UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
GABRIEL DA SILVA SOUZA
OS EFEITOS DA ATIVIDADE FÍSICA SOBRE ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDO
POR EPILEPSIA NO CÉREBRO
Tubarão
2007
GABRIEL DA SILVA SOUZA
OS EFEITOS DA ATIVIDADE FÍSICA SOBRE ESTRESSE OXIDATIVO INDUZIDO
POR EPILEPSIA NO CÉREBRO.
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao
Curso de Fisioterapia da Universidade do Sul de
Santa Catarina, como requisito parcial à
obtenção do título de Bacharel em Fisioterapia.
Orientador: Prof. Aderbal Silva Aguiar Jr.
Tubarão
2007
Dedico este trabalho aos meus pais, Tania e
Edson, por tornar tudo isso possível e
permanecerem sempre ao meu lado; a
minha irmã, Beatriz, por todo o apoio e a
minha namorada, Bruna, por toda força,
cobrança, paciência e compreensão que
teve comigo durante todo este processo.
Amo muito todos vocês!
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente aos meus pais, Tania e Edson, pela vida, pelo
amor, pela criação exemplar que me deram, por sempre me apoiarem em minhas
decisões e por todo o apoio nesta fase da minha vida.
A minha irmã, Beatriz, por todo seu amor e por me aturar durante toda a
sua vida.
A minha namorada, Bruna, por todo amor, apoio, cobrança, paciência,
compreensão e momentos inesquecíveis que me proporcionou durante nossos 2
anos de namoro.
Ao meu orientador, Aderbal, por toda dedicação e disponibilidade de
tempo para me auxiliar neste projeto.
Ao Paulo Renato, por me ajudar na preparação dos camundongos.
Aos profissionais do Departamento de Bioquímica da Universidade
Federal de Santa Catarina – UFSC, que realizaram os testes comportamentais,
dissecações e análises bioquímicas necessárias para a obtenção dos resultados.
Ao Arlindo, profissional que cuida do Biotério da Universidade do Sul de
Santa Catarina – UNISUL, proporcionando os cuidados necessários aos meus
camundongos.
Aos membros da banca, pela disponibilidade de tempo para contribuir com
o meu trabalho.
RESUMO
As espécies reativas de oxigênio (EROs) implicam na patogênese de várias
desordens neurológicas, inclusive a epilepsia. O tratamento farmacológico da
epilepsia é voltado para o controle de convulsões, sendo alternativas meramente
paliativas. Assim, buscam-se estratégias terapêuticas que também atuem no
processo neurodegenerativo desta patologia, como por exemplo, o exercício. Este
estudo teve como meta geral analisar os efeitos da atividade física sobre dano
oxidativo induzido por epilepsia no cérebro de camundongos, tendo como objetivos
específicos: verificar níveis de oxidação de lipídios no hipocampo, identificar níveis
de oxidação de proteínas no hipocampo, analisar níveis da enzima citrato sintase no
músculo sóleo e verificar atividade motora e memória olfativa. Os camundongos
foram separados em 4 grupos, com 7 camundongos em cada grupo (grupo sham,
epilepsia, sham exercício, epilepsia exercício). O tempo de treinamento foi de 8
semanas com acesso livre a roda de correr. Os camundongos foram induzidos à
epilepsia através de polimicrogiria. Foi realizada análise da enzima cintrato sintase
no músculo sóleo, teste de campo aberto e de discriminação olfatória e verificação
dos níveis de lipoperoxidação e carbonilação no hipocampo. Verificou-se que: 8
semanas foram suficientes para treinar os camundongos; a epilepsia não leva a
déficits motores; a epilepsia causa prejuízos significativos à memória olfativa dos
animais e 8 semanas de exercício foram suficientes para reverter os mesmos; os
níveis de lipoperoxidação mostraram-se elevados no grupo epilepsia, sendo
diminuídos após 8 semanas de exercício, mas sem conseguir voltar a normalidade;
os níveis de carbonilação mostraram-se diminuídos no grupo epilepsia exercício,
quando comparados ao grupo epilepsia. Comprovou-se que a atividade física
diminuiu o dano oxidativo no cérebro gerado pela epilepsia e reverteu os prejuízos
causados pela epilepsia à memória olfativa dos camundongos. Assim, demonstrouse que o exercício pode ser uma das estratégias terapêuticas que atuam no
processo neurodegenerativo gerado pela epilepsia.
Palavras-chave: Epilepsia. Estresse oxidativo. Atividade física.
ABSTRACT
The reactivate oxygen species (ROS) implicate in the patogenesis of several
neurological disorders, besides the epilepsy. The farmacologic treatment of the
epilepsy is gone back to the control of convulsions, being merely palliative
alternative. Like this, therapeutic strategies are looked for that also act in the
neurodegenative process of this pathology, as for instance, the exercise. This study
had as general goal to analyze the effects of the physical activity on oxidative
damage induced by epilepsy in the brain of mice, tends as specific objectives: to
verify levels of oxidation of lipids in the hippocampus, to identify levels of oxidation of
proteins in the hippocampus, to analyze levels of the enzyme citrate synthase in the
muscle soleus and to verify motive activity and smell memory. The mice were
separate in 4 groups, with 7 mice in each group (I group sham, epilepsy, sham
exercise, epilepsy exercise). The time of training was of 8 weeks with free access the
wheel of running. The mice were induced to the epilepsy through polymicrogyria.
Analysis of the enzyme citrate synthase was accomplished in the muscle soleus, test
of open field and of olfactory discrimination and verification of the lipoperoxidation
and protein oxidation levels in the hippocampus. It was verified that: 8 weeks were
enough to train the mice; the epilepsy doesn't take to motor deficits; the epilepsy
causes significant damages to the smell memory of the animals and 8 weeks of
exercise were enough to revert the same ones; the lipoperoxidation levels were
shown high in the group epilepsy, being reduced after 8 weeks of exercise, but
without getting to return the normality; the protein oxidation levels were shown
decreased in the group epilepsy exercise, when compared to the group epilepsy.
He/she was proven that the physical activity reduced the oxidative damage in the
brain generated by the epilepsy and it reverted the damages caused by the epilepsy
to the smell memory of the mice. Like this, it was demonstrated that the exercise can
be one of the therapeutic strategies that act in the neurodegenerative process
generated by the epilepsy.
Key words: Epilepsy. Oxidative stress. Physical activity.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – EEG de paciente normal...........................................................................13
Figura 2 – EEG de paciente com epilepsia................................................................14
Figura 3 – Metabolismo oxidativo normal...................................................................20
Figura 4 – Estresse oxidativo.....................................................................................21
Fotografia 1 – Roda de correr utilizada no treino dos camundongos.........................28
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Atividade da enzima citrato sintase aumentada nos grupos que
realizaram exercício...................................................................................................31
Gráfico 2 – Teste de campo aberto, não mostrando diferença significativa entre os
grupos.........................................................................................................................32
Gráfico 3 – Teste de discriminação olfatória mostrando que a epilepsia causa
prejuízos significativos a memória olfativa dos animais e que 8 semanas de exercício
foram suficientes para reverter a mesma...................................................................33
Gráfico 4 – Níveis de LPO elevados no grupo epilepsia e diminuídos após 8
semanas de exercício, mas sem conseguir voltar a normalidade..............................35
Gráfico 5 – Níveis de carbonilação diminuídos no grupo epilepsia exercício quando
comparados ao grupo epilepsia.................................................................................36
LISTA DE SIGLAS
ATP – trifosfato de adenosina
AVC – acidente vascular encefálico
CAT – catalase
EEG – eletroencefalgroma
EROs – espécies reativas de oxigênio
GPx – glutationa peroxidase
GSH – glutationa
ILAE – Liga Internacional de Epilepsia
LPO – lipoperoxidação
PTZ – pentilenetetrazol
SNC – sistema nervoso central
SOD – superóxido dismutase
TBARS – substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................10
2 EPILEPSIA ............................................................................................................13
2.1 HISTÓRICO ........................................................................................................13
2.2 DEFINIÇÃO.........................................................................................................13
2.3 EPIDEMIOLOGIA................................................................................................14
2.4 ETIOLOGIA .........................................................................................................15
2.5 CLASSIFICAÇÃO................................................................................................15
2.5.1 Crises parciais................................................................................................15
2.5.2 Crises generalizadas......................................................................................16
2.6 EPILEPSIA E DANO OXIDATIVO.......................................................................16
2.7 OXIDAÇÃO E ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO ........................................17
2.7.1 Sistema de defesa antioxidante ....................................................................18
2.7.2 Estresse oxidativo..........................................................................................20
2.8 ATIVIDADE FÍSICA.............................................................................................21
2.8.1 Definição .........................................................................................................21
2.8.2 Atividade física e estresse oxidativo ............................................................22
2.9 MEMÓRIA ...........................................................................................................24
2.9.1 Tipos de memória...........................................................................................24
2.9.2 Amnésia ..........................................................................................................25
2.9.3 Lobos temporais e seu papel na memória ...................................................26
2.9.4 Condicionamento clássico e operante .........................................................26
3 DELINEAMENTO DA PESQUISA .........................................................................27
3.1 ANIMAIS..............................................................................................................27
3.2 PROCEDIMENTOS.............................................................................................27
4 ANÁLISE DOS DADOS E DISCUSSÃO ...............................................................31
4.1 ATIVIDADE DA CITRATO SINTASE ..................................................................31
4.2 CAMPO ABERTO ...............................................................................................31
4.3 DISCRIMINAÇÃO OLFATÓRIA ..........................................................................32
4.4 NÍVEIS DE LIPOPEROXIDAÇÃO E CARBONILAÇÃO ......................................34
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................38
REFERÊNCIAS.........................................................................................................39
10
1 INTRODUÇÃO
O sistema nervoso central (SNC) é mais suscetível a danos oxidativos,
pois apresenta grande atividade energética mitocondrial dependente de oxigênio,
associada à elevada concentração de ferro livre e lipídios polinsaturados e baixos
níveis de enzimas antioxidantes (AGUIAR JR., PINHO; 2007). Segundo Rajasekaran
(2005), dados crescentes de modelos experimentais no cérebro humano sugerem
que este estresse oxidativo e seus acometimentos podem ter um importante papel
fisiopatológico em problemas neurológicos agudos como acidente vascular cerebral
(AVC) e convulsões.
