Pedro Augusto Carlos Magno Fernandes
Regulação da produção hormonal da glândula pineal
de ratos por moduladores do processo inflamatório.
São Paulo
2009
Pedro Augusto Carlos Magno Fernandes
Regulação da produção hormonal da glândula pineal
de ratos por moduladores do processo inflamatório.
Tese apresentada ao Instituto de
Biociências da Universidade de São
Paulo, para a obtenção de Título de
Doutor em Ciências, na Área de
Fisiologia Geral.
Orientador(a):
Regina
Pekelmann
Markus
Co-orientador(a):Valérie Simonneaux
São Paulo
2009
Ficha Catalográfica
Carlos
Magno
Fernandes,
Pedro
Augusto
Regulação da produção hormonal
da
glândula
pineal
de
ratos
por
moduladores do processo inflamatório.
142 páginas
Tese (Doutorado) - Instituto de
Biociências da Universidade de São
Paulo. Departamento de Fisiologia.
1. Melatonina 2. Eixo-imunepineal 3. Processo inflamatório
I. Universidade de São Paulo.
Instituto
de
Biociências.
Departamento de Fisiologia.
Comissão Julgadora:
________________________
Prof(a). Dr(a).
____________________________
Prof(a). Dr(a).
_________________________
Prof(a). Dr(a).
____________________________
Prof(a). Dr(a).
Prof(a). Dr(a).
Orientador(a)
Aos meus pais e amigos
"O tempo que passas a rir é tempo que passas com os Deuses."
Provérbio chinês
“Os pés eu deixo no chão porque a cabeça eu gosto que avoe!”
Alberto Magno Ghizzi
AGRADECIMENTOS
Esta é a parte mais difícil de materialização da presente tese. A
magnitude dos sentimentos associada ao limite de espaço disponível desafia
grandemente minha capacidade de síntese. Agradecendo, reverencio a
interligação existente entre mim, meu trabalho e todos aqueles que deram as
bases teóricas, emocionais e espirituais para o desenvolvimento da ciência e do
pesquisador humano por traz dos resultados aqui apresentados. Agradeço,
portanto, ao Deus que existente em cada um de vocês mesmo não possuindo
palavras satisfatórias para descrever a importância que cada um de vocês teve e
ainda tem em minha jornada.
Família: minha verdade! A formação intelectual/emocional humanista
que de vós recebi foi, é e sempre será fundamental para a expressão livre da
minha verdade pessoal. Às minhas avós Célia (meu amor póstumo ao meu avô
Augusto) e Cida (meu amor infantil e eterno ao meu avô Pedro), aos meus
progenitores unos Guga-Ignês/Ignês-Guga, a minha amada irmã Anita (valeu
pra você também Gordão), aos meus padrinhos Cristina e Zanzo (presentes de
Deus), a todos os meus tios e tias e a todos os meus queridos (únicos em beleza
e verdade) primos e primas o meu muito obrigado!
Amigos: minha força! Abençoado em família sou privilegiado também
por possuir amigos sinceros. Nasci com esta graça! Agradeço novamente a
pessoas como o Guigão, o Neto, o Alberto, a Carolina, a Ana Luiza, a Vitorinha,
o André, a Juju, o Gabriel, a Lívia, a Andréia, a Gabi e todos os meus primos e
parentes que amo incondicionalmente! Neste parágrafo agradecerei à minha
segunda família; aquela que escolhi e me escolheu. Agradeço então, de forma
especial: o Cadão, a Dani Simoni, o Lukito, o Pet, o Portuga, a Lelê, a Raposona,
o Danadas, a Fezinha, a Camila, a Batatinha, a Dridri, a Pow, o Savinho, o Didi,
a Catú, a Marcella, a Mayumi, a Marisa, a Gisele, a Carlota, o Gregory, o Ewout,
a Corina, a Kasia, o Jorge, a Domitille, a Orélie, a Aurore, o Léo, a Celina, a
Cíntchan, o Tchelão, o Harukão, o Brou, o mister Anderson (Nei), a Luisa (Lú),
o Pedro (diretor doidão), o Gui, todos os queridos amigos do grupo de teatro
Smart Spirit, todos os amados mestres do grupo Ibis e todos que fizeram e
fazem parte de minha vida.
Orientadores: minha expressão! Agradeço aqui aos amigos que
possibilitaram de maneira efetiva, empolgante e divertida a realização deste
trabalho. À Regina Pekelmann Markus, à Valérie Simonneaux, à Zulma Ferreira
e à Béatrice Bothorel, agradeço a orientação cuidadosa e gentil da minha
formação enquanto pesquisador e ser humano pensante. Aos meus queridos
companheiros de caminhada Erika, Eduardo, Débora, Daiane, Marco, Mara,
Sam, Alex, Renato, Kelly, Claudinha, Claúdia, Cecília, Camila Cris e todos os
outros que fazem e fizeram parte do laboratório de cronofarmacologia, deixo
aqui registrado todo meu amor e admiração. Agradeço também a amigável
acolhida de todos os integrantes do Laboratoire de Neurobiolgie des Rythmes do
Institut des Neurosciences Cellulaires et Intégratives da Université Louis Pasteur,
dentre eles, o senhor e a senhora Paul Pévet e Mireille Masson-Pévet e a
pesquisadora Sylvie Raison.
Agradeço, por fim, o fundamental apoio financeiro e científico da
FAPESP (04/10922-3), CAPES/COFECUB e CNPq.
ÍNDICE
I. INTRODUÇÃO______________________________________________________ 1
1.
Glândula Pineal _____________________________________________________ 1
1.1.
Controle da produção de melatonina pela pineal_______________________ 4
2.
Sistema oscilatório endógeno ________________________________________ 9
3.
Moduladores do processo inflamatório ______________________________13
4.
3.1.
Glicocorticóides e seus receptores _____________________________________ 16
3.2.
TNF e ativação da via NF-κB ___________________________________________ 19
3.3.
IFN-γ e ativação da via JAK-STAT _______________________________________ 21
Melatonina e sistema imune ________________________________________23
4.1.
Relação adrenal-pineal________________________________________________ 26
II. OBJETIVOS _______________________________________________________ 28
III. MATERIAL e MÉTODOS ___________________________________________ 29
1.
Animais ____________________________________________________________29
2.
Drogas e reagentes_________________________________________________29
3.
Preparo de drogas__________________________________________________31
4.
Cultura de glândulas pineais ________________________________________31
5.
Adrenalectomia ____________________________________________________32
6.
Microdiálise intrapineal _____________________________________________32
7.
Dosagem radioimunologica de corticosterona _______________________33
8.
Dosagem radioimunológica de melatonina __________________________34
9.
Extração protéica nuclear de glândula pineal de rato ________________34
10. Dosagem de proteína ______________________________________________35
11. Ensaio de eletromobilidade em Gel (EMSA) __________________________35
12. Extração de RNA ___________________________________________________36
13. RT-PCR _____________________________________________________________36
14. RT-PCR em tempo real ______________________________________________37
15. Ensaio de atividade enzimática da AA-NAT __________________________38
16. Ensaio de atividade enzimática da HIOMT ___________________________38
17. Ensaio de atividade enzimática da TPH ______________________________39
18. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) _____________________39
19. Análises estatísticas ________________________________________________40
IV. RESULTADOS ____________________________________________________ 41
1.
2.
3.
Efeitos da corticosterona sobre a síntese de NAS e melatonina________41
1.1.
Estudos in vitro _________________________________________________________ 41
1.2.
Estudos in vivo _________________________________________________________ 45
Mecanismos de ação da corticosterona _____________________________50
2.1.
inibição da captação extraneuronal de adrenalina ____________________ 50
2.2.
Participação de receptores intracelulares de glicocorticóides __________ 51
2.3.
Via de transcrição NF-κB _______________________________________________ 52
2.4.
Efeito sobre a produção do transcrito aa-nat ___________________________ 54
2.5.
Atividade enzimática __________________________________________________ 56
2.6.
Adrenalectomia _______________________________________________________ 58
Citocinas Pró-inflamatórias__________________________________________60
3.1.
IFN-γ___________________________________________________________________ 60
3.2.
TNF____________________________________________________________________ 62
3.2.1.
NAS e RNAm de AA-NAT, HIOMT e 14-3-3 _____________________________ 63
3.2.2.
Síntese protéica e produção do transcrito aa-nat ____________________ 65
V. DISCUSSÃO ______________________________________________________ 67
1.
Controle da via biossintética da melatonina pela corticosterona ______69
2.
Mecanismos Celulares e Moleculares dos Glicocorticóides ___________71
3.
Efeito de citocinas sobre a função pineal ____________________________73
4.
Pineal enquanto um sensor da resposta imune inata__________________76
5.
Eixo imune-pineal __________________________________________________77
VI. CONCLUSÕES ___________________________________________________ 82
VII. RESUMO________________________________________________________ 83
VIII. ABSTRACT______________________________________________________ 84
IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ___________________________________ 85
X. SÚMULA CURRICULAR ___________________________________________ 107
XI. TRABALHOS PUBLICADOS _______________________________________ 112
Lista de Abreviaturas
[Ca2+]
concentração de cálcio
5-HIAA
ácido 5-hidroxindolacético
5-HT
serotonina
5-HTP
5-hidroxitriptofano
AA-NAT
arilalquilamina N-acetiltransferase
AC
adenilil ciclase
ACTH
hormônio adrenocorticotrófico
ADX
adrenalectomia
ALLN
N-acetil-leucinil-leucinil-norleucinol-H
AMP
adenosina monofosfato
AMPc -
monofosfato cíclico de adenosina
ATP
adenosina trifosfato
BCG
Bacillus Calmett Guérin
CBP
CREB binding protein
CHX
cicloheximida
COMT
catecol-O-metiltransferase
CORT
corticosterona
COX
ciclooxigenase
CRE
elementos responsivos a AMPc
CREB
cyclic AMP response element binding
DBD
domínio de ligação ao DNA
DMH
núcleo dorsomedial do hipotálamo
EMSA
ensaio de eletromobilidade em Gel
epm
erro padrão da média
GABA
ácido γ-aminobutírico
GAS
IFN-γ-activated site
GCS
gânglio cervical superior
GMP
guanosina monofosfato
GR
receptores para glicocorticóides
GRE
regiões responsivas a glicocorticóides
Gs
proteína G estimulatória
HIOMT
hidroxi-indol-O-metiltransferase
HPA
eixo hipotálamo – hipófise – adrenal
HPLC
cromatografia líquida de alta eficiência
hsp
heat shock proteins
Iκ
κB
proteína inibitória κB
IFN-γγ
interferon γ
IKK
Iκ
κB quinase
IL-1β
β
Interleucina 1 β
IL-12
Interleucina 12
IL-18
Interleucina 18
IL-2
Interleucina 2
IL-6
Interleucina 6
IML
porção intermédio lateral da medula
iNOS
sintase do óxido nítrico induzível
IP3
diacilglicerol
JAK
Janus activated kinase
LBD
ligand binding domain
LH
hormônio luteinizante
LPS
lipopolissacarideo de bactérias Gram-negativas
MAO
monoaminoxidase
MR
receptores de mineralocorticóides
MT1
receptor de melatonina do subtipo 1
MT2
receptor de melatonina do subtipo 2
NA
noradrenalina
NAS
N-acetilserotonina
NF-κ
κB
fator nuclear Kappa B
NK
natural killer
nNOS
sintase do óxido nítrico neuronal
NO
óxido nítrico
NSQ
núcleos supraquiasmáticos
PDTC
pirrolidinaditiocarbamato
PKA II
proteína quinase dependente de AMP cíclico II
PKC
proteína quinase dependente de Ca2+
PLC
fosfolipase C
PNMT
fenil-etanolamina-N-metil transferase
PVN
núcleo paraventricular do hipotálamo
RHD
rel homology domain
RIP
receptor-interacting protein
RT-PCR
reação de polimerase em cadeia catalizada por trasncriptase
reversa
RU-486
mifepristone
SAM
S-adenosil-metionina
SODD
silencer of death domain
STAT
signal tranducer and activator of transcription
TGF-β
β
transforming growth factor-beta
Th-1
T helper
TNF
fator de necrose tumoral
TPH1
triptofano hidroxilase 1
TRADD
TNFR1-associated via death domain
TRAF2
TNF receptor-associated factor 2
TSH
hormônio estimulante da tireóide
U-STAT
unphosphorilated-STAT
VIP
peptídeo intestinal vasoativo
VP
vasopressina
ZT
zeitgeber time
Introdução
I. INTRODUÇÃO
1. Glândula Pineal
A glândula pineal foi batizada pelo médico e filósofo Cláudio Galeno
(131-200) em vista do seu formato de pineale que, em latim, quer dizer nó de
pinho. O debate da época girava em torno da estrutura que seria responsável
pelo fluxo da chamada “psico pneuma” entre os hemisférios cerebrais. Havia
uma disputa se esta seria a função da pineal ou de uma estrutura vermiforme,
como sugerido por Galeno. Já no século XVII o filósofo e matemático francês
René Descartes (1596-1650), em um de seus tratados, disse que “há uma
pequena glândula no cérebro, na qual a alma exerce suas funções mais
particularmente do que nas outras partes” (Descartes, 1973; p.238). Ele dizia que
esta glândula seria a pineal, que captaria o espírito do animal controlando
movimentos corporais, sensações, memória e imaginação. Apesar de Descartes
ter estudado as bases anatômicas da pineal, as proposições conceituais de
Galeno é que foram comprovadas ao longo dos anos.
Em humanos, esta glândula está localizada na parte rostro-dorsal da base
do cérebro na junção entre o encéfalo e o cerebelo. Ela é uma estrutura
epitalâmica derivada de células neuroectodérmicas e, a exemplo da retina,
desenvolve-se a partir de uma invaginação do teto da parede do terceiro
ventrículo (para revisão ver Duvernoy & Risold, 2007). Em roedores, está
dividida em uma porção superficial localizada entre os hemisférios cerebrais, e
outra profunda na base do cérebro, conectadas por um longo e fino pedúnculo
(Vollrath, 1981).
Em 1898, as observações pioneiras de Otto Heubner (pediatra alemão)
sobre a associação entre tumor pineal e puberdade precoce em três meninas,
levou
à
sugestão
de
que
esta
estrutura
produziria
um
hormônio
antigonadotrófico, colocando a glândula pineal como um elo no controle do
sistema reprodutor. Na década de cinquenta, pesquisadores estabeleceram a
ligação entre esta glândula e a reprodução ao estudarem os efeitos de extratos
da pineal sobre úteros de ratas (Kitay & Altschule, 1954). Na sequência, no final
1
Introdução
da década de cinquenta, Aaron Lerner isolou de pineais de bovinos um fator
capaz de agregar melanóforos, a melatonina (Lerner et al., 1958), sintetizada a
partir da serotonina (Lerner et al., 1959). Na década seguinte foi demonstrado o
ritmo diário da síntese de serotonina (Quay, 1963) e melatonina (Quay, 1964)
em pineais de ratos.
A variação do fotoperíodo ao longo das estações do ano influencia vários
aspectos da fisiologia interna e do comportamento reprodutivo de diversas
espécies. Os primeiros trabalhos que mostraram os efeitos diferenciais da pineal
sobre a capacidade reprodutiva de roedores usaram como modelo o hamster,
cujas alterações sazonais na reprodução eram bem descritas (Hoffman et al.,
1965). Quando estes animais são mantidos em fotoperíodo curto (ou cujos
globos oculares são removidos) apresentam redução testicular que é revertida
por pinealectomia (Hoffman & Reiter, 1965a). Este efeito não é observado em
animais mantidos em fotoperíodo longo (Hoffman & Reiter, 1965b). Estes
estudos foram pioneiros na demonstração da glândula pineal como
controladora de processos fisiológicos temporalmente regulados. Atualmente,
diversos trabalhos têm caracterizado esta glândula como um importante
transdutor neuroendócrino que recebe a informação luminosa captada pela
retina e integrada nos núcleos supraquiasmáticos (NSQ) e a retransmite para o
resto do organismo por meio do pico noturno de melatonina (para revisão ver
Simonneaux e Ribelayga, 2003).
Estudos sobre a estrutura celular e morfológica da pineal bem como de
seu desenvolvimento e diferenciação celular possibilitaram a caracterização de
diferentes fenótipos celulares na glândula pineal. Em mamíferos são descritos
cinco tipos básicos de células na pineal. O fenótipo celular mais abundante é o
pinealócito, célula produtora de hormônio, identificada pela presença das
enzimas da via biossintética da melatonina: arilalquilamina-N-acetiltransferase
(AA-NAT) e hidroxindol-O-metiltransferase (HIOMT) (Pfeffer et al., 1999;
Ribelayga et al., 1999). Os outros fenótipos celulares são: células intersticiais que
expressam marcadores gliais (Calvo et al., 1988), fagócitos perivasculares que
expressam proteínas de membrana características de macrófagos e microglia
2
Introdução
(Pedersen et al., 1993; Sato et al., 1996), neurônios clássicos e peptidérgicos (para
revisão ver Møller & Baeres, 2002).
As células pineais organizam-se em grupos que se comunicam
eletricamente (Schenda & Vollrath, 1998; Reuss, 1985). O padrão de
comunicação entre as células é alterado por noradrenalina, acetilcolina e
concentração de cálcio ([Ca2+]) extracelular (Schenda & Vollrath, 1999). Este
padrão de organização, semelhante ao que ocorre em músculo liso (para revisão
ver Brading, 2006), sugere que a informação neural chega a uma célula e é
transmitida para as demais. Uma heterogeneidade entre os pinealócitos
também foi constatada ao se estudar a função nitridérgica. Uma subpopulação
de células expressa constitutivamente a sintase de óxido nítrico neuronal
(nNOS, do inglês, neuronal nitric oxide synthase) e produz óxido nítrico (NO)
após estimulação de adrenoceptores (Spessert et al., 1998). Estas células estão
geralmente rodeadas de células nNOS negativas mas, que produzem guanosina
monofosfato (GMP) cíclico quando estimuladas por NO sugerindo que as
diferentes subpopulações celulares estejam trocando informações (Spessert et
al., 1998).
A principal inervação da glândula pineal é a simpática (Kapers, 1960),
que libera os mediadores clássicos desta via, noradrenalina (Klein, 1985) e
adenosina trifosfato (ATP) (Barbosa et al., 2000), e apresenta o peptídeo Y, já
caracterizado em outros terminais simpáticos (para revisão ver Simonneaux &
Ribelayga, 2003). Esta via será descrita em detalhes mais adiante, focalizando a
síntese de melatonina. A glândula pineal também recebe projeções colinérgicas
(Phansuwan-Pujito et al., 1999). Além disso, a glândula desnervada em cultura
produz acetilcolina (Wessler et al., 1997). A ativação de receptores colinérgicos
dos pinealócitos resulta na despolarização da membrana, aumento da [Ca2+]
intracelular e secreção de glutamato (Letz et al., 1997; Yamada et al., 1998). A
exemplo do que ocorre em outros sistemas (Reno et al., 2004), glutamato
promove a liberação de glutamato em células da pineal (Kim et al., 2008).
Interessante notar que este aminoácido provavelmente inibe a síntese de
melatonina induzida por noradrenalina (Kus et al., 1994).
3
Introdução
1.1.
CONTROLE DA PRODUÇÃO DE MELATONINA PELA PINEAL
A melatonina é sintetizada a partir do triptofano, proveniente da
circulação, que é inicialmente convertido a 5-hidroxitriptofano (5-HTP) sob a
ação da triptofano hidroxilase 1 (TPH 1) (Lovenberg et al., 1967). Está é a enzima
limitante da síntese de serotonina (5-HT), sendo sua atividade, em roedores,
aumentada duas vezes na fase de escuro (Sugden, 2003). O 5-HTP é
descarboxilado, através da enzima 5-HTP descarboxilase, dando origem à
serotonina (Snyder & Axelrod, 1964), que é substrato de diferentes rotas
metabólicas. A serotonina pode ser acetilada pela ação da enzima AA-NAT
originando a N-acetilserotonina (NAS) (Axelrod & Weissbach, 1960; Voisin et
al., 1984), que é metilada pela HIOMT formando a melatonina (Axelrod &
Weissbach, 1960). A segunda via metabólica, considerada uma via de
catabolismo,
promove
a
deaminação
oxidativa
da
serotonina
pela
monoaminoxidase (MAO) forma o ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) (para
revisão ver Simmoneuax & Ribelayga, 2003).
O neurônio simpático que inerva a glândula pineal (Kapers, 1960) libera
noradrenalina (NA) (Klein, 1985) que interage com receptores adrenérgicos α1 e
β1 localizados nos pinealócitos. A liberação noturna de NA é 100 vezes maior
que a diurna (Drijfhout et al., 1996) e o ritmo diário dos adrenoceptores β1 faz
com que a maior densidade seja encontrada na transição claro/escuro (Romero
& Axelrod, 1974; Panger et al., 1990). Estes receptores estão acoplados à proteína
G estimulatória (Gs) e sua ativação induz a síntese de adenosina monofosfato
(AMP) cíclico (Strada et al., 1972) induzindo um aumento de sua concentração
de até 10x em relação ao basal (Vanecek et al., 1985). A estimulação simultânea
de receptores adrenérgicos α1 e β1 promove um aumento adicional deste
segundo mensageiro, devido ao cross-talk entre as vias inositol trifosfato (IP3) e
AMP cíclico, visto que a atividade da adenilil ciclase (AC) é potenciada ao ser
fosforilada por proteína quinase dependente de Ca2+ (PKC) (Tzavara et al.,
1996). Em condições de higidez apenas os adrenoceptores β1 são ativados, visto
4
Introdução
que o bloqueio dos adrenoceptores α1 não reduz a produção de melatonina
(Tobin et al., 2002). Já em condições de resposta à injúria, quando o eixo
hipotálamo – hipófise – adrenal (HPA) é ativado, há um aumento da
quantidade de noradrenalina disponível na fenda sináptica (Sabban et al., 2004;
Serova et al., 2008), o que poderia resultar na ativação dos dois subtipos de
receptores. Os nervos conários, quando estimulados, também liberam ATP
(Barbosa et al., 2000) que, ativando receptores purinérgicos P2Y1, levam à
ativação da via dependente de IP3 (Ferreira et al., 2003). Estes experimentos
foram todos feitos in vitro e ainda não há confirmação da relevância destes
receptores na atividade regular de glândulas pineais in vivo.
O aumento de AMP cíclico após estimulação β1-adrenérgica ativa a
proteína quinase dependente de AMP cíclico II (PKA II) (Klein et al., 1970). A
fosforilação do fator de transcrição CREB (do inglês, cyclic AMP response element
binding) facilita a sua ligação a elementos responsivos ao AMP cíclico (CRE)
presentes nos promotores das enzimas TPH 1 (Besançon et al., 1996 e 1997) e
AA-NAT (Baler et al., 1997; Burke et al., 1999) aumentando a formação dos
respectivos transcritos (Klein et al., 1997). A fosforilação das enzimas TPH 1
(Gastel et al., 1998) e AA-NAT (Ganguly et al., 2002) aumenta a atividade das
mesmas. Portanto, AMP cíclico atua sobre a via biossintética da melatonina
induzindo a transcrição dos genes e as atividades das enzimas TPH 1 e AANAT. A fosforilação da AA-NAT impede sua degradação por proteassomas
levando a um acúmulo citoplasmático desta enzima (Coon et al., 2002). É
preciso ressaltar que o aumento sobre TPH 1 é muito menor que o observado
para a AA-NAT, que é praticamente indetectável na fase de claro.
O papel da AA-NAT como enzima chave na síntese e liberação de
melatonina é conhecido desde a década de oitenta (Klein, 1985). De fato, em
todas as espécies estudadas até o momento, a atividade da AA-NAT é baixa
durante o dia e bastante elevada na fase de escuro, independente do animal ser
de hábito diurno (Reiter et al., 1984) ou noturno (Klein & Weller, 1970). O
equilíbrio dinâmico do conteúdo da enzima AA-NAT é determinado pelo
controle da síntese do RNAm e da degradação da proteína por dois
5
Introdução
mecanismos moleculares, dependentes de AMP cíclico e ativação de PKA II.
Como mencionado anteriormente, um mecanismo envolve o controle do
conteúdo de RNAm da AA-NAT por meio da regulação da sua transcrição
(Klein et al., 1997) e/ou da degradação da mensagem (Guillaumond et al., 2000)
e o outro mecanismo envolve a inibição da proteólise desta enzima (Ganguly et
al., 2001).
Em algumas espécies a alteração na transcrição do gene da AA-NAT
ocorre em base circadiana. Em roedores, onde este mecanismo é mais evidente,
a diferença no conteúdo de RNAm da AA-NAT entre o dia e a noite chega a ser
superior a 100 vezes (Borjigin et al., 1995; Coon et al., 1995). Como foi visto, o
CREB fosforilado liga-se ao seu elemento responsivo, localizado na região
promotora e no primeiro íntron do gene da AA-NAT, ativando a sua
transcrição (Coon et al., 2001). O aumento do conteúdo de RNAm da AA-NAT é
seguido pelo aumento nos níveis protéicos e de atividade da enzima (Klein et
al., 1997). Recentemente, foi demonstrado que a fosforilação do resíduo 31
(treonina) é uma etapa fundamental para o aumento da atividade da enzima
AA-NAT, pois permite a sua ligação com a proteína 14-3-3 formando um
complexo proteína/proteína estável que expõem o sítio de ligação da enzima ao
seu substrato (Coon et al., 2001; Ganguly et al., 2001, Klein et al 2002). A
fosforilação da enzima AA-NAT e sua formação de complexo com a 14-3-3 são
os mecanismos que a protegem contra a degradação por proteossomas
citosólicos (Gastel et al., 1998; Ganguly et al., 2002). Detalhes sobre a via
biossintética da melatonina na figura 1.
A análise molecular da ativação noturna da AA-NAT tem sido realizada
em ratos (Borjigin et al., 1995; Roseboon & Klein, 1995; Roseboon et al., 1996;
Baler et al., 1997; Gastel et al., 1998; Ganguly et al., 2001) e em outros roedores de
hábito noturno, como hamster (Gauer et al., 1999) e camundongos (Foulkes et
al., 1986; Roseboom et al., 1998). Em todos os roedores estudados foi observado
um controle na transcrição do gene da AA-NAT. Por outro lado, a regulação
desta enzima em ungulados e primatas é diferente. Em ovelhas (Coon et al.,
1995), bovinos (Craft et al., 1999) e primatas (Klein et al., 1997) não há variação
6
Introdução
diária da quantidade de RNAm, mas sim do conteúdo da proteína. Neste caso
está em operação apenas o segundo mecanismo regulatório dependente de
AMP cíclico, ou seja, a inibição da proteólise de AA-NAT (Gastel et al., 1998). O
aumento noturno dos níveis protéicos e da atividade da AA-NAT depende de
mecanismos regulatórios pós-transducionais. Assim, em bovinos e humanos a
proteína da AA-NAT é sintetizada continuamente a partir do RNAm e
destruída por proteólise proteassomal durante o dia. Durante a noite, a
produção de AMP cíclico induzida por noradrenalina protege a AA-NAT de
proteólise e permite seu acúmulo citoplasmático, ativação e consequente síntese
de melatonina (Schomerus et al., 2000).
Considerando estas diferenças na regulação da AA-NAT, foi sugerido
que a síntese de melatonina poderia ser controlada de maneira diferente em
roedores de hábito noturno ou diurno. Simonneaux e colaboradores testaram
esta hipótese analisando as bases genéticas da ativação da AA-NAT e a síntese
de melatonina na glândula pineal do roedor de hábito diurno Arvicanthis
ansorgei. Esta é uma espécie de roedor africano que apresenta atividade diurna
também nas condições controladas de laboratório. O gene da AA-NAT nesta
espécie mostrou 86% de homologia ao gene clonado do rato Wistar (Rattus
novergicus), animal de hábito noturno. O perfil diário do RNAm da AA-NAT, a
regulação noradrenérgica da atividade da enzima e a síntese de melatonina
foram similares em ambas as espécies de roedores (Garidou et al., 2002). Em
outras palavras, os autores mostraram que a estimulação com agonista de
adrenoceptor β durante a fase de claro leva a um aumento da produção de
melatonina e esta é bloqueada com a administração noturna de propranolol
(antagonista β). Além disso, a capacidade da melatonina de atuar sobre o
relógio é semelhante nos dois modelos. Em animais mantidos em escuro
constante (livre-curso), a infusão diária de melatonina arrasta, por exemplo, o
ritmo circadiano de atividade locomotora (Slotten et al., 2002). Portanto, tanto os
roedores de hábito noturno quanto os de hábito diurno têm mecanismos
semelhantes de produção do hormônio que marca a noite, e este atua sobre o
relógio da mesma forma.
7
Introdução
Figura 1. Controle noradrenérgico da produção de melatonina pela glândula pineal
de ratos. A liberação noturna de NA pelas fibras simpáticas provenientes do gânglio
cervical superior ativa receptores adrenérgicos dos subtipos α1 e β. Os receptores βadrenérgicos são receptores de sete domínios transmembrânicos acoplados à proteína
Gs que, quando ativados, induzem a conversão de ATP em AMP cíclico (AMPc) pela
adenilil ciclase (AC). Os receptores do subtipo α1–adrenérgico também são de sete
domínios transmembrânicos, mas acoplados à proteína Gq que ativa a fosfolipase C
(PLC) induzindo a produção de inositol trifosfato (IP3) que, por sua vez, induz o
aumento intracelular de cálcio levando a ativação da PKC. A PKC aumenta a produção
de AMP cíclico modulando positivamente a AC. O aumento de AMP cíclico ativa PKA
que fosforila o fator de transcrição CREB. Este fator vai ao núcleo e ativa a transcrição
do RNA mensageiro da enzima AA-NAT. Uma vez transcrita e traduzida a AA-NAT
pode ser degradada por ação proteassomal ou então fosforilada pela PKA. Quando
fosforilada ela se liga à proteína 14-3-3 que a protege da degradação e altera sua
conformação expondo seu sítio ativo. Uma vez ativada, AA-NAT converte a 5-HT
originada do metabolismo do aminoácido triptofano em NAS que, pela ação da enzima
HIOMT, forma melatonina. Tanto melatonina quanto NAS são liberadas na corrente
sanguínea.
8
Introdução
2. Sistema oscilatório endógeno
A
glândula
pineal
e
seu
principal
hormônio,
a
melatonina,
desempenham um papel chave na sincronização de ritmos endógenos do
organismo ao ciclo claro-escuro ambiental. A síntese de melatonina é
sincronizada pela luz, sendo que este hormônio age tanto sobre o relógio
biológico - NSQ - quanto sobre diferentes elementos do sistema biológico, tendo
assim uma ação pleiotrópica. A seguir será apresentado como o sistema
oscilatório endógeno de mamíferos controla a produção de melatonina pela
glândula pineal e a produção de glicocorticóides pelas adrenais, por serem os
hormônios relevantes para esta tese.
