aproximadamente 30
l no tubo e
cuidando para não ressuspender o pellet;
i) Adicionar 1ml de etanol 70% e inverter cuidadosamente;
j) Centrifugar durante 5 minutos a 6000 rpm;
k) Descartar o sobrenadante, deixando aproximadamente 30 l no tubo cuidando
para não ressuspender o pellet;
l) Secar a 37ºC na estufa a vácuo;
m) Ressuspender o pellet em 200 l de Tris-HCl pH 7,6 0,01 M;
n) Estocar a –20ºC até o momento do uso. Existe indicação, de que o DNA em
tampão, mantém-se por bastante tempo (1 ano ou mais) em geladeira; em
freezer, mantém-se por tempo indeterminado.
Apêndices 56