As espécies reativas de oxigênio (EROs) implicam na patogênese de
várias
desordens
frequentemente
neurológicas
acompanhadas
inclusive
pela
a
epilepsia.
geração
de
EROs
Convulsões
são
causando
uma
lipoperoxidação (LPO), que pode consequentemente causar uma neurodegeneração
observada em certos tipos de epilepsia humana (RAJASEKARAN, 2005). Conforme
Patel (2004), estudos com animais mostram que convulsões resultam na produção
de EROs e danos oxidativos nas proteínas celulares, lipídios e DNA.
De acordo com Gluck e outros (2000), o estado epiléptico é uma
emergência neurológica associada com uma taxa de mortalidade de 10-12%. Esta
condição é caracterizada por prolongadas ou repetitivas descargas epilépticas,
resultando clinicamente em persistentes alterações do funcionamento normal do
cérebro e estado cognitivo. A prolongada excitação dos neurônios durante as
convulsões pode causar dano e morte. Um dos mecanismos plausíveis de dano
celular envolve a formação excessiva de EROs, evidências incluem a correlação
temporal entre a geração de EROs e o desenvolvimento de convulsões em
condições patológicas e a proteção eficaz de agentes antioxidantes contra alguns
tipos de convulsões (FRANTSEVA et al., 2000).
Evidências
demonstram
descargas
elétricas
anormais
no
eletroencefalograma (EEG) na maioria dos pacientes epilépticos, desaparecendo
durante a atividade física e retornando ao repouso (ARIDA et al., 1999).
O tratamento farmacológico da epilepsia é baseado na carbamazepina,
valproato,
fenitoína,
fenobarbital
e
primidona
(controle
de
convulsões)
(GUERREIRO, 2006), que são alternativas meramente paliativas. Assim, buscam-se
estratégias terapêuticas que também atuem no processo neurodegenerativo desta
11
patologia, como por exemplo, o exercício. Os benefícios dos exercícios físicos
regulares são bem comprovados, tais como, diminuição do risco de doenças
cardiovasculares (PLAISANCE et al., 2007), câncer (DE BACKER et al, 2007),
osteoporose (BORER, 2005) e diabetes (HU et al., 2007). O complexo mecanismo
que contribui para esses efeitos inclui diminuição do tecido adiposo, alteração dos
perfis lipídicos e hormonais, recepção e transporte-adaptadores protéicos,
melhoramento da função mitocondrial e alterações das defesas antioxidantes. Essas
defesas são necessárias porque os organismos aeróbicos produzem EROs durante
a respiração normal e condições inflamatórias (LEEUWENBURGH; HEINECKE,
2001).
Aguiar Jr. e Pinho (2007) citam que os benefícios do exercício à saúde
mental em geral e na prevenção de doenças são bem conhecidos. Entretanto, o
exercício crônico representa uma forma de estresse oxidativo para o organismo e
pode alterar o balanço entre oxidantes e antioxidantes. Os antioxidantes biológicos
desempenham papel na proteção celular do estresse oxidativo induzido pelo
exercício. Não somente uma grande produção de EROs, mas também a deficiência
ou depleção de vários sistemas antioxidantes, pode revelar exacerbação da lesão
oxidativa, enquanto a suplementação de vários antioxidantes gera resultados
diversos.
Na última década pacientes com desordens crônicas vem sendo
encorajados a participar de atividades esportivas como parte de sua reabilitação.
Pacientes com doenças crônicas, tais como a epilepsia, são facilmente excluídos de
atividades físicas por causa de medo, proteção ou falta de informação (ARIDA et al.,
1999).
A atividade motora regular traz muitos benefícios às condições mentais e
físicas, mas as implicações para epilepsia ainda são controversas. Visando
esclarecer este problema será estudado se a atividade física diminui o estresse
oxidativo a nível cerebral em casos de epilepsia.
Sendo assim o presente estudo teve como meta geral analisar os efeitos
da atividade física sobre dano oxidativo induzido por epilepsia no cérebro de
camundongos. Esta pesquisa teve como objetivos específicos: verificar níveis de
oxidação de lipídios no hipocampo, identificar níveis de oxidação de proteínas no
hipocampo, analisar níveis da enzima citrato sintase no músculo sóleo e verificar
atividade motora e memória olfativa.
12
Esta pesquisa foi dividida em cinco capítulos, sendo que o primeiro referese à introdução, relatando um breve comentário sobre o assunto a ser tratado neste
trabalho. O segundo capítulo está direcionado ao referencial teórico, descrevendo
detalhadamente o assunto pesquisado. No terceiro capítulo consta o delineamento
desta pesquisa, expondo o tipo de pesquisa, a população/amostra utilizada, o
material e o procedimento de coletas dos dados. Já o quarto capítulo expõe a
apresentação e discussões dos possíveis resultados. E o quinto capítulo refere-se às
considerações finais e sugestões feitas pelo autor do estudo.
13
2 EPILEPSIA
2.1 HISTÓRICO
A epilepsia foi reconhecida pela primeira vez como uma doença do
cérebro por Hipócrates em sua monografia “On the Sacred Disease”. Mas foi
somente em 1889 que Jackson & Beevor e Jackson & Colemann verificaram em
exame post mortem a associação entre lesão de córtex frontal e crises convulsivas
motoras focais.
Barbosa-Coutinho e outros (1999) citam que inicialmente a demonstração
da presença de lesões focais em pacientes com epilepsia era realizada apenas em
estudos pós-morte como no importante estudo realizado por Margerison & Corselis
sobre alterações clínicas, eletrencefalográficos e neuropatológicos em pacientes
com epilepsia.
2.2 DEFINIÇÃO
Para Rigatti e Trevisol-Bittencourt (1999), epilepsia é um distúrbio
recorrente da bioeletrogênese cerebral. Epilepsias poderão ser provocadas por
praticamente qualquer condição que afete o córtex cerebral. Pode, por exemplo, ser
conseqüência de anomalias congênitas, infecções, tumores doenças vasculares,
doenças degenerativas ou lesão traumática.
De acordo com Patel (2004), a epilepsia pode ser convulsiva ou nãoconvulsiva caracterizada por uma atividade elétrica anormal em um grupo de
neurônios cerebrais.
14
Figura 1 – EEG de paciente normal
Fonte: Markand, 2003.
Figura 2 – EEG de paciente com epilepsia
Fonte: Markand, 2003.
2.3 EPIDEMIOLOGIA
Segundo Rigatti e Trevisol-Bittencourt (1999), epilepsia é uma síndrome
neurológica comum, tendo alta prevalência mundial, estimada entra 0,4 a 2% da
população geral. No Brasil, apesar da inexistência de estudos epidemiológicos
adequados envolvendo diferentes regiões sócio-econômicas, supõe-se que algo em
torno de 1 a 2% da população em geral esteja sendo acometida por algumas das
formas de epilepsia.
