Uso da bioinformática na análise genômica
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Bioinformática
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Fim
Processamento de seqüências
30
20
cromatograma
10 acgatctcgctagctgctactgtagccgcgattattcgcgatctacgtatatcgcgatcgatc
• O programa Phred lê o cromatograma e nomeia as bases
• Cada base tem uma chance de erro de sua nomeação (10% = 0,1)
DNA:
• A escala
de Phred é semelhante à de pH multiplicado por 10:
FASTA
- chance de erro de 0,001 = 10-3 = Phred 30
Seq.qual
• A nomeação é praticamente aleatória no início e no final, onde a
chance de erro é alta (baixo valor de Phred)
Crescimento do GenBank
Seqüências
16.000.000
15 milhões
14.000.000
24h
Europeu
12.000.000
Japonês
10.000.000
8.000.000
6.000.000
4.000.000
2.000.000
606
0
Ano
Seqüencias do DNA
Seqüências do mRNA
Repetição calculada
•draft
= 5x
•finished = 10x
Amostragem
tecidos
momentos
(genoma)
Genoma pequeno
(seqüenciador grande)
(genes expressos)
Eucariotos
mRNA
TR
cDNA
Seqüenciamento parcial
de transcritos
Seqüênciamento de genes expressos:
Documentar a existência de transcritos gênicos
num transcriptoma [otorrin... e ...damonh...]
• EST (Etiqueta de Seqüência Expressa)
– seqüenciamento único de cada cDNA
– extremidades 5’ ou 3’
• ORESTES (ESTs ricas em ORFs)
– seqüenciamento único do amplicon derivado de
cDNA por PCR inespecífico
– prevalece o centro do cDNA (cds)
Um mRNA & suas ESTs
AUG
ATG
cDNA (fita +)
ATCATGACTTACGGGCGCGCGAT
cDNA (fita -)
AUG
(A)20
(A)
18
0(T)18
cDNA (fita +)
GGCGCGCGATATCC
cDNA (fita -)
(A)20
(A)
18
0(T)18
Quantas ESTs de Schistosoma mansoni há no NCBI?
Quantas proteínas não mitocondriais?
PCR inespecífico & seu ORESTES
AUG
ampliconGGGCGCGCGATATCGAAAAATTTATAAGGCTAG
(fita +)
CCCCGGCGGCTCGGCCGGGGAGATCGATCATGAC
AGATCGATCATGACTTACGGGCGCGCGATATCG
amplicon
cDNA (fita -)
Iniciador
PCR
(60ºC(60ºC)37ºC)
Quantos ORESTES estão hoje no NCBI?
Eles são ESTs?
Só há ORESTES humanos?
(A)200
250
200
150
100
2. Estudando coleções de sequências
• Alinhamento de um grupo pequeno de sequências
com MultiAlign
• Descarregando um grande número de sequências
através do BatchEntrez
• Formação de aglomerados de sequências com
Icatools, com Cap3 ou Megablast
• Estimando distância evolutiva com Phylip
Aglomerados ou
Clusters
• Uma das atividades em bioinformática é formar
aglomerados de todas as sequências geradas no
projeto (as figurinhas de um álbum)
• Podemos saber quantas vezes um gene foi
seqüenciado, e detectar os freqüentes!
• E quantos dos genes foram detectados
– Usa-se também para validar bibliotecas
– Pode usar dados originais ou descarregados do NCBI
• Alinhamento global: usar para publicar
• Quando se quer comparar globalmente as
sequências, busca-se o melhor alinhamento global
• Um bom algoritmo computacional é o usado no Fast
Alignment, apelidado de FASTA
Descarregando muitas
seqüências com BatchEntrez
• Inicialmente busque suas seqüências
• Descarregue uma lista dos indicadores delas (GI)
• Use o BatchEntrez para baixar o FASTA das
seqüências
• Estude-as localmente com seu programa predileto
Alinhamento Global
• Comparação exaustiva
• Visando
• Use o BatchEntrez para baixar o FASTA das
seqüências
• Estude-as localmente com seu programa predileto
Phylip
• Genes ortólogos são os
homólogos mais próximos entre
dois organismos (BestHit)
• A evolução os faz diferentes
• Phylip DNAdist mede
• Phylip Protdist para proteínas
• Plylip Neighbor faz uma matriz
• E um desenhador de árvore:
Programas para aglomerar
•
•
•
•
•
•
Icatools
Phrap
Cap3, Cap4
Swat
BLAST
MegaBLAST
Um aglomerado = Um gene
UniGene
• Organização das sequências do GenBank em um
conjunto de aglomerados
• Cada aglomerado do UniGene contém as sequências
que representam um gene único
• E também informações relacionadas, como em que
tecidos o gene é expresso, etc.
• E também onde está mapeado
MegaBLAST gera o UniGene
Todas ESTs contra todas
Detecção de homologia
> 96% de identidade
> 70% do potencial
Aglomerar
Qualidade das bibliotecas
(100 primeiras ESTs)
Boa biblioteca?
1
2
3
4
5
7
9
11
Freqüência em que uma EST foi amostrada
catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctaactagctgactg
catcgatcgatcgtcgtagctacgtagctagctagctagctagctagctagctagctgactg
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