Os seres vivos, na sua forma mais simples, como os seres unicelulares,
até sua forma mais complexa, como os vertebrados, são estruturados no tempo
e no espaço. A maioria dos parâmetros bioquímicos, fisiológicos e
comportamentais dos organismos apresenta flutuações diárias que persistem
sob condições constantes, indicando a incorporação de osciladores endógenos
aos sistemas responsivos às variações cíclicas ambientais. A principal função
resultante desta característica é a organização do decurso temporal das funções
biológicas de modo a antecipar as mudanças cíclicas ambientais de acordo com
o hábito de vida do indivíduo (Menaker et al., 1997).
A endogenicidade dos ritmos biológicos é conhecida há muito tempo.
Jean Lacques de Mairan, em 1729, constatou que o movimento diário de
abertura e fechamento dos folíolos de uma planta da família da Mimosa é
mantido mesmo em um ambiente desprovido de variação circadiana de claro e
escuro. Contudo, os ritmos endógenos são ajustáveis aos ritmos externos por
meio do processo de arrastamento que consiste, resumidamente, na
modificação do período e da fase de um oscilador circadiano por ritmos
ambientais. Aschoff em 1960 foi quem primeiro cunhou o termo zeitgeber
(doador de tempo, em alemão) para os ciclos ambientais capazes de promover
este arrastamento, sendo o ciclo claro/escuro ambiental o principal zeitgeber dos
mamíferos (para revisão ver Menaker et al., 1997).
9
Introdução
No centro dos sistemas que controlam e regulam os ritmos endógenos
dos vertebrados estão três tipos de estruturas funcionais que se interconectam
em um sistema oscilatório central. A primeira capta a informação do oscilador
externo (zeitgeber) e a transmite para um controlador central (relógio biológico
central) que ajusta a sua ritmicidade intrínseca ao meio ambiente e regula o
funcionamento das estruturas responsáveis pela propagação da informação
para o resto do organismo. No caso dos mamíferos, células ganglionares
especializadas da retina captam as informações fóticas ambientais por meio do
pigmento fotorreceptor melanopsina (Provencio et al., 2000) e as transmite via
trato retino-hipotalâmico para os NSQ (Hattar et al., 2002). Os NSQ, por meio de
projeções neuronais específicas (que serão mais bem abordadas adiante)
modulam a ritmicidade dos osciladores periféricos, dentre eles, a glândula
pineal.
Como comentado, os NSQ constituem uma das estruturas anatômicas
mais importantes na geração e manutenção de ritmos circadianos em
mamíferos. A lesão dos NSQ resulta na perda de vários ritmos circadianos em
diferentes funções ou vias metabólicas como, por exemplo, locomoção, ingestão
de líquidos (Schwartz et al., 1980), produção de corticosterona pela adrenal de
ratos (Moore & Eichler, 1972) e produção de melatonina pela glândula pineal
(Moore & Klein, 1974).
Como podemos observar na figura 2, os diversos ritmos endógenos
controlados pelos NSQ apresentam períodos e fases próprias em relação ao
zeitgeber ambiental. Estas diferenças podem ser parcialmente explicadas pelo
fato dos NSQ emitirem projeções para diferentes regiões do sistema nervoso
central. As projeções que aferentam neurônios endócrinos, neurônios préautonômicos e interneurônios são bem descritas (para revisão ver Kalsbeek et
al., 2006). Além disso, trabalhos que avaliaram a eletrofisiologia e a biologia
molecular revelam a existência de subpopulações neuronais nos NSQ (La
Iglesia et al., 1999) que se projetam para regiões diferentes e produzem
neurotransmissores específicos e com acrofases próprias (Saeb-Parsy & Dyball,
2003). Pelo menos quatro subdivisões dos NSQ são conhecidas em relação às
10
Introdução
suas diferentes acrofases. A primeira subpopulação neuronal apresenta acrofase
em ZT 2 (zeitgeber time, ZT 0 é definido como sendo o começo da fase de luz),
produz vasopressina (VP) e ácido γ-aminobutírico (GABA) e inibe a produção
de glicose hepática e corticosterona. A segunda possui acrofase em ZT 6
(acredita-se que de 50 a 60 % dos neurônios dos NSQ façam parte deste grupo),
produz GABA e inibe o pico noturno de melatonina. Há ainda mais duas
populações de neurônios com acrofases em ZT 10 e ZT 18 cujos
neurotransmissores não são conhecidos. A primeira (ZT 10) modula a produção
de corticosterona ativando o eixo HPA e a segunda (ZT 18) o pico noturno de
melatonina (para revisão ver Kalsbeek et al., 2006).
Os NSQ controlam as poduções de melatonina e corticosterona a partir
de vias que apresentam congruências e diferenças anatômicas. Com relação à
síntese circadiana de melatonina os NSQ enviam projeções para o núcleo
paraventricular do hipotálamo (PVN, do inglês, paraventricular nucleus) que, por
sua vez, projeta-se para a porção intermédio lateral (IML) da medula espinhal.
A partir daí, via gânglio cervical superior (GCS), a informação é passada para a
glândula pineal induzindo a produção de melatonina. Já a produção rítmica de
corticosterona é estimulada pelos NSQ tanto por uma via neuroendócrina, que
passa pelo núcleo dorsomedial do hipotálamo (DMH, do inglês, dorsomedial
nucleus of hypothalamus) (Teclemariam-Mesbah et al., 1999; Buijs & Kalsbeek,
2001; Kalsbeek & Buijs, 2002), quanto por uma via autonômica composta pelo
PVN e pela porção IML da medula (Buijs et al., 1999; Ulrich-Lai et al., 2006).
Os neurônios projetados a partir dos NSQ para a divisão autonômica do
núcleo paraventricular são VIPérgicos (do inglês, vasoactive intestinal peptide),
vasopressinérgicos (Buijs et al., 1999) e GABAérgicos (Kalsbeek et al., 1993). A
estimulação de receptores GABAérgicos reduz o fluxo simpático na fase de
escuro e inibe o aumento noturno de melatonina. Confirmando esta observação,
o bloqueio GABAérgico do PVN ou a ablação dos NSQ elevam a concentração
do RNAm da AA-NAT na fase de escuro (Kalsbeek et al., 2000). Em resumo,
durante o claro, a ativação das fibras GABAérgicas provenientes dos NSQ inibe
11
Introdução
o tráfego simpático resultando no bloqueio da produção de melatonina (para
revisão ver Simonneaux & Ribelayga, 2003).
Corticosterona
TSH
3
(ng/mL)
(ng/mL)
120
80
40
0
0
6
12
18
2
1
0
24
0
6
LH
(ng/mL)
(ng/mL)
4
300
200
100
2
0
6
12
18
0
24
0
6
12
18
24
Melatonina
Leptina
100
(% do pico)
5
(ng/mL)
24
Prolactina
6
4
3
2
1
0
18
400
8
0
12
0
6
12
18
Zeitgeber (h)
24
80
60
40
20
0
0
6
12
18
24
Zeitgeber (h)
Figura 2. Ritmos hormonais de mamíferos de hábito noturno. Esquema baseado em
dados apresentados por Kalsbeek e col, (2006) mostrando os diferentes ritmos de
produção circadiana dos hormônios corticosterona, hormônio estimulante da tireóide
(TSH), hormônio luteinizante (LH), prolactina, leptina e melatonina. Nesta figura
podemos observar que, em animais de hábito noturno, o pico de corticosterona, LH,
prolactina e leptina ocorrem próximo à transição claro/escuro e o de melatonina está
todo localizado na fase de escuro. Por outro lado, também é exemplificado um
hormônio, TSH, que tem um ritmo ultradiano apresentando dois picos, um no meio da
fase de claro e outro no meio da fase de escuro.
Com relação à produção de corticosterona, o PVN é responsável pelo
controle da neuro e adeno-hipófise. As grandes células hipotalâmicas que se
localizam ao redor do terceiro ventrículo enviam axônios diretamente para a
hipófise posterior onde os terminais liberam ocitocina e vasopressina. Células
menores, da mesma área, aferentam os núcleos dorsomediais do hipotálamo e
secretam neurotransmissores específicos no sistema porta-hipofisário anterior
(para revisão ver Kalsbeek et al., 2006). Estes fatores induzem a secreção de
12
Introdução
hormônios da adeno-hipófise, entre eles o hormônio adrenocorticotrófico
(ACTH) responsável pela estimulação do córtex da adrenal. Além do controle
endócrino os NSQ também controlam a produção de corticosterona por via
neural. A projeção do PVN para a porção IML da medula não só alcança o
gânglio cervical superior, mas também chega ao córtex da adrenal (Buijs et al.,
1999), à glândula tireóide (Kalsbeek et al., 2000) e ao fígado (La Fleurs, 2000)
controlando por uma via neural direta, e não pela clássica via neuroendócrina, a
secreção de corticosterona.
Por fim, a administração de oligonucleotídeos antisenso para VIP nos
NSQ
bloqueia
temporariamente
o
ritmo
circadiano
da
secreção
de
corticosterona, mas não altera os picos de corticosterona relacionados com
estresse (Scarbrough et al., 1996). Um pulso de luz durante a fase de escuro
reduz os níveis plasmáticos de melatonina e de corticosterona em ratos, sem
modificar os níveis plasmáticos de ACTH. Já a ablação dos NSQ, que aumenta
per se os níveis de corticosterona (Buijs et al., 1993), impede que um pulso de luz
na fase de escuro leve a uma redução da corticosterona (Buijs et al., 1999). Se, no
mesmo intervalo de tempo, ao invés de ser apresentado ao animal um pico de
luz, este for colocado em um ambiente novo (forma de estresse) ocorre um
aumento de corticosterona e uma elevação do pico de ACTH. Assim sendo, os
NSQ utilizam uma via neural para enviar sua mensagem sobre a iluminação
ambiental não somente para a pineal, mas também para a adrenal através de
eferências do sistema nervoso autônomo simpático (Fig. 3).
3. Moduladores do processo inflamatório
Assim como a organização temporal dos organismos garante a
sobrevivência dos indivíduos em situações de higidez, durante o combate a
injúrias, diversos moduladores são produzidos de maneira temporalmente
padronizada, de modo a garantir que a montagem e a resolução do quadro
ocorram apropriadamente. A resposta imune inata é a primeira linha de defesa
do organismo contra agentes injuriantes. Seu objetivo é induzir a migração
13
Introdução
leucocitária ao tecido injuriado de forma a eliminar o agente agressor e, quando
necessário, recompor o tecido alterado.
melatonina
pineal
GCS
PVN
claro/escuro
NSQ
IML
CRH
retina
ACTH
Adrenal
Glicocorticóides
Figura 3. Controle da produção circadiana de melatonina e de corticosterona pelo
sistema oscilatório endógeno. Esquema baseado no apresentado por Schultz & Kay
(2003) sobre a produção de melatonina e corticosterona em roedores de hábito noturno.
A informação fótica ambiental captada pela retina chega aos núcleos
supraquiasmáticos (NSQ) pelo trato retino-hipotalâmico e é retransmitida para o
núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN). O PVN envia então aferências para a
coluna intermédio lateral que, via gânglio cervical posterior (GCS), induz a síntese
noturna de melatonina. O PVN controla a produção de corticosterona da adrenal por
uma via neuronal direta pela porção IML da medula ou então por uma via
neuroendócrina que resulta na produção e liberação sistêmica de ACTH pela hipófise.
Macrófagos residentes são as primeiras células a reagirem produzindo a
citocina pró-inflamatória TNF (do inglês, tumor necrosis factor; considerações
sobre a nomenclatura desta citocina serão descritas adiante) que recruta novas
células para o foco inflamatório. Do mesmo modo, as células NK (do inglês,
natural killer) são linfócitos que matam células infectadas e produzem interferon
gama (IFN-γ) que, por sua vez, ativam novos macrófagos (Medzhitov &
Janeway, 2000). Um exemplo disto é que macrófagos estimulados por IFN-γ
14
Introdução
produzem coestimuladores que aumentam a ativação de células T e a produção
de interleucina 12 (IL-12) e esta citocina induz a produção de mais IFN-γ por
este tipo celular (para revisão ver Abbas & Lichtman, 2005). As citocinas
produzidas nesta fase estimulam a natureza da resposta adaptativa
subsequente.
Durante quadros de infecções severas como observadas, por exemplo, na
sepsis, a produção excessiva de citocinas circulantes pode causar à morte do
hospedeiro (para revisão ver Hack et al., 1997) ficando claro que o controle
temporal e da magnitude de suas produções devam ser bem regulados. O
contraponto da resposta pró-inflamatória é dado pela ação de moduladores
anti-inflamatórios, como os glicocorticóides. Na verdade, a dinâmica de um
processo de defesa traz em seu cerne a ativação do eixo HPA. Citocinas como
TNF e IFN-γ são capazes de ativar este eixo (para revisão ver Turnbull & Rivier,
1999) integrando o mecanismo de autocontrole exercido pelos glicocorticóides
sobre o processo inflamatório. Em roedores inflamados com lipopolissacarídeo
de bactérias Gram-negativas (LPS) o pico de produção plasmática de TNF (Wu
et al., 2001; Carrillo-Vico et al., 2005) ocorre após duas horas e o de IFN-γ após
seis horas da administração do agente agressor (Carrillo-Vico et al., 2005). Já os
glicocorticóides atingem seu pico de concentração plasmática três horas após a
administração de LPS (Nadeau & Rivest, 2003).
Como será explicado adiante, os glicocorticóides atuam via receptores
citoplasmáticos para glicocorticóides (GR, do inglês, glucocorticoid receptor); a
citocina TNF pela via, dentre outras, do fator de transcrição nuclear κB (NF-κB,
do inglês, nuclear factor κB) e o IFN-γ principalmente pela via das STATs (do
inglês, signal tranducer and activator of transcription; para revisão ver Abbas &
Lichtman, 2005). Estas vias, centrais no controle de processos inflamatórios, são
capazes de se comunicar entre si, de forma que o cross-talk entre elas é mais um
mecanismo de regulação da resposte imune inata (para revisão ver De Bosscher
et al., 2003). Muitas outras vias e moduladores pró e anti-inflamatórios são
importantes no controle de respostas de defesa, contudo serão detalhados a
seguir os mecanismos de ação dos glicorticóides, TNF e IFN-γ e suas respectivas
15
Introdução
vias de sinalização por serem os agentes do processo inflamatório relevantes no
contexto desta tese.
3.1.
GLICOCORTICÓIDES E SEUS RECEPTORES
A produção hormonal de glicocorticóides pelas glândulas adrenais é
responsável pelo controle temporal e/ou pontual de processos fisiológicos em
situações de higidez ou patológicas. A produção circadiana deste hormônio via
controle neuronal direto, está associada com a transição da fase de repouso para
a de atividade de mamíferos. Esta regulação envolve, por exemplo, o
metabolismo de glicose/lipídios, a deposição de glicogênio no fígado e o
controle da pressão sanguínea (para revisão ver Buckingham, 2006). Por outro
lado, a via neuro-endócrina regula a produção de glicocorticóides em resposta a
diferentes formas de injúrias (inflamatórias ou não).
Os glicocorticóides atuam em diferentes etapas de um processo
inflamatório. Estes hormônios controlam, por exemplo, a resposta vascular e a
mobilização de células imunocompetentes para o foco inflamatório por regular
a produção de prostaglandinas, NO, neuropetídeos (Cato & Wade, 1996;
Reichardt & Schutz, 1998; Moynagh, 2003) e moléculas de adesão (Cavalcanti et
al., 2006). Os glicocorticóides inibem os efeitos de citocinas inflamatórias que
atuam, por exemplo, pelas vias de sinalização JAK (do inglês, Janus activated
kinase)-STAT (Rhen & Cidlowski, 2005) e NF-κB (Reichardt et al., 1998).
Os
glicocorticóides
intracelulares,
os
interagem
receptores
de
com
duas
classes
mineralocorticóides
de
(MR,
receptores
do
inglês,
mineralocorticoids receptors) e os GR (Krozowski & Funder, 1983). Estes ligantes
têm alta afinidade por MR (Reul & De Kloet, 1985), fazendo com que estes
receptores estejam ativados tonicamente. A ativação de GR é obtida por altas
concentrações de glicocorticóides que são atingidas a partir da estimulação do
HPA. A interação do hormônio adrenal com GR localizados no hipotálamo é
um dos passos da autorregulação do eixo HPA, visto que leva a uma
diminuição da síntese de ACTH e reduz o estímulo sobre a adrenal. O eixo
16
Introdução
HPA é ativado em situações de alerta e estresse. Estes receptores são
dessensibilizados por alta concentração de ligante, o que pode resultar num
aumento da concentração circulante de glicocorticóides (para revisão ver De
Kloet et al., 1998).
Os GR pertencem à super família dos receptores de hormônios
esteroidais e sua ligação ao hormônio correspondente facilita a transferência do
complexo para o núcleo (Kumar & Thompson, 2003). Na ausência do hormônio,
GR inativos encontram-se complexados com moléculas chaperonas (sendo as
mais importantes as heat shock proteins hsp90 e hsp70) e cochaperonas
(imunofilinas, hsp40, p60 e p23 dentre outras; Ditmar et al., 1997) que podem
modular positivamente ou negativamente a ação deste receptor (De Bosscher et
al., 2003). A ativação promove a hiperfosforilação, desligamento das proteínas
de choque térmico e uma mudança conformacional que favorece a localização
do complexo ligante/receptor no núcleo.
No
núcleo,
os
receptores
para
glicocorticóides,
na
forma
de
homodímeros, ligam-se com o auxílio de proteínas chaperonas (hsp90 e p23) à
regiões específicas de genes alvos (para revisão ver De Franco & Csermely,
2000). O GR é uma proteína modular composta por porções funcional e
estruturalmente especializadas. Estes receptores possuem um domínio de
ligação ao DNA (DBD, é responsável também pela sua dimerização), um
domínio que reconhece o ligante e outros dois (AF1 e 2) responsáveis pela
atividade transcricional (Schoneveld et al., 2004). O domínio DBD é composto
por dois dedos de zinco que se ligam cooperativamente em alvos específicos do
DNA, sendo outra função desta porção a discriminação entre diferentes
elementos responsivos e a determinação de qual gene específico será ativado
(Beato, 1989).
Genes regulados pelos GR possuem em seus promotores, regiões
responsivas a glicocorticóides que podem induzir tanto ativação (GRE) quanto
inibição (nGRE) da produção dos transcritos (Schoenmakers et al., 2000; De
Bosscher et al., 2003). Outra forma de inibição de expressão gênica é pela
17
Introdução
associação do GR com outros fatores nucleares de transcrição, como NF-κB,
STAT e CREB, entre outros (para revisão ver De Bosscher et al., 2003).
Com relação ao NF-κB muitos mecanismos moleculares foram propostos
para explicar o antagonismo mútuo existente entre este fator de transcrição e o
GR. Uma das primeiras hipóteses levantadas foi a de que os GR inibiam a ação
do fator de transcrição NF-κB por aumentar a síntese da enzima inibitória IκB
(do inglês, inhibitory κB protein), o que induz a retenção do NF-κB no citoplasma
(Scheinman et al., 1995). De fato, trabalhos demonstram que glicocorticóides
induzem em roedores a expressão de IκB e a conseqüente diminuição da ligação
do NF-κB aos promotores dos genes que produzem interleucina 2 (Auphan et
al., 1995), iNOS (De Vera et al., 1997) e IL-1β (Eberhardt et al., 2002). Contudo,
este mecanismo de ação requer melhor elucidação uma vez que nenhuma
região GRE clássica foi encontrada até agora na porção modulatória do
promotor do gene de IκB.
Atualmente, o modelo que explica o antagonismo mútuo existente entre
estes fatores de transcrição leva em consideração à interação proteína/proteína,
mediada ou não por cofatores, entre o GR e o NF-κB. A associação física entre
os fatores de transcrição GR e NF-κB foi demonstrada por diversos estudos in
vitro (Ray & Prefontaine, 1994; Scheinman et al., 1995) e in vivo (Adcock et al.,
1999). A maioria dos estudos baseia-se na determinação dos domínios dos
fatores de transcrição responsáveis por esta interação. A deleção do domínio
LBD (do inglês, ligand binding domain) dos receptores para glicocorticóides
diminui a transrepressão sobre o NF-κB (Oro et al., 1988) e a mutação do
domínio RHD (do inglês, rel homology domain) da subunidade p65 do NF-κB
inibe a repressão sobre a ativação gênica induzida por GR (Wissink et al., 1997).
O contexto do promotor e a presença de cofatores também estão envolvidos
neste processo. Foi demonstrado (Scheinman et al., 1995) que o CBP (do inglês,
CREB binding protein) é capaz de potenciar tanto a repressão do GR sobre o NFκB quanto a repressão do NF-κB sobre a transcrição induzida por GR
(Fig. 4).
18
Introdução
Além do NF-κB outros fatores de transcrição como o STAT e o AP-1
podem ser modulados pelos receptores para glicocorticóides. A inter-relação
existente entre o GR e o AP-1 é similar à encontrada entre o GR e NF-κB (para
revisão ver De Bosscher et al., 2003). Em contrapartida, o resultado do cross-talk
entre o GR e a via STAT depende do gene em questão e do tecido onde ele
ocorre. Um exemplo reside no fato de que, em alguns modelos, enquanto a
associação entre GR e STAT3 (ativada por IL-6) ativa promotores com
elementos responsivos a glicocorticóides a associação de GR com STAT5
(ativada por IL-2) reprime-os (para revisão ver Necela & Cidlowski, 2004). Esta
variabilidade no padrão de interação com outras vias de transcrição confere ao
processo especificidade tecidual sem que se perca a coordenação integrada da
fase anti-inflamatória de uma resposta inflamatória.
3.2.
TNF E ATIVAÇÃO DA VIA NF-κB
O TNF descrito na década de setenta (Carswell et al., 1975) era
anteriormente conhecido por TNF-α mas, a partir de consenso criado
recentemente, passou a ser denominado apenas TNF (Tracey, 2008). O TNF é
produzido por diversos tipos celulares como células NK, neutrófilos, células
endoteliais, células musculares lisas e cardíacas, fibroblastos e osteoclastos (para
revisão ver Bradley, 2008). Durante processos de defesa, a principal fonte de
TNF são os macrófagos e monócitos ativados (Tracey & Cerami, 1994) sendo
funções bem descritas, o recrutamento e a ativação de neutrófilos e monócitos
para o foco infeccioso (Tracey & Cerami, 1993). Ou seja, esta é uma citocina próinflamatória muito importante na montagem de uma resposta inflamatória.
O TNF pode ativar dois tipos de receptores descritos até o momento, o
TNFR1 e o TNFR2 (para revisão ver Ledgerwood, 1999) sendo a afinidade do
TNFR1 pelo TNF solúvel maior que a do TNFR2 (Grell et al., 1998). A partir da
ativação destes receptores o TNF pode sinalizar por diversas cascatas
intracelulares que culminam na ativação dos fatores de transcrição NF-κB, AP-1
e da caspase-8 (Wajant et al., 2003). No caso do NF-κB, a ligação do TNF ao
domínio extracelular do receptor TNFR permite a troca da proteína inibitória
19
Introdução
SODD (do inglês, silencer of death domain) pela proteína adaptodara TRADD (do
inglês,
TNFR1-Associated
via
Death
Domain)
no
domínio
intracelular
denominado death domain (Chen & Goeddel, 2002). A ativação da via NF-κB é
mediada pela interação da TRADD com as proteínas RIP (do inglês, receptorinteracting protein) ou TRAF2 (do inglês, TNF receptor-associated factor 2) que
ativam o complexo IKK (quinase de IκB) e, conseqüentemente, liberam o NF-κB
do citoplasma (Wajant et al., 2003).
O fator de transcrição NF-κB pertence à família dos fatores de transcrição
NF-κB/REL formada por cinco genes (NFKB1, NFKB2, RELA, c-REL e RELB)
que dão origem a sete proteínas - p100, p105, p50, p52, RELA (p65), RELB e cREL (para revisão ver Chen & Greene, 2004). Sua ação pleiotrópica e seu padrão
de expressão multimediado possibilitam às células a capacidade de responder
de forma precisa a diferentes estímulos e situações externas (Bonizzi & Karin,
2004).
O NF-κB apresenta-se como homo ou heterodímeros constituídos por
duas das subunidades acima mencionadas (Baeuerle & Baltimore, 1996;
Siebenlist, 1997) sendo a composição do dímero importante na regulação desta
via. Embora todas as subunidades possuam o domínio RHD reponsável pela
ligação ao DNA e a outros cofatores (Gosh et al., 1998) apenas as proteínas p65,
cREL e RELB possuem domínios de transativação (TAD, do inglês, transcription
activation domain) na sua porção carboxiterminal (para revisão ver Hayden &
Gosh, 2004). Portanto, apenas dímeros que contenham uma cópia destas
proteínas podem ativar diretamente a transcrição de genes. Por outro lado,
acredita-se que dímeros formados pelas subunidades p50 e/ou p52 sejam
repressores da atividade transcricional devido a ausência de domínios do tipo
TAD, como representado na figura 4 (para revisão ver Gosh & Hayden, 2008).
No entanto, se estes homodímeros estiverem associados à proteina BCL-3, que
possui domínio TAD e localiza-se no núcleo, é possível que esses passem a
apresentar atividades transcricionais positivas (Nolan et al., 1993).
O controle da ativação do fator de transcrição NF-κB, isto é, a sua
translocação para o núcleo, é feito através das proteínas IκB que se associam ao
20
Introdução
NF-κB no citoplasma e impedem a sua translocação para o núcleo (Baeuerle &
Baltimore, 1996; Baldwin, 1996). Quando receptores que atuam pela via NF-κB
são estimulados, ocorre a ativação do complexo de IκB quinase (IKK) que
fosforila IκB sinalizando para a sua ubiquitinação e posterior degradação pelo
proteassoma 26S (Palombella et al., 1994; Pickart, 1997). Uma vez desfeito o
complexo IκB/NF-κB, o dímero de NF-κB se acumula no núcleo onde poderá se
ligar a regiões responsivas presentes nos genes alvos (Gosh et al., 1998).
O NF-κB modula uma série de respostas e atividades fisiológicas nas
células dos eucariotos, sendo sua ação sobre processos inflamatórios e imunes,
apoptose, diferenciação celular e tumorigênese os mais bem estudados e
entendidos até agora. A ativação de NF-κB relacionada com a resposta
inflamatória leva à transcrição de moléculas de adesão, citocinas próinflamatórias, iNOS, COX-2, receptores de bradicinina do subtipo B1 e, numa
fase mais tardia, IκBα, o que resulta na autoinibição do sistema (Cabrini et al.,
2001; Medeiros et al., 2001; Gosh & Hayden, 2008).
3.3.
IFN-γ E ATIVAÇÃO DA VIA JAK-STAT
O IFN-γ é uma citocina solúvel conhecida como único membro da classe
tipo II e foi originalmente chamada de fator ativador de macrófagos (Gray &
Goeddel, 1982). Esta é uma citocina pró-inflamatória importante no controle de
respostas imunes inatas e adquiridas. No começo de um processo inflamatório,
células apresentadoras de antígeno produzem quimiocinas e citocinas como IL12 e IL-18 (Salazar-Mather et al., 2000) que atraem células do tipo NK para o
foco infeccioso e induzem a maturação de células T em células de fenótipo Th-1
(do inglês, T helper) produtoras de IFN-γ (Boehm et al., 1997). Macrófagos
também respondem ao IFN-γ e passam a produzir mais IL-12 e IL-18, que
amplificarão ainda mais a produção de IFN-γ pelas células NK e Th-1 (Yoshida
et al., 1994; Murphy et al., 1995). Este padrão de produção e ação do IFN-γ pode
ser considerado como um sinal de alerta que o sistema de defesa utiliza no
começo de uma resposta inflamatória (para revisão ver Schroder et al., 2004).
21
Introdução
Figura 4. Esquema do controle da expressão gênica por GR e NF-κ
κB. GR: receptor
para glicocorticóide; GC: glicocorticóide; GRE: elemento responsivo para
glicocorticóide; nGRE: elemento responsivo para glicocorticóide negativo; TNF: fator
de necrose tumoral; NFKB: elemento responsivo ao fator nuclear κB; IκB: proteína
inibitória de NF-κB; IKK: proteína quinase de IκB; CBP: proteína ligadora de CREB;
p65 e p50: subunidades do NF-κB.
O IFN-γ liga-se a receptores formados por duas subunidades, IFNR1 e
IFNR2 (para revisão ver Platanias, 2005), que interagem, cada uma, com um
membro da família das JAKs (para revisão ver Darnell et al., 1994; Ihle, 1995).
Ao serem ativadas, essas subunidades se autofosforilam e desencadeiam
respostas via cascata de sinalização JAK/STAT (Shuai et al., 1992; Silvennoinen
et al., 1993). JAKs ativadas fosforilam principalmente as STATs do tipo 1 (a três
também pode ser fosforilada em alguns modelos e tecidos) que formam
homodímeros, translocam para o núcleo, ligam-se a elementos GAS (do inglês,
IFN-γ-activated site) e induzem a expressão gênica (para revisão ver Darnell,
1997; Stark et al., 1998).
22
Introdução
No núcleo, a atividade dos dímeros de STAT pode ser modulada por
diferentes mecanismos como o grau de acetilação das histonas e a sua
associação a cofatores como p300 e CBP (Nusinzon & Horvath, 2003). Além
disso, a interação com outros fatores de transcrição como o NF-κB acrescentam
complexidade à sinalização da STAT induzida por IFN-γ. A ativação desta via
aumenta a degradação da proteína IκB e aumenta a translocação do NF-κB para
o núcleo (Held et al., 1999), ou ainda o priming de macrófagos por IFN-γ
aumenta a quantidade de dímeros p65/p50 em relação aos p50/p50 após
estimulação com LPS por um mecanismo ainda desconhecido (de Wit et al.,
1996). Por fim, o aumento citoplasmático de STAT não fosforilada (U-STAT, do
inglês, unphosphorilated-STAT) induzida por ativação da via JAK/STAT pode
promover o acúmulo nuclear de NF-κB, pois a U-STAT compete com a proteína
inibitória IκB (Yang et al., 2007).