Em mais de 3/4 dos pacientes com epilepsia, as crises começam antes
dos 18 anos. Na ultima década, aparentemente aumentou a incidência de ataques
epilépticos iniciando na vida adulta (RIGATTI; TREVISOL-BITTENCOURT, 1999,).
A incidência da epilepsia é maior em crianças com idade menor que 5
anos, também aparecendo em indivíduos com idade superior a 65 anos (PATEL,
2004).
15
2.4 ETIOLOGIA
De acordo com Borges e outros (2001), a etiologia da epilepsia pode ser
classificada de acordo com as normas da “Commission Epidemiology na Prognosis”
da Liga Internacional de Epilepsia (ILAE), conforme segue:
a) Idiopática, conforme Borges e outros (2001), refere-se à epilepsia que
se enquadra em umas síndromes epilépticas (presumidamente genética) e ocorre na
ausência de quaisquer anormalidades neurológicas.
b) Sintomática, segundo Borges e outros (2001), refere-se à epilepsia que
ocorre na presença de uma agressão remota ou a uma prévia desordem que seja
reconhecidamente associada a fator de risco da epilepsia.
Segundo Rigatti e Trevisol-Bittencourt (1999), alguns exemplos da
classificação sintomática são: cisticercose, traumatismo craniano encefálico,
convulsão febril, meningite/outras infecções, transtornos no parto, neoplasias, mau
formação artério-venosa, doença vascular cerebral.
c) Criptogênico, de acordo Borges e outros (2001), este termo é usado
quando há ausência de causa identificável, e o paciente não reúne critério para a
síndrome epiléptica idiopática.
2.5 CLASSIFICAÇÃO
Mory e outros (2002) citam que as crises epilépticas são classificadas de
acordo com os critérios propostos pela ILAE em dois grandes grupos: parciais (ou
focais) e generalizadas; estas por sua vez, são subdivididas de acordo com as
características de semiologia e caracterização eletroencefalográfica.
2.5.1 Crises parciais
Conforme Mory e outros (2002), as crises parciais apresentam achados
semiológicos e eletroencefalográficos que envolvem uma região especifica do córtex
cerebral.
As crises parciais são divididas em simples e complexas: nas crises
parciais simples o indivíduo é capaz de perceber e interagir com o meio, enquanto
16
que nas crises parciais complexas ocorre comprometimento da consciência (MORY
et al, 2002, p. 789).
2.5.2 Crises generalizadas
Nas crises generalizadas, as primeiras manifestações clínicas indicam
envolvimento de ambos os hemisférios e o padrão eletrográfico durante a crise é
bilateral desde o início (MORY et al, 2002, p. 789).
Segundo Mory e outros (2002), dentre os diversos tipos de crises que
ocorrem nas epilepsias generalizadas, as crises de ausência e as mioclônicas são
as mais relevantes no contexto do diagnóstico diferencial entre as síndromes
epilépticas em adultos.
2.6 EPILEPSIA E DANO OXIDATIVO
Epilepsia é uma doença neurológica crônica, associada continuamente a
dano neurológico, particularmente quando descontrolada. O dano oxidativo pode ter
um papel na iniciação e progressão da epilepsia e terapias que visam reduzir o
estresse oxidativo podem diminuir os danos teciduais e causar uma alteração
favorável no quadro clínico (COSTELLO; DELANTY; 2004).
Frantseva e outros (2000) relatam que o estresse oxidativo pode ocorrer
durante as convulsões e participar da patofisiologia da epilepsia. Tais evidências
incluem o aumento da incidência de convulsões devido a traumatismo craniano,
hiperoxigenação e hipoxia, condições estas associadas com um grande aumento da
produção de EROs, assim como uma variedade de modelos experimentais de
epilepsia onde é observado a formação de EROs.
Um papel importante das EROs durante as convulsões induzindo morte
neuronal, é suportado em parte pela observação de repetidos ataques epilépticos
resultando em um aumento da oxidação de macromoléculas celulares e combinadas
com propriedades antioxidantes (superóxido dismutase (SOD), vitamina C e
melatonina) (PATEL, 2004).
Convulsões que levam a morte neuronal envolvendo processos de
necrose e apoptose, são fortemente influenciadas pelo funcionamento mitocondrial e
estresse oxidativo (PATEL, 2004).
17
Através de modelos de epilepsia experimentais em roedores, tais como o
induzido por pentilenetetrazol (PTZ), verificou-se estresse oxidativo no SNC. As
principais razões para o desenvolvimento de estresse oxidativo no SNC podem ser a
diminuição das defesas antioxidantes e o aumento da formação de EROs. Além
disso, o cérebro é rico em ácidos graxos polinsaturados, tornando os neurônios
particularmente vulneráveis ao dano oxidativo (PATSOUKIS et al., 2004).
O estresse oxidativo é visto como uma conseqüência importante da
ativação do receptor de glutamato e excitotoxicidade, tendo um papel crítico no dano
do cérebro epiléptico (PATEL, 2004).
Agressões à membrana lipídica, incluindo LPO, contribui significantemente
para o mau funcionamento da membrana durante a epileptogênese; o aumento da
produção de EROs e danos oxidativos a lipídios foram verificados durante
convulsões e danos neuronais (RAJASEKARAN, 2005).
A Glutationa (GSH), principal tiol não-enzimático dos organismos
aeróbicos, é conhecida por participar de diversos processos celulares, também pela
ação direta como antioxidante ou substrato em vários mecanismos enzimáticos de
defesa antioxidantes. O papel importante da GSH nas convulsões foi verificado
através de estudos no qual esse tiol foi administrado para inibir a convulsões
induzidas pela PTZ ou pelo aumento dos níveis das convulsões induzido pelo
decréscimo nos níveis de GSH no cérebro. Isto é atribuído ao fato de a depleção de
GSH no cérebro gerar elevados níveis de EROs (PATSOUKIS et al, 2004).
Os receptores GABA, que são os principais alvos de ação das drogas
anticonvulsivantes, são altamente sensíveis ao estresse oxidativo. As EROs podem
comprometer
os
receptores
GABA,
contribuindo
para
o
dano
neuronal
(RAJASEKARAN, 2005).
2.7 OXIDAÇÃO E ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO
Com exceção dos anaeróbios, a maioria dos organismos usa o oxigênio
como aceptor terminal de elétrons para oxidar os vários tipos de componentes
energéticos metabólicos estocados para que haja a liberação de energia requerida
para as atividades biológicas (GARRETT JR; KIRKENDALL, 2003).
O oxigênio (O2) representa um paradoxo por ser elemento essencial e, ao
mesmo tempo, potencialmente destrutivo para saúde (GHORAYEB; BARROS,
18
2004). Nós somos dependentes do O2 para reações de oxidação durante a geração
de trifosfato de adenosina (ATP), desintoxicação e biosíntese. No entanto, quando o
O2 aceita um elétron livre, ele se transforma em um radical de oxigênio altamente
reativo causando danos celulares em lipídios, proteínas e DNA. Danos causados por
radicais de oxigênio reativos contribuem para morte celular e degeneração em uma
longa gama de doenças (SMITH; MARKS; LIEBERMAN, 2005.).
Os processos de oxiredução são resultados da troca de elétrons entre
átomos e moléculas (GHORAYEB; BARROS, 2004). O oxigênio é um elétron que
permite que os organismos aeróbicos usem a energia armazenada nos nutrientes,
tais como carboidratos, lipídios e proteínas. Isto ocorre devido a processos
catabólicos capazes de gerar EROs, tais como superóxido (O2·), radical hidroxil
(OH¯ ) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Em condições fisiológicas normais, a maioria
das EROs são produzidas na cadeia mitocondrial transportadora de elétrons,
aproximadamente 95% do consumo de oxigênio do corpo é reduzido a água nas
mitocôndrias e 5% a EROs (JI, 1999).
Para Koury e Donangelo (2003), as EROs são átomos, íons ou moléculas
que contém oxigênio com um elétron não pareado em sua órbita externa. Segundo
Ghorayeb e Barros (2004), quando se aumenta a ingestão calórica, a carga de
exercício ou se eleva a pressão de oxigênio, o que se faz é aumentar o consumo
desse último elemento. Isto ocasiona maior produção de EROs.
O constante contato e a reação dos constituintes celulares (incluindo
material genético) com as EROs têm sido proposto como o principal mecanismo de
envelhecimento do organismo (GARRETT JR; KIRKENDALL, 2003).