4. Melatonina e sistema imune
O papel imunomodulatório da melatonina vem sendo descrito por
diferentes laboratórios ao longo das últimas duas décadas. Estes estudos
evidenciam a capacidade da melatonina em atuar tanto sobre a resposta imune
inata quanto sobre a resposta adquirida.
Camundongos inflamados cronicamente por injeção de BCG (Bacillus
Calmett Guérin) na pata perdem o ritmo diário da lesão granulomatosa após
pinealectomia, sendo este ritmo restabelecido com a administração noturna de
melatonina (Lopes et al., 1997). Neste trabalho, mostrou-se que o tamanho do
edema inflamatório era maior durante o dia do que durante a noite. O
mecanismo de ação da melatonina neste caso poderia ser explicado pela sua
capacidade de reduzir o aumento de permeabilidade vascular (Lopes et al.,
2001) induzido por moduladores inflamatórios como o leucotrieno B4, através
de uma ação sobre o endotélio (Lotufo et al., 2006), ou ainda inibindo a
produção de NO, levando a uma vasoconstrição (Tamura et al., 2006). Outros
resultados obtidos em roedores mostram que a inibição de síntese de
23
Introdução
melatonina inibe respostas imunes celulares e humorais em camundongos
(Maestroni et al., 1986) e que a melatonina também está implicada nas variações
sazonais observadas no sistema imune de hamsters (Nelson et al., 1995; Nelson
& Demas, 1997). Pode ainda ser mencionada a correlação entre a redução na
produção de melatonina pela pineal e o processo de involução tímica observada
no envelhecimento. O timo é o órgão onde o repertório de células T tolerantes a
antígenos próprios é gerado. Pinealectomia ou envelhecimento aceleram a
involução tímica, processo revertido em ambos os casos pela administração de
melatonina (Csaba & Richter, 1975; Oner et al., 2004).
Considerando as ações da melatonina sobre células do sistema imune, foi
demonstrado que melatonina aumenta a produção de IL-2, IL-6 e IFN-γ em
células mononucleares em cultura (Garcia-Maurino et al., 1997), induz a
produção de IL-12, aumenta a atividade de células do tipo NK e aumenta a
produção de IFN-γ por células do tipo Th-1 (Miller et al., 2006; Garcia-Maurino
et al., 1997). Cabe ainda ressaltar que células imunocompetentes além de terem
sua atividade modulada pela melatonina também são capazes de produzir este
hormônio localmente (Carrillo-Vicco et al., 2003; Pontes et al., 2006). Esta
produção é importante para o combate a agentes agressores uma vez que induz
a atividade fagocitária de macrófagos (Pontes et al., 2006), controla a produção
de óxido nítrico por células endoteliais (Tamura et al., no prelo), inibe a
proliferação bacteriana (Tekbas et al., 2008) e diminui os efeitos nocivos de
radicais livres por ativar enzimas antioxidantes (Reiter et al., 1997).
Os efeitos da melatonina podem ser mediados por receptores de
membrana dos subtipos MT1 e MT2 (Carrillo-Vico et al., 2003; para revisão ver
Markus & Tamura, 2009) por mecanismos independentes que envolvem a
modulação de vias transcricionais como, por exemplo, a do NF-κB e do GR.
Células imunocompetentes apresentam receptores para melatonina (CarrilloVico et al., 2006), sendo o subtipo MT2 (Dubocovich & Markowska, 2005) alvo
importante da melatonina no controle de respostas imunes celulares e humorais
(Drazen & Nelson, 2001). Melatonina inibe a translocação nuclear de receptores
para glicocorticóides em células tímicas (Sainz et al., 1999; Presman et al., 2006) e
24
Introdução
inibe a translocação nuclear do NF-κB em macrófagos (Gilad et al., 1998) e
células endoteliais (Tamura et al., no prelo).
As bases experimentais para o entendimento dos efeitos da melatonina
sobre respostas imunes inatas e adquiridas têm sido ampliadas de forma
importante. No entanto, pouco é conhecido sobre os efeitos de moduladores da
resposta inflamatória sobre a atividade pineal (Skwarlo-Sonta, 1996 e 2002).
Recentemente foi constatada a presença de receptores de imonuglobulina E em
pinealócitos de rato (Ganguly et al., 2007). Os autores observaram que esta
expressão é 100 vezes maior durante a noite do que de dia devido a um
mecanismo controlado pela produção de AMP cíclico induzida por
noradrenalina (Ganguly et al., 2007), sugerindo então um controle circadiano da
expressão deste receptor. Em astrócitos da pineal a noradrenalina também é
capaz de induzir a expressão dos RNAm de TGF-β (do inglês, transforming
growth factor-beta) e IL-6 (Tsai et al., 2001). Este efeito é potenciado por IL-1β que,
por sua vez, é constitutivamente produzida em astrócitos da pineal e tem sua
expressão aumentada na presença de noradrenalina ou IFN-γ (Tsai & McNulty,
1999).
Com relação ao efeito de citocinas sobre a produção de melatonina
menos ainda é sabido. Neste sentido, foi demonstrado que IFN-γ apresenta um
efeito dual sobre a síntese de melatonina, pois ao mesmo tempo em que
aumenta a produção de melatonina, inibe a atividade da enzima AA-NAT
induzida por estimulação β-adrenérgica. Este efeito poderia ser explicado por
um aumento na atividade da HIOMT, mas nenhum efeito sobre esta enzima foi
observado, deixando o mecanismo de ação do IFN-γ sobre a síntese de
melatonina pela glândula pineal em aberto (Withyachumnarnkul et al., 1990).
Como visto, IFN-γ pode atuar por várias vias de transcrição sendo a mais
comum e bem descrita a da JAK/STAT (para revisão ver Stark, 2007). É sabido
que esta via está ativada na pineal durante processos inflamatórios (Takamiya
et al., 2002) e que as vias da STAT e do NF-κB podem interagir em diversos
modelos celulares (Yang et al., 2007). É possível que a interação entre estas vias
25
Introdução
possa estar ocorrendo na glândula pineal e controle, de algum modo ainda
desconhecido, a produção de melatonina durante processos fisiopatológicos.
4.1.
RELAÇÃO ADRENAL-PINEAL
A ativação do eixo HPA com consequente elevação da concentração de
glicocorticóides circulantes faz parte do sistema de manutenção do equilíbrio
interno em mamíferos (Kalsbeek et al., 2006). Este sistema é ativado por injúrias
físicas ou psicológicas e visa compensar ações que o organismo desencadeia
para combater agentes injuriantes. No caso de uma inflamação, a circulação de
corticosterona (roedores) está elevada na fase anti-inflamatória da mesma
(Nadeau & Riviest, 2002). Por outro lado, quando a resposta inflamatória é
cronificada, a quantidade de glicocorticóide circulante se mantém elevada.
Na década de 1970 foram apresentados os primeiros trabalhos que
buscam estabelecer um eixo adreno-pineal. O modelo estudado na época era a
ativação da adrenal por estresse em animais controle ou pinealectomizados e a
observação das alterações na quantidade de corticosterona circulante. Os
resultados eram controversos, visto que na dependência do protocolo
experimental era obtida uma fotografia estática desta complexa interação. Neste
período a melatonina era considerada uma inibidora do eixo HPA e, portanto,
um agente inibidor da resposta de estresse. Como exemplo desta fase podemos
citar um trabalho em que foram medidos os níveis de corticosterona no início
da manhã em ratos adultos normais ou pinealectomizados mantidos em
iluminação constante. Claro constante, uma situação sabidamente estressante,
não alterou a concentração de corticosterona circulante. No entanto, houve um
aumento quando animais controle, mantidos em escuro constante, foram
comparados com animais pinealectomizados (Nir et al., 1970). A conclusão
destes dados, de acordo com os autores, reforçava o conceito de que a ativação
pineal produzia um efeito inibidor sobre o eixo HPA. Este conceito foi
reforçado por estudos in vitro que demonstraram que a produção de
corticosterona por células da adrenal estimuladas in vitro com ACTH pode ser
reduzida por extratos de glândulas pineais (Porter & Heiman, 1977). No
26
Introdução
entanto, melatonina não mimetizava o efeito do extrato de pineal, deixando em
dúvida uma ação direta da melatonina sobre a produção de corticosterona. A
literatura atual não acrescenta novos fatos a estes trabalhos pioneiros, ficando
evidente a complexidade do tema.
Mais recentemente, foi sugerido que corticosterona poderia ter uma ação
direta sobre a glândula pineal, modulando a produção de melatonina, visto que
a adrenalectomia de camundongos cronicamente inflamados com BCG abolia o
ritmo diário de excreção de 6-sulfatoximelatonina (Lopes et al., 2001). Alterações
hormonais mais intensas, como as induzidas por orquiectomia, resultam em
aumento inicial dos níveis de corticosterona (enquanto a melatonina fica
inalterada) e um aumento retardado da melatonina circulante (quando os níveis
de corticosterona já foram normalizados). Mais ainda, estresse moderado
causado por contenção apresenta correlação positiva entre o aumento da
concentração plasmática do precursor da melatonina NAS e o aumento dos
níveis de corticosterona em ratos (Couto-Moraes et al., no prelo). Por outro lado,
a administração de altas concentrações de glicocorticóides inibe a produção de
melatonina pela glândula pineal estimulada com concentrações elevadas de
noradrenalina in vitro (Troiani et al., 1988; Yuwiller, 1989; Zhao & Touitou, 1993)
e a administração de glicocorticóides in vivo reduz a concentração plasmática de
melatonina (Beck-Friis et al., 1983; Demisch et al., 1988). Desta forma, a
corticosterona poderia atuar de duas maneiras opostas, quer potenciando, quer
inibindo a produção noturna de melatonina dependendo da condição testada.
Os trabalhos de Cristiane Lopes (Lopes et al., 1997 e 2001) mencionados
acima foram a base para a realização desta pesquisa, pois sugeriam que o
hormônio da córtex da adrenal poderia agir diretamente sobre a pineal. Na
presente tese foi avaliado o mecanismo de ação pelo qual a corticosterona atua
sobre pineais e este conhecimento levou ao estudo do efeito de citocinas próinflamatórias (TNF e IFN-γ) sobre esta glândula.
27
Objetivos
II. OBJETIVOS
O objetivo central da presente tese foi o de avaliar o efeito, bem como os
mecanismos de ação, de corticosterona sobre a glândula pineal.
Foram avaliados os efeitos da corticosterona sobre:
1 – os produtos da via biossintética de melatonina
2 – a atividade das enzimas desta via biossintética
3 – a transcrição dos genes aa-nat e hiomt
4 – a via de transdução NF-κB
Considerando que a inibição da via NF-κB resultou em um aumento da
produção de melatonina, foram então realizados os experimentos com as
citocinas TNF e IFN-γ, com o objetivo de testar se esta via de sinalização ubíqua
participa de forma efetiva na modulação da atividade pineal.
28
Material e Métodos
III. MATERIAL e MÉTODOS
1. Animais
Em todos os experimentos foram utilizados ratos machos Rattus
novergicus da linhagem Wistar (procedentes do biotério central da FMUSP e
UNIFESP e criados no biotério do IB), pesando entre 200 e 300 g. Os
experimentos realizados na França foram feitos com animais criados no biotério
do Instituto de Neuroquímica da Universidade Louis Pasteur – Estrasburgo. Os
animais foram mantidos em ciclo claro-escuro 12h00/12h00, sendo o acender
das luzes definido como ZT 0 (zeitgeber time 0). Os animais receberam comida e
água ad libitum. Tanto nos experimentos in vitro quanto após os in vivo os
animais foram eutanasiados por decapitação sem a administração de
anestésicos.
2. Drogas e reagentes
As drogas utilizadas tiveram várias procedências, tais como:
•
Abbott Laboratories (França): solução de Ringer (147 mM de NaCl, 4
mM de KCl, 1,2 mM de CaCl2 e 1,0 mM de MgCl2).
•
Agner (Brasil): cloridrato de ketamina.
•
Amersham Biosciences (Reino unido): [125I]-2-iodomelatonina, [γ
32P]ATP,
(3C)-acetil coenzima A, 14C-S-adenosil-L-methionin, poli(dIdC)
e T4 polinucleotídeo quinase.
•
Bayer (Alemanha): Rompum (solução aquosa a 2% de
Cloridratode 2-(2,6-xilidino)-5,6-dihidro-4-H-1,3-tiazina.)
•
Beker (Brasil): água estéril para injeção
•
Bio-Rad Laboratories (USA): SYBR Green.
•
Biosurce Internatinal Inc. (USA): primers (senso e antisenso) para
aa-nat (5’-AGCGCGAAGCCTTTATCTCA-3’ e 5’- AAGTGCCGGATC
TCATCCAA-3’),
hiomt
(5’-
AGCGCCTGCTGTTCATGAG-3’
e
5’-
29
Material e Métodos
GGAAGCGTGAGAGGT
CAAA
G-3’)
e
14-3-3
(5’-
TGATCGGGATCTGGTGTA-3’ e 5’- TCCACCATTTCGTC GTATCG-3’).
•
Calbiochem (USA): NP40.
•
Coopers (Brasil): Cloridrato de Xilasina.
•
Cromato Produtos Químicos LTDA: glycerol.
•
F.Maia: álcool isopropílico, Clorofórmio.
•
Gibco BRL: estreptomicina, glutamina, penicilina.
•
Hoeschst (Brasil): ácido ascórbico.
•
ICN Biomedical Division (USA): kit radioimunológico comercial de
corticosterona marcada com 125I.
•
INRA (França): anticorpo originado de coelho específico para
melatonina (R19540).
•
Integrated DNA Technologies Inc. (USA): Primers (senso e antisenso
para 18S: (5’- CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’ e 5’-GCTGGAATTA
CCGCGGCT-3’).
•
Invitrogem Life Technology (USA): ditiotreitol (DTT), Randon
Primers, SuperScript II, Trizol, dNTPs, tampão para PCR (5x), fluoreto de
fenilmetilsulfonil (PMSF).
•
Merck (Brasil): acetato de sódio, ácido cítrico, ácido clorídrico
(HCL), ácido perclórico, álcool etílico, EDTA (ethylenediaminetetracetic acid
dissodium salt), metabissulfito de sódio, metanol.
•
Sigma-Aldrich
(USA):
5-hiroxitriptamina
(5-HT),
5-
hidróxitriptofano (5-HTP), (-) arterenol bitratate salt (noradrenalina), 3hidroxibenzilhidrazina (NSD 1015), ácido heptanosulfônico, adrenalina,
ciclohexiamida,
corticosterona,
fator de
necrose
tumoral
(TNF),
fenilefrina, HEPES, interferon gama (IFN-γ), iproniazida, isoprenalina,
meio de cultura BGJb, melatonina, mifepristone (RU-486) N-acetil
serotonina
(NAS),
N-acetil-leucinil-leucinil-norleucinol-H
(ALLN),
pirrolidinaditiocarbamato (PDTC), tolcapone, triptamina.
30
Material e Métodos
•
Virbac, (França): Zoletil (cloridrato de zolazepan e cloridrato de
tiletamina).
3. Preparo de drogas
Os padrões de 5-HT, 5-HTP, adrenalina, NAS e melatonina para
cromatografia foram preparados da seguinte maneira: As soluções estoque das
substâncias tinham concentração de 1 mM e foram feitas em 0,1 M de ácido
clorídrico acrescido de 0,02% de metabissulfito de sódio e 0,02% de EDTA
dissódico. No momento da análise cromatográfica os padrões foram diluídos
em ácido perclórico 0,1 M acrescido de 0,02% de metabissulfito de sódio e
0,02% de EDTA dissódico.
As soluções estoque de noradrenalina e adrenalina (10 mM) foram feitas
em ácido clorídrico 0,01 M e a diluição com solução aquosa de ácido ascórbico
(50 mg/L).
A solução estoque de corticosterona (10 mM) e RU-486 (10 mM) foram
feitas em etanol e as diluições em água deionificada purificada por sistema
Milli-Q (Millipore).
As demais drogas utilizadas e listadas acima foram, quando necessário,
diluídas em água deionizada purificada por sistema Milli-Q (Millipore ).
4. Cultura de glândulas pineais
As glândulas pineais foram cultivadas de acordo com método proposto
por Parfitt e col. (1976) e modificado por Ferreira e col. (1994). Glândulas recém
retiradas dos animais foram colocadas em placas de cultura de 24 poços (TPP)
contendo 200 µL de meio de cultura BGJb acrescido de glutamina (2 mM), ácido
ascórbico (0,1 mg/mL), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 µg/mL),
pH 7,4 e mantidas a 37 ˚C; 95% O2 – 5% CO2. Os ensaios foram realizados após
24 ou 48 horas de cultura, com o objetivo de permitir a maior desnervação
possível das glândulas e melhor controlar a concentração de noradrenalina
administrada. Para verificar o acúmulo nuclear do fator de transcrição NF-κB,
31
Material e Métodos
as glândulas foram cultivadas por 6 horas. As glândulas foram sempre
estimuladas por noradrenalina (10 ou 100 nM) por 5 h. Glândulas e meios de
cultura foram estocados a –70 ˚C por no máximo 15 dias.
5. Adrenalectomia
Os ratos foram submetidos à adrenalectomia bilateral sob anestesia com
a associação de cloridrato de ketamina (0,5 mg/Kg) e cloridrato de xilasina
(1 mg/Kg). Foi feita uma incisão anteroposterior de aproximadamente 1 cm,
logo abaixo da costela direita, permitindo a retirada da adrenal direita. Após
sutura do corte cirúrgico em dois planos, o mesmo procedimento foi repetido
na região contralateral. Após a cirurgia, a água de beber desses animais foi
acrescida de 0,9% de NaCl para manter o osmolaridade sanguínea. Os animais
foram sacrificados sete dias após a cirurgia sendo que cinco dias é o tempo
mínimo necessário para recuperação.
6. Microdiálise intrapineal
Os animais foram anestesiados com Zoletil e Rompum i.p. (0,2 mL/100 g
e 0,05 mL/100 g, respectivamente). A sonda de microdiálise (membrana de
celulose de diâmetro interno de 0,22 mm e diâmetro externo de 0,27 mm, que
permite a passagem de substâncias com pesos moleculares menores ou iguais a
10000) foi fixada horizontalmente em um aparato esteriotáxico (David Kopf
Instrument). Em cada lado do osso temporal foi realizado um furo por onde a
sonda é introduzida lateralmente até a pineal a uma distância de 1,7 mm
ventralmente ao crânio e 0,7 mm posteriormente à sutura lambda, segundo Atlas
de Paxinos e Watson (1982). Tubos de entrada e saída foram fixados ao crânio
com cimento dentário. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais para
recuperação durante uma semana. Durante os experimentos, o tubo de entrada
do sistema foi conectado a uma bomba de microinjeção (Harvard) através de
um conector de fluidos (Instech 375/22) com tubos de polietileno. O tubo de
saída do sistema foi conectado, com tubos de polietileno, a microtubos eppendorf
32
Material e Métodos
(Fig. 5). Em todos os experimentos foi utilizado Ringer (147 mM de NaCl, 4 mM
de KCl, 1,2 mM de CaCl2 e 1,0 mM de MgCl2) como líquido de perfusão a um
fluxo de 3 µL/min. As amostras foram coletadas segundo os protocolos
experimentais descritos nos resultados e armazenadas a -20 °C para posterior
dosagem de melatonina e/ou corticosterona (Fig. 5).
Microdiálise intrapineal
A
10 mm
B
silicone
2 mm 10 mm
membrana livre
Ciment
cimento
dentaire
dentário
fio de tungistênio
C
junção
móvel
Joint tournant
entrada
Entrée
saída
Sortie
melatonina pg/25 µL
D
cérebro
Crâne
Cerveau
60
50
40
30
20
10
00 6 12 18 0 6 12 18 0 6 12 18 0
Zeitgeber (h)
Figura 5. Microdiálise intrapineal. A) Esquema da sonda de implantação utilizada. B)
Posição da implantação da sonda. C) Animal conectado ao sistema de perfusão. D)
Representação esquemática da reprodutibilidade da secreção de melatonina no
decorrer de três dias consecutivos (esquema baseado em Barassin et al., 1999).
7. Dosagem radioimunologica de corticosterona
A concentração de corticosterona dos dialisados foi determinada em
duplicatas utilizando o kit radioimunológico comercial de corticosterona
marcada com 125I. Neste kit a curva padrão (0 – 1000 ng/mL, diluída em tampão
33
Material e Métodos
para esteróides presente no kit) e as amostras são incubadas com 200 µL
cortocosterona marcada (125I) e 200 µL de anticorpo específico para
corticosterona (produzido em coelhos) por 2 horas em temperatura ambiente
(22-25 ˚C). Após este peíriodo é adicionada a solução de precipitação (500 µL) e
os tubos são agitados. Os tubos são centrifugados por 15 min (1000 x g; 4 ˚C), o
sobrenadante é descartado e a radiotividade do preciptado determinada em
contador gamma (Packard). Controles de ligação não específica foram feitos
em tubos contendo apenas o tampão de diluição e corticosterona marcada. O
limite mínimo de sensibilidade do kit é de 5 ng/mL (Perreau-Lenz et al., 2003).
8. Dosagem radioimunológica de melatonina
A concentração de melatonina dos dialisados foi determinada em
duplicatas de 25 µL utilizando anticorpo específico para melatonina produzido
por coelho (R19540; diluição final de 1/40000) e [125I]-2-iodomelatonina
(Barassin et al., 1999). As amostras e a curva padrão foram incubadas com
200 µL de anticorpo e 100 µL do hormônio marcado por 18 horas. A
precipitação do anticorpo ligado foi feita com a adição de 500 µL de anticorpo
anti-coelho (produzido por cabra) por 15 min em gelo seguido de centrifugação
por 15 min (3000 x g; 4˚C). A radioatividade foi quantificada por contador gama
(Packard) e o limite de sensibilidade do método é de 0,5 pg/tubo. As diluições
foram todas feitas em tampão de tricina 0,1 mol/L contendo 0,9% de NaCl e
0,01% de gelatina.
9. Extração protéica nuclear de glândula pineal de rato
As glândulas foram processadas segundo técnica descrita em Ferreira e
col. (2005). As glândulas pineais foram homogeneizadas em 100 µL de tampão
de lise (HEPES 10 mM, KCl 10 mM, EDTA 0,1 mM pH 8,0, glicerol 10%,
DTT 1 mM e PMSF 0,1 mM) à temperatura de 4 ºC. Após adição de NP40 (10%),
que auxilia a lise da membrana, as amostras foram agitadas em vórtex por 10
segundos e centrifugadas (12000 x g; 1 min; 4 °C), o sobrenadante foi removido,
34
Material e Métodos
o pellet foi ressuspenso em 50 µL do mesmo tampão de lise citado anteriormente
e
os
tubos
foram
novamente
centrifugados
(12000
x
g;
1
min;
4 °C). Após a centrifugação o sobrenadante foi descartado e as amostras foram
ressuspensas em 20 µL de tampão de extração nuclear (HEPES 10 mM; pH 7,5,
KCl 0,5 M, EDTA 1 mM; pH 8,0, glicerol 10%, DTT 1 mM e PMSF 0,1 mM),
deixadas sob agitação em gelo por 15 min e centrifugadas (20000 x g; 5 min;
4 °C). O sobrenadante contendo o extrato protéico nuclear foi armazenado a
-20 °C até o momento da dosagem de proteína e do ensaio de eletromobilidade
em gel (EMSA).
10. Dosagem de proteína
O conteúdo de proteína total da pineal foi determinado pelo método de
Bradford (1976). Foi padronizada a quantidade de proteína (4 µg) de cada
amostra a ser analisada pelos ensaios de eletromobilidade em gel.
11. Ensaio de eletromobilidade em Gel (EMSA)
Este ensaio baseia-se na ligação das proteínas de NF-κB presentes em
extratos protéicos nucleares a uma sonda construída de oligonucleotídeo duplafita consenso para NF-κB (5’AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’) marcada
nas extremidades com
32P.
polinucleotídeo quinase e [γ
Esta marcação é feita na presença da T4
32P]ATP
por 10 min a 37 °C. Os nucleotídeos não
incorporados são removidos quando a mistura é passada em uma coluna
MicroSpin G-25 (Amersham). Os extratos nucleares de pineal (4 µg) foram
incubados à temperatura ambiente por 20 min em um volume final de 20 µL de
tampão contendo: 10 mM de tris-hidroximetilaminometano-HCl, 1 mM de
MgCl2, 50 mM de NaCl, 0,5 mM de ditiotreitol, 0,5 mM de EDTA (ácido etileno
diamino tetracético), 4% de glicerol e 1 µg de poli(dIdC); pH 7,5.
Posteriormente, cada amostra foi incubada por 30 min à temperatura ambiente
com aproximadamente 40.000 cpm do oligonucleotídeo [32P]-NF-κB. Os
35
Material e Métodos
complexos proteína-DNA foram analisados em gel não-desnaturante 6% de
acrilamida:bisacrilamida (5:1) em tampão Tris-borato/EDTA (TBE 0,25x) a
150 V por 1h e 30 min. O gel foi seco à vácuo, exposto ao filme XAR-5 (Kodak)
por 48 h a -70 °C, revelado em sala escura (solução reveladora, 5 min, e
fixadora, 10 min, Kodak) e quantificado densitometricamente.
12. Extração de RNA
O RNA total de cada glândula pineal foi extraído utilizando-se o
reagente Trizol, seguido de 100 µL de clorofórmio. Após agitar os tubos
manualmente por 15 segundos, mantê-los por 3 min à temperatura ambiente e
centrifugá-los (12000 x g; 15 min; 4 ˚C), o RNA total é isolado por ficar retido na
fase aquosa. Esta fase foi transferida para um novo tubo e o RNA foi
precipitado com 250 µL de isopropranol. Após 10 min à temperatura ambiente
os tubos foram novamente centrifugados (12000 x g; 10 min; 4 ºC), o
sobrenadante foi removido, o pellet lavado duas vezes com etanol 75%,
centrifugado (7500 x g; 5 min; 4 ºC) e o excesso de etanol evaporado à
temperatura ambiente por 10 min. Para melhor purificação das amostras, o
pellet foi ressuspenso em solução aquosa contendo 10% de acetato de sódio
(3 M; pH 5,2) e 2,5% de etanol (100%) e mantido a -20 ˚C por 18h. Após esse
período, o material foi centrifugado (20000 x g; 30 min; 4 ºC) e o RNA foi então
ressuspenso em água estéril para injeção (RNAse free). A determinação da
quantidade de RNA foi feita por espectrofotometria, utilizando o leitor ND1000 (Nanodrop).
13. RT-PCR
Para a construção do DNA complementar (cDNA) aos RNAs
mensageiros presentes nos extratos, foram utilizados: 1 µL de primers
randômicos (50 ng), 1 µL de dNTPs (10 mM), 0,5 µg de RNA total extraído e
água estéril (RNAse free) até completar o volume de 13 µL. Os tubos foram
incubados por 5 min a 65˚ C (termociclador Eppenforf) e resfriado em banho
36
Material e Métodos
de gelo. A seguir, adicionou-se 4 µL de tampão para PCR (5x), 1 µL de
ditiotreitol e 1 µL da enzima de transcriptase reversa SuperScript II (200U/µL).
As amostras foram então incubadas por 5 min a 25 ˚C, 55 min a 50 ˚C e 15 min a
70 ˚C (termociclador Eppenforf). O cDNA resultante foi congelada a -20 ˚C até
sua utilização.
14. RT-PCR em tempo real
Para determinar a expressão gênica das enzimas AA-NAT, HIOMT e da
proteina chaperona 14-3-3 os cDNAs construídos (1 µL) foram incubados com
os respectivos primers senso e antisenso (300 nM)e com iQ SYBER Green
Supermix (mix 2x, 50% do volume final; 20 µL) que contem, dentre outras
susbstâncias, a iTaq DNA polimerase. A expressão gênica da proteína
ribossomal 18S também foi analisada, pelo mesmo procedimento, utilizando-se
primers específicos (25 nM) o que possibilitou a normalização interna dos dados.
Neste ensaio o fluoróforo SYBER Green intercala-se ao DNA dupla-fita
formando um complexo capaz de emitir fluorescência.
A reação em cadeia da polimerase, responsável pela amplificação da
expressão dos genes alvos, foi acompanhada em tempo real utilizando-se o
aparelho iCycler (BioRad Laboratories). Os sete primeiros minutos da etapa de
danaturação (95 ˚C) foram seguidos por 40 ciclos de amplificação (10 s de
denaturação a 95 ˚C e 1 min de anelamento e elongação a 60 ˚C). Como uma
forma de se saber se houve a amplificação de produtos inespecíficos utiliza-se
melting curves, as quais são feitas ao final do experimento e analisadas para cada
amostra. Durante essa fase, a temperatura é baixada 1 ºC a intervalos de tempo
determinados e o pico de fluorescência é obtido em cada poço, numa
temperatura que coincide com o Tm (do inglês, melting temperature) do produto
esperado. Produtos inespecíficos formam picos de fluorescência em Tms
diferentes na curva. Em todos os ensaios foram incluídos controles negativos
com água e RNA de pineais que não foram incubados com a transcriptase
reversa.
37
Material e Métodos
Os primers (senso e antisenso) para aa-nat, hiomt e 14-3-3 utilizados foram,
respectivamente: 5’-AGCGCGAAGCCTTTATCTCA-3’, 5’- AAGTGCCGGATC
TCATCCAA-3’, 5’- AGCGCCTGCTGTTCATGAG-3’, 5’- GGAAGCGTGAGAG
GTCAAAGG-3’, 5’- TGATCGGGATCTGGTGTA-3’ e 5’- TCCACCATTTCGTC
GTATCG-3’.
Os
primers
(senso
e
antisenso)
para
a
18S
foram:
5’- CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’ e 5’- GCTGGAATTACCGCGGCT-3’.
A concentração do RNAm foi calculada usando-se o valor do threshold
cycle (Ct) da amplificação dos genes alvo. A quantificação relativa foi feita pela
fórmula 2-∆∆Ct onde ∆∆Ct representa a diferença entre os ciclos normalizada pela
referância interna (18S) e um calibrador (glândulas não estimuladas por
noradrenalina).
15. Ensaio de atividade enzimática da AA-NAT
A atividade da enzima AA-NAT foi determinada por ensaio
radiométrico. As glândulas pineais mantidas previamente em cultura (24 h)
foram sonicadas (4 °C) em 100 µL de tampão de fosfato de sódio (0,05 M;
pH 6,8) contendo 0,35 mM de acetil coenzima A. 40 microlitros dos
homogenatos foram incubados (37 °C por 20 minutos) com triptamina (10 mM)
e (14C)-acetil coenzima A (10 mM; atividade específica final de 44 mCi/mmol)
em um volume final de 80 µL. O produto radiativo da reação (14C -Nacetilserotonina) foi extraído com 1 mL de clorofórmio gelado e saturado com
ar. As amostras foram colocadas em um recipiente de cintilação por 18 horas,
até que seu conteúdo evaporasse. Quando secas, 3,5 mL de líquido de cintilação
foram adicionados aos tubos e a radioatividade de cada tubo foi determinada
em um contador β (Beckman).