2.7.1 Sistema de defesa antioxidante
A geração de EROs é um processo normal na vida de organismos
aeróbicos. Em condições fisiológicas, estas espécies deletérias são removidas
principalmente pelos sistemas antioxidantes celulares, que incluem vitaminas
antioxidantes, tiols protéicos e não-protéicos e enzimas antioxidantes (BANERJEE et
al, 2003).
As EROs são uma séria ameaça ao sistema de defesa antioxidante
celular, causando uma diminuição nas reservas de vitaminas antioxidantes e
glutationa, aumentando a suscetibilidade tecidual ao dano oxidativo (JI, 1999).
19
Conforme Koury e Donangelo (2003), o sistema de defesa antioxidante do
organismo tem como principal função inibir ou reduzir os danos causados às células
pelas EROs.
As células possuem uma determinada reserva antioxidante, para uma
eventual situação de estresse oxidativo, de modo a não ocorrer prejuízos sérios e/ou
duradouros em situação fisiológica. Entretanto, pode-se considerar a margem de
segurança, conferida pelo sistema antioxidativo, como sendo relativamente baixa (JI,
1999). Nas condições de produção excessiva de EROs ou com mecanismos
oxidativos debilitados por inativação ou por deficiência nutricional, extensivos
prejuízos celulares podem ocorrer, levando, inclusive, a quadros patogênicos. O
resultado do prejuízo pode induzir à maior produção de EROs, resultando assim em
uma forma de ciclo vicioso (GARRETT JR; KIRKENDALL, 2003).
Conforme Schneider e Oliveira (2004), o sistema antioxidante é constituído
por diversas enzimas e elementos antioxidativos não enzimáticos, os quais possuem
atividades
e
concentrações
diferentes
e
estão
presentes
nos
diferentes
compartimentos subcelulares.
Schneider e Oliveira (2004) citam como principais enzimas antioxidantes a
SOD na qual catalisa o processo de dismutação onde o superóxido recebe mais um
elétron e dois íons de hidrogênio formando o peróxido de hidrogênio; a catalase
(CAT) que desempenha papel importante na eliminação de peróxido de hidrogênio e
a glutationa peroxidase (GPx) convertendo a glutationa reduzida à glutationa
oxidada, removendo peróxido de hidrogênio e formando água.
O sistema não enzimático inclui compostos sintetizados pelo organismo
humano como bilirrubina, ceruloplasmina, hormônios sexuais, melatonina, coenzima
Q, acido úrico e outros, ingeridos através da dieta regular ou via suplementação
como acido ascórbico (vitamina C),
-tocoferol (vitamina E),
-caroteno (precursor
de vitamina A) e grupos fenóis de plantas (flavonóides) (SCHNEIDER; OLIVEIRA,
2004).
O perfeito equilíbrio entre as enzimas antioxidantes é importante para a
manutenção da integridade celular.
20
Figura 3 – Metabolismo oxidativo normal
Fonte: Smith, Marks e Lieberman, 2005.
2.7.2 Estresse oxidativo
Para Koury e Donangelo (2003), o estresse oxidativo é desencadeado
devido ao desequilíbrio entre a liberação de EROs e a capacidade de ação dos
sistemas de defesa antioxidante.
Para Schneider e Oliveira (2004), o termo é utilizado em circunstâncias
nas quais o “desafio” por EROs resulta em dano tecidual ou na produção de
compostos tóxicos ou danosos ao tecido. Ocorre um desequilíbrio entre os sistemas
prooxidantes e antioxidantes, de maneira que os primeiros sejam predominantes,
ocasionando a oxidação de estruturas celulares importantes como membranas,
proteínas e DNA, causando disfunção celular e, portanto, tecidual.
A geração de EROs durante o metabolismo é um processo normal e
necessário. Isto é compensado por um elaborado sistema antioxidante endógeno.
No entanto, devido ao ambiente, ao estilo de vida e a situações patológicas que
resultam no excesso de EROs acumulados, causando estresse oxidativo. O estresse
21
oxidativo está relacionado com doenças cardiovasculares, câncer e outras doenças
crônicas (WILLCOX; ASH; CATIGNANI, 2004).
Schneider e Oliveira (2004), Powers (2000), McArdle e outros (1998)
dizem que um dos principais mecanismos de lesão é a LPO, ou seja, a oxidação da
camada lipídica da membrana celular e em conseqüência disfunção cerebral, já que
os tecidos do sistema nervoso são especialmente suscetíveis, em virtude de seu alto
conteúdo lipídico.
Vários são os mecanismos que podem levar ao estresse oxidativo:
oxigênio, atividade física, alimentos, tabagismo, álcool, radiação, ativação de
macrófagos, infecção, inflamação, trauma, queimaduras, metais tóxicos, drogas,
isquemia-reperfusão, transplante (GHORAYEB; BARROS, 2004).
Figura 4 – Estresse oxidativo
Fonte: Smith, Marks e Lieberman, 2005.
2.8 ATIVIDADE FÍSICA
2.8.1 Definição
O exercício para Powers (2000), é movimento corporal produzido pela
contração do músculo esquelético e que substancialmente incrementa o gasto
22
energético. Hoffman e Harris (2002) afirmam que essa definição limita o exercício a
comportamentos voluntários e propositais (contração músculo esquelética ao
contrário dos músculos voluntários).
De acordo com Hoffman e Harris (2002, p. 22) “o exercício é um
movimento intencional voluntário realizado para alcançar um objeto identificável”. De
acordo com esta definição, simplesmente mover o corpo não constitui exercício.
Excluindo todos os reflexos involuntários e todos os movimentos fisiológicos como o
peristaltismo, a deglutição ou o movimento dos olhos e também os movimentos
voluntários que não são realizados com objetivo intencional.
Para Robergs e Roberts (2002), o termo exercício pode ser usado para
indicar a atividade que é realizada com o objetivo de melhorar, manter ou expressar
um tipo específico de aptidão física.
2.8.2 Atividade física e estresse oxidativo
A atividade física é conhecida por promover saúde e bem-estar. O
exercício também é responsável por aumentar a produção de EROs pelo acréscimo
do consumo de oxigênio mitocondrial nos tecidos. O desequilíbrio entre a produção
de EROs e as defesas oxidantes dos tecidos pode provocar danos oxidativos a
proteínas, lipídios e DNA (AGUIAR JR., PINHO; 2007).
Existe uma forte evidência de que o exercício árduo, bem como aquele em
que o indivíduo não está habituado, pode acarretar um desequilíbrio entre as
espécies reativas de oxigênio EROs e as defesas antioxidantes de maneira que
favoreça as primeiras. Esse distúrbio pode ser agravado por desordens fisiológicas,
antes e depois dos exercícios, tais como fadiga, dor muscular, ruptura miofibrilar, e
problemas associados à função imune (GARRETT JR; KIRKENDALL, 2003).
A premissa de que o exercício físico estimula a produção de EROs está
baseada no conhecimento de que o consumo de O2 tecidual encontra-se elevado,
proporcionalmente ao trabalho físico realizado (GARRETT JR; KIRKENDALL, 2003).
A magnitude da melhora do sistema antioxidante depende das cargas de
treinamento. Quanto mais alto o VO2máx, mais alta a atividade da enzima
antioxidante GPx nos eritrócitos, protegendo o organismo do dano à membrana
celular (SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004).
23
Atletas em condições de sobrecarga de treinamento apresentavam
maiores índices de LPO, avaliada pelo nível de substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS), CK-MB e mioglobina plasmáticos, marcadores de lesão
muscular, além da queda da relação GSH:GSSG, indicando claramente que esta
sobrecarga compromete os mecanismos de defesa antioxidantes relacionados à
resposta induzida pelo exercício (SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004).
Os tecidos afetados pelos treinamentos intensos estão sob grande
“desafio oxidativo”. O aumento na energia demandada, acompanhado pelo aumento
na taxa metabólica oxidativa, significa um grande fluxo de oxigênio pelas
mitocôndrias, promovendo uma alta exposição tecidual às EROs. O treinamento
pode diminuir os estoques de antioxidantes não-enzimáticos, tais como vitamina E e
GSH, caso a ingestão não esteja em equilíbrio com a demanda (GARRETT JR;
KIRKENDALL, 2003).
Uma série aguda de exercícios pode aumentar a atividade de algumas
enzimas antioxidantes sem nova síntese protéica. Esta atividade de proteção é
limitada a características enzimáticas individuais e o tecido envolvido. Como
estratégia a longo prazo, as células podem aumentar a síntese protéica de enzimas
antioxidantes para controlar o estresse oxidativo (AGUIAR JR., PINHO; 2007).
Foi demonstrado que o exercício intenso não altera as atividades das
enzimas SOD e GPx no hipocampo, estriado e córtex pré-frontal 24 horas após o
exercício (AGUIAR JR., PINHO; 2007).