16. Ensaio de atividade enzimática da HIOMT
A atividade da enzima HIOMT foi determinada por ensaio radiométrico.
As glândulas pineais mantidas previamente em cultura (24 h) foram sonicadas
(4 °C) em 100 µL de tampão de fosfato de sódio (0,05 M; pH 7,9). Cinquenta
38
Material e Métodos
microlitros do sobrenadante foram então incubados (37 °C por 30 minutos) com
N-acetilserotonina (1 mM) e
14C-S-adenosyl-L-methionine
(43,8 µM; atividade
específica final de 52,7 mCi/mmol) em um volume final de 100 µL. A reação foi
interrompida com a adição de 200 µL de tampão de borato de sódio (12,5 mM;
pH 10) e 1 mL de clorofórmio. Os tubos foram então centrifugados por 5
minutos (13000 x g; 4 °C) e o produto radioativo da reação (14C melatonina) foi
extraído com 800 µL de clorofórmio. As amostras foram colocadas em um
recipiente de cintilação por 18 horas, até que seu conteúdo evaporasse. Quando
secas, 3,5 mL de líquido de cintilação foram adicionados aos tubos e a
radioatividade foi determinada em um contador β (Beckman).
17. Ensaio de atividade enzimática da TPH
A atividade da enzima TPH foi determinada por HPLC pela medida da
produção de 5-hidroxitriptofano (5-HTP) nos meios de cultura de glândulas
pinais. As glândulas foram tratadas por 30 minutos com o inibidor da enzima 5HTP descaborxilase NSD 1015 (400 µM). Após os procedimentos experimentais
descritos nos resultados, as glândulas foram homogeneizadas em solução de 0,1
M de ácido perclórico contendo 0,02% de EDTA e metabissulfito de sódio,
centrifugadas (13000 x g; 4 ˚C) e o sobrenadante armazenado a -70 ˚C até o
momento de dosagem.
18. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
Os conteúdos de 5-HTP, 5-HT, NAS, melatonina e adrenalina nas
glândulas e nos meios de incubação foram analisados por HPLC com detecção
eletroquímica, segundo método adaptado por nosso grupo (Ferreira et al., 1994
e 2001; Barbosa et al., 2000). O sistema cromatográfico utilizado é composto de
uma bomba LC-6A (Shimadzu), injetor Reodyne 7125 com loop de 20 µL,
coluna C18 fase reversa (150 x 3,9 mm, Resolve – Waters) em temperatura
ambiente, detector eletroquímico L-ECD-6A (Shimadzu) mantido com
potencial de + 0,90 V (para dosagem de indóis) ou + 0,80 V (para dosagem de
39
Material e Métodos
adrenalina) no eletrodo de trabalho (vs eletrodo de referência Ag/AgCl),
acoplado a um computador para integração dos dados. As fases móveis
utilizadas foram: acetato de sódio 0,1 M, ácido cítrico 0,1 M, EDTA 0,15 mM,
metanol 7%, para dosagem de 5-HTP, 5-HT e NAS ou metanol 25% para
dosagem de melatonina. Nas dosagens de adrenalina a fase móvel utilizada foi:
fosfato de sódio dibásico 0,02 M, ácido cítrico 0,02 M, EDTA 0,12 mM, ácido
heptanosulfônico 556 mg/mL e metanol 2%; pH 2,64.
19. Análises estatísticas
Os dados estão representados como média ± erro padrão da média
(epm). Nos experimentos in vivo as concentrações de corticosterona ou
melatonina foram expressas como a porcentagem em relação ao pico detectado
em cada animal no dia controle. Análises estatísticas foram feitas por teste t de
Student; análise de variância de uma via seguida do teste de Newman-Keuls ou
duas vias seguida do teste de Bonferroni (experimentos de microdiálise). O
paralelismo entre as porções exponenciais de duas curvas foi determinado pela
análise de variância de retas paralelas. O nível de significância foi considerado
menor que na probabilidade de 5% (p<0,05).
40
Resultados
IV. RESULTADOS
1. Efeitos da corticosterona sobre a síntese de NAS e
melatonina
O efeito da corticosterona sobre a produção de NAS e melatonina foi
avaliado em pineais de ratos mantidas em cultura ou por perfusão in situ
utilizando a técnica de microdiálise. Nos experimentos in vitro os efeitos de
diferentes concentrações de corticosterona (0,01 a 100 µM) foram testados frente
à estimulação com noradrenalina (10 nM), isoprenalina (0,1 nM a 3 µM) ou
isoprenalina mais fenilefrina (10 µM); já nos estudos in vivo foi feita a
administração local (microdiálise intrapineal) de corticosterona (6 µg/mL) em
diferentes ZTs (ZT 2 ou ZT 13).
1.1.
ESTUDOS IN VITRO
A síntese de NAS e melatonina em glândulas pineais estimuladas com
noradrenalina (10 µM, 5 horas) foi potenciada por corticosterona (0,01 a 100 µM,
48 horas) seguindo uma curva em sino. Os efeitos sobre a síntese de NAS foram
medidos tanto na glândula (Fig. 6A) quanto no meio de cultura, enquanto que
os efeitos sobre a produção de melatonina foi medida apenas nos meios de
cultura (Fig. 6B). As concentrações de NAS e melatonina foram determinadas
por HPLC.
O aumento na produção de NAS foi observado com concentrações de
corticosterona compreendidas na faixa de 0,01 a 10 µM. A concentração de 100
µM de corticosterona não alterou a produção de NAS em comparação ao grupo
estimulado apenas com
noradrenalina
10
nM,
mostrando que
altas
concentrações do glicocorticóide não induz o mesmo efeito potencializador
observado com concentrações menores (Fig. 6A e B).
A produção de melatonina, medida apenas no meio de cultura, também
foi potenciada por corticosterona. No entanto, houve uma diferença na relação
41
Resultados
concentração-efeito (Fig. 6B). O aumento na produção de melatonina foi
observado nas concentrações de corticosterona compreendidas na faixa de 0,01
até 1 µM. As concentrações de 10 e 100 µM não alteraram a produção de
melatonina em comparação ao grupo estimulado apenas com noradrenalina
10 nM (Fig. 6B).
melatonina
Indol (ng/poço)
NAS (ng/pineal)
NAS
NAS
0,01 0,1
1
10
0,01 0,1
100
Corticosterona µM
1
10
100
Corticosterona µM
Figura 6. Efeito da corticosterona sobre a produção de NAS e melatonina induzida
por noradrenalina. Glândulas pineais de rato cultivadas por 48 horas na ausência
(símbolos brancos) ou na presença de corticosterona (0,01 a 100 µM, símbolos pretos)
foram estimuladas por 5 horas com noradrenalina (NA, 10 nM). A) Conteúdo de NAS
analisado em homogenatos de pineais em cultura. B) Conteúdo de NAS e melatonina
analisado nos meios de cultura. Valores representam média ± epm; n = 4-12 glândulas
por grupo experimental.
Dando continuidade ao estudo, foi testado se corticosterona altera a
produção de NAS e melatonina induzida por diferentes concentrações do
agonista β-adrenérgico, isoprenalina. O estudo de variância das partes
exponenciais das curvas concentração-resposta obtidas após estimulação com
isoprenalina (0,1 nM a 3 µM, 5 horas) na presença ou na ausência de
corticosterona (1 µM, 48h) mostrou que as diferentes preparações do ensaio não
influenciaram os resultados, que há regressão entre os pontos avaliados e que
as retas obtidas são paralelas entre si. Esta análise possibilitou testar
estatisticamente
a
diferença
entre
os
pontos
equivalentes
(mesmas
concentrações de isoprenalina). Foi constatado que corticosterona potenciou a
42
Resultados
síntese de NAS (Fig. 7A) e melatonina (Fig. 7B) induzida por isoprenalina. A
incubação com corticosterona deslocou a curva de produção de NAS para a
esquerda, indicando uma potenciação sobre o efeito do agonista noradrenérgico
sem, no entanto, aumentar a produção máxima desta indolamina (Fig. 7A). Já
no caso da melatonina, além do deslocamento para a esquerda também houve
um aumento da resposta máxima (Fig. 7B).
A
B
NAS (ng/poço)
CORT 1 µM
65
Melatonina (ng/poço)
90
*
*
40
15
-10
-9
-8
-7
-6
isoprenalina log [M]
*
100
CORT 1 µM
75
*
50
25
0
-10
-9
-8
-7
-6
isoprenalina log [M]
Figura 7. Efeito da corticosterona sobre a produção de NAS e melatonina induzida
por isoprenalina. Glândulas pineais de ratos cultivadas por 48 horas na ausência
(símbolos abertos) ou na presença de corticosterona (CORT, 1 µM, triângulos cinza),
foram estimuladas por 5 horas com isoprenalina (0,1 nM - 3 µM). A) Produção de NAS.
B) Produção de melatonina. Valores representam média ± epm; n = 3-4 glândulas por
ponto. * p<0,05 vs ponto correspondente da curva estimulada apenas por isoprenalina.
Noradrenalina ativa tanto adrenoceptores α1 quanto β1. Corticosterona
potencia a síntese hormonal da pineal na presença de baixas concentrações de
noradrenalina e inibe na presença de altas (Yuwiler, 1989). Neste contexto, foi
testado o efeito da corticosterona (1 ou 10 µM, 48 h) sobre a estimulação
conjunta de receptores do subtipo β, com concentração de isoprenalina que já
induz a resposta máxima (3 µM), e de adrenoceptores α1, pelo agonista seletivo
fenilefrina (10 µM). Para tanto, glândulas pineais em cultura (48 h), na presença
ou não de corticosterona, foram estimuladas por isoprenalina (5 h) ou
isoprenalina mais fenilefrina (5 h). Os resultados demonstraram que
corticosterona, em ambas as concentrações utilizadas, não altera a produção de
43
Resultados
NAS (Fig. 8A), mas potencia a produção de melatonina (Fig. 8B) induzida por
isoprenalina. A estimulação conjunta de receptores β e α1 adrenérgicos por
isoprenalina e fenilefrina aumentou (em comparação ao grupo estimulado
apenas com isoprenalina) tanto a produção de NAS como a de melatonina.
Corticosterona inibiu ambos os efeitos (Fig. 8A e B).
B
*
NAS (ng/poço)
100
75
125
#
#
50
25
melatonina (ng/poço)
A
* *
100
*
#
75
#
50
25
0
0
+
0
+ +
1 10
+
+
0
+
+
1
+ ISO
3 µM
+ FEN 10 µM
10 CORT
µM
+
0
+ +
1 10
+
+
0
+
+
1
+ ISO
3 µM
+ FEN 10 µM
10 CORT
µM
Figura 8. Participação da estimulação β e β/α
α1 adrenérgica no efeito da corticosterona
sobre a produção de melatonina. Glândulas pineais de rato cultivadas por 48 horas na
ausência (barras brancas) ou na presença de corticosterona (CORT, 1 ou 10 µM, barras
cinza) foram estimuladas por 5 horas com isoprenalina (ISO, 3 µM) ou por ISO mais
fenilefrina (FEN, 10 µM, barras listradas). A) Produção de NAS. B) Produção de
melatonina. Valores representam média ± epm; n = 4 glândulas por grupo
experimental. * p<0,05 vs grupo estimulado apenas com ISO; # p<0,05 vs grupo
estimulado com ISO mais FEN.
44
Resultados
1.2.
ESTUDOS IN VIVO
Ratos implantados com sondas de microdiálise intrapineal foram
utilizados para avaliar o efeito de infusão in situ de corticosterona aplicada em
concentração equivalente à encontrada no plasma de ratos submetidos a
processos inflamatórios (Nadeau & Rivest, 2002). O conteúdo de melatonina
e/ou corticosterona encontrados nos dialisados foi determinado por
radioimunoensaio.
Primeiramente, foi realizada a determinação do perfil diário de
produção endógena de corticosterona após o período pós-operatório para a
validação do modelo e posterior teste do efeito de corticosterona exógena sobre
a produção de melatonina in vivo. Foi observado um ritmo normal de
corticosterona nos animais avaliados (n=3, perfundidos com Ringer a um fluxo
constante de 3 µL/min) sendo o pico de produção encontrado durante a
transição da fase de claro para a fase de escuro (Fig. 9).
Nos experimentos descritos a seguir, os animais foram mantidos
conectados ao aparato de perfusão durante três ou sete dias. Animais
perfundidos por três dias com solução de Ringer apresentaram um perfil diário
constante de produção de melatonina (Fig. 10A), enquanto que a perfusão de
corticosterona (6 µg/mL a um fluxo constante de 3 µL/min) aumentou a
produção noturna de melatonina em aproximadamente duas vezes e meia
(Fig. 10B e C). No grupo que recebeu corticosterona no começo da fase de claro
(ZT 2) do segundo dia experimental o efeito máximo já pode ser observado na
noite subsequente, sendo este mantido na noite do terceiro dia (Fig. 10B). Já no
grupo que recebeu corticosterona no começo da fase de escuro (ZT 13) foi
observado um ligeiro aumento na produção de melatonina na noite do segundo
dia, sendo o efeito máximo atingido na noite do terceiro dia (Fig. 10C). A média
de três animais no grupo ZT 13 (Fig. 11A) e seis no grupo ZT 2 (Fig. 11B) está
apresentada na figura 11.
Após a perfusão de corticosterona o sistema foi lavado com Ringer por
três dias e a produção de melatonina foi novamente determinada. Os perfis de
45
Resultados
produção de melatonina após a lavagem não diferiram significativamente dos
observados no primeiro dia de experimento, indicando que o efeito da
corticosterona sobre a produção de melatonina é reversível (Fig. 12).
Ritmo de corticosterona
% corticosterona
100
90
80
70
60
50
40
30
0
6
12
18
0
Zeitgeber (h)
Figura 9. Ritmo de corticosterona. A concentração de corticosterona nos dialisados
está representada como uma função do tempo em zeitgeber ao longo de 24 horas, cinco
dias após a cirurgia. Os dados obtidos foram normalizados pelo pico de produção de
corticosterona encontrado para cada animal. Valores representam média ± epm; n = 3.
O quadrado cinza representa a fase de escuro do ciclo claro/escuro.
46
Resultados
A
CONTROLE
melatonina (pg/25 µL)
40
30
20
10
0
0
6
12 18
0
6
12 18
0
6
12 18
0
0
6
12 18
0
Zeitgeber (h)
B
melatonina (pg/25 µL)
CORT - ZT 2
100
75
50
25
0
0
6
12 18
0
6
12 18
Zeitgeber (h)
C
melatonina (pg/25 µL)
CORT - ZT 13
30
20
10
0
0
6
12 18
0
6
12 18
0
6
12 18
0
Zeitgeber (h)
Figura 10. Perfil de melatonina de animais representativos. A) Animal perfundido
com Ringer (fluxo: 3 µL/min) por três dias. B) Animal perfundido com Ringer por um
dia e com corticosterona (6 µg/mL; fluxo: 3 µL/min) começando no ZT 2 do segundo
dia até o fim do experimento (seta cinza). C) Animal perfundido com Ringer por um
dia e meio e com corticosterona (6 µg/mL; fluxo: 3 µL/min) começando no ZT 13 do
segundo dia até o fim do experimento (seta cinza). Os quadrados cinza representam a
fase de escuro do dia.
47
Resultados
A
CORT - ZT 2
300
* *
% melatonina
250
200
*
*
*
150
*
*
*
100
50
0
10 12 14 16 18 20 22
0
2
Zeitgeber (h)
B
CORT - ZT 13
350
% melatonina
300
250
200
150
*
*
*
*
*
*
*
*
100
50
0
10 12 14 16 18 20 22
0
2
Zeitgeber (h)
Figura 11. Perfusão de corticosterona in situ. A) Perfusão de corticosterona (CORT;
6 µg/mL; fluxo: 3 µL/min) começando no ZT 2 do segundo dia de experimento. B)
Perfusão de CORT (6 µg/mL; fluxo: 3 µL/min) começando no ZT 13 do segundo dia de
experimento. Linhas pretas representam a perfusão de Ringer no primeiro dia de
experimento; linhas cinzas representam os dias em que houve perfusão de CORT;
círculos abertos representam os pontos dos diferentes zeitgebers do primeiro dia de
experimento; círculos cinzas representam os pontos dos diferentes zeitgebers do
segundo dia; triângulos cinzas representam os pontos dos diferentes zeitgebers do
terceiro dia de experimento. Os dados foram normalizados pelo pico de melatonina de
cada animal encontrado no primeiro dia. Valores representam média ± epm; n = 6 (A)
ou 3 (B); * p< 0,05 vs ponto de mesmo zeitgeber do primeiro dia experimental.
Quadrados cinzas representam a fase de escuro do dia.
48
Resultados
300
% melatonina
250
200
150
100
50
0
10 12 14 16 18 20 22
0
2
Zeitgeber (h)
Figura 12. Reversibilidade do efeito da perfusão de corticosterona in situ. A
produção rítmica de melatonina foi acompanhada no primeiro e no sétimo dia de
experimento. Nos segundo e terceiro dias, corticosterona foi perfundida (6 µg/mL;
fluxo: 3 µL/min) começando no ZT 2 do segundo dia. Nos quarto, quinto e sexto dias o
sistema foi lavado com a perfusão de Ringer. As linhas preta e cinza representam a
perfusão de Ringer (fluxo: 3 µL/min) no primeiro dia e no sétimo dia de experimento,
respectivamente. Os círculos abertos e os triângulos cinza representam os pontos dos
diferentes zeitgebers do primeiro e do sétimo dias de experimento, respectivamente.
Valores representam média ± epm; n = 3 por ponto experimental. O quadrado cinza
representa a fase de escuro do ciclo claro/escuro.
49
Resultados
2. Mecanismos de ação da corticosterona
2.1.
INIBIÇÃO DA CAPTAÇÃO EXTRANEURONAL DE ADRENALINA
A corticosterona, assim como outros hormônios esteroidais, é capaz de
bloquear a captação de catecolaminas por células não neuronais, ou captação II.
Considerando que o melhor substrato para este mecanismo de captação é a
adrenalina e que a noradrenalina não é encontrada em concentrações
mensuráveis por HPLC em glândulas pineais, os estudos do efeito da
corticosterona sobre a captação extraneuronal foram feitos com adrenalina. Para
tanto, foram utilizadas pinais incubadas ou não com corticosterona (1 ou 100
µM) por uma hora na presença de inibidores da monoaminoxidase (tolcapone,
200 µM) e da catecol-O-metiltransferase (iproniazida, 100 nM). Em seguida, as
glândulas foram estimuladas com adrenalina (10 ou 100 µM) por diferentes
períodos de tempo (0,5 – 30 min).
Glândulas pineais captam adrenalina rapidamente, atingindo o máximo
de captação em menos de 5 minutos (Fig. 13). O processo é dependente da
concentração de adrenalina testada (10 ou 100 µM) sendo a proporção entre a
quantidade administrada e a quantidade captada mantida (10 vezes). Este fato
mostra que com a concentração de 10 µM de adrenalina ainda não havia sido
atingido o máximo de captação do sistema. Os tratamentos com corticosterona
não inibiram a captação de adrenalina nas condições testadas (Fig. 13). Estes
dados permitiram descartar a hipótese de que um aumento da quantidade de
neurotransmissor disponível na fenda sináptica poderia ser um fator
determinante para os efeitos da corticosterona sobre a síntese de melatonina
induzida por estimulação adrenérgica.
50
Adrenalina (ng/pineal)
Adrenalina (ng/pineal)
Resultados
Adrenalina µM
Corticosterona µM
minutos
Figura 13. Captação extraneuronal de adrenalina por pineais de rato. Glândulas
pineais de rato cultivadas por 48 horas foram incubadas com adrenalina (10 µM,
círculos abertos ou 100 µM, quadrados abertos) na ausência (símbolos abertos) ou na
presença (símbolos fechados) de corticosterona (1 µM). O gráfico de barras inserido
mostra o efeito de duas doses de corticosterona (1 e 100 µM, barras pretas) sobre a
captação de adrenalina (1 µM). Valores representam média ± epm, n = 3-6 glândulas
por grupo experimental.
2.2.
PARTICIPAÇÃO DE RECEPTORES INTRACELULARES DE GLICOCORTICÓIDES
Tendo visto que a ação da corticosterona sobre a glândula pineal não é
via inibição da captação extraneuronal de catecolaminas, foi testada então a
participação dos receptores para glicocorticóides. Para isso, utilizou-se o
antagonista seletivo de receptores de glicocorticóides, mifepristone (RU-486,
1 µM). Glândulas pineais mantidas em cultura foram divididas em grupo
controle, corticosterona (1 µM por 48h) e corticosterona mais RU-486
(coincubados por 48 horas) e estimuladas com noradrenalina (10 nM por 5
horas). A concentração de NAS liberada nos meios foi então determinada por
HPLC.
51
Resultados
O inibidor seletivo de receptores para glicocorticóides, RU-486, reverteu
o efeito potencializador da corticosterona sobre a produção de NAS induzida
por noradrenalina em pineais de rato em cultura (Fig. 14), sugerindo que este
NAS (ng/poço)
efeito é mediado pela ativação destes receptores.
Noradrenalina nM
Corticosterona µM
RU - 486 µM
Figura 14. Bloqueio dos receptores de glicocorticóides por RU–486. Glândulas pineais
de rato cultivadas por 48 horas incubadas (barra branca) ou não com corticosterona
(1 µM, barras pretas) foram estimuladas por 5 horas com noradrenalina (NA, 10 nM)
na presença ou ausência de RU–486 (1 µM). Valores representam a média ± epm; n= 4-8
glândulas por grupo experimental; * p<0,05 vs grupo estimulado apenas com
noradrenalina.
2.3.
VIA DE TRANSCRIÇÃO NF-κB
Considerando que a ativação de GR é capaz de inibir o acúmulo nuclear
de NF-κB em diversos modelos, o efeito da corticosterona (1 µM, 24 h) sobre o
acúmulo nuclear do fator de transcrição NF-κB foi testado em glândulas pineais
em cultura na presença ou na ausência de noradrenalina (10 nM, 5 h). Os níveis
nucleares do fator de transcrição NF-κB foram determinados por EMSA e
quantificados por densitometria óptica.
52
Resultados
Os grupos tratados apenas com corticosterona ou noradrenalina
apresentaram níveis similares de NF-κB nos núcleos das células da pineal, mas
quando as drogas foram coincubadas foi observada a redução do acúmulo
nuclear deste fator comparativamente ao grupo estimulado apenas com
Complexo DNA-NF-κB (U. A.)
noradrenalina (Fig. 15).
1.00
0.75
0.50
*
0.25
0.00
+
-
+
NA 10 nM
-
+
+
CORT 10 nM
Figura 15. Efeito da corticosterona sobre o acúmulo nuclear de NF-κ
κB. Glândulas
pineais em cultura na ausência ou na presença de corticosterona (CORT, 1 µM, 24 h;
barras listradas) foram estimuladas por noradrenalina (10 nM, 5 h, barras cinza) e
tiveram seus níveis nucleares de NF-κB determinados. Valores representam média ±
epm; n= 3 por grupo experimental; * p<0,05 vs grupo estimulado apenas com
noradrenalina.
Em vista da capacidade de corticosterona em inibir a translocação da NFκB para o núcleo de células da glândula pineal, foi testado o efeito de inibidores
desta via sobre a produção do precursor da melatonina a NAS.
Os bloqueadores testados nas pineais em cultura foram: corticosterona (1
µM, 48 h), o bloqueador de proteassoma; ALLN (12,5 ou 25 µM, 48 h) ou o
inibidor de ligação do NF-κB ao DNA; PDTC (12,5 ou 25 µM, 48 h). Após a
incubação com as drogas, as glândulas foram estimuladas com noradrenalina
53
Resultados
(10 nM, 5 h) e o conteúdo de NAS liberado no meio de cultura determinado por
HPLC.
Tanto ALLN (Fig. 16A) quanto PDTC (Fig. 16B) mimetizaram o efeito
potencializador de corticosterona (1 µM) sobre a produção de NAS induzida
por noradrenalina. Em todos os casos, a produção do hormônio foi
aproximadamente duas vezes maior que a encontrada no grupo estimulado
apenas com noradrenalina.
B
*
50
*
40
*
30
20
10
0
+
-
+
+
-
+
12,5
+
NA
10 nM
- CORT 1 µM
25 ALLN
µM
NAS (ng/poço)
NAS (ng/poço)
A
60
50
*
*
+
+
-
+
12,5
*
40
30
20
10
0
+
-
+
NA
10 nM
- CORT 1 µM
25 PDTC
µM
Figura 16. Efeito do bloqueio da via NF-κ
κB sobre a produção de NAS. Glândulas
pineais em cultura foram incubadas com corticosterona (1 µM, 48 h, barras cinza), A)
ALLN (12,5 – 25 µM, 48 h barras pretas) ou B) PDTC (12,5 – 25 µM, 48 h; barras pretas)
e então estimuladas com noradrenalina (10 µM, 5 h; barras brancas). Valores
representam média ± epm; n = 4-10 glândulas por grupo experimental; * p<0,05 vs
grupo estimulado apenas com noradrenalina.
2.4.
EFEITO SOBRE A PRODUÇÃO DO TRANSCRITO AA-NAT
Noradrenalina induz, in vivo e in vitro, a produção do transcrito aa-nat,
mas, tendo em vista que diferentes concentrações desta catecolamina ativam
diferentes populações de receptores adrenérgicos, primeiramente foi avaliado
se noradrenalina poderia promover a transcrição do gene aa-nat em pineais de
rato em cultura de maneira concentração dependente. Para tanto, glândulas
pineais em cultura de 48 horas foram estimuladas com concentrações crescentes
de noradrenalina (10 nM, 100 nM ou 1 µM) por 5 horas e os conteúdos de RNA
mensageiro do gene em questão foram avaliados por RT-PCR em tempo real.
54
Resultados
As concentrações de noradrenalina 10 nM, 100 nM e 1 µM induziram um
aumento no conteúdo de RNA mensageiro aa-nat de 20, 70 e 140 vezes,
Expressão do RNAm aa-nat
(x Basal - Gl. não estimuladas)
respectivamente, em relação a glândulas controle não estimuladas (Fig. 17).
150
100
50
0
10
100
1000
NA nM
Figura 17. Noradrenalina induz a produção do transcrito aa-nat. Os níveis de RNA
mensageiro de aa-nat, extraídos de glândulas pineais de rato em cultura estimuladas ou
não com noradrenalina por 5 horas, foram determinados por RT-PCR em tempo real.
Valores foram normalizados em relação às glândulas não estimuladas. Valores
representam média ± epm, n = 3 glândulas por grupo experimental.
O efeito da corticosterona sobre a síntese de melatonina foi observado
após estimulação com noradrenalina 10 nM por 5 horas. Tendo em vista que a
transcrição do RNAm da enzima AA-NAT ocorre em tempos menores,
glândulas pineais cultivadas na presença ou na ausência de corticosterona
(1 µM, 48 h) e estimuladas com noradrenalina (10 nM) por diferentes períodos
de tempo (2, 3, 4 e 5 h) foram utilizadas para determinar o tempo ótimo para o
teste do efeito da corticosterona sobre a produção do transcrito aa-nat.
Verificou-se que a amplificação máxima da corticosterona sobre a transcrição do
gene da AA-NAT ocorre quando as glândulas são estimuladas por 5 horas com
noradrenalina (Fig. 18A).
Com base nos resultados obtidos, o efeito da concentração de 1 µM de
corticosterona sobre a produção do transcrito aa-nat foi testado com estimulação
55
Resultados
noradrenérgica de 5 horas (Fig. 18B). As glândulas tratadas com corticosterona
apresentaram uma produção aproximadamente 2 vezes maior do transcrito em
relação ao grupo estimulado apenas com noradrenalina (Fig. 18B).
B
6
NA 10 nM
+ Corticosterona 1µM
5
300
4
3
*
200
2
NA 10 nM
4
100
1
0
E xp ressão d o R N A m aa-na t
(x basal - G l. n ão
e stim ulad as)
Expressão do RNAm aa-nat
(x Gl. com NA por 1 hora)
A
0
1
2
3
4
5
6
7 horas
tempo incubação com NA
8
0
10
-
10
1
noradrenalina nM
corticosteronaµM
Figura 18. Efeito da corticosterona sobre a produção do transcrito aa-nat.
Glândulas pineais em cultura na presença ou na ausência de corticosterona (1 µM,
48 h), estimuladas por noradrenalina (10 nM) tiveram a quantidade do RNAm do gene
aa-nat determinados por RT-PCR em tempo real. A) incubação com noradrenalina por
diferentes períodos de tempo (2-5 horas, quadrados) ou noradrenalina mais
corticosterona (círculos). Os valores foram normalizados a partir de glândulas
estimuladas com noradrenalina por 1 h. B) Glândulas na ausência (barra branca) ou na
presença (barra preta) de corticosterona e estimuladas por noradrenalina por 5 horas.
Os dados foram normalizados por glândulas cultivadas e não estimuladas com
noradrenalina. Valores representam média ± epm, n = 4-8 glândulas por grupo
experimental (inseridos nas colunas). * p<0,05 vs grupo estimulado apenas com
noradrenalina.
2.5.
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
O efeito da corticosterona (0, 1 ou 10 µM, 24 h) sobre a atividade das
enzimas TPH, AA-NAT e HIOMT foi avaliado em glândulas pineais em cultura
estimuladas ou não com noradrenalina (10 nM, 5 h). A produção de serotonina
e melatonina foram determinadas por HPLC e e os produtos radioativos dos
ensaios de atividade enzimática da AA-NAT (14C-N-acetilserotonina) e da
HIOMT (14C-melatonina) foram determinados por contador β.
Nenhum dos tratamentos foi capaz de alterar a atividade de enzima TPH
(Fig. 19A). Em contrapartida, noradrenalina aumentou significativamente a
atividade da enzima AA-NAT quando comparado com o grupo não
56
Resultados
estimulado. Corticosterona per se não alterou a atividade desta enzima quando
comparada ao grupo controle (não estimulado), mas na concentração de 1 µM
foi capaz de potenciar a atividade desta enzima induzida por noradrenalina
(Fig. 19B). A atividade da enzima HIOMT não foi alterada nem por
noradrenalina nem por corticosterona de forma isolada. A estimulação conjunta
de noradrenalina e corticosterona (10 µM) aumentou em cerca de duas vezes a
atividade desta enzima quando comparada com o grupo estimulado somente
com noradrenalina (Fig. 19C).
A dosagem de melatonina nos meios de cultura mostrou que ambas as
doses de corticosterona potenciam a produção de melatonina induzida por
noradrenalina (Fig. 19D).
A
B
TPH
C N-acetilserotonina
(pmol/pineal/h)
3.0
1.5
0.0
0
0
10
10
10
NA nM
0
10
0
1
10
CORT µΜ
C
#
600
400
*
*
200
0
40
30
14
20
10
0
00
10
10
1010
00
10
10
0
11
0
10
10
0
10
0
1
10 NA nM
10 CORT µΜ
Melatonina
40
melatonina (ng/25 µL)
#
00
0
D
HIOMT
50
C melatonina
(pmol/pineal/h)
AA-NAT
800
14
5-hidroxitriptofano
(pmol/pineal/min)
4.5
#
30
#
*
20
10
0
1010 NA
NAnM
nM
0
10
10
10
NA nM
1010 CORT
µMµΜ
CORT
0
0
1
10
CORT µM
Figura 19. Efeito da corticosterona sobre a atividade das enzimas TPH, AA-NAT e
HIOMT. Glândulas pineais em cultura foram incubadas com corticosterona
(Cort; 1 ou 10 µM por 24 h, barras listradas) na presença (barras cinza) ou não (barras
brancas) de noradrenalina (NA; 10 nM por 5 h). A) Atividade enzimática da TPH. B)
Atividade enzimática da AA-NAT. C) Atividade enzimática da HIOMT. D) Produção
de melatonina. Valores representam média ± epm; n = 5-10 por grupo experimental.
* p<0,05 vs grupo controle (barras brancas), # p<0,05 vs grupo estimulado apenas com
noradrenalina.
57
Resultados
2.6.
ADRENALECTOMIA
A atividade da enzima TPH é inibida por adrenalectomia e restaurada
pela administração de corticosterona em núcleos da rafe de mesencéfalo de
ratos (Malek et al., 2007). Já a estabilidade e atividade da HIOMT dependem da
disponibilidade do cofator S-adenosil-metionina (SAM) como doador de
metilas (Ciaranello, 1978; Sandrock et al., 1980). Foi demonstrado que
hipofisectomia reduz a atividade das enzimas envolvidas na via biossintética de
SAM e que dexametasona reverte o processo (Wong et al., 1985).
Tendo em vista que corticosterona não altera a atividade da TPH, mas é
capaz de potenciar a atividade da HIOMT em glândulas pineais em cultura, foi
testado o efeito da inibição da produção de glicocorticóides endógenos por
adrenalectomia (ADX) sobre a produção hormonal da glândula pineal. Para
tanto, glândulas pineais de ratos controle ou adrenalectomizados foram
incubadas com noradrenalina (10 nM, 5 horas) e a produção de 5-HTP, 5-HT,
NAS e melatonina foram dosadas nos meios de cultura por HPLC.
Os resultados obtidos mostram que a adrenalectomia não alterou a
produção de 5-HTP (Fig. 20A), 5-HT (Fig. 20B) e NAS (Fig. 20C), mas inibiu a
produção de melatonina (Fig. 20D) em pineais de rato incubadas com
noradrenalina (10 nM, 5 horas).
58
Resultados
A
B
200
5-HT (ng/poço)
5-HTP (ng/poço)
12
8
4
150
100
50
0
controle
0
ADX
controle
ADX
D
70
70
60
60
Melatonina (ng/poço)
NAS (ng/poço)
C
50
40
30
20
10
0
*
50
40
30
20
10
controle
ADX
0
controle
ADX
Figura 20. Efeito da adrenalectomia sobre a produção hormonal da pineal. Glândulas
pineais de animais controles ou adrenalectomizados (ADX) (barras cinza) foram
estimuladas com noradrenalina (10 nM por 5 h). A) 5-HTP, B) 5-HT, C) NAS e D)
melatonina. Valores representam média ± epm; n = 5-6 glândulas por groupo
experimental; *p<0.05, vs grupo controle (barras brancas).
59
Resultados
3. Citocinas Pró-inflamatórias
Os resultados anteriores demostraram o envolvimento da via NF-κB
sobre a modulação da produção de melatonina pela glândula pineal. Como
citado na introdução, as citocinas inflamatórias IFN-γ e TNF podem atuar pela
ativação indireta ou direta deste fator de transcrição, respectivamente. Assim
sendo, o entendimento do efeito do IFN-γ e do TNF sobre a via NF-κB e sobre a
produção de melatonina permitirá a obtenção de dados complementares para
comprovar a relevância desta via na função pineal.
3.1.
IFN-γ
Como comentado anteriormente, IFN-γ aumenta a síntese de melatonina
in vitro. Tendo em vista que IFN-γ atua pela via da STAT, presente na pineal
(Takamiya et al., 2002), e que esta via pode interferir com a via do NF-κB,
testou-se o efeito deste fator de transcrição sobre o acúmulo nuclear de NF-κB e
sobre a produção de melatonina. Para tanto, foram usadas glândulas pineais de
rato em cultura incubadas com IFN-γ (10 ou 30 ng/mL) por 30 min e então
estimuladas com noradrenalina (10nM) por 5 h, ainda na presença de IFN-γ. O
acúmulo nuclear de NF-κB foi determinado por EMSA e quantificado por
densitometria óptica e a concentração de melatonina foi dosada por HPLC.
Os resultados apresentados na figura 21 mostram uma correlação inversa
entre os parâmetros avaliados. Como podemos observar, IFN-γ nas
concentrações de 10 e 30 ng/mL diminuiu o acúmulo nuclear de NF-κB das
pineais em cultura de forma concentração dependente (Fig. 21A) e a
concentração de IFN-γ 10 ng/mL aumentou a produção de melatonina
induzida por noradrenalina em aproximadamente 50% (Fig. 21B).
60
Resultados
A
B
0.4
Melatonina (ng/poço)
Complexo DNA-NF-κB (U.A.)
25
0.6
*
*
0.2
*
20
15
10
3
0
0.0
+
+
+
0
10
30
NA 10 nM
IFN- γ ng/mL
+
+
NA
10 nM
-
+
IFN-γ 10 ng/mL
Figura 21. Efeitos do IFN-γγ sobre a via NF-κ
κB e a produção de melatonina.
A) Acúmulo nuclear de NF-κB em glândulas pineais de rato na ausência (barra branca)
ou na presença de IFN-γ (10 ou 30 ng/mL, barras cinzas) por 30 min e estimuladas por
noradrenalina (NA, 10 nM) por 5 h. B) Produção de melatonina por glândulas pineais
na ausência (barra branca) ou na presença de IFN-γ (10 ng/mL, barra cinza) por 30 min
e estimuladas por NA (10 nM) por 5 h. Valores representam média ± epm; n = 5-6
glândulas por grupo experimental; * p<0,05 vs grupo estimulado apenas com
noradrenalina.
Como descrito anteriormente, o efeito potencializador da corticosterona
sobre a síntese de melatonina é observado na vigência de estimulação βadrenérgica, mas é invertido quando ocorre a estimulação concomitante de
receptores adrenérgicos dos subtipos α1 e β. Para testar se o mesmo fenômeno
ocorre com o IFN-γ foram usadas glândulas pineais em cultura incubadas com
esta citocina (10 ng/mL) por 30 min e então estimuladas com uma concentração
maior de noradrenalina (100 nM) por 5 horas ainda na presença do IFN-γ.
Podemos observar que, apesar do tratamento com IFN-γ ter inibido a via
NF-κB (Fig. 22A), a produção de melatonina induzida por uma alta estimulação
noradrenérgica não foi alterada (Fig. 22B).
61
Resultados
A
B
100
0.6
Melatonina (ng/poço)
Complexo DNA-NF-κB (U.A.)
0.7
0.5
*
0.4
0.3
0.2
0.1
75
50
25
0.0
0
+
+
-
+
NA 100 nM
IFN- γ 10 ng/mL
+
+
-
+
NA 100 nM
IFN-γ 10 ng/mL
Figura 22. Efeitos do IFN-γγ sobre a via NF-κ
κB e a produção de melatonina.
A) Acúmulo nuclear de NF-κB em glândulas pineais de rato na ausência (barra branca)
ou na presença de IFN-γ (30 ng/mL, barra cinza) por 30 min e estimuladas por
noradrenalina (NA, 100 nM) por 5 h. B) Produção de melatonina por glândulas pineais
na ausência (barra branca) ou na presença de IFN-γ (10 ng/mL, barra cinza) por 30 min
e estimuladas por NA (100 nM) por 5 h. Valores representam média ± epm; n = 4
glândulas por grupo experimental; * p<0,05 vs grupo estimulado apenas com
noradrenalina.
3.2.
TNF
Tendo verificado que a inibição da via NF-κB potencia a produção de
melatonina, avaliou-se o efeito da ativação desta via sobre a produção do
hormônio pineal. Para tanto, glândulas pineais de rato foram incubadas com
TNF (30 ng/mL) por curtos períodos de tempo (5, 10 ou 15 minutos) e tiveram
os níveis nucleares de NF-κB presentes em suas células determinados por
EMSA e quantificados por densitometria óptica.
Os resultados mostram que a incubação com TNF por 5 min aumentou
em duas vezes os níveis nucleares de NF-κB nos núcleos das células da
glândula pineal. As incubações mais prolongadas não levaram à alteração da
quantidade de NF-κB translocado para o núcleo (Fig. 23A).
62
Resultados
Dando sequência a este estudo, glândulas pineais de rato incubadas ou
não com TNF (30 ng/mL, 30 min) foram estimuladas com noradrenalina
100 nM (5 h) por ser uma concentração capaz de estimular tanto receptores α1
quanto β-adrenérgicos. Os níveis de melatonina produzidos e liberados no meio
de cultura foram dosados por HPLC. O tratamento com TNF reduziu em
aproximadamente 50 % os níveis de melatonina produzidos após estimulação
noradrenérgica em pineais de rato em cultura (Fig. 23B).
B
A
45
Melatonina (ng/poço)
Complexo DNA-NF-kB (U.A.)
1.0
*
0.8
0.6
0.4
0.2
30
*
15
0
0.0
0
5
10
15
min (TNF 30 ng/mL)
+
-
+
+
NA 100 nM
TNF 30 ng/mL
Figura 23. Efeitos do TNF sobre a via NF-κ
κB e a produção de melatonina.
A) Glândulas pineais em cultura na ausência (barra listrada) ou na presença de TNF
(30 ng/mL, 5, 10 ou 15 min; barras cinza) tiveram seus níveis de NF-κB nuclear
determinados. Valores representam média ± epm; n = 3 glândulas por grupo
experimental. * p<0,05 vs grupo controle. B) Melatonina produzida por glândulas
pineais em cultura na ausência ou na presença de TNF (30 ng/mL, 30 min; barra cinza)
e estimuladas por noradrenalina (NA; 100 nM, 5 h. barra branca). Valores representam
média ± epm, n = 4 glândulas por grupo experimental. * p<0,05 vs grupo na ausência
de TNF (A) ou estimulado apenas com noradrenalina (B).
3.2.1. NAS E RNAM DE AA-NAT, HIOMT E 14-3-3
A expressão e regulação das enzimas da via biossintética de melatonina
são passos importantes e passíveis de modulação. Neste sentido, glândulas
pineais mantidas em cultura por 48 horas foram incubadas por diferentes
períodos de tempo (0,5, 1, 6, 12, 24 e 48 h) com TNF (30 ng/mL) e então
estimuladas por noradrenalina (100 nM, 5 h). A expressão dos transcritos aa-nat,
63
Resultados
hiomt e 14-3-3 foram determinadas por RT-PCR em tempo real. Os níveis de
NAS produzidos e liberados nos meios de cultura foram dosados por HPLC.
Nenhum dos tratamentos com TNF alterou a transcrição dos genes da
HIOMT (NA= 1,08 ± 0,22, n=5 vs NA + TNF 30 min = 1,09 ± 0,17, n=3) e da
proteína 14-3-3 (NA = 0,96 ± 0,16, n = 5 vs + TNF 30 min = 0,96 ± 0,12, n=3), mas
foi observada uma inibição transitória da expressão do gene da AA-NAT. A
inibição máxima foi observada 30 minutos após a incubação com TNF. Este
efeito ocorreu nos tempos subseqüentes até o grupo incubado doze horas com
TNF. A inibição observada foi perdida nas incubações com TNF por 24 e 48
horas (Fig. 24A).
O efeito obtido sobre a expressão do RNA mensageiro da enzima AANAT refletiu-se na produção de NAS dosada nos meios de cultura. A produção
da indolamina induzida por noradrenalina foi reduzida em aproximadamente
70% no grupo incubado com TNF por 30 minutos. Este efeito ainda é observado
com 1, 6 e 12 horas de incubação com a citocina, começando a diminuir com 24
horas e sendo perdido no grupo incubado por 48 horas com TNF (Fig. 24B).
B
TNF (30 ng/mL)
50
90
60
30
*
*
0
*
*
0 0,5 1 6 12 24 48 h
N A S (n g / p o ç o )
E x p r e ssã o d o R N A m a a -n a t
(x B a sa l - G l. n ã o e stim u la d a s)
A
TNF (30 ng/mL)
25
*
* * * *
0
0 0,5 1 6 12 24 48 h
Figura 24. Efeitos do TNF sobre a produção do transcrito aa-nat e de NAS. Glândulas
pineais em cultura na presença (barras cinza) ou ausência (barras brancas) de TNF (30
ng/mL) e estimuladas com noradrenalina (100 nM). A) RNAm do transcrito aa-nat. B)
concentração de NAS. Os dados foram normalizados por glândulas cultivadas e não
estimuladas com noradrenalina. Valores representam média ± epm, n = 3-6 glândulas
por grupo experimental. * p<0,05 vs grupo estimulado apenas com noradrenalina.
64
Resultados
3.2.2. SÍNTESE PROTÉICA E PRODUÇÃO DO TRANSCRITO AA-NAT
A transitoriedade do efeito observado sobre a transcrição de aa-nat pode
estar relacionada com a produção da molécula repressora IκB induzida pelo
próprio fator de transcrição NF-κB. Neste sentido, para avaliar indiretamente
esta hipótese foi analisada a participação de síntese protéica neste processo em
glândulas pineais pré-incubadas ou não com o inibidor do processo de tradução
na síntese protéica cicloheximida (10 µg/mL, 24h) e então incubadas ou não
com TNF (30 ng/mL) por 30 min ou 24 horas. Todas as glândulas foram
estimuladas com noradrenalina (100 nM) e os conteúdos de RNA mensageiro
do gene da enzima AA-NAT foram determinados por RT-PCR em tempo real.
O tratamento com cicloheximida não alterou a produção do transcrito aanat no grupo estimulado apenas com noradrenalina e também não inibiu o
efeito do TNF sobre a síntese deste transcrito quando incubado por 30 minutos
antes da estimulação com noradrenalina. Em contrapartida, o tratamento com
cicloheximida manteve o efeito inibitório do TNF sobre a produção do RNA
mensageiro aa-nat quando este foi incubado com a citocina por 24 horas antes
da estimulação noradrenérgica (Fig. 25), indicando que o retorno aos níveis
basais de RNAm de aa-nat após esse período de incubação é dependente de
neossíntese protéica.
65
Resultados
Expressão do RNAm aa-nat
(x Basal - Gl. não estimuladas)
CHX 10 µg/mL
0
0,5
24
horas (TNF 30 ng/mL)
Noradrenalina 100 nM
Figura 25. Relevância da síntese protéica no efeito transitório do TNF sobre a
produção do transcrito aa-nat em pineais em cultura. Glândulas pineais préincubadas ou não com cicloheximida (CHX, 10 µg/mL, 24 h; barras cinza) e então
incubadas (tempos 0,5 e 24 horas) ou não (tempo 0) com TNF (30 ng/mL) foram
estimuladas com noradrenalina (NA, 100 nM, 5 h). Os conteúdos de RNA mensageiro
do gene da enzima AA-NAT foram determinados. Os dados foram normalizados por
glândulas cultivadas e não estimuladas com noradrenalina. Valores representam média
± epm, n = 4 glândulas por grupo experimental. # p<0,05 vs grupo estimulado apenas
com noradrenalina; * p<0,05 vs grupo estimulado com noradrenalina na presença de
TNF por 24 horas.
66
Discussão
V. DISCUSSÃO
A integração dos diversos sistemas endógenos resulta em padrões
dinâmicos de funcionamento capazes de manter a oscilação rítmica interna dos
organismos necessária para a sobrevivência. É esta característica que habilita os
seres vivos a organizarem-se temporalmente e antecipar variações cíclicas do
meio ambiente. Em situações patológicas agudas, esta organização temporal
pode ser alterada de forma a facilitar a resposta fisiopatológica permitindo a
solução ou mesmo a adaptação ao problema. Neste contexto, o presente
trabalho demonstra que a glândula pineal, além de sua função como
transdutora endógena da informação fótica ambiental, pode funcionar como
um sensor interno capaz de detectar e responder temporalmente a agentes
moduladores de processos fisiopatológicos. Esta tese faz parte de uma série de
trabalhos que permitiram concluir que a glândula pineal integra a resposta de
defesa imune, fazendo parte dos dados que levaram à proposta da existência de
um EIXO IMUNE-PINEAL.
O efeito de glicocorticóides sobre a pineal era bastante controverso e,
como pode ser apreciado na Introdução, poderia resultar em potenciação,
inibição ou mesmo em nenhuma alteração sobre a atividade biossintética desta
glândula. Os dados obtidos nesta tese, que teve como diferencial a avaliação de
diferentes concentrações de corticosterona, vêm confirmar que este hormônio
apresenta um efeito dual sobre a pineal. Isto é, pode potenciar ou inibir a
produção de melatonina induzida por ativação simpática, na dependência da
concentração de corticosterona analisada e da intensidade da estimulação
simpática.
Pela primeira vez foi mostrado que corticosterona potencia a produção
do precursor N-acetilserotonina e da própria melatonina induzida por
concentrações de noradrenalina que ativam adrenoceptores β (10 nM). Este
efeito potenciador ocorre com as menores concentrações de corticosterona
testadas. Ao se atingir a concentração de corticosterona de 100 µM não foi
observada alteração da produção de NAS e MEL induzidas por noradrenalina
67
Discussão
10 µM. Este efeito em sino poderia continuar em um efeito dual, isto é,
corticosterona chegando a inibir a produção de melatonina induzida por
ativação simpática. Em 1989, já havia sido constatado que glicocorticóides
poderiam inibir a atividade da AA-NAT em pineais em cultura estimuladas de
forma a produzir a resposta máxima (Yuwiler, 1989).
Com o objetivo de testar o efeito da corticosterona após ativação dos dois
sistemas de receptores, foram usados os agonistas seletivos de adrenoceptores α
(fenilefrina) e β (isoprenalina). Foi observado que a corticosterona potencia a
produção de melatonina induzida por isoprenalina, mas inibe o aumento
induzido por fenilefrina. Este dado leva à conclusão de que quando os dois
sistemas são estimulados há uma inversão do efeito da corticosterona. Por outro
lado, também tem que ser considerada a hipótese que corticosterona inibiria
uma produção alta de melatonina, visto que com altas concentrações de
noradrenalina ocorre uma inibição da via biossintética deste hormônio pela
corticosterona (Yuwiler, 1989). Em resumo, corticosterona é capaz de potenciar
a produção de melatonina induzida por uma estimulação moderada de
noradrenalina, mas inibe em estimulações muito altas.
Considerando que os peptídeos CRH e ACTH que são liberados pela
ativação do eixo HPA são capazes de aumentar transientemente a ativação do
gânglio cervical superior e a liberação de noradrenalina (Sabban et al., 2004;
Serova et al., 2003) e que em alguns modelos de estresse a inibição da produção
de melatonina é contrabalanceada pela hipofisectomia (Troiane et al., 1987)
pode-se concluir que, em determinadas situações de injúria, pode haver uma
redução da produção noturna de melatonina. Em outras palavras, a estimulação
concomitante de adrenoceptores α e β e de receptores de glicocorticóides gera
uma situação que pode levar à redução da produção de melatonina.
Por outro lado, a produção noturna de melatonina em roedores
saudáveis é mediada apenas por adrenoceptores β (Tobin et al., 2002) e,
portanto, a administração de corticosterona neste modelo experimental deveria
levar a um aumento da produção noturna de melatonina. Em condições de
estresse de contensão, que é considerada uma condição injuriante leve, sem
68
Discussão
ativação do sistema autonômico, o aumento de corticosterona circulante é
acompanhado do aumento da produção noturna de melatonina (Couto-Moraes
et al., no prelo).
Na presente tese foi utilizado o método de perfusão por microdiálise
intrapineal para avaliar se em animais normais corticosterona poderia aumentar
a produção noturna de melatonina. Os animais utilizados apresentavam um
perfil rítmico padrão de produção de corticosterona indicando que o eixo HPA
não estava estimulado. Nestas condições, a corticosterona potenciou a síntese
de melatonina. Estes dados, além de confirmarem que corticosterona pode
aumentar a produção de melatonina in vivo, também reforçam a ideia de que,
em condições normais, há uma predominância de estimulação β-adrenérgica na
glândula pineal.
Os experimentos de microdiálise também mostram que a corticosterona
não induz per se a produção de melatonina, visto que nos experimentos em que
a perfusão foi iniciada durante a fase de claro (ZT 2) não ocorreu produção
concomitante (diurna) de melatonina, sendo esta potenciada apenas na fase de
escuro. No entanto, o efeito da corticosterona é imediato quando o início da
perfusão ocorre uma hora após o apagar das luzes (ZT 13), pois foi observada
uma potenciação da produção do hormônio pineal logo na primeira noite. Em
resumo, estes dados indicam que em condições normais ou na vigência de uma
injúria leve ocorre um aumento na produção noturna de melatonina induzida
pela corticosterona.
1. Controle
da
via
biossintética
da
melatonina
pela
corticosterona
O estudo da atividade das enzimas da via biossintética da melatonina
(TPH, AA-NAT e HIOMT), realizado com glândulas em cultura, mostra um
efeito específico da corticosterona sobre cada enzima. A segunda enzima desta
via biossintética é a TPH, que transforma o 5-hidroxitriptofano em serotonina.
A atividade desta enzima não foi alterada por tratamento com corticosterona in
69
Discussão
vitro e a quantidade de serotonina presente em glândulas pineais de animais
controle não diferiu daquela de animais adrenalectomizados. No entanto, em
núcleos da rafe do mesencéfalo de ratos, a expressão do RNA mensageiro, bem
como a atividade da TPH são reduzidas por adrenalectomia (Malek et al., 2004,
2005 e 2007), o que sugere uma especificidade do efeito da corticosterona em
diferentes tecidos. Existem duas isoformas de TPH (1 e 2) codificadas por genes
diferentes. Os neurônios serotonérgicos cerebrais expressam uma quantidade
150 vezes maior da isoforma 2 em comparação com a isoforma 1 (Walther et al.,
2003), enquanto que em pineais de ratos a expressão da isoforma 1 é 105 vezes
superior a da isoforma 2 (Sugden, 2003). Portanto, esta diferença de isoformas
poderia explicar a especificidade da ação da corticosterona em cada tecido.
As enzimas que transformam serotonina em N-acetilserotonina e esta em
melatonina foram alteradas pelo tratamento in vitro com corticosterona. Nas
condições dos experimentos em cultura foi observado um aumento da
produção do RNA mensageiro do transcrito aa-nat e da atividade da AA-NAT e
da HIOMT. Já a transcrição do RNA mensageiro da HIOMT não sofreu
alteração. Estas mudanças na atividade das enzimas estão de acordo com o
aumento da produção de NAS e melatonina descritos anteriormente. O efeito
sobre a atividade da AA-NAT pode ser entendido como o reflexo do aumento
da transcrição do RNAm aa-nat, contudo, no caso da HIOMT, nenhum
tratamento alterou a produção de transcrito que lhe dá origem, indicando que
alterações pós-traducionais estão envolvidas na modulação da atividade desta
enzima.
A atividade das enzimas que metilam indolaminas (HIOMT) e
catecolaminas (fenil-etanolamina-N-metil transferase – PNMT; catecol-Ometiltransferase – COMT) depende do cofator S-adenosil-metionina (SAM)
como doador de metilas (citado por Sandrock et al., 1980). A estabilidade da
PNMT na adrenal e da HIOMT na pineal é conferida pela disponibilidade de
SAM (Ciaranello, 1978; Sandrock et al., 1980). Hipofisectomia reduz a atividade
das enzimas envolvidas na via biossintética de SAM e estas podem ser
restauradas pelo tratamento com dexametasona (Wong et al., 1985). No presente
70
Discussão
trabalho foi verificado que a adrenalectomia é capaz de reduzir o conteúdo de
melatonina, sem alterar o conteúdo de N-acetilserotonina – o que está de acordo
com uma redução da atividade da HIOMT na falta de corticosterona. Este
último dado permite não só caracterizar o efeito da corticosterona sobre a
HIOMT, mas também sugere uma explicação para a supressão da produção
noturna
de
melatonina
após
adrenalectomia
de
animais
inflamados
cronicamente (Lopes et al., 2001). A redução da disponibilidade de SAM levaria
a uma inibição da atividade da HIOMT, impedindo a síntese de melatonina,
mesmo durante o escuro.
2. Mecanismos Celulares e Moleculares dos Glicocorticóides
O efeito dos glicocorticóides em tecidos inervados pelo sistema nervoso
simpático pode ocorrer de pelo menos duas maneiras diferentes. Uma seria
aumentando o tempo de disponibilidade de noradrenalina na fenda sináptica
por bloquear a captação extraneuronal de catecolaminas (Trendelenburg, 1978),
e a outra seria agindo sobre os mecanismos de controle da expressão gênica
(Necela & Cidlowski, 2004).
Glândulas pineais em cultura são capazes de captar adrenalina de forma
eficiente, mas esta captação não é potenciada por corticosterona. Portanto, este
tecido apresenta uma atividade de captação diferente em relação a outros
estudados, tal como o ducto deferente de rato (Avellar et al., 1988 e 1990), tendo
sido descartado este mecanismo não-genômico entre os responsáveis pela
potenciação da produção de melatonina induzida por ativação simpática.
A glândula pineal de ratos expressa receptores para glicocorticóides (GR)
em concentrações compatíveis com o desenvolvimento de uma resposta
funcional (Ferreira et al., 2005), visto que o número de receptores presentes
chega a 50% dos detectados no fígado, tecido que tem alta expressão dos
mesmos (Ballard et al., 1974). A ligação de glicocorticóides a GR no citoplasma
leva à dissociação deste da proteína de choque térmico 90 (hsp90) e à
translocação do complexo para o núcleo, onde se liga a sequências
71
Discussão
palindrômicas
específicas
chamadas
de
elementos
responsivos
de
glicocorticóides (GRE), resultando no aumento da transcrição de vários genes.
Além disso, o complexo glicocorticóide/GR pode ligar-se a outros fatores de
transcrição, tais como NF-κB, STAT e AP-1, mudando de forma marcante o
padrão transcricional das células alvo (Almawi et al., 2002, Nacela & Cidlowski,
2004).
Os receptores de glicocorticóides medeiam o efeito da corticosterona
sobre a glândula pineal, visto que a potenciação da produção de NAS é
bloqueada por mifepristone, um antagonista de GR. Neste trabalho foi
verificada, pela primeira vez, a presença do fator de transcrição NF-κB em
glândulas pineais. A inibição deste fator de transcrição levou a um aumento da
potenciação da NAS, mimetizando o efeito observado com corticosterona. A
inibição funcional do NF-κB foi feita bloqueando a sua interação aos possíveis
domínios de interação com DNA, usando PDTC, ou impedindo a ativação deste
fator de transcrição pela inibição de proteassomas com ALLN.
A questão ainda não respondida é se o efeito do glicocorticóide ocorre
diretamente sobre GREs ou por transrrepressão do fator de transcrição NF-κB.
Camundongos nocauteados para GR não sobrevivem (para revisão ver Cole et
al., 1995), enquanto os que têm uma mutação no receptor, o que impede a
ligação do dímero ativado ao GRE mas que ainda permite a transrepressão do
NF-κB, são animais que podem sobreviver em condições de laboratório
(Reichardt et al., 1998). Estes e outros dados têm levado vários autores a
considerar que a transrrepressão de fatores de transcrição por glicocorticóides
deva ser um mecanismo tão ou mais importante que a própria ligação ao GRE
(Karin & Chang, 2001). Estes mecanismos genômicos podem induzir expressões
fenotípicas que reforçam a inibição desta via de transcrição. Vários modelos
celulares envolvendo células imunocompetentes, de linhagem ou primárias,
apresentam um aumento na expressão de IκBα ao serem expostas a
glicocorticóides. No entanto, este mecanismo não é universal, pois outros
modelos experimentais não são capazes de desenvolver este fenótipo (para
revisão ver De Boscher et al., 2003). Em tecido cerebral de ratos, por exemplo, a
72
Discussão
ativação de NF-κB induzida por LPS ou estresse é reduzida por glicocorticóides
e amplificada por adrenalectomia na dependência do aumento ou da redução
da expressão de IκBα (Quan et al., 2000).
Independente do mecanismo intrínseco que ocorre na pineal foi
demonstrado que corticosterona inibe o acúmulo nuclear de NF-κB e potencia a
transcrição de aa-nat, sugerindo que o mecanismo de ação deste hormônio seja
genômico.
A via de sinalização NF-κB é uma via central e pleiotrópica na mediação
de respostas imune inatas. Isto é, participa das respostas estereotipadas
resultantes de processos infecciosos, microbacterianos ou virais, de processos
inflamatórios gerados por agentes físicos ou químicos e da remoção de debris
celulares (Ghosh & Hayden, 2008). No contexto deste trabalho, foi avaliada em
seguida a participação de citocinas pró-inflamatórias que teriam a capacidade
de modular a via de transcrição NF-κB.
3. Efeito de citocinas sobre a função pineal
No processo de defesa primário, TNF é produzido por macrófagos e
monócitos ativados e tem como principal função o recrutamento e a ativação de
neutrófilos e monócitos para o foco infeccioso (Tracey & Cerami, 1993). Esta
citocina ativa receptores de membrana que levam à transcrição de um conjunto
de genes que medeiam a resposta de defesa. Os efeitos do TNF em células
imunocompetentes são mediados pela via de transcrição NF-κB (para revisão
ver Wajant et al., 2003). Desta forma, esta citocina foi utilizada para avaliar os
efeitos da ativação da via NF-κB em glândulas pineais em cultura.