Quando ácidos graxos polinsaturados nas biomembranas são atacados
por EROs na presença de oxigênio molecular, levando a formação de uma cadeia de
reações de peroxidação. Bioprodutos da peroxidação lípidica são os marcadores
mais estudados da lesão tissular durante o exercício. Assim como as modificações
oxidativas causadas às proteínas (incluindo enzimas) e ácidos nucléicos (AGUIAR
JR., PINHO; 2007).
De acordo com Aguiar Jr. e Pinho (2007), os efeitos agudos do exercício
sobre enzimas antioxidantes do cérebro também não mostraram diferenças na
atividade da SOD na medula espinal e hipotálamo, cerebelo, córtex cerebral e
hipocampo. O acréscimo da atividade de enzimas antioxidantes no cérebro como
resposta ao exercício físico regular está mais provavelmente ligado ao excesso de
formação de radicais livres.
24
As EROs e danos associados são um dos possíveis fatores na regulação
da função cerebral. A atividade da enzima SOD elevou no tronco cerebral e estriado
de ratos após treinamento de corrida em esteira, acompanhada de acréscimo na
concentração de GSH no córtex e tronco cerebral (AGUIAR JR., PINHO; 2007).
2.9 MEMÓRIA
Memória é a retenção da informação aprendida. Aprendemos e
lembramos de muitas coisas e é importante notar que essas várias coisas podem
não ser processadas e armazenadas pela mesma maquinaria neural. Não existe
uma estrutura ou mecanismo cerebral que, sozinhos, sejam encarregados de todo o
aprendizado. Além disto, a forma como determinado tipo de informação é
armazenado pode mudar com o tempo (BEAR; CONNORS; PARADISO, 2002).
Memória difere da aprendizagem, pois aprendizagem é apenas o processo de
aquisição das informações (LENT, 2004).
2.9.1 Tipos de memória
A memória pode ser classificada quanto ao tempo de retenção em:
memória ultra-rápida, cuja retenção não dura mais que alguns segundos; a memória
de curta duração, que dura alguns minutos ou horas e serve para proporcionar a
continuidade do nosso sentido presente e por último a memória de longa duração,
que estabelece engramas duradouros (dias,semanas e até mesmo anos) (LENT,
2004).
A memória pode também ser classificada, quanto a sua natureza: memória
explicita ou declarativa, memória implícita ou não declarativa e memória operacional
(LENT, 2004).
A memória explicita envolve tudo aquilo que podemos evocar por meio de
palavras. Pode ser episódica, quando envolve eventos relacionados ao tempo; ou
semântica, quando envolve conceitos atemporais (LENT, 2004).
As principais estruturas nervosas responsáveis pelas memórias episódicas
e semânticas são duas áreas intercomunicadas do lobo temporal: o hipocampo e o
córtex entorrinal. Ambas trabalham associadas entre si e em comunicação com
25
outras regiões do córtex, como o córtex cingulado e o córtex parietal (IZQUIERDO,
2002).
A memória implícita é aquela que não precisa ser descrita com palavras.
Pode ser de quatro subtipos: a memória de representação perceptual, que
corresponde à imagem de um evento, preliminar à compreensão do que ele significa.
Outro subtipo é a memória de procedimentos, que trata dos hábitos e habilidades e
das regras em geral. Dois subtipos importantes são a memória associativa e a
memória não associativa, ambas relacionadas fortemente a algum tipo de resposta
ou comportamento, por exemplo, quando começamos a salivar bem antes que a
comida chegue à nossa boca (LENT, 2004).
O terceiro tipo é a memória operacional, através do qual armazenamos
temporariamente informações que serão úteis apenas para o raciocínio imediato e a
resolução de problemas, ou para a elaboração de comportamentos, podendo ser
descartadas logo a seguir (LENT, 2004).
2.9.2 Amnésia
O esquecimento é uma propriedade normal da memória. Provavelmente
desempenha papel muito importante como mecanismo de prevenção de sobrecarga
nos sistemas cerebrais dedicados à memorização e tem ainda a virtude de permitir a
filtragem dos aspectos mais relevantes ou importantes de cada evento. Mas há
casos em que o esquecimento é patológico, para mais ou para menos. Chama-se
amnésia quando o indivíduo apresenta esquecimento demais. Denomina-se
hipermnésia quando ocorre o oposto, exacerbada capacidade de retenção que
impede a separação entre aspectos relevantes e irrelevantes dos eventos (KANDEL;
SCHWARTZ; JESSELL, 2003).
Concussão, alcoolismo crônico, encefalite, tumor cerebral e acidente
vascular encefálico são condições que podem causar prejuízos à memória. Após
trauma cerebral, a perda de memória pode manifestar-se de duas formas: amnésia
retrógrada e amnésia anterógrada. A amnésia retrógrada é caracterizada por perda
de memória para eventos anteriores ao trauma. Já a amnésia anterógrada é a
inabilidade de formar novas memórias após um trauma cerebral (BEAR; CONNORS;
PARADISO, 2002).
26
2.9.3 Lobos temporais e seu papel na memória
Consideráveis evidências apontam para os lobos temporais como sendo
particularmente importante para o registro de eventos passados. Os lobos temporais
contêm o neocórtex temporal, que pode ser um sítio de armazenamento da memória
de longa duração. Dentro do lobo temporal também se encontra o hipocampo e
outras estruturas que são críticas para a formação das memórias declarativas
(BEAR; CONNORS; PARADISO, 2002).
Um papel importante dos lobos temporais mediais relaciona-se com o
processamento
ou
consolidação
de
memória
declarativa.
Pesquisas
com
hipocampos de rato sugerem, entretanto, que essa estrutura esteja envolvida em
funções relacionadas à memória para uma diversidade de tarefas (BEAR;
CONNORS; PARADISO, 2002).
2.9.4 Condicionamento clássico e operante
Denominamos condicionamento clássico o fato de o estímulo poder causar
uma resposta. Enquanto denominamos condicionamento operante o fato de que a
resposta se deve a um estímulo antes associado a outro estímulo. A resposta é feita
por associação sendo, portanto, associativa. Este tipo de condicionamento foi feito
por Ivan Pavlov, premio Nobel em Medicina de 1904 (KANDEL; SCHWARTZ;
JESSELL, 2003).
27
3 DELINEAMENTO DA PESQUISA
A pesquisa realizada foi classificada com relação ao nível, como uma
pesquisa explicativa. A pesquisa explicativa tem como preocupação fundamental
identificar fatores que contribuem ou agem como causa para a ocorrência de
determinados fenômenos. É o tipo de pesquisa em que se explica as razões ou os
porquês das coisas (HEERDT; LEONEL, 2005, p. 70).
Com relação ao procedimento utilizado na coleta de dados, foi classificada
como pesquisa experimental. Para Rudio (1999 apud HEERDT; LEONEL, 2005, p.
80):
A pesquisa experimental está interessada em verificar a relação de
casualidade que se estabelece entre as variáveis, isto é, em saber a
variável X (independente) determina a variável Y (independente). Para isto,
cria-se uma situação de controle rigoroso neutralizando todas as
influências alheias que Y pode sofrer.
Na presente pesquisa, buscou-se verificar os efeitos da variável
independente (atividade física) sobre a dependente (estresse oxidativo).
3.1 ANIMAIS
Constituíram a amostra 28 camundongos da raça Mus Muscarinus, do
Biotério da UNISUL, com 6 semanas de idade, todos machos. Separados
aleatoriamente em 4 grupos, de 7 camundongos cada: sham, epilepsia, sham e
exercício e epilepsia e exercício. Os animais foram mantidos com ciclo claro/escuro
de 12/12h a 22 °C, com água e comida ad libitum.
3.2 PROCEDIMENTOS
Este projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da UNISUL,
em 19/04/2007, registro no CEP (código): 07.014.4.08.III.
Os animais foram induzidos à epilepsia através de uma criolesão em seu
lobo temporal, no seu 1° dia de vida. Os filhotes foram anestesiados através de
hipotermia, sendo imersos no gelo até não responderem a estímulos nocivos, tal
como um forte estresse de compressão na cauda. Seus crânios foram expostos e
uma caneta especial (criada pelos acadêmicos) a uma temperatura de -50°C foi
28
colocada no local exposto por 3-7s. A caneta tem uma forma circular com 2-3 mm de
diâmetro. O escalpo foi suturado, os filhotes aquecidos e colocados de volta nas
gaiolas (JACOBS; HWANG; PRINCE, 1999)
O treinamento teve a duração de 8 semanas com acesso livre às rodas de
correr.