No modelo utilizado, TNF promoveu translocação transiente de NF-κB
para o núcleo. Os tempos avaliados foram de 5, 10 e 15 minutos e apenas aos 5
minutos foi observado um acúmulo significativamente superior ao controle.
Esta ativação bastante rápida do fator de transcrição foi acompanhada de uma
inibição da produção de melatonina. O decurso temporal com que TNF induz o
acúmulo de NF-κB em outros tecidos é bastante variável. Em músculo liso
73
Discussão
vascular, aos 30 minutos de incubação é observado um pequeno aumento,
enquanto o acúmulo máximo é observado após 60 minutos (Giordano et al.,
2006). Em células HeLA a translocação nuclear de NF-κB induzida por TNF é
evidente aos 10 minutos e atinge o pico aos 20 minutos, mantendo-se estável até
120 minutos (Heissmeyer et al., 1999). Um estudo mais detalhado com duas
linhagens de células humanas (células T e monócitos) e com fibroblastos de
camundongos mostrou um decurso temporal específico para cada célula
(Hoffmann et al., 2002). Este trabalho propõe que a transitoriedade, ou
ritmicidade, da permanência do complexo NF-κB no núcleo está na
dependência da indução da transcrição do gene da proteína inibitória do
NF-κB. Vale mencionar que existem três isoformas desta proteína inibitória
(IκBα, β e γ). A síntese da isoforma IκBα é altamente controlada pelo conteúdo
de NF-κB no núcleo, visto que o promotor do gene desta proteína é altamente
responsivo a NF-κB, permitindo um mecanismo de autocontrole (Scott et al.,
1993). A partir dos dados iniciais obtidos neste trabalho, abre-se uma nova linha
de investigação, que deverá avaliar a relevância fisiopatológica e os
mecanismos regulatórios da via de transcrição NF-κB na pineal.
TNF induz uma inibição transiente da transcrição do gene aa-nat, o que
se traduz em uma inibição transiente na produção de NAS. Esta transiência é
dependente de síntese protéica, visto que é inibida pela incubação das pineais
com cicloheximida, um bloqueador de síntese protéica. Em vista do exposto
acima, é possível que a indução da síntese de IκBα seja um fator decisivo no
término da ação ou na transitoriedade da ativação da via NF-κB em pineais de
rato. Outro ponto que merece ser mencionado é que há um importante retardo
entre a ativação do NF-κB e a indução da transcrição do gene aa-nat e da
produção de NAS. Glândulas incubadas por 10 minutos com TNF não mais
apresentavam um conteúdo aumentado de NF-κB no núcleo, enquanto que a
reversão da inibição da transcrição do gene aa-nat e da produção de NAS foram
observadas após 24 e 48 horas de incubação. Portanto, apesar deste trabalho
mostrar alguns dados que apontam o papel do TNF no controle da síntese de
74
Discussão
melatonina, ainda há muitos pontos que precisam ser esclarecidos e que
provavelmente permitirão melhor compreenção do papel da glândula pineal
frente a processos de injúria.
Tendo discutido os mecanismos que poderiam estar sendo mediados
pela via de sinalização NF-κB na pineal, o passo seguinte é indagar se esta
sinalização participa de processos fisiopatológicos de controle da atividade
pineal. Como mencionado anteriormente, é sabido que TNF é uma das
primeiras citocinas liberadas durante respostas inflamatórias agudas a partir da
produção por células imunocompetentes residentes sendo, em seguida,
produzida também por células recrutadas para o local da lesão (para revisão
ver Turnbull & Rivier, 1999). Assim sendo, seria interessante verificar se no
início de uma resposta inflamatória haveria um bloqueio da produção de
melatonina pela glândula pineal.
Pontes e colaboradores(2006) testaram esta hipótese em humanos. Foi
determinado o conteúdo de TNF e melatonina em colostro de parturientes
controles ou que apresentavam mastite, uma inflamação não infecciosa da
mama que se inicia no processo de sucção durante a amamentação. Neste
modelo foi verificado que parturientes controles apresentaram um ritmo
normal de melatonina, com altas concentrações desta indolamina na fase
noturna e baixas concentrações na diurna. Além disto, estas não tinham
concentrações
mensuráveis
de
TNF.
Por
outro
lado,
as
mães
que
desenvolveram mastite não apresentaram o pico noturno de melatonina e
mantiveram altas concentrações de TNF (Pontes et al., 2006). Mais recentemente,
foram comparadas parturientes que passaram por parto normal ou cesariano.
As que sofreram parto normal, a exemplo do descrito acima, apresentaram
ritmo normal de melatonina e não tiveram quantidades mensuráveis de TNF,
enquanto que as que sofreram parto cesariano não apresentaram ritmo de
melatonina (Pontes et al., 2007). Nos dois casos, foi observada uma correlação
negativa entre as concentrações de TNF e melatonina, o que vem a corroborar
os dados deste trabalho.
75
Discussão
O IFN-γ é uma citocina pró-inflamatória cujas ações ocorrem, em grande
parte, pela ativação da via JAK/STAT1 (Meraz et al., 1996). Contudo, é bem
descrita na literatura a capacidade do IFN-γ em ”primar” respostas induzidas
por LPS em macrófagos (Jurkovich et al., 1991; Bundscuh et al., 1997) por
mecanismos capazes de ativar a via de transcrição do NF-κB (De Wit et al., 1996;
Held et al., 1999). No presente trabalho, IFN-γ apresentou efeito contrário, pois
inibiu o acúmulo nuclear do NF-κB em glândulas pineais em cultura. Por outro
lado, este efeito está de acordo com os dados aqui apresentados, pois esta
inibição da via NF-κB está correlacionada com o aumento da produção de
melatonina induzida por noradrenalina, efeito este observado em outros
trabalhos (Withyachumnarnkul et al., 1990). O efeito inibitório sobre esta via é
um achado inédito e estudos posteriores poderão desvendar novas formas de
ação do IFN-γ e aprimorar o conhecimento do papel da glândula pineal durante
processos fisiopatológicos.
4. Pineal enquanto um sensor da resposta imune inata
Os dados obtidos sugerem que a pineal seja capaz de perceber e
responder funcionalmente a diferentes agentes produzidos durante um
processo inflamatório. Esta resposta é expressa através da variação dos níveis
dos hormônios NAS e melatonina produzidos por esta glândula. Nessa
condição a glândula pineal passaria a ser um órgão ao mesmo tempo transdutor
temporal interno e sensor do estado patológico, pois sinaliza e controla de
maneira temporalmente ativa o processo inflamatório que o organismo está
enfrentando. Neste sentido, é possível hipotetizar que durante o começo de um
processo inflamatório, o aumento da liberação de noradrenalina pelos terminais
nervosos e da estimulação α-adrenérgica permitam que citocinas próinflamatórias, como o TNF, em associação aos altos níveis de corticosterona,
inibam a produção de NAS e melatonina pela glândula pineal. Com o passar do
tempo, a diminuição dos níveis de TNF, a diminuição de estimulação
α-adrenérgica sobre a pineal e a manutenção dos altos níveis de corticosterona
76
Discussão
no sistema favorecam o retorno para condições basais, isto é, a produção
noturna de melatonina voltaria a ser uma expressão da ativação de
adrenoceptores β (Fig. 26).
Fase pró-inflamatória
Corticosterona
TNF
Condição Normal
-
-
+
MEL
NA
MEL
+
NA
Fase anti-inflamatória
Corticosterona
+
MEL
+
NA
Figura 26. Variação da produção hormonal da glândula pineal durante processos
inflamatórios. A produção de melatonina pela glândula pineal está sobre o controle do
eixo retino-hipotalâmico durante condições normais. Na vigência de um processo
inflamatório, com o aumento da estimulação noradrenérgica proveniente das fibras
que inervam a pineal, o TNF liberado na fase pró-inflamatória induziria o aumento da
produção de corticosterona e, em associação a este hormônio, induziria a diminuição
da produção de melatonina pela glândula pineal. Com a resolução do processo a
redução da atividade noradrenérgica simpática, a redução de níveis de TNF e os altos
níveis de corticosterona durante a fase anti-inflamatória restabeleceriam (ou
aumentariam) a produção noturna de melatonina pela glândula pineal.
5. Eixo imune-pineal
A integração dos sistemas imune e neuroendócrino atua como sensor,
mantendo um estado de alerta preparado para reagir frente a situações de
estresses físicos, psicológicos ou patológicos (Blalock & Smith, 2007; Markus et
al., 2007; Srinivasan et al., 2008). A resposta a um agente estressor deve ser
temporalmente controlada de forma a combater com eficiência o agressor sem
agredir o próprio organismo. Neste sentido, diversos mecanismos de controle
foram selecionados de modo a permitir a detecção, o combate inicial ao
77
Discussão
agressor, a especialização no recrutamento das células de defesa combatentes e
a resolução ativa da resposta desencadeada. Qualquer tipo de desequilíbrio em
uma dessas fases resulta em respostas imunológicas inadequadas que podem
resultar na cronificação da doença ou do processo inflamatório (nos casos em
que a resposta não consegue combater efetivamente o agente agressor) ou pode
resultar em uma doença autoimune quando o sistema não se autodesliga.
Respostas inflamatórias a injúrias ou infecções induzem a migração de
leucócitos para a região afetada que neutralizam e eliminam os estímulos
injuriantes. O estado de prontidão do sistema imune é preponderante na
qualidade e efetividade da resposta e, neste contexto, as produções endógenas
de glicocorticóides e melatonina atuam sinergicamente no controle da
quantidade e na qualidade de células de defesa na corrente sangüínea. Este
controle multimediado regula, por exemplo, a migração destas células para
tecidos periféricos durante situações de higidez, sendo a alteração de suas
proporções quantitativas e qualitativas importantes sinais para a montagem de
respostas celulares de defesa.
Recentemente foi demonstrado que uma das funções dos glicocorticóides
endógenos é controlar a mobilização de neutrófilos da coluna óssea para o
sangue e para tecidos periféricos em situações não inflamatórias (Cavalcanti et
al., 2007). Os autores demonstraram que a adrenalectomia ou a inibição dos
receptores para glicocorticóides endógenos altera a fase de maturação de
neutrófilos e inibem a expressão de L-selectinas destas células resultando em
um maior número de neutrófilos na circulação sanguínea. Os tratamentos
também levaram a um aumento da expressão de moléculas de adesão e do
acúmulo nuclear de fator de transcrição NF-κB nas células endoteliais. A
melatonina, por sua vez, é capaz de inibir, em doses fisiológicas, o rolamento e
a aderência de neutrófilos ao endotélio (Lotufo et al., 2001) e inibir a
permeabilidade vascular induzida por leucotrieno B4 (Lotufo et al., 2006).
Melatonina também é capaz de controlar a produção e a disponibilização de
células imunocompetentes específicas através de suas ações sobre o timo e
sobre a produção da IL-2. Diversos trabalhos indicam que o ritmo circadiano de
78
Discussão
IL-2 é gerado pelo ritmo diário de melatonina (Lissoni et al., 1998; Pontes et al
2006). Esta interleucina induz a maturação de linfócitos do tipo Th no timo
sugerindo que a produção circadiana de melatonina contribui para a prontidão
do sistema de defesa do organismo.
No começo de uma resposta inflamatória, a migração de células
imunocompetentes para o foco inflamatório deve ocorrer prontamente,
independentemente da fase do dia em que isto ocorra. A inibição observada em
pineais de rato em cultura da via biossintética e da síntese de melatonina pelo
TNF (presente tese) e a existência da correlação inversa entre esta citocina e a
produção circadiana deste hormônio, em humanos que apresentam processos
inflamatórios (Pontes et al., 2006 e 2007), sugerem que o aumento da produção
de TNF, no começo de uma resposta inflamatória, induz uma inibição da
síntese de melatonina pela glândula pineal. Este efeito pode ainda ser associado
a uma inibição transitória da síntese de melatonina pela corticosterona se a
liberação de noradrenalina pelos terminais nervosos do GCS estiver levando a
uma ativação concomitante de receptores α e β adrenérgicos. A inibição da
melatonina
circulante
permite
uma
maior
migração
de
células
imunocompetentes através do endotélio e possibilita a montagem apropriada
da resposta inflamatória independentemente da fase do dia em que ela seja
requerida.
Durante a fase de combate aos agentes agressores a melatonina também
tem papéis funcionais importantes. Neste ponto, é preciso considerar as
diferenças entre a produção deste hormônio pela glândula pineal e a produção
local proveniente de células imunocompetentes. Células de defesa são capazes
de produzir localmente grandes quantidades de melatonina (Carrillo-Vicco et
al., 2005; Pontes et al., 2006) caracterizando uma transferência temporalmente
determinada da produção central imposta pela pineal para uma produção local
(Markus et al., 2007). O aumento local da produção de melatonina permite que
as atividades anti-inflamatórias, antibióticas e de scavenger de radicais livres
deste hormônio ocorram de maneira efetiva nos locais onde são necessárias.
Altas concentrações de melatonina estimulam a fagocitose de macrófagos
79
Discussão
(Pontes et al., 2006), inibem a proliferação de bactérias (Tekbas et al., 2008) e
podem diminuir os efeitos nocivos de radicais livres por ativar enzimas
antioxidantes (Reiter et al., 1997) ou por inibir a síntese de óxido nítrico
induzida por LPS em células endoteliais (Tamura et al., no prelo).
Melatonina favorece respostas imunes do tipo TH-1 induzindo uma
maior produção das citocinas IL-6, IL-10 e IFN-γ (Garcia-Maurino et al., 1997). O
aumento da síntese de melatonina local por células imunocompetentes pode
fazer com que uma maior quantidade destas citocinas seja produzida
localmente e liberada na corrente sanguínea. Como visto, IFN-γ potencia a
síntese de melatonina na glândula pineal. Assim como altas concentrações de
corticosterona podem estar, em colaboração com o TNF, inibindo a síntese
induzida por estimulação adrenérgica α e β de melatonina no começo de uma
resposta inflamatória é possível sugerir que, na fase de resolução do processo, a
ausência de estimulação α-adrenérgica sobre a pineal associada a altos níveis de
corticosterona aumentem a síntese de melatonina em sinergismo com o
aumento dos níveis circulantes de IFN-γ.
O fim da resposta inflamatória e o consequente restabelecimento da
condição de prontidão são tão importantes quanto a montagem e o combate
efetivo do processo de defesa. O aumento da fagocitose, a redução da produção
de radicais livres e os efeitos microbicidas da melatonina contribuem para que o
desequilíbrio induzido por elementos estressores seja combatido. Uma vez
resolvido o problema, a restauração do estado inicial de prontidão deve ser
alcançada. Neste contexto, a restabelecimento da produção de melatonina pela
glândula pineal induzida por corticosterona e IFN-γ voltaria a inibir a migração
de células imunocompetentes através do endotélio e, junto com a redução na
produção local de melatonina, permitiriam que o equilíbrio do sistema fosse
atingido (Fig. 27).
A presente tese sugere que a glândula pineal possa funcionar como um
“olho” que enxerga dentro do indivíduo percebendo e informando o estado de
higidez ou patológico do organismo. Esta capacidade, associada à sua função
enquanto órgão central no ajuste interno às variações cíclicas ambientais,
80
Discussão
controla a homeostase dinâmica interna dos organismos e permite respostas
apropriadas às diferentes situações que estes estão sujeitos ao longo de suas
vidas. Neste contexto, o eixo imune-pineal pode ser compreendido como um
dos maestros das respostas de defesa que, ao ajustar as fases e os períodos de
funcionamento de alguns componentes, preserva o andamento harmonioso da
orquestra.
Figura 27. Eixo imune-pineal. Em condições normais a produção rítmica de
melatonina é induzida por ativação β-adrenérgica e inibe a migração de células de
defesa para os tecidos periféricos. Quando na vigência de uma resposta inflamatória, a
produção central de melatonina é inibida durante a fase pró-inflamatória pela ação de
altos níveis de TNF e corticosterona. Estas substâncias atingem a pineal estimulada por
doses de noradrenalina capazes de ativar concomitantemente receptores α e βadrenérgicos. Nesta fase, ocorre a liberação da migração de células imunocompetentes
para o foco inflamatório, onde passam a produzir localmente melatonina. Na fase antiinflamatória, a perda de estimulação α-adrenérgica associada aos altos níveis
circulantes de corticosterona permite o retorno da produção noturna de melatonina
pela glândula pineal e a inibição da migração celular para o foco inflamatório.
81
Conclusões
VI. CONCLUSÕES
O presente trabalho demonstra o efeito de agentes moduladores de
processos inflamatórios sobre a função pineal. Esta ideia surgiu a partir de
trabalhos que indicavam uma possível modulação positiva da corticosterona
(Lopes et al., 2001) e do IFN-γ (Withyachumnarnkul et al., 1990) sobre a
produção de melatonina.
Corticosterona modula a produção de melatonina em pineais em cultura e
in vivo. Os dados apresentados revelam que o efeito da corticosterona sobre a
produção de melatonina é dependente da estimulação noradrenérgica aplicada.
Em situações em que os receptores do subtipo β-adrenérgicos estão ativados,
corticosterona potencia, mas inibe na vigência de estimulação β e α1adrenérgica. Quando o efeito da corticosterona é positivo ocorre o aumento da
expressão do transcrito aa-nat bem como da atividade das enzimas AA-NAT e
HIOMT da via biossintética da melatonina. Além da corticosterona, foi
demonstrado que as citocinas pró-inflamatórias TNF e IFN-γ também são
capazes de alterar a produção de melatonina em pineais em cultura, sendo que
TNF inibe e IFN-γ potencia a produção hormonal da pineal.
Um ponto importante deste trabalho foi a demonstração da presença e
funcionalidade das vias dos fatores de transcrição GR e NF-κB. Na glândula
pineal, a ativação da via do GR potencia enquanto que a ativação da via NF-κB
inibe a síntese de melatonina. Esta é a primeira vez que se demonstrou que a
maquinaria molecular classicamente imunomoduladora é capaz de controlar a
síntese de melatonina pela glândula pineal.
Os dados inéditos aqui apresentados permitem concluir que a glândula
pineal de roedores está aparelhada para responder a diferentes moduladores
produzidos durante um quadro fisiopatológico. Os estudos sugerem que esta
glândula possui um importante papel, não apenas no controle da ritmicidade
interna do organismo em situações de higidez, mas também em sua capacidade
de responder apropriadamente a condições injuriantes.
82
Resumo
VII. RESUMO
A melatonina produzida pela glândula pineal apresenta diversas ações
reguladoras da homeostase dinâmica interna de mamíferos. Suas ações
abrangem tanto a regulação de funções endógenas circadianas e sazonais em
situações de higidez quanto durante processos fisiopatológicos. O presente
trabalho avalia o efeito dos moduladores de processos inflamatórios
corticosterona, TNF e IFNγ sobre o metabolismo da glândula pineal. Os
resultados aqui apresentados mostram que: 1- Corticosterona potencia a síntese
de noradrenalina in vivo e in vitro na vigência de estimulação β-adrenérgica,
mas inibe a produção induzida por estimulação concomitante α e βadrenérgica. 2- Este efeito é dependente de ativação de GR e não altera a
captação extraneuronal de catecolaminas. 3- Corticosterona aumenta a
expressão do transcrito aa-nat e a atividade das enzimas AA-NAT e HIOMT. 4 –
Corticosterona inibe o acúmulo nuclear de NF-κB. 5- A inibição farmacológica
da via NF-κB mimetiza o efeito potenciador da corticosterona sobre a produção
hormonal da pineal. 6 – IFN-γ inibe a via NF-κB. 7 – IFN-γ potencia a produção
de melatonina pela glândula pineal. 8- TNF ativa a via NF-κB. 9 – TNF inibe a
produção de melatonina pela pineal. 10- TNF inibe transitoriamente a expressão
do transcrito aa-nat e NAS. 11 – A transitoriedade deste efeito é dependente de
neosíntese protéica. O presente trabalho mostra que a glândula pineal está
aparelhada para responder a diferentes agentes moduladores de processos
inflamatórios além de fortalecer e darem base para a hipótese da existência de
um eixo imune-pineal central no controle de processos patológicos em
mamíferos.
83
Abstract
VIII. ABSTRACT
The melatonin, synthetized by the pineal gland, exihibits a number of
regulatory activities on the internal dynamic homeostasis of mammals. These
functions are related to the regulation of endogenous circadian and seasonal
rhythms during healthy and physiopathological processes. This study evaluates
the effects of the inflammatory modulators, corticosterone, TNF and IFN-γ, over
the pineal gland metabolism. The results presented here show that:
1 - Corticosterone enhances the synthesis of norepinephrine in vivo and in vitro
in the presence of β-adrenergic stimulation, but inhibits the hormonal
production when both, α and β adrenoceptors, are activated. 2 - This effect
depends on the GR activation and does not interfere in the extraneuronal
uptake of catecholamines. 3 - Corticosterone increases the expression of the aanat transcript and also the enzymatic activity of AA-NAT and HIOMT.
4 - Corticosterone inhibits the nuclear accumulation of NF-κB. 5 – The
pharmacological
inhibition
of
NF-κB
pathway
mimics
the
effect
of
corticosterone on the hormonal production in pineal. 6 - IFN- γ inhibits the NFκB pathway. 7 - IFN-γ enhances the synthesis of melatonin in the pineal gland.
8- TNF activates the NF-κB pathway. 9 – TNF inhibits the production of
melatonin in the pineal gland. 10 - TNF transiently inhibits the production of
the aa-nat transcript and also of NAS. 11 - This transient effect depends on the
synthesis of proteins. This study shows that the pineal gland can respond to
different inflammatory modulators, supporting the hypothesis of a central
immune-pineal axis controlling pathological processes in mammals.
84
Referências Bibliográficas
IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBAS, A.K. & LICHTMAN, A.H. (2005). Cellular and molecular immunology.
updated Edition. Ed. ABBAS, A.K. & LICHTMAN A.H. Philadelphia:Elsevier
Saunders.
ADCOCK, I.M., NASUHARA, Y., STEVENS, D.A. & BARNES, P.J. (1999). Ligandinduced differentiation of glucocorticoid receptor (GR) trans-repression and
transactivation: preferential targetting of NF-kappaB and lack of I-kappaB
involvement. Br J Pharmacol, 127, 1003-1011.
ALMAWI, W.Y., & MELEMEDJIAN, O.K. (2002). Negative regulation of nuclear factorkappaB activation and function by glucocorticoids. J Mol Endocrinol, 28, 69-78.
ASCHOFF, J. (1960). Exogenous and endogenous components in circadian rhythms.
Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 25, 11-28.
AUPHAN, N., DIDONATO, J.A., ROSETTE, C., HELMBERG, A. & KARIN, M. (1995).
Immunosuppression by glucocorticoids: inhibition of NF-kappa B activity through
induction of I kappa B synthesis. Science, 270, 286-290.
AVELLAR, M.C. & MARKUS, R.P. (1988). Age-related changes in neuronal uptake of
catecholamines. Braz J Med Biol Res, 21, 553-555.
AVELLAR, M.C., KOBASHI, Y.L. & MARKUS, R.P. (1990). Age-related changes in
neuronal uptake of noradrenaline. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 341, 295300.
AXEROLD, J. & WEISSBACH, H. (1960). Enzymatic O-methylation of Nacetylserotonin to melatonin. Science, 131, 1312.
BAEUERLE, P.A & BALTIMORE, D. (1996). NF-kappa B: ten years after. Cell, 87, 13-20.
BALDWIN, A.S. JR. (1996). The NF-kappa B and I kappa B proteins: new discoveries
and insights. Annu Rev Immunol, 14, 649-683.
BALER, R., COVINGTON, S. & KLEIN, D.C. (1997). The rat arylalkylamine Nacetyltransferase gene promoter. cAMP activation via a cAMP-responsive elementCCAAT complex. J Biol Chem, 272, 6979-6985.
BALLARD, P.L., BAXTER, J.D., HIGGINS, S.J., ROUSSEAU, G.G. & TOMKINS, G.M.
(1974). General presence of glucocorticoid receptors in mammalian tissues.
Endocrinology, 94, 998-1002.
BARASSIN, S., SABOUREAU, M., KALSBEEK, A., BOTHOREL, B., VIVIEN-ROELS, B.,
MALAN, A., BUIJS, R.M., GUARDIOLA-LEMAITRE, B. & PÉVET, P. (1999).
85
Referências Bibliográficas
Interindividual differences in the pattern of melatonin secretion of the Wistar rat. J
Pineal Res, 27, 193-201.
BARBOSA, E.J.M., FERRIERA, Z.S. & MARKUS, R.P. (2000). Purinergic and
noradrenergic cotransmission in the rat pineal gland. Eur J Pharmacol, 401, 59-62.
BEATO, M. (1989). Gene regulation by steroid homones. Cell, 56, 335-344.
BECK-FRIIS, J., HANSSEN, T., KJELLMAN, B.F., LJUNGGREN, J.G., UNDEN, F. &
WETTERBERG, L. (1983). Serum melatonin and cortisol in human subjects after
administration of dexamethasone and propranolol. Psychopharmacol Bull, 19, 646648.
BESANÇON, R., REBOUL, A., CLAUSTRAT, B., JOUVET, A., BELIN, M.F. & FEVREMONTANGE, M. (1997). Tryptophan hydroxylase mRNAs analysis by RT-PCR:
preliminary report on the effect of noradrenaline in the neonatal rat pineal gland. J
Neurosci Res, 49, 750-758.
BESANÇON, R., SIMONNEAUX, V., JOUVET, A., BELIN, M.F. & FEVREMONTANGE, M. (1996). Nycthemeral expression of tryptophan hydroxylase
mRNAs in the rat pineal gland. Brain Res Mol Brain Res, 40, 136-138.
BLALOCK, J.E. & SMITH, E.M. (2007). Conceptual development of the immune system
as a sixth sense. Brain Behav Immun, 21, 23-33.
BOEHM, U., KLAMP, T., GROOT, M. & HOWARD, J.C. (1997). Cellular responses to
interferon-gamma. Annu Rev Immunol, 15, 749-795.
BONIZZI, G. & KARIN, M. (2004). The two NF-kB activation pathways and their role
in innate and adaptative immunity. Trends Immunol, 25, 280-288.
BORJIGIN, J., WANG, M.M. & SNYDER, S.H. (1995). Diurnal variation in mRNA
encoding serotonin n-acetyltransferase in pineal gland. Nature, 378, 783-785.
BRADFORD, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal Biochem, 72, 248-254.
BRADING, A.F. (2006). Smooth muscle research: from Edith Bülbring onwards. Trends
Pharmacol Sci, 27, 158-165.
BRADLEY, J.R. (2008). TNF-mediated inflammatory disease. J Pathol, 214, 149–160.
BUCKINGHAM, J.C. (2006). Glucocorticoids: exemplars of multi-tasking. Br J
Pharmacol, 147, 258-268.
BUIJS, R.M. & KALSBEEK, A. (2001). Hypothalamic integration of central and
peripheral clocks. Nat Rev Neurosci, 2, 521-526.
86
Referências Bibliográficas
BUIJS, R.M., KALSBEEK, A., VAN DER WOUDE, T.P., VAN HEERIKHUIZE, J.J. &
SHINN, S. (1993). Suprachiasmatic nucleus lesion increases corticosterone
secretion. Am J Physiol, 264, 1186–1192.
BUIJS, R.M., WORTEL, J., VAN HEERIKHNUIZE, J.J., FEENSTRA, M.G., TER HORST,
G.J., ROMIJN, H.J. & KALSBEEK, A. (1999). Anatomical and functional
demonstration of a multisynaptic suprachiasmatic nucleus adrenal (cortex)
pathway. Eur J Neurosci, 11, 1535–1544.
BUNDSCHUH, D.S., BARSIG, J., HARTUNG, T., RANDOW, F., DÖCKE, W.D., VOLK,
H.D. & WENDEL, A. (1997). Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
and IFN-gamma restore the systemic TNF-alpha response to endotoxin in
lipopolysaccharide-desensitized mice. J Immunol, 158, 2862-2871.
BURKE, Z., WELLS, T., CARTER, D., KLEIN, D. & BALER, R. (1999). Genetic targeting:
the
serotonin
N-acetyltransferase
promoter
imparts
circadian
expression
selectively in the pineal gland and retina of transgenic rats. J Neurochem, 73, 13431349.
CABRINI, D.A., CAMPOS, M.M., TRATSK, K.S., MERINO, V.F., SILVA, J.A. J.R.,
SOUZA, G.E., AVELLAR, M.C., PESQUERO, J.B. & CALIXTO, J.B. (2001).
Molecular and pharmacological evidence for modulation of kinin b(1) receptor
expression by endogenous glucocorticoids hormones in rats. Br J Pharmacol, 132,
567-577.
CALVO, J., BOYA, J., BORREGON, A. & GARCIA-MAURIÑO, J.E. (1988). Presence of
glial cells in the rat pineal gland: a light and electron microscopic
immunohistochemical study. Anat Rec, 220, 424-428.
CARRILLO-VICO, A., GARCÍA-MAURIÑO, S., CALVO, J.R. & GUERRERO, J.M.
(2003). Melatonin counteracts the inhibitory effect of PGE2 on IL-2 production in
human lymphocytes via its mt1 membrane receptor. FASEB J, 17, 755-757.
CARRILLO-VICO, A., LARDONE, P. J., NAJI, L., FERNANDEZ-SANTOS, J. M.,
MARTIN-LACAVE, I., GUERRERO, J.M. & CALVO, J.R. (2005). Beneficial
pleiotropic actions of melatonin in an experimental model of septic shock in mice:
regulation of pro-/anti-inflammatory cytokine network, protection against
oxidative damage and anti-apopitotic effects. J Pineal Res, 39, 400-408.
CARRILLO-VICO, A., REITER, R.J., LARDONE, P.J., HERRERA, J.L., FERNÁNDEZMONTESINOS, R., GUERRERO, J.M. & POZO, D. (2006). The modulatory role of
melatonin on immune responsiveness. Curr Opin Investig Drugs, 7, 423-431.
87
Referências Bibliográficas
CARSWELL, E.A., OLD, L.J., KASSEL, R.L., GREEN, S., FIORE, N. & WILLIAMSON,
B. (1975). An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc
Natl Acad SciUSA, 72, 3666–3670.
CATO, A.C. & WADE, E. (1996) Molecular mechanisms of anti-inflammatory action of
glucocorticoids. Bioassays, 18, 371-378.
CAVALCANTI, D.M., LOTUFO, C.M., BORELLI, P., FERREIRA, Z.S., MARKUS, R.P.
& FARSKY, S.H. (2007). Endogenous glucocorticoids control neutrophil
mobilization from bone marrow to blood and tissues in non-inflammatory
conditions. Br J Pharmacol, 152, 1291-1300.
CAVALCANTI, D.M., LOTUFO, C.M., BORELLI, P., TAVASSI, A.M., PEREIRA, A.L.,
MARKUS, R.P. & FARSKY, S.H. (2006). Adrenal deficiency alters mechanisms of
neutrophil mobilization. Mol Cell Endocrinol, 249, 32-39.
CHEN, G. & GOEDDEL, D.V. (2002). TNF-R1 Signaling: A Beautiful Pathway. Science,
296, 1634.
CHEN, L.F. & GREENE, W.C. (2004). Shapping the nuclear action of NF-κB. Mol Cell
Biol, 5, 392-401.
CIARANELLO, R.D. (1978). Regulation of phenylethanolamine N-methyltransferase
synthesis and degradation. Regulation by rat adrenal glucocorticoids. Mol
Pharmacol, 14, 478-489.
COLE, T.J., BLENDY, J.A., MONAGHAN, A.P., SCHMID, W., AGUZZI, A. &
SCHÜTZ, G. (1995). Molecular genetic analysis of glucocorticoid signaling during
mouse development. Steroids, 60, 93-96.
COON, S.L., DEL, OLMO. E., YOUNG, W.S. 3rd. & KLEIN, D.C. (2002). Melatonin
synthesis enzymes in Macaca mulatta: focus on arylalkylamine N-acetyltransferase
(EC 2.3.1.87). J Clin Endocrinol Metab, 87, 4699-4706.
COON, S.L., ROSEBOOM, P.H., BALER, R., WELLER, J.L., NAMBOODIRI, M.A.A.,
KOONIN, E.V. & KLEIN, D.C. (1995). Pineal serotonin n-acetyltransferase:
expression cloning and molecular analysis. Science, 270, 1681-1683.
COON, S.L., WELLER, J.L., KORF, H.W., NAMBOODIRI, M.A., ROLLAG, M. &
KLEIN, D.C. (2001). cAmp regulation of arylalkylamine N-acetyltransferase
(AANAT, EC 2.3.1.87): a new cell line (1E7) provides evidence of intracellular
AANAT activation. J Biol Chem, 276, 24097-24107.
88
Referências Bibliográficas
COUTO-MORAES, R., PALERMO-NETO, J. & MARKUS, R.P. The Immune-Pineal
Axis: Stress as a modulator of pineal gland function. Annals of the New York
Academy of Sciences, no prelo.
CRAFT, C.M., MURAGE, J., BROWN, B. & ZHAN-POE, X. (1999). Bovine
arylakylamine N-acetyltransferase activity correlated with mRNA expression in
pineal and retina. Mol Brain Res, 65, 44-51.
CSABA, G. & RICHTER, T. (1975). Collaboration of serotonin and melatonin in the
control of thyroid function. Acta Biol Med Ger, 34, 1097-1100.
DARNELL, J.E. Jr. (1997) STATs and gene regulation. Science, 277, 1630-1635.
DARNELL, J.E. Jr., KERR, I.M. & STARK, G.R. (1994). Jak-STAT pathways and
transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling
proteins. Science, 264, 1415-1421.
De BOSSCHER, K., BERGHE, W. V. & HAEGEMAN, G. (2003). The interplay between
the glucocorticoid receptor and nuclear factor-κB or activator protein-1: molecular
mechanisms for gene repression. Endocr Rev, 24, 488-522.
De FRANCO, D.B. & CSERMELY, P. (2000). Steroid receptor and molecular chaperone
encounters in the nucleus. Sci STKE, 42, PE1.
De KLOET, E.R., VREUGDENHIL, E., OITZL, M.S. & JOËLS, M. (1998). Brain
corticosteroid receptor balance in health and disease. Endocr Rev, 19, 269-301.
De VERA, M.E., TAYLOR, B.S., WANG, Q., SHAPIRO, R.A., BILLIAR, T.R. & GELLER,
D.A. (1997). Dexamethasone suppresses iNOS gene expression by upregulating Ikappa B alpha and inhibiting NF-kappa B. Am J Physiol, 273, 1290-1296.
De WIT, H., HOOGSTRATEN, D., HALIE, R.M. & VELLENGA, E. (1996). Interferongamma modulates the lipopolysaccharide-induced expression of AP-1 and NFkappa B at the mRNA and protein level in human monocytes. Exp Hematol, 24, 228235.
DEMISCH, L., DEMISH, K. & NICKELSEN, T. (1988). Influense of dexamethasone on
nocturnal melatonin production in healthy adult subjects. J Pineal Res, 5, 317-321.
DESCATES, R. (1973). As Paixões da Alma. In Os Pensadores. Ed. Civita, V. São Paulo:
Abril Cultural e Industrial , 1a ed, 15.
DITTMAR, K.D., DEMADY, D.R., STANCATO, L.F., KRISHINA, P. & PRATT, W.T.
(1997). Folding of the glucocorticoid receptor by the heat shock protein (hsp) 90based chaperone machinery. The role of p23 is to stabilize receptor. hsp90
heterocomplexes formed by hsp90. p60. hsp70. J Biol Chem, 272, 21213-21220.
89
Referências Bibliográficas
DRAZEN, D.L. & NELSON, R.J. (2001) Melatonin receptor subtype MT2 (Mel 1b) and
not mt1 (Mel 1a) is associated with melatonin-induced enhancement of cellmediated and humoral immunity. Neuroendocrinology, 74, 178-184.
DRIJFHOUT, W. J., GROL, C. J. & WESTERINK, B. H. C. (1996). Parasympathetic
inhibition of pineal indole metabolism by prejunctional modulation of
noradrenaline release. Eur J Pharamcol, 20, 24-32.
DUBOCOVICH, M.L. & MARKOWSKA, M. (2005). Functional MT1 and MT2
melatonin receptors in mammals. Endocrine, 27, 101-110.
DUVERNOY, H.M. & RISOLD, P.Y. (2007). The circumventricular organs: an atlas of
comparative anatomy and vascularization. Brain Res Rev, 56, 119-147.
EBERHARDT, W., SCHULZE, M., ENGELS, C., KLASMEIER, E. & PFEILSCHIFTER, J.
(2002).
Glucocorticoid-mediated
suppression
of
cytokine-induced
matrix
metalloproteinase-9 expression in rat mesangial cells: involvement of nuclear
factor-kappaB and Ets transcription factors. Mol Endocrinol, 16, 1752-1766.
FERREIRA, Z.S. & MARKUS, R.P. (2001). Caracterisation of P2Y(1)-like receptor in
cultured rat pienal glands. Eur J Pharmacol, 415, 151-156.
FERREIRA, Z.S., CIPOLLA-NETO, J. & MARKUS, R.P. (1994). Presence of P2purinoceptors in the rat pineal gland. Brit J Pharmacol, 112, 107-110.
FERREIRA, Z.S., FERNANDES, P.A.C.M., DUMA, D., ASSREUY, J., AVELLAR,
M.C.W. & MARKUS, R.P. (2005). Corticosterone modulates noradrenaline-induced
melatonin synthesis through inhibition of nuclear factor kappaB. J Pineal Res, 38,
182-188.
FERREIRA, Z.S., GARCIA, C.R., SPRAY, D.C. & MARKUS, R.P. (2003). P2Y(1) receptor
activation enhances the rate of rat pinealocyte-induced extracellular acidification
via a calcium-dependent mechanism. Pharmacology, 69, 33-37.
FOULKES, N.S., BORJIGIN, J., SNYDER, H. & SASSONE-CORSI, P. (1986).
Transcriptional control of circadian hormone synthesis via the CREM feedback
loop. Proc Natl Acad Sci USA, 93, 14140-14145.
GANGULY, S., COON, S. L. & KLEIN, D. C. (2002). Control of melatonin synthesis in
mammalian pineal gland; the critical role of seretonin acetylation. Cell Tissue Res,
309, 127-137.
GANGULY, S., GRODZKI, C., SUGDEN, D., MØLLER, M., ODOM, S., GAILDRAT, P.,
GERY, I., SIRAGANIAN, R.P., RIVERA, J. & KLEIN, D.C. (2007). Neural
adrenergic/cyclic AMP regulation of the immunoglobulin E receptor alpha-
90
Referências Bibliográficas
subunit expression in the mammalian pinealocyte: a neuroendocrine/immune
response link? J Biol Chem, 282, 32758-32764.
GANGULY, S.; GASTEL, J.A.; WELLWE, J.L.; SCHAWARTZ, C., JAFFE, H.,
NAMBOODIRI, M.A., COON, S.L., HICHMAN, B., ROLLAG, M., OBSIL, T.,
BEAUVERGER, P., FERRY, G., BOUTIN, J.A. & KLEIN, D.C. (2001). Role of a
pineal cAMP-operated arylakylamine N-acetyltransferase/14-3-3-binding switch
in melatonin synthesis. Proc Natl Acad Sci USA, 98, 8083-8088.
GARCIA-MAURIÑO, S., GONZALEZ-HABA, M.G., CALVO, J.R., RAFII-EL-IDRISSI,
M., SANCHEZ-MARGALET, V., GOBERNA, R. & GUERRERO JM. (1997).
Melatonin enhances IL-2, IL-6, and IFN-gamma production by human circulating
CD4+ cells: a possible nuclear receptor-mediated mechanism involving T helper
type 1 lymphocytes and monocytes. J Immunol, 159, 574-581.
GARIDOU, M.L., GAUER, F., VIVIEN-ROELS, B., SICARD, B., PÉVET, P. &
SIMONNEAUX, V. (2002). Pineal arylalkylamine N-acetyltransferase gene
expression is highly stimulated at night in the diurnal rodent, Arvicanthis ansorgei.
Eur J Neurosci, 15, 1632-1640.
GASTEL, J.A., ROSEBOOM, P.H., RINALDI, P.A., WELLER, J.L. & KLEIN, D.C. (1998).
Melatonin production: proteasomal proteolysis in serotonin n-acetyltransferase
regulation. Science, 279, 1358-1360.
GAUER, F., POIREL, V.J., GARIDOU, M.L., SIMONNEAUX, V. & PÉVET, P. (1999).
Molecular cloning of the arylalkylamine-N-acetyltransferase and daily variations
of its mRNA expression in the Syrian hamster pineal gland. Mol Brain Res, 71, 8795.
GHOSH, S. & HAYDEN, M.S. (2008). New regulators of NF-kappaB in inflammation.
Nat Rev Immunol, 11, 837-848.
GHOSH, S., MARY, M.J. & KOPP, E.B. (1998). NF-kB and Rel proteins: evolutionarily
conserved mediations of immune responses. Annu Rev Immunol, 16, 225-260.
GILAD, E., WONG, H.R., ZINGARELLI, B., VIRÁG, L., O'CONNOR, M., SALZMAN,
A.L. & SZABÓ, C. (1998). Melatonin inhibits expression of the inducible isoform of
nitric oxide synthase in murine macrophages: role of inhibition of NFkappaB
activation. FASEB J, 12, 685-693.
GIORDANO, A., AVELLINO, R., FERRARO, P., ROMANO, S., CORCIONE, N. &,
ROMANO, M.F. (2006). Rapamycin antagonizes NF-kappaB nuclear translocation
91
Referências Bibliográficas
activated by TNF-alpha in primary vascular smooth muscle cells and enhances
apoptosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 290, 2459-2465.
GRAY, P.W. & GOEDDEL, D.V. (1982). Structure of the human immune interferon
gene. Nature, 298, 859–863.
GRELL, M., WAJANT, H., ZIMMERMANN, G. & SCHEURICH, P. (1998). The type 1
receptor (CD120a) is the high-affinity receptor for soluble tumor necrosis factor.
Proc Natl Acad Sci USA, 95, 570-575.
GUILLAUMOND, F., SAGE, D., DEPREZ, P., BOSLER, O., BECQUET, D. &
FRANCOIS-BELLAN, A M. (2000). Circadian binding activity of ap-1, a regulator
of the arylalkylamine n-acetyltransferase gene in the rat pineal gland, depends on
circadian fra-2, c-jun, and jun-d expression and is regulated by the clock's
zeitgebers. J Neurochem, 75, 1398-1407.
HACK, C.E., AARDEN, L.A. & THIJS, L.G. (1997). Role of cytokines in sepsis. Adv
Immunol, 66, 101-195.
HATTAR, S., LIAO, H.W., TAKAO, M., BERSON, D.M. & YAU, K.W. (2002).
Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and
intrinsic photosensitivity. Science, 295, 1065-1070.
HAYDEN, M.S. & GHOSH, S. (2004). Signaling to NF-kappaB. Genes Dev, 18, 21952224.
HEISSMEYER, V., KRAPPMANN, D., WULCZYN, F.G. & SCHEIDEREIT, C. (1999).
NF-kappaB p105 is a target of IkappaB kinases and controls signal induction of
Bcl-3-p50 complexes. EMBO J, 18, 4766-4778.
HELD, T.K., WEIHUA, X., YUAN, L., KALVAKOLANU, D.V. & CROSS, A.S. (1999).
Gamma interferon augments macrophage activation by lipopolysaccharide by two
distinct mechanisms, at the signal transduction level and via an autocrine
mechanism involving tumor necrosis factor alpha and interleukin-1. Infect Immun,
67, 206-212.
HOFFMAN, R.A. & REITER, R.J. (1965a). Pineal gland: influence on gonads of male
hamsters. Science, 148, 1609-1611.
HOFFMAN, R.A. & REITER, R.J. (1965b). Influence of compensatory mechanisms and
the pineal gland on dark-induced gonadal atrophy in male hamsters. Nature, 207,
658-659.
92
Referências Bibliográficas
HOFFMAN, R.A., HESTER, R.J. & TOWNS, C. (1965). Effect of light and temperature
on the endocrine system of the golden hamster (Mesocricetus auratus Waterhouse).
Comp Biochem Physiol, 15, 525-533.
HOFFMANN, A., LEVCHENKO, A., SCOTT, M.L. & BALTIMORE, D. (2002). The IκB–
NF-κB Signaling Module: Temporal Control and Selective Gene Activation.
Science, 298, 1241-1245.
IHLE, J.N. (1995). The Janus protein tyrosine kinase family and its role in cytokine
signaling. Adv Immunol, 60, 1-35.
JURKOVICH, G.J., MILESKI, W.J., MAIER, R.V., WINN, R.K., & RICE, C.L. (1991).
Interferon gamma increases sensitivity to endotoxin. J Surg Res, 51, 197-203.
KALSBEEK, A. & BUIJS, R.M. (2002). Output pathways of the mammalian
suprachiasmatic nucleus: coding circadian time by transmitter selection and
specific targeting. Cell Tissue Res, 309, 109-118.
KALSBEEK, A., GARIDOU, M.L., PALM, I.F., VAN DER VLIET, J., SIMONNEAUX,
V., PÉVET, P. & BUIJS, R.M. (2000) Melatonin sees the light: blocking GABA-ergic
transmission in the paraventricular nucleus induces daytime secretion of
melatonin. Eur J Neurosci, 12, 3146-3154.
KALSBEEK, A., PERREAU-LENZ, S. & BUIJS, R.M. (2006). A network of (autonomic)
clock outputs. Chronobiol Int, 23, 521-535.
KALSBEEK, A., RIKKERS, M., VIVIEN-ROELS, B. & PÉVET, P. (1993). Vasopressin
and vasoactive intestinal peptide infused in the paraventricular nucleus of the
hypothalamus elevate plasma melatonin levels. J Pineal Res, 15, 46-52.
KAPPERS, J.A. (1960). The development, topographical relations and innervation of
the epiphysis cerebri in the albino rat. Zeitschrift fur Zellforschung, 52, 163-215.
KARIN, M. & CHANG, L. (2001). AP-1-glucocorticoid receptor cross-talk taken to a
higher level. J Endocrinol, 169, 447-451.
KIM, M.H., UEHARA, S., MUROYAMA, A., HILLE, B., MORIYAMA, Y. & KOH, D.S.
(2008). Glutamate transporter-mediated glutamate secretion in the mammalian
pineal gland. J Neurosci, 28, 10852-10863.
KITAY, J.I. & ALTSCHULE, M.D. (1954). Effects of pineal extract administration on
ovary weight in rats. Endocrinology, 65, 782-784.
KLEIN, D. C. & WELLER, J. L. (1970). Indole Metabolism in the Pineal Gland: A
Circadian Rhythm in N-Acetyltransferase. Science,169, 1093–1095.
93
Referências Bibliográficas
KLEIN, D.C. (1985).
Photoneural regulation of the mammalian pineal gland. In:
Everet, D. & Clark, D. (eds), Photoperiodism, Melatonin and the Pineal. Ciba
Foundation Symposium 117. Pittman Press, London, pp. 38-56.
KLEIN, D.C., COON, S.L.; ROSEBOOM, P.H., Weller, J.L., BERNARD, M., GASTEL,
J.A., ZATZ, M., IUVONE, M., RODRIGUEZ, I.R., BÉGAY, V., FLCON, J., CAHILL,
G.M., COSSONE, V.M. & BALER, R. (1997). The melatonin rhythm-generating
enzyme: molecular regulation of serotonin n-acetyltransferase in the pineal gland.
Recent Progress in Hormone Res, 52, 307-358.
KLEIN, D.C., GANGULY, S., COON, S., WELLER, J.L., OBSIL, T., HICKMAN, A. &
DYDA, F. (2002). 14-3-3 Proteins and photoneuroendocrine transduction: role in
controlling the daily rhythm in melatonin. Biochem Soc Trans, 30, 365-73.
KROZOWSKI, Z.S. & FUNDER, J.W. (1983). Renal mineralocorticoid receptors and
hippocampal corticosterone-binding species have identical intrinsic steroid
specificity. Proc Natl Acad Sci USA, 80, 6056-6060.
KUMAR, R. & THOMPSON, E.B. (2003). Transactivation functions of the N-terminal
domains of nuclear hormone receptors: protein folding and coativator interactions.
Mol Endocrinol, 17, 1-10.
KUS, L., HANDA, R.J. & MCNULTY, J.A. (1994). Glutamate inhibition of the
adrenergic-stimulated production of melatonin in rat pineal gland in vitro. J
Neurochem, 62, 2241-2245.
La FLEUR, S.E., KALSBEEK, A., WORTEL, J. & BUIJS, R.M. (2000). Polysynaptic neural
pathways between the hypothalamus, including the suprachiasmatic nucleus, and
the liver. Brain Res, 871, 50-56.
La IGLESIA, H.O., BLAUSTEIN, J.D. & BITTMAN, E.L. (1999). Oestrogen receptoralpha-immunoreactive neurones project to the suprachiasmatic nucleus of the
female Syrian hamster. J Neuroendocrinol, 11, 481-490.
LEDGERWOOD, E.C., POBER, J.S. & BRADLEY, J.R. (1999). Recent advances in the
molecular basis of TNF signal transduction. Lab Invest, 79, 1041-1050.
LERNER, A.B., CASE, J.D. & HEINZELMAN, R.V. (1959). Structure of melatonin. J Am
Chem Soc, 81, 6084.
LERNER, A.B., CASE, J.O., TAKAHASHI, Y., LEE, T.H. & MORI, W. (1958). Isolation
of melatonin, the pineal factor that lightens melanocytes. J Am Chem Soc, 80, 2587.
94
Referências Bibliográficas
LETZ, B., SCHOMERUS, C., MARONDE, E., KORF, H.W. & KORBMACHER, C.
(1997). Stimulation of a nicotinic ACh receptor causes depolarization and
activation of L-type Ca2+ channels in rat pinealocytes. J Physiol, 499, 329-340.
LISSONI, P., ROVELLI, F., BRIVIO, F., BRIVIO, O. & FUMAGALLI, L. (1998).
Circadian secretions of IL-2, IL-12, IL-6 and IL-10 in relation to the light/dark
rhythm of the pineal hormone melatonin in healthy humans. Nat Immun, 16, 1-5.
LOPES, C., DELYRA, J.L., MARKUS, R.P. & MARIANO, M. (1997). Circadian rhythm
in experimental chronic inflammation is modulated by melatonin. J Pineal Res, 23,
72-78.
LOPES, C., MARIANO, M. & MARKUS, R.P. (2001). Interaction between the adrenal
and the pineal gland in chronic experimental inflammation induced by BCG in
mice. Inflammation Res, 50, 6-11.
LOTUFO, C.M., YAMASHITA, C.E., FARSKY, S.H. & MARKUS, R.P. (2006).
Melatonin effect on endothelial cells reduces vascular permeability increase
induced by leukotriene B4. Eur J Pharmacol, 534, 258-263.
LOTUFO, C.M.C., LOPES, C., DUBOCOVICH, M.L., FARSKY, S.H.P. & MARKUS, R.P.
(2001). Melatonin and N-acetylserotonin inhibit leucocyte rolling and adhesion to
rat microcirculation. Eur J Pharmacol, 430, 351-357.
LOVENBERG, W., JEQUIER, E. & SJOERDSMA, A. (1967). Tryptophan hydroxylation:
measurement in pineal gland, brainstem, and carcinoid tumor. Science, 155, 217219.
MAESTRONI, G.J., CONTI, A. & PIERPAOLI, W. (1986). Role of the pineal gland in
immunity. Circadian synthesis and release of melatonin modulates the antibody
response and antagonizes the immunosuppressive effect of corticosterone. J
Neuroimmunol, 13, 19-30.
MALEK, Z.S., DARDENTE, H., PÉVET, P. & RAISON, S. (2005). Tissue-specific
expression of tryptophan hydroxylase mRNAs in the rat midbrain: anatomical
evidence and daily profiles. Eur J Neurosci, 22, 895-901.
MALEK, Z.S., PÉVET, P. & RAISON, S. (2004). Circadian change in tryptophan
hydroxylase protein levels within the ratintergeniculate leaflets and raphe nuclei.
Neuroscience, 125, 749-758.
MALEK, Z.S., SAGE, D., PÉVET, P. & RAISON, S. (2007). Daily rhythm of tryptophan
hydroxylase-2 messenger ribonucleic acid within raphe neurons is induced by
95
Referências Bibliográficas
corticoid
daily
surge
and
modulated
by
enhanced
locomotor
activity.
Endocrinology, 148, 5165-5172.
MARKUS, R.P. & TAMURA, E.K. (2009). G protein-coupled receptors and others
mechanisms that translate melatonin effects. In G Protein-coupled receptors in
vertebrates: Comparative Perspectives. Ed. Magalhães, M.F. & Yamanouye,
Norma. Research Signpost.
MARKUS, R.P., FERREIRA, Z.S., FERNANDES, P.A.C.M. & CECON, E. (2007). The
immune-pineal axis: a shuttle between endocrine and paracrine melatonin sources.
Neuroimmunomodulation, 14, 126-133.
MEDEIROS, R., CABRINI, D.A. & CALIXTO, J.B. (2001). The "in vivo" and "ex vivo"
roles of cylcooxygenase-2, nuclear factor-kappaB and protein kinases pathways in
the up-regulation of B1 receptor-mediated contraction of the rabbit aorta. Regul
Pept, 97, 121-130.
MEDZHITOV, R. & JANEWAY, C. JR. (2000). Innate immune recognition: mechanisms
and pathways. Immunol Rev, 173, 89-97.
MENAKER, M., MOREIRA, L.F., TOSINI, G. (1997). Evolution of circadian
organization in vertebrates. Braz J Med Biol Res, 30, 305-313.
MERAZ, M.A., WHITE, J.M., SHEEHAN, K.C., BACH, E.A., RODIG, S.J., DIGHE, A.S.,
KAPLAN, D.H., RILEY, J.K., GREENLUND, A.C., CAMPBELL, D., CARVERMOORE, K., DUBOIS, R.N., CLARK, R., AGUET, M. & SCHREIBER, R.D. (1996).
Targeted disruption of the Stat1 gene in mice reveals unexpected physiologic
specificity in the JAK-STAT signaling pathway. Cell, 84, 431-442.
MILLER, R., WEN, X., DUNFORD, B., WANG, X. & SUZUKI, Y. (2006). Cytokine
production of CD8+ immune T cells but not of CD4+ T cells from Toxoplasma
gondii-infected mice is polarized to a type 1 response following stimulation with
tachyzoite-infected macrophages. J Interferon Cytokine Res, 26, 787-792.
MØLLER, M. & BAERES, F.M. (2002). The anatomy and innervation of the mammalian
pineal gland. Cell Tissue Res, 309, 139-150.
MOORE, R.Y. & EICHLER, V.B. (1972). Loss of a circadian adrenal corticosterone
rhythm following suprachiasmatic lesions in the rat. Brain Res, 42, 210-216.
MOORE, R.Y. & KLEIN, D.C. (1974). Visual pathways and the central neural control of
a circadian rhythm in pineal serotonin N-acethyltransferase activity. Brain Res, 71,
17-33.
96
Referências Bibliográficas
MOYNAGH, P.N. (2003). Toll-like receptor signalling pathways as key targets for
mediating
the
anti-inflammatory
and
immunosuppressive
effects
of
glucocorticoids. J Endocrinol, 179, 139-144.
MURPHY, T.L., CLEVELAND, M.G., KULESZA, P., MAGRAM, J. & MURPHY, K.M.
(1995). Regulation of interleukin 12 p40 expression through a NF-kappa B half-site.
Mol Cell Biol, 15, 5258-5267.
NADEAU, S. & RIVEST, S. (2002). Endotoxemia prevents the cerebral inflammatory
wave induced by intraparenchymal lipopolysaccharide injection: role of
glucocorticoids and CD14. J Immunol, 169, 3370-3381.
NADEAU, S. & RIVEST, S. (2003) Glucocorticoids play a fundamental role in
protecting the brain during innate immune response. J Neurosci, 23, 5536-5544.
NECELA, B.M. & CIDLOWSKI, J.A. (2004). Mechanisms of glucocorticoid receptor
action in noninflammatory and inflammatory cells. Proc Am Thorac Soc, 1, 239-246.
NELSON, R.J., DEMAS, G.E. (1997). Role of melatonin in mediating seasonal energetic
and immunologic adaptations. Brain Res Bull, 44, 423-430.
NELSON, R.J., DEMAS, G.E., KLEIN, S.L. & KRIEGSFELD, L.J. (1995). The influence of
season, photoperiod, and pineal melatonin on immune function. J Pineal Res, 19,
149-165.
NIR, I., KAISER, N., HIRSCHMANN, N. & SULMAN, F.G. (1970). The effect of 17 betaestradiol on pineal metabolism. Life Sci I, 9, 851-858.
NOLAN, G.P., FUJITA, T., BHATIA, K., HUPPI, C., LIOU, H.C., SCOTT, M.L. &
BALTIMORE, D. (1993). The bcl-3 proto-oncogene encodes a nuclear I kappa B-lie
molecule that preferentially interacts with NF-kappaB p50 and p52 in a
phosphorylation-dependent manner. Mol Cell Biol, 13, 3557-3566.
NUSINZON, I. & HORVATH, C.M. (2003). Interferon-stimulated transcription and
innate antiviral immunity require deacetylase activity and histone deacetylase 1.
Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 14742-14747.
ONER, H., KUS, I., ONER, J., OGETÜRK, M., OZAN, E. & AYAR, A. (2004). Possible
effects of melatonin on thymus gland after pinealectomy in rats. Neuro Endocrinol
Lett, 25, 115-118.
ORO, A.E., HOLLENBERG, S.M. & EVANS, R.M. (1988). Transcriptional inhibition by
a glucocorticoid receptor-beta-galactosidase fusion protein. Cell, 55, 1109-1114.
97
Referências Bibliográficas
PALOMBELLA, V.J., RANDO, O.J., GOLDBERG, A.L. & MANIATIS, T. (1994). The
ubiquitin-proteasome pathway is required for processing the NF-kappaB1
precursor protein and the activation of NF-kappaB. Cell, 78, 773-785.
PANGER, B., PANGER, A. & REITER, R. J. (1990). Circadian variations of adrenergic
receptors in the mammalian pineal gland: a review. J Neural Transm, 81, 17-29.
PARFITT, A., WELLER, J.L. & KLEIN, D.C. (1976). Beta-adrenergic blockers decrease
adrenergically stimulated n-acetyltransferase activity in pineal glands in organ
culture. Neuropharmacology, 15, 353-358.
PAXINOS, G. & WATSON, C. (1982). In: Paxinos G, Watson C. The Rat Brain in
Stereotaxic Coordinates. New York: Academic Press Inc.
PEDERSEN,
E.B.,
FOX,
Immunocytochemical
L.M.,
and
CASTRO,
A.J.
&
electron-microscopic
McNULTY,
J.A.
characterization
(1993).
of
macrophage/microglia cells and expression of class II major histocompatibility
complex in the pineal gland of the rat. Cell Tissue Res, 272, 257-265.
PERREAU-LENZ, S., KALSBEEK, A., GARIDOU, M.L., WORTEL, J., VAN DER VLIET,
J., VAN HEIJNINGEN, C., SIMONNEAUX, V., PÉVET, P. & BUIJS R.M. (2003).
Suprachiasmatic control of melatonin synthesis in rats: inhibitory and stimulatory
mechanisms. Eur J Neurosci, 17, 221-228.
PFEFFER, M., MARONDE, E., MOLINA, C.A., KORF, H.W. & STEHLE, J.H. (1999).
Inducible cyclic AMP early repressor protein in rat pinealocytes: a highly sensitive
natural reporter for regulated gene transcription. Mol Pharmacol, 56, 279-289.
PHANSUWAN-PUJITO, P., MØLLER, M. & GOVITRAPONG, P. (1999). Cholinergic
innervation and function in the mammalian pineal gland. Microsc Res Tech, 46, 281295.
PICKART, C.M. (1997). Targeting of substrates to the 26S proteasome. FASEB J, 11,
1055-1066.
PLATANIAS, L.C. (2005). Mechanisms of type-I- and type-II-interferon-mediated
signalling. Nat Rev Immunol, 5, 375-386.
PONTES, G.N., CARDOSO, E.C., CARNEIRO-SAMPAIO, M.M. & MARKUS, R.P.
(2006). Injury switches melatonin production source from endocrine (pineal) to
paracrine (phagocytes) - melatonin in human colostrum and colostrum
phagocytes. J Pineal Res, 41, 136-141.
PONTES, G.N., CARDOSO, E.C., CARNEIRO-SAMPAIO, M.M. & MARKUS, R.P.
(2007). Pineal melatonin and the innate immune response: the TNF-alpha increase
98
Referências Bibliográficas
after cesarean section suppress nocturnal melatonin production. J Pineal Res, 43,
365- 371.