Fotografia 1 – Roda de correr utilizada no treino dos camundongos
Fonte: Elaboração do autor, 2007.
Após 48 horas passadas da última sessão de treinamento, os
camundongos foram sacrificados e tiveram seu hipocampo, córtex temporal e sóleo
dissecados para posterior análise.
O nível de estresse oxidativo foi mensurado através da comparação entre
os níveis encontrados, pela dissecação do hipocampo e sóleo, de Carbonil, TBARS,
atividade da cintrato sintase e proteínas entre o grupo controle e os grupos induzidos
à epilepsia.
Campo aberto - Para avaliarmos possíveis alterações motoras induzidas
pelos diferentes tratamentos utilizados, os animais foram testados durante 5 min no
campo aberto. O aparato de madeira e fórmica é formado por um chão de cor preta
(30 x 30 cm), dividido em 9 quadrantes de 10 x 10 cm, com paredes transparentes
de 15 cm de altura. Durante os experimentos, cada camundongo foi colocado no
centro do campo aberto, sendo que um sistema de câmera de vídeo captou as
imagens, registrando o número de quadrantes cruzados e o número de atos de
levantar (PREDIGER; BATISTA; TAKAHASHI, 2005 e PREDIGER; DE-MELLO;
TAKAHASHI, 2006).
29
Discriminação olfatória - Foi realizado seguindo o protocolo previamente
descrito por Prediger, Batista e Takahashi (2005) e Prediger, De-Mello e Takahashi
(2006). O teste consistiu em isolar os animais 72 horas antes do início dos
experimentos em caixas individuais (42 x 34 x 17 cm) para que houvesse uma
padronização da impregnação do odor. A caixa de discriminação olfatória consiste
em dois compartimentos idênticos (30 x 30 x 20 cm) separados por uma abertura
que permite o acesso dos animais aos dois compartimentos. O chão de um dos
compartimentos foi forrado com a serragem retirada da gaiola na qual o
camundongo ficou isolado por 72 horas, enquanto que o outro compartimento foi
forrado com serragem limpa e inodora. O experimento consistiu em colocar o animal
na caixa de discriminação olfatória e registrar, durante um período de 5 minutos, o
tempo de investigação em cada compartimento. A discriminação olfatória foi avaliada
pela preferência do animal ao compartimento impregnado com o seu cheiro
(compartimento familiar) em relação ao compartimento inodoro (não-familiar), visto
que nesta situação tem sido demonstrado que roedores adultos preferem ambientes
impregnados com seu próprio cheiro.
Nível de TBARS - Os níveis de Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) foram mensurados pelo método de Draper e Hadley (1990) e expressos
em equivalentes de malonaldeído (MDA). 1ml de ácido tricloroacético 10% e 1ml de
ácido tiobarbitúrico 0,67% foi acrescido às amostras e posteriormente aquecidos em
banho maria por 15 min. Os níveis de TBARS foram determinados pela leitura da
absorbância a 535nm e os resultados em nmol MDA/mg proteína.
Nível de Carbonil - O conteúdo de carbonilação de proteínas foi
determinado de acordo com o método de Levine et al (1990), pela formação de
derivados da proteína hidrazona utilizando 2,4-dinitrofenilhidrazida (DNPH). Estes
derivados foram extraídos sequencialmente com ácido tricloroacético 10% seguido
de tratamento com etanol/etilacetato (volume 1:1) e re-extração com ácido
tricloroacético 10%. O precipitado resultante foi dissolvido em uréia 6M. A diferença
entre as leituras do espectro a 370nm de 2,4-DNPH (branco) foi utilizada para
calcular o nmol de 2,4-DNPH incorporado por mg de proteína.
Atividade da Citrato Sintase - A atividade da CS do músculo sóleo foi
realizada através do método de Alp et al (1976). O tecido foi homogeneizado em
gelo em 100 mM de Tris-HCl, e adicionado a 100 mM de Tris-HCl, 1.0 mM ditio-bis
(2- ácido nitrobenzóico), e de 3.9 mM acetil coenzima A. Após a adição de 1.0 mM
30
de oxalacetato, foi registrada a absorbância a 412nm por um período de 2 min. A
absorbância média alterada por minuto foi registrada para cada amostra e a
atividade da CS em mmol.min/g calculada utilizando um coeficiente de extinção de
13.600.
Os dados foram descritos em média±erro padrão médio e analisados
estatisticamente pela análise de variância (ANOVA) two-way, seguido pelo teste post
hoc Tukey. O nível de significância estabelecido para o teste estatístico é de p<0,05.
Foi utilizado o SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) versão 12.0 como
pacote estatístico.
No estudo piloto, realizado pelo autor com os camundongos, foram feitos
somente os grupos sham, que tiveram os crânios expostos, mas a caneta não
estava na temperatura de -50 °C para causar a criolesão.
31
4 ANÁLISE DOS DADOS E DISCUSSÃO
4.1 ATIVIDADE DA CITRATO SINTASE
O gráfico 1 apresenta os níveis de atividade da enzima citrato sintase no
músculo sóleo, nos grupos sham, sham exercício, epilepsia e epilepsia exercício. O
grupo sham apresentou 0,42048±0,05236U CS/mg proteína, o grupo sham exercício
0,71±0,06U CS/mg proteína, o grupo epilepsia 0,28±0,04U CS/mg proteína e o
grupo epilepsia mais exercício 0,59±0,07U CS/mg proteína.
Verificou-se que 8 semanas de exercício foram suficientes para treinar os
camundongos (p<0,05).
Gráfico 1 – Atividade da enzima citrato sintase aumentada nos grupos que realizaram exercício.
*p<0,05 do grupo sham. #p<0,05 do grupo epilepsia. ‡p<0,05 do grupo sham exercício.
Fonte: Elaboração do autor, 2007.
Segundo Evangelista, Brum e Krieger (2003), um aumento da atividade
muscular oxidativa concomitante com um aumento da capacidade de trabalho
aeróbico é um dos marcadores da adaptação do músculo ao condicionamento
aeróbico. Evangelista, Brum e Krieger (2003) e Röckl e outros (2007) verificaram que
a atividade da citrato está elevada no músculo sóleo dos camundongos treinados.
4.2 CAMPO ABERTO
O gráfico 2 apresenta o teste de campo aberto, nos grupos sham, sham
exercício, epilepsia e epilepsia exercício. Quanto ao item cruzamentos, o grupo
32
sham apresentou 118±22,6 cruzamentos, o grupo sham exercício 133,6±32,4, o
grupo epilepsia 130±34,4 e o grupo epilepsia mais exercício 119,2±25,9.
Já com relação ao item levantamentos, o grupo sham apresentou 49,6±6,9
levantamentos, o grupo sham exercício 41,8±4,9, o grupo epilepsia 38,7±3,8 e o
grupo epilepsia mais exercício 45,2±5,4. Não existiu diferença estatística entre os
grupos, verificando que a epilepsia não leva a déficits motores (p<0,05).
Gráfico 2 – Teste de campo aberto, não mostrando diferença significativa entre os grupos. *p<0,05 do
grupo sham. #p<0,05 do grupo epilepsia. ‡p<0,05 do grupo sham exercício.
Fonte: Elaboração do autor, 2007.
4.3 DISCRIMINAÇÃO OLFATÓRIA
O gráfico 3 apresenta o teste de discriminação olfatória, nos grupos sham,
sham exercício, epilepsia e epilepsia exercício. O grupo sham ficou 39,4±3,3s no
ambiente novo, o grupo sham exercício 41±10,8s, o grupo epilepsia 60,1±5,9s e o
grupo epilepsia mais exercício 40,3±8,7s.
Existiu diferença estatística no desempenho ao teste de discriminação
olfatória nos grupos sham vs. epilepsia e epilepsia vs. eplipesia mais exercício
(p<0,05). Estes resultados demonstram que a epilepsia causa prejuízos à memória
olfativa dos animais e que 8 semanas de exercício foram suficientes para reverter os
mesmos.
33
Gráfico 3 – Teste de discriminação olfatória mostrando que a epilepsia causa prejuízos significativos a
memória olfativa dos animais e que 8 semanas de exercício foram suficientes para reverter os
mesmos. *p<0,05 do grupo sham. #p<0,05 do grupo epilepsia. ‡p<0,05 do grupo sham exercício.
Fonte: Elaboração do autor, 2007.
Isto é bem postulado na literatura, já que Aguiar Jr. e Pinho (2007)
descreveram que exercícios moderados aumentam a cognição, sendo que
recentemente foi demonstrado que o cérebro é responsivo à atividade física. Isso
quer dizer que a atividade física apresenta potencial na prevenção e tratamento de
danos traumáticos cerebrais assim como em doenças neurodegenerativas. Estudos
apóiam que muitas dessas mudanças ocorrem em áreas específicas de funções
cerebrais importantes como a memória de longo termo e prevenção do declínio
cognitivo durante o envelhecimento. Radák e outros (2001) verificaram que 9
semanas de natação regular aumentaram a capacidade de aprendizagem e
memória dos animais. Praag e outros (1999) observaram que a atividade física
regula a neurogênese hipocampal, plasticidade sináptica e aprendizagem.
Radák e outros (2001) relataram que o exercício físico através de
diferentes meios, incluindo a indução do fator de crescimento de fibroblastos,
atividades das enzimas antioxidantes ou aumento concomitante na secreção de
catecolaminas, podem levar a uma melhora da função cognitiva.
Radák e outros (2006) citaram que processos adaptativos ao exercício
produzem efeitos benéficos na função cerebral, incluindo aprendizagem e memória.
O exercício físico mantém a integridade cerebrovascular, aumenta a capilarização,
as conexões dendríticas e melhora a eficiência no processamento de funções no
sistema nervoso central.
34
De acordo com Navarro e outros (2004) os resultados negativos nos testes
de função cognitiva, associados a indicadores de TBARS e às atividades
mitocondriais no cérebro, indicam uma correlação entre estresse oxidativo, disfunção
mitocondrial e diminuição da cognição. O mesmo autor constatou que o exercício
moderado tem um efeito positivo nestes fatores.
4.4 NÍVEIS DE LIPOPEROXIDAÇÃO E CARBONILAÇÃO
No gráfico 4 observamos os níveis de LPO nos grupos sham, sham
exercício, epilepsia e epilepsia exercício. O grupo sham apresentou 0,3±0,07nmol
MDA/mg proteína, o grupo sham exercício 0,2±0,05nmol MDA/mg proteína, o grupo
epilepsia 0,52±0,14nmol MDA/mg proteína e o grupo epilepsia mais exercício
0,37±0,05nmol MDA/mg proteína.
Existiu diferença estatística nos níveis de LPO nos grupos sham vs.
epilepsia, sham exercício vs. epilepsia exercício e epilepsia vs. eplipesia mais
exercício (p<0,05). Estes resultados demonstram que a epilepsia eleva os níveis de
LPO no cérebro de camundongos e que 8 semanas de exercício causa um
decréscimo significativo nestes níveis, mas sem conseguir voltar a normalidade.
O gráfico 5 mostra os níveis de carbonilação nos grupos sham, sham
exercício,
epilepsia
0,00660±0,00108mMol
0,00449±0,00073mMol
e
epilepsia
exercício.
carbonil/mg
carbonil/mg
proteína,
No
grupo
no
proteína,
grupo
no
sham
sham
grupo
verificou-se
exercício
epilepsia
0,01024±0,00433mMol carbonil/mg proteína e no grupo epilepsia exercício
0,00503±0,00037mMol carbonil/mg proteína.
Houve diferença estatística nos níveis de carbonilação no grupo epilepsia
vs. eplipesia mais exercício (p<0,05). Observou-se que 8 semanas de exercício
diminui os níveis de carbonilação induzidos pela epilepsia.
Exercícios físicos aumentam a geração de EROs, causando adaptações,
podendo diminuir a incidência de EROs associada a doenças. Uma única série de
exercício, dependendo da intensidade e da duração, pode causar aumento da
atividade de enzimas antioxidantes, diminuição dos níveis de tióis e vitaminas
antioxidantes, resultando em dano oxidativo como um sinal de uma adaptação
incompleta. Aumento nos níveis de EROs e dano oxidativo são iniciadores de
respostas adaptativas específicas, tais como a estimulação da ativação de enzimas
35
antioxidantes, tióis, aumentando o reparo dos danos oxidativos (AGUIAR et al,
2007). Exercícios regulares têm a capacidade de desenvolver compensações para o
estresse oxidativo, resultando em supercompensação contra o aumento dos níveis
de produção de EROs e dano oxidativo. Exercícios regulares causam adaptações
aos sistemas antioxidantes e de reparo, que pode resultar em decréscimo dos níveis
de danos oxidativos e aumento da resistência ao estresse oxidativo (BANERJEE et
al, 2003).
O estresse oxidativo certamente possui um papel importante na adaptação
fisiológica à atividade física. Exercícios de intensidade moderada (menos de 50-60%
da capacidade aeróbica ou da máxima tensão muscular) causam pequeno estresse
sem causar dano oxidativo. Treinos regulares e uma dieta balanceada são
mecanismos de defesa contra o estresse oxidativo excessivo (APOR; RADI, 2006).
Dishman e outros (2006) citam que a atividade física voluntária crônica
também aumenta as respostas neurais ao estresse nos circuitos cerebrais
responsáveis
pela
regulação
da
atividade
simpática
periférica,
podendo
possivelmente contribuir para a redução de desordens clínicas como hipertensão,
ataque cardíaco, estresse oxidativo e diminuição da imunidade.
Gráfico 4 – Níveis de LPO elevados no grupo epilepsia e diminuídos após 8 semanas de exercício,
mas sem conseguir voltar a normalidade. *p<0,05 do grupo sham. #p<0,05 do grupo epilepsia.
‡p<0,05 do grupo sham exercício.
Fonte: Elaboração do autor, 2007.
Existem várias evidências demonstrando dano oxidativo induzido pela
epilepsia. Gluck (2000), em seu estudo, verificou que após 4 horas da indução à
epilepsia, o nível de carbonilação estava elevado em 103, 55, 52 e 32% no córtex,
36
hipocampo, gânglia basal e cerebelo, respectivamente. O nível de LPO estava
aumentado em 30-45% em todas as áreas. Após 24h, níveis elevados de oxidação
de proteínas e lipídios persistiam no hipocampo e no cerebelo.
Rajasekaran (2005) e Frantseva e outros (2000) relatam que convulsões
resultam em um aumento significante no hipocampo nos níveis de peroxidação
lipídica e na atividade da SOD, junto com um significante decréscimo da atividade da
GPx.
Freitas e outros (2005) relatam que depois da indução do estado
epiléptico, verificou-se aumento significante de 77% na peroxidação de lipídios, mas
um decréscimo de 55% no nível de GSH. A atividade da CAT aumentou 88%, mas a
atividade da SOD permaneceu inalterada. Esses resultados mostram evidências de
dano neurológico no hipocampo, devido ao decréscimo da concentração de GSH e
aumento da peroxidação de lipídios e nitratos. As atividades da GSH e da CAT estão
envolvidas com mecanismos responsáveis pela eliminação de espécies reativas de
oxigênio durante o estabelecimento do estado epilético no hipocampo. A GSH e a
CAT trabalham como mecanismos antioxidantes no hipocampo durante o estado
epilético.
Gráfico 5 – Níveis de carbonilação diminuídos no grupo epilepsia exercício quando comparados ao
grupo epilepsia. *p<0,05 do grupo sham. #p<0,05 do grupo epilepsia. ‡p<0,05 do grupo sham
exercício.
Fonte: Elaboração do autor, 2007.
Os resultados encontrados corroboram aos achados da literatura, pois
Radák e outros (2001) verificaram que 9 semanas de natação regular diminuíram a
acumulação de derivados de carbonil reativos no cérebro de ratos e esse
decréscimo é acompanhado de melhora da função neuronal. Radák e outros (2006)
37
constataram que ocorre um decréscimo nas EROs no cérebro de ratos após
treinamento e esse efeito benéfico não é eliminado com o destreinamento.
A atividade muscular é dependente da estimulação nervosa. Ativações
repetidas das células nervosas podem levar a uma melhora da função neurológica.
Inatividade forçada e/ou voluntária do sistema muscular ou nervoso pode causar
sérias conseqüências. Oito horas de imobilização resultam em um aumento dos
níveis de derivados de carbonil reativos, TBARS no cérebro de ratos (RADÁK et al,
2001).
Navarro e outros (2004) verificaram que o exercício moderado em
camundongos, tanto machos quanto fêmeas, preveniu em 43±14%, o aumento dos
níveis de derivados de carbonil reativos e de TBARS (p<0,05).
O exercício moderado decresce significativamente o estresse oxidativo,
prevenindo o aumento de derivados de carbonil reativos e de TBARS nas
membranas submitocondriais e a diminuição da atividade das enzimas antioxidantes
(Mn- e Cu, Zn-SOD e CAT) no cérebro de camundongos (NAVARRO et al, 2004).
38
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Comprovou-se que a atividade física diminuiu o dano oxidativo no cérebro
gerado pela epilepsia e reverteu os prejuízos causados pela epilepsia à memória
olfativa dos camundongos. Assim, demonstrou-se que o exercício pode ser uma das
estratégias terapêuticas que atuam no processo neurodegenerativo gerado pela
epilepsia.
39
REFERÊNCIAS
AGUIAR JR., A. S.; PINHO, R. A. Efeitos do exercício físico sobre o estado redox
cerebral. Revista Brasileira de Medicina do Esporte, 2007 “in press”.
AGUIAR JR., A. S. et al. Intense Exercise Induces Mitochondrial Dysfunction in Mice
Brain. Neurochemical research, v. 6, jul. 2007.
ALP, P. R.; NEWSHOLME, E. A.; ZAMMIT, V. A. Activities of Citrate Synthase and
NAD+-Linked and NADP+-Linked Isocitrate Dehydrogenase in Muscle from
Vertebrates and Invertebrates. The Biochemical journal, n. 154, p. 689-700, 1976.
APOR, P.; RADI, A. Physical exercise, oxidative stress and damage. Orvosi Hetilap,
v. 147, n. 22, p. 1025-1031, jun. 2006.
ARIDA, R. M. et al. Effect of physical exercise on seizure occurrence in a model of
temporal lobe epilepsy in rats. Epilepsy Research, v. 37, p. 45-52, 1999.
BANERJEE, A. K. et al. Oxidant, antioxidant and physical exercise. Molecular and
Cellular Biochemistry, v. 253, n. 1-2, p. 307-312, nov. 2003.
BARBOSA-COUTINHO, L. M. et al. Neuropatologia das epilepsias de difícil controle:
estudo de 300 casos consecutivos. Arquivos de Neuro-Psiquiatria, São Paulo, v.
57, n. 2-B, p. 405-414, 1999.
BEAR, M. F.; CONNORS, B W.; PARADISO, M A.. Neurociências: desvendando o
sistema nervoso. 2.ed. Porto Alegre: Artmed, 2002.
BORER, K. T. Physical activity in the prevention and amelioration of osteoporosis in
women: interaction of mechanical, hormonal and dietary factors. Sports medicine,
Auckland, v. 35, n. 9, p. 779-830, 2005.
BORGES, M. A. et al. Prevalência da epilepsia entre índios Bakairi do estado do
Mato Grosso, Brasil. Arquivos de Neuro-Psiquiatria, São Paulo, v. 60, n. 1, p. 8085, 2001.
COSTELLO, D. J.; DELANTY, N. Oxidative injury in epilepsy: potential for antioxidant
therapy?. Expert review of neurotherapeutics, v. 4, n. 3, p. 541-553, mai. 2004.
DE BACKER, I. C. et al. High-intensity strength training improves quality of life in
cancer survivors. Acta Onconlogica, Stockholm, v. 30, p. 1-9, mai. 2007.
DISHMAN, R. K. Neurobiology of exercise. Obesity, v. 14, n. 3, p. 345-356, mar.
2006.
DRAPER, H. H.; HADLEY, M. Malondialdehyde determination as index of lipid
peroxidation. Methods in enzymology, n. 186, p. 421-431, 1990.
40
EVANGELISTA, F.S.; BRUM, P.C.; KRIEGER, J.E.. Duration-controlled swimming
exercise training induces cardiac hypertrophy in mice. Brazilian journal of medical
and biological research, Ribeirão Preto, v. 36, n. 12, 2003.
FRANTSEVA, M. V. et al. Oxidative stress is involved in seizure-induced
neurodegeneration in the kindling model of epilepsy. Neuroscience, v. 97, n. 3, p.
431-435, 2000.
FREITAS, R. M. et al. Oxidative stress in the hippocampus after pilocarpine-induced
status epilepticus in Wistar rats. The FEBS journal, v. 272, n. 6, p. 1307-1312, mar.
2005.
GARRETT JR, W. E.; KIRKENDALL, D. T. A ciência do exercício e dos esportes.
São Paulo: Artmed, 2003.
GHORAYEB, N.; BARROS, T. L. de. O exercício: preparação fisiológica, avaliação
médica, aspectos especiais e preventivos. São Paulo: Atheneu, 2004.
GLUCK, M. R. CNS oxidative stress associated with the kainic acid rodent model of
experimental epilepsy. Epilepsy Research, v. 39, p. 63-71, 2000.
GUERREIRO, Carlos A. M.. História do surgimento e desenvolvimento das drogas
antiepilépticas. Journal of Epilepsy and Clinical Neurophysiology, Porto Alegre,
v. 12, n. 1, 2006.
HEERDT, M. L; LEONEL, V. Metodologia da pesquisa: disciplina na modalidade a
distância. 2. ed. Palhoça: UnisulVirtual, 2005.
HOFFMAN, S. J.; HARRIS, J. C. Cinesiologia: o estudo da atividade física. Porto
Alegre: Artmed, 2002.
HU, G. et al. Epidemiological studies of exercise in diabetes prevention. Applied
physiology, nutrition, and metabolism, v. 3, n. 32, p. 583-593, jun. 2007.
IZQUIERDO, I. Memória. Porto Alegre: Artmed, 2002.
JACOBS, K. M.; HWANG, B. J.; PRINCE, D. A.. Focal epileptogenesis in a rat model
of polymicrogyria. Journal of neurophysiology, United States, v. 81, n. 1, p. 159173, jan. 1999.
JI, L. L. Antioxidants and oxidative stress in exercise. Proceedings of the Society
for Experimental Biology and Medicine, New York, v. 222, n. 3, p. 283-292, dez.
1999.
KANDEL, E. R.; SCHWARTZ, J. H.; JESSELL, T. M.. Princípios da neurociência.
Barueri: Manole, 2003.
KOURY, J. C.; DONANGELO, C. M. Zinco, estresse oxidativo e atividade física.
Revista de Nutrição, Campinas, v. 16, n. 4, p. 433-441, out./dez. 2003.
41
LEEUWENBURGH, C.; HEINECKE, J. W. Oxidative stress and antioxidants in
exercise. Current Medical Chemistry, v. 8, p. 829-838, 2001.
LENT, R. Cem bilhões de neurônios: conceitos fundamentais de neurociência. Ed.
rev. e ampl. São Paulo: Atheneu, 2004.
LEVINE, R. L. et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified
proteins. Methods in enzymology, n. 186, p. 464-478, 1990.
MARKAND, O. N. Pearls, perils, and pitfalls in the use of the electroencephalogram.
Seminars in Neurology, v. 32, n. 1, p. 7-46, 2003.
MCARDLE, W. D.; KATCH, F. I.; KATCH, V. L Fisiologia do exercício: energia,
nutrição e desempenho humano. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998.
MORY, S. B. et al. Epilepsias generalizadas idiopáticas diagnosticadas
incorretamente como epilepsias parciais. Arquivos de Neuro-Psiquiatria, São
Paulo, v. 60, n. 3-B, p. 788-796, 2002.
NAVARRO, A. et al. Beneficial effects of moderate exercise on mice aging: survival,
behavior, oxidative stress, and mitochondrial electron transfer. American journal of
physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology, v. 286, n. 3, p.
505-511, mar. 2004.
PATEL, M. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress: cause and consequence
of epileptic seizures. Free Radical Biology & Medicine, v. 1, p. 1951-1962, 2004.
PATSOUKIS, N. et al. Thiol redos state (TRS) and oxidative stress in the mouse
hippocampus after pentilenetetrazol-induced epileptic seizure. Neuroscience
Letters, v. 357, p. 83-86, 2004.
PLAISANCE, E. P. et al. Cardiovascular fitness and vascular inflammatory markers
after acute aerobic exercise. International journal of sport nutrition and exercise
metabolism, v. 2, n.17, p. 152-162, abr. 2007.
POWERS, S. K.; HOWLEY, E. T. Fisiologia do exercício: teoria e aplicação ao
condicionamento e ao desempenho. São Paulo: Manole, 2000.
PRAAG, H. V. et al. Running enhances neurogenesis, learning, and long-term
potentiation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, v. 96, n. 23, p. 13427-13431, nov. 1999.
PREDIGER, R. D.; BATISTA, L. C.; TAKAHASHI, R. N.. Caffeine reverses agerelated deficits in olfactory discrimination and social recognition memory in rats.
Involvement of adenosine A1 and A2A receptors. Neurobiology of aging, United
States, v. 26, n. 6, p. 957-964, jun. 2005.
PREDIGER, R. D.; DE-MELLO, N.; TAKAHASHI, R. N