PORTER, J.R. & HEIMAN, M. (1977). The effects of pineal indoles and a crude aqueous
pineal extract on ACTH mediated corticosterone release by isolated adrenal cells.
Life Sci, 20, 1363-1372.
PRESMAN, D.M., HOIJMAN, E., CEBALLOS, N.R., GALIGNIANA, M.D. & PECCI, A.
(2006). Melatonin inhibits glucocorticoid receptor nuclear translocation in mouse
thymocytes. Endocrinology, 147, 5452-5459.
PROVENCIO, I., RODRIGUEZ, I.R., JIANG, G., HAYES, W.P., MOREIRA, E.F. &
ROLLAG, M.D. (2000). A novel human opsin in the inner retina. J Neurosc, 20, 600605.
QUAN, N., HE, L., LAI, W., SHEN, T. & HERKENHAM, M. (2000). Induction of IkBa
mRNA Expression in the Brain by Glucocorticoids: A Negative Feedback
Mechanism for Immune-to-Brain Signaling. The Journal of Neuroscience, 20, 6473–
6477.
QUAY, W.B. (1963). Circadian rhythm in rat pineal serotonin and its modifications by
estrous cycle and photoperiod. Gen Comp Endocrinol, 14, 473-479.
QUAY, W.B. (1964). Circadian and estrous rhythms in pineal melatonin and 5-hydroxy
indole-3-acetic acid. Proc Soc Exp Biol Med, 115, 710-713.
RAY, A. & PREFONTAINE, K.E. (1994). Physical association and functional
antagonism between the p65 subunit of transcription factor NF-kappa B and the
glucocorticoid receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 91, 752-756.
REICHARDT, H.M. & SCHÜTZ, G. (1998). Glucocorticoid signalling-multiple
variations of a common theme. Mol Cell Endocrinol, 146, 1-6.
REICHARDT, H.M., KAESTNER, K.H., WESSELY, O., GASS, P., SCHMID, W. &
SCHÜTZ, G. (1998). Analysis of glucocorticoid signalling by gene targeting. J
Steroid Biochem Mol Biol, 65, 111-115.
REITER, R., TANG, L., GARCIA, J.J. & MUÑOZ-HOYOS, A. (1997). Pharmacological
actions of melatonin in oxygen radical pathophysiology. Life Sci, 60, 2255-2271.
REITER, R.J., HURLBUT, E.C., ESQUIFINO, A.I., CHAMPNEY, T.H. & STEGER, R.W.
(1984). Changes in serotonin levels, N-acetyltransferase activity, hydroxyindole-Omethyltransferase activity, and melatonin levels in the pineal gland of the
Richardson's ground squirrel in relation to the light-dark cycle. Neuroendocrinology,
4, 356-360.
99
Referências Bibliográficas
RENO, L.A. ZAGO, W. & MARKUS, R.P. (2004). Release of [(3)H]-L-glutamate by
stimulation of nicotinic acetylcholine receptors in rat cerebellar slices. Neuroscience,
124, 647-653.
REUL, J.M. & DE KLOET, E.R. (1985). Two receptor systems for corticosterone in rat
brain: microdistribution and differential occupation. Endocrinology, 117, 2505-2511.
REUSS, S., SEMM, P. & VOLLRATH, L. (1985). Changes in the electrical activity of the
rat pineal gland following stimulation of the cervical sympathetic ganglia. J Auton
Nerv Syst, 12, 281-288.
RHEN, T. & CIDLOWSKI, J.A. (2005). Antiinflammatory action of glucocorticoids-new
mechanisms for old drugs. N Engl J Med, 353, 1711-1723.
RIBELAYGA, C., GAUER, F., CALGARI, C., PÉVET, P. & SIMONNEAUX, V. (1999).
Photoneural regulation of rat pineal hydroxyindole-O-methyltransferase (HIOMT)
messenger ribonucleic acid expression: an analysis of its complex relationship with
HIOMT activity. Endocrinology, 140, 1375-1384.
ROMERO, J.A. & AXELROD, J. (1974). Pineal beta-adrenergic receptor: diurnal
variation in sensitivity. Science, 184, 1091-1092.
ROSEBOOM, P.H. & KLEIN, D.C. (1995). Norepinephrine stimulation of pineal cyclic
AMP response element-binding protein phosphorylation: primary role of a betaadrenergic receptor/cyclic AMP mechanism. Mol Pharmacol, 47,439-449.
ROSEBOOM, P.H., COON, S.L., BALER, R., McCUNE, S.K., WELLER, J.L., KLEIN,
D.C. (1996). Melatonin synthesis: analysis of the more than 150-fold nocturnal
increase in serotonin N-acetyltransferase messenger ribonucleic acid in the rat
pineal gland. Endocrinology, 137, 3033-3045.
ROSEBOOM, P.H., NAMBOODIRI, M.A., ZIMONJIC, D.B., POPESCU, N.C.,
RODRIGUEZ, I.R., GASTEL, J.A. & KLEIN, D.C. (1998). Natural melatonin
'knockdown' in C57BL/6J mice: rare mechanism truncates serotonin Nacetyltransferase. Brain Res Mol Brain Res, 63, 189-197.
SABBAN, E.L., NANKOVA, B.B., SEROVA, L.I., KVETNANSKY, R. & LIU, X. (2004).
Molecular regulation of gene expression of catecholamine biosynthetic enzymes by
stress: sympathetic ganglia versus adrenal medulla. Ann N Y Acad Sci, 1018, 370377.
SAEB-PARSY, K. & DYBALL, R.E. (2003). Defined cell groups in the rat
suprachiasmatic nucleus have different day/night rhythms of single-unit activity
in vivo. J Biol Rhythms, 18, 26-42.
100
Referências Bibliográficas
SAINZ, R.M., MAYO, J.C., REITER, R.J., ANTOLIN, I., ESTEBAN, M.M. &
RODRIGUEZ, C. (1999). Melatonin regulates glucocorticoid receptor: an answer to
its antiapoptotic action in thymus. FASEB J, 13, 1547-1556.
SALAZAR-MATHER, T.P., HAMILTON, T.A. & BIRON, C.A. (2000). A chemokine-tocytokine-to-chemokine cascade critical in antiviral defense. A chemokine-tocytokine-to-chemokine cascade critical in antiviral defense. J Clin Invest, 105, 985993.
SANDROCK, A.W. JR., LEBLANC, G/G., WONG, D.L. & CIARANELLO, R.D. (1980).
Regulation of rat pineal hydroxyindole-O-methyltransferase: evidence of Sadenosylmethionine-mediated glucocorticoid control. J Neurochem, 35, 536-543.
SATO, T., KANEKO, M., HAMA, A., KUSAKARI, T. & FUJIEDA, H. (1996). Expression
of class II MHC molecules in the rat pineal gland during development and effects
of treatment with carbon tetrachloride. Cell Tissue Res, 284, 65-76.
SCARBROUGH, K., HARNEY, J.P., ROSEWELL, K.L. & WISE, P.M. (1996). Acute
effects of antisense antagonism of a single peptide neurotransmitter in the
circadian clock. Am J Physiol, 270, 283-288.
SCHEINMAN, R.I., COGSWELL, P.C., LOFQUIST, A.K. & BALDWIN, A.S. JR. (1995).
Role of transcriptional activation of I kappa B alpha in mediation of
immunosuppression by glucocorticoids. Science, 270, 283-286.
SCHENDA, J. & VOLLRATH, L. (1998). Modulatory role of acetylcholine in the rat
pineal gland. Neurosci Lett, 254, 13-16.
SCHENDA, J. & VOLLRATH, L. (1999). An intrinsic neuronal-like network in the rat
pineal gland. Brain Res, 823, 231-233.
SCHOENMAKERS, E., VERRIJDT, G., PEETERS, B., VERHOEVEN, G., ROMBAUTS,
W. & CLAESSENS, F. (2000). Differences in DNA binding characteristics of the
androgen and glucocorticoid receptors can determine hormone-specific responses.
J Biol Chem, 275, 12290-12297.
SCHOMERUS, C., KORF, H.W., LAEDTKE, E., WELLER, J.L. & KLEIN, D.C. (2000).
Selective adrenergic/cyclic amp-dependent switch-off of proteasomal proteolysis
alone switches on neural signal transduction: an example from the pineal gland. J
Neurochem, 75, 2123-2132.
SCHONEVELD, O.J.L.M., GAEMES, I.C. & LAMERS, W.H. (2004). Mechanismis of
glucocorticoid signaling. Bioch Bioph Acta, 1680, 114-128.
101
Referências Bibliográficas
SCHRODER, K., HERTZOG, P.J., RAVASI, T. & HUME, D.A. (2004). Interferongamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J Leukoc Biol, 75, 16389.
SCHULTZ, T.F. & KAY, S.A. (2003). Circadian clocks in daily and seasonal control of
development. Science, 301, 326-328.
SCHWARTZ, W. J., DAVIDSON, L.C. & SMITH, C.B. (1980). In vivo metabolic activity
of a putative circadian oscillator, the rat suprachiasmatic nucleus. Comp Neurol,
189, 157-168.
SCOTT, M.L., FUJITA, T., LIOU, H.C., NOLAN, G.P. & BALTIMORE, D. (1993). The
p65 subunit of NF-kappa B regulates I kappa B by two distinct mechanisms. Genes
Dev, 7, 1266-1276.
SEROVA, L.I., GUEORGUIEV, V., CHENG, S.Y. & SABBAN, E.L. (2008).
Adrenocorticotropic hormone elevates gene expression for catecholamine
biosynthesis in rat superior cervical ganglia and locus coeruleus by an
adrenalindependent mechanism. Neuroscience, 153, 1380-1389.
SHUAI, K., SCHINDLER, C., PREZIOSO, V.R. & DARNELL, J.E. Jr. (1992). Activation
of transcription by IFN-gamma: tyrosine phosphorylation of a 91-kD DNA binding
protein. Science, 258, 1808-1812.
SIEBENLIST, U. (1997). NF kappa B/I kappa B proteins. Their role in cell growth,
differentiation and development. Biochim Biophys Acta, 1332, 7-13.
SILVENNOINEN, O., IHLE, J.N., SCHLESSINGER, J. & LEVY, D.E. (1993). Interferoninduced nuclear signalling by Jak protein tyrosine kinases. Nature, 366, 583-585.
SIMONNEAUX, V. & RIBELAYGA, C. (2003). Generation of the melatonin endocrine
message in mammals: a review of the complex regulation of melatonin synthesis
by norepinephrine, peptides, and other pineal transmitters. Pharmacol Rev, 55, 325395.
SKWARŁO-SOŃTA, K. (1996). Functional connections between the pineal gland and
immune system. Acta Neurobiol Exp (Wars), 56, 341-357.
SKWARLO-SONTA, K. (2002). Melatonin in immunity: comparative aspects. Neuro
Endocrinol Lett, 1, 61-66.
SLOTTEN, H.A., KREKLING, S., SICARD, B. & PÉVET, P. (2002). Daily infusion of
melatonin entrains circadian activity rhythms in the diurnal rodent Arvicanthis
ansorgei. Behavioural Brain Res, 133, 11-19.
102
Referências Bibliográficas
SNYDER, S.H. & AXELROD, J. (1964). A sensitive assay for 5-hydroxytryptophan
decarboxylase. Biochem Pharmacol, 13, 805-806.
SPESSERT, R., LAYES, E., HILL, G. & VOLLRATH, L. (1998). Nitric oxide is formed in
a subpopulation of rat pineal cells and acts as an intercellular messenger.
Neuroendocrinology, 68, 57-63.
SRINIVASAN,
V.,
SPENCE,
D.W.,
TRAKHT,
I.,
PANDI-PERUMAL,
S.R.,
CARDINALI, D.P. & MAESTRONI, G.J. (2008). Immunomodulation by melatonin:
its significance for seasonally occurring diseases. Neuroimmunomodulation,15, 93101.
STARK, G.R. (2007). How cells respond to interferons revisited: from early history to
current complexity. Cytokine Growth Factor Rev, 18, 419-423.
STARK, G.R., KERR, I.M., WILLIAMS, B.R., SILVERMAN, R.H. & SCHREIBER, R.D.
(1998). How cells respond to interferons. Annu Rev Biochem, 67, 227-264.
STRADA, S.J., KLEIN, D.C., WELLER, J. & WEISS, B. (1972). Effect of norepinephrine
on the concentration of adenosine 3',5'-monophosphate of rat pineal gland in organ
culture. Endocrinology, 90, 1470-1475.
SUGDEN, D. (2003). Comparison of circadian expression of tryptophan hydroxylase
isoform mRNAs in the rat pineal gland using real-time PCR. J Neurochem, 86, 13081311.
TAKAMIYA, A., TAKEDA, M., YOSHIDA, A. & KIYAMA, H. (2002). Inflammation
induces serine protease inhibitor 3 expression in the rat pineal gland. Neuroscience,
113, 387-394.
TAMURA, E.K., CECON, E., MONTEIRO, A.W.A., SILVA, C.L.M. & MARKUS, RP.
Melatonin inhibits LPS-induced NO production in rat endothelial cells, J Pineal
Res, no prelo.
TAMURA, E.K., SILVA, C.L. & MARKUS, R.P. (2006). Melatonin inhibits endothelial
nitric oxide production in vitro. J Pineal Res, 41, 267-274.
TECLEMARIAM-MESBAH, R., TER HORST, G.J., POSTEMA, F., WORTEL, J. & BUIJS,
R.M. (1999) Anatomical demonstration of the suprachiasmatic nucleus-pineal
pathway. J Comp Neurol, 406, 171-182.
TEKBAS, O.F., OGUR, R., KORKMAZ, A., KILIC, A. & REITER, R.J. (2008). Melatonin
as an antibiotic: new insights into the actions of this ubiquitous molecule. J Pineal
Res, 44, 222-226.
103
Referências Bibliográficas
TOBIN, V.A., MCCANCE, I., COLEMAN, H.A. & PARKINGTON, H.C. (2002). How
important is stimulation of alpha-adrenoceptors for melatonin production in rat
pineal glands? J Pineal Res, 32, 219-224.
TRACEY K.J. & CERAMI, A. (1993). Tumor necrosis factor, other cytokines and
disease. Anuu. Rev. Cell Biol, 9, 317-343.
TRACEY, D., KLARESKOG, L., SASSO, E.H., SALFELD, J.G. & TAK, P.P. (2008).
Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehensive review.
Pharmacol Ther, 117, 244-279.
TRACEY, K.J. & CERAMI, A. (1994). Tumor Necrosis factor: a pleiotropic cytokine and
therapuetic target. Annu. Rev. Med, 45, 491-503.
TRENDELENBURG,
U.
(1978).
Extraneuronal
uptake
and
metabolism
of
catecholamines as a site of loss. Life Sci, 22, 1217-1222.
TROIANI, M.E., OAKNIN, S., REITER, R.J., VAUGHAN. M.K. & COZZI, B. (1987).
Depression in rat pineal N-acetyltransferase activity and melatonin content
produced by a hind leg saline injection is time and darkness dependent. J Pineal
Res, 2,185-195.
TROIANI, M.E., REITER, R.J., VAUGHAN, M.K., GONZALEZ-BRITO, A. &
HERBERT, D.C. (1988). The depression in rat pineal melatonin production after
saline injection at night may be elicited by corticosterone. Brain Res, 450, 18-24.
TSAI S, Y. & MCNULTY, J.A. (1999). Interleukin-1beta expression in the pineal gland
of the rat. J Pineal Res, 27, 42-48.
TSAI, S.Y., SCHLUNS, K.S., LE, P.T. & MCNULTY, J.A. (2001). TGF-beta1 and IL-6
expression in rat pineal gland is regulated by norepinephrine and interleukin1beta. Histol Histopathol, 16, 1135-1141.
TURNBULL, A.V. & RIVIER, C.L. (1999). Regulation of the hypothalamic-pituitaryadrenal axis by cytokines: actions and mechanisms of action. Physiol Rev, 79, 1-71.
TZAVARA, E.T., POUILLE, Y., DEFER, N. & HANOUNE, J. (1996). Diurnal variation
of the adenylyl cyclase type 1 in the rat pineal gland. Proc Natl Acad Sci USA, 93,
11208-11212.
ULRICH-LAI, Y.M., ARNHOLD, M.M. & ENGELAND, W.C. (2006). Adrenal
splanchnic innervation contributes to the diurnal rhythm of plasma corticosterone
in rats by modulating adrenal sensitivity to ACTH. Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol, 290, 1128-1135.
104
Referências Bibliográficas
VANECEK, J., SUGDEN, D., WELLER, J. & KLEIN, D.C. (1985). Atypical synergistic α1
and β-adrenergic regulation of adenosine 3',5'-monophosphate and guanosine 3',5'monophosphate in rat pinealocytes. Endocrinology, 116, 2167-2173.
VOISIN, P., NAMBOODIRI, M. A. A. & KLEIN, D. C. (1984). Arylamine Nacetyltransferase and aryl- alkylamine N- acetyltransferase in the mammalian
pineal gland. J biol Chem, 259, 10913-10918.
VOLLRATH, L. (1981). The pineal organ. In Handbuch der mikroskopischen antomie
des menschen. Ed A. Oksche and L. Vollrath, Springer Verlag, Berlin, 6.
WAJANT, H., PFIZENMAIER, K. & SCHEURICH, P. (2003). Tumor necrosis factor
signaling. Cell Death and Differentiation, 10, 45–65.
WALTHER, D.J., PETER, J.U., BASHAMMAKH, S., HÖRTNAGL, H., VOITS, M.,
FINK, H. & BADER, M. (2003). Synthesis of serotonin by a second tryptophan
hydroxylase isoform. Science, 299, 76.
WESSLER, I., REINHEIMER, T., BITTINGER, F., KIRKPATRICK, C.J., SCHENDA, J. &
VOLLRATH, L. (1997). Day-night rhythm of acetylcholine in the rat pineal gland.
Neurosci Lett, 224, 173-176.
WISSINK, S., VAN HEERDE, E.C., SCHMITZ, M.L., KALKHOVEN, E., VAN DER
BURG, B. BAEUERLE, P.A. & VAN DER SAAG, P.T. (1997). Distinct domains of
the RelA NF-kappaB subunit are required for negative cross-talk and direct
interaction with the glucocorticoid receptor. J Biol Chem, 272, 22278-22284.
WITHYACHUMNARNKUL, B., NONAKA, K.O., ATTIA, A.M. & REITER, R.J. (1990).
Changes in indole metabolism in organ cultured rat pineal glands induced by
interferon-gamma. J Pineal Res, 8, 313-322.
WONG, D.L., HAYASHI, R.J. & CIARANELLO, R.D. (1985). Regulation of biogenic
amine methyltransferases by glucocorticoids via S-adenosylmethionine and its
metabolizing
enzymes,
methionine
adenosyltransferase
and
S-
adenosylhomocysteine hydrolase. Brain Res, 330, 209-216.
WU, C.C., CHIAO, C.W., HSIAO, G., CHEN, A., YEN, M.H. (2001). Melatonin prevents
endotoxin-induced circulatory failure in rats. J Pineal Res, 30, 147-156.
YAMADA, H., OGURA, A., KOIZUMI, S., YAMAGUCHI, A. & MORIYAMA, Y.
(1998). Acetylcholine triggers L-glutamate exocytosis via nicotinic receptors and
inhibits melatonin synthesis in rat pinealocytes. J Neurosci, 18, 4946-4952.
105
Referências Bibliográficas
YANG, J., LIAO, X., AGARWA, L.M.K., BARNES, L., AURON, P.E. & STARK, G.R.
(2007). Unphosphorylated STAT3 accumulates in response to IL-6 and
activatestranscription by binding to NFkappaB. Genes Dev, 21, 1396-1408.
YOSHIDA, A., KOIDE, Y., UCHIJIMA, M. & YOSHIDA, T.O. (1994). IFN-gamma
induces IL-12 mRNA expression by a murine macrophage cell line, J774. Biochem
Biophys Res Commun, 198, 857-861.
YUWILER, A. (1989). Effects of steroids on serotonin-N-acetyltransferase activity of
pineals in organ culture. J Neurochem, 52, 46-53.
ZHAO, Z.Y. & TOUITOU, Y. (1993). Kinetic changes of melatonin release in rat pineal
perifusion at different circadian stages. Effect of corticosteroids. Acta Endocrinol
Copenh, 129, 81-88.
106
Súmula Curricular
X. SÚMULA CURRICULAR
Informações pessoais
Nome completo: Pedro Augusto Carlos Magno Fernandes
Sexo: masculino
Data e local de nascimento: 23/12/1979; São Paulo - São Paulo, Brasil
Nacionalidade: brasileiro
Endereço eletrônico:
[email protected]
______________________________________________________________________
Formação Acadêmica
2004 – atual:
Estudante de doutorado do curso de Fisiologia desde 2004
Instituição: Universidade de São Paulo, USP, São Paulo, Brasil.
Université Louis Pasteur, Strasbourg, France (2006).
Título Tese: Glândula Pineal de Ratos como Alvo de
Mediadores Inflamatórios.
Orientadora: Regina Pekelmann Markus- Universidade de São
Paulo, São Paulo, Brazil.
Coorientadora: Valérie Simonneaux- Université Louis Pasteur,
Strasbourg, France.
Bolsas: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo (FAPESP/processo: 04/10922-3) 11/2004 -11/
2005; 11/ 2006-11/2008
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES/COFECUB) 12/2005-12/2006
2000 – 2004:
Bacharel em Ciências Biologicas
Instituição: Instituto de Biociências da Universidade de São
Paulo (USP) - São Paulo, Brasil
Titulo da iniciação científica: Corticosterona potencia a
produção de melatonina in vitro
Orientadora: Regina Pekelmann Markus
Bolsa de Iniciação Científica: Fundação de Amparo à Pesquisa
do Estado de São Paulo (FAPESP). 2002-2003
107
Súmula Curricular
Produção Científica
______________________________________________________________________
ARTIGOS PUBLICADOS
1. Fernandes, P.A.C.M., Bothorel, B., Clesse, D. Monteiro, A.A., Calgari, C.,
Raison, S., Simonneaux, V., Markus, R.P. (2009). Local corticosterone
infusion enhances nocturnal pineal melatonin production in vivo. J
Neuroendocrinol, 21, 90-97.
2. Markus, R.P., Ferreira, Z.S., Fernandes, P.A.C.M., Cecon, E. (2007). The
immune-pineal axis: a shuttle between endocrine and paracrine
melatonin sources. Neuroimmunomodulation, 14, 126 - 133.
3. Fernandes, P.A.C.M., Cecon, E., Markus, R.P., Ferreira, Z.S. (2006). Effect
of TNF-alpha on the melatonin synthetic pathway in the rat pineal gland:
basis for a 'feedback' of the immune response on circadian timing. J
Pineal Res, 41, 344 – 350.
4. Ferreira, Z.S., Fernandes, P.A.C.M., Duma, D. ; Assreuy, J., Avellar,
M.S.W., Markus, R.P. (2005). Corticosterone modulates noradrenalineinduced melatonin synthesis trhught inhibition of nuvlear factor kappa
B. J Pineal Res, 38, 182-188.
_____________________________________________________________________
COMUNICAÇÃO ORAL EM CONGRESSO INTERNACIONAL
1. Fernandes, P.A.C.M., Bothorel, B., Markus, R.P., Simonneaux, V. Local
perfusion of corticosterone mimicking inflammation in the rat pineal
gland increases melatonin production. XXXVIII Congrés de la Société
Francophone de Chronobiologie, Lion France, 2006.
______________________________________________________________________
108
Súmula Curricular
POSTERES APRESENTADOS EM CONGRESSOS INTERNACIONAIS
1. Fernandes, P.A.C.M., Cecon, E., Monteiro, A.W.A., Ferreira, Z.S.F. &
Markus, R.P.. Effect of Cytokines on the Control of the melatonin
Production by rat Pineal Glands in vitro. In: FASEB Summer Research
Conferences – Melatonin Receptors: Actions and Therapeutics. Snowmas
Village – Colorado – USA de 10 – 15 de agosto de 2008.
2. Fernandes, P.A.C.M., Cecon, E., Monteiro A.W.A., Ferreira Z.S., Markus.
RP. Diferentiated Effects\Interleukine 6 (IL-6) and Interferon γ (IFN-γ) on
Cultured Rat Pineal Function. In: VII Congress of The International
Society for NeuroImmunomodulation. Rio de Janeiro (RJ), Brazil, 2007
3. Fernandes, P.A.C.M., CECON, E., Ferreira, Z.S., Markus, R.P.Effect of
Inflammation (Bacillus Calmet-Guerin, BCG) and Adrenalectomy on the
Production of N-acetylserotonin and NFkB Nuclear Translocation of
Cultured Rat Pineal Gland In: 1st Iberoamerican
Congress of
Neuroimmunomodulation. Rio de Janeiro (RJ), Brazil, 2005.
4. Cecon, E., Fernandes, P.A.C.M., Ferreira, Z.S., Markus, R.P.
Pineal nuclear factor kappa B (NFkB) daily rhythm is impaired by injury
and plays a pivotal role in melatonin production In: 2nd Iberoamerican
Congress of Neuroimmunomodulation, Madrid, Spain, 2007.
5. Cecon, E., Fernandes, P.A.C.M., Markus, R.P., Ferreira, Z.S.
Corticosterone Modulates Aa-nat Gene Expression in Rat Pineal Gland
In: 1st Iberoamerican Congress of Neuroimmunomodulation. Rio de
Janeiro (RJ), Brazil, 2005.
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Súmula Curricular
POSTERES APRSENTADOS EM CONGRESSOS NACIONAIS
1. Fernandes, P. A. C. M.; Cecon, E.; Monteiro A. W. A.; Ferreira, Z. S.;
Markus, R. P. Effects of tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha),
interleukine-1 beta (IL-1beta), interleukine-6 (IL-6) and interferon gamma
(IFN-gamma) on pineal gland function. In: XL Congresso Brasileiro de
Farmacologia e Terapéutica Experimental, Águas de Lindóia, Brazil,
2008.
2. Fernandes, P.A.C.M., Bothorel, B., Markus, R.P., Simonneaux, V. Local
Perfusion of Corticosterone Amplifies Nocturnal Melatonin Surge in Rat
Pineal Gland. In: XXXIX Congresso Brasileiro de Farmacologia e
Terapéutica Experimental, Ribeirão Preto, Brazi, 2007.
3. Fernandes, P.A.C.M., Cecon, E., Cavalcanti, D.M.H., Farsky, S.H.P.,
Ferreira, Z.S., Markus, R.P.Effect of Endogenous Adrenal Cortical
Hormones and the Mechanism of Corticosterone Action on the Pineal
NAS Production In: FESBE - Federação de Sociedades Brasileiras de
Biologia Experimental. Águas de Lindóia (SP), Brazil, 2005.
4. Fernandes, P.A.C.M., Floriano, S.M., Ferreira, Z.S., Markus, R.P. TNFalpha reduces the production of n-acetyjserotonin (NAS) on cultured rat
pineal gland. In: XXXVI Congresso Brasileiro de Farmacologia e
Terapéutica Experimental, Águas de Lindóia, Brazil, 2004.
5. Fernandes, P.A.C.M., Ferreira, Z.S., Markus, R. P. Corticosterone,
inhibiting NF-kappaB patway, potentiates the production of pineal
hormones. In: XXXV Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapéutica
Experimental. Águas de Lindóia, Brazil, 2003.
6. Cecon, E., Fernandes, P.A.C.M., Ferreira, Z.S., Markus, R.P. Nuclear
Factor kappa B (NFkB) Rhythm in Rat Pineal Gland – New Molecular
Basis for Organism Timing In: XXXVIII Congresso Brasileiro de
Farmacologia e Terapêutica Experimental. Ribeirão Preto, Brazil, 2006.
7. Cecon, E., Fernandes, P.A.C.M., Ferreira, Z.S., Markus, R.P. Regulação do
Fator de Transcrição NFkB em Glândulas Pineais de Rato In: IX Simpósio
Brasileiro de Cronobiologia. Águas de Lindóia, Brazil, 2006.
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Súmula Curricular
PRÊMIOS
1. “Travel Award – For Outstanding Research in the field of Melatonin”
pelo trabalho: Fernandes, P.A.C.M., Cecon, E., Monteiro, A.W.A.,
Ferreira, Z.S.F. & Markus, R.P.. Effect of Cytokines on the Control of the
melatonin Production by rat Pineal Glands in vitro. durante o congresso
“ In: FASEB Summer Research Conferences – Melatonin Receptors:
Actions and Therapeutics.” Realizado em Snowmas Village – Colorado –
USA de 10 – 15 de agosto de 2008,
2. Melhor poster da sessão: Fernandes, P.A.C.M., Bothorel, B., Markus, R.P.,
Simonneaux, V. Local Perfusion of Corticosterone Amplifies Nocturnal
Melatonin Surge in Rat Pineal Gland. In: XXXIX Congresso Brasileiro de
Farmacologia e Terapéutica Experimental, Ribeirão Preto, Brazi, 2007.
3. Melhor poster da sessão: Fernandes, P.A.C.M., Floriano, S.M., Ferreira,
Z.S.,
Markus,
R.P.
TNF-alpha
reduces
the
production
of
n-
acetyjserotonin (NAS) on cultured rat pineal gland. In: XXXVI Congresso
Brasileiro de Farmacologia e Terapéutica Experimental, Águas de
Lindóia, Brazil, 2004.
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Trabalhos Publicados
XI. TRABALHOS PUBLICADOS
1. Ferreira, Z.S., Fernandes, P.A.C.M., Duma, D.; Assreuy, J., Avellar,
M.S.W., Markus, R.P. (2005). Corticosterone modulates noradrenalineinduced melatonin synthesis trhught inhibition of nuvlear factor kappa
B. J Pineal Res, 38, 182-188.
2. Fernandes, P.A.C.M., Cecon, E., Markus, R.P., Ferreira, Z.S. (2006). Effect
of TNF-alpha on the melatonin synthetic pathway in the rat pineal gland:
basis for a 'feedback' of the immune response on circadian timing. J
Pineal Res, 41, 344 – 350.
3. Markus, R.P., Ferreira, Z.S., Fernandes, P.A.C.M., Cecon, E. (2007). The
immune-pineal axis: a shuttle between endocrine and paracrine
melatonin sources. Neuroimmunomodulation, 14, 126 - 133.
4. Fernandes, P.A.C.M., Bothorel, B., Clesse, D. Monteiro, A.A., Calgari, C.,
Raison, S., Simonneaux, V., Markus, R.P. (2009). Local corticosterone
infusion enhances nocturnal pineal melatonin production in vivo. J
Neuroendocrinol, 21, 90-97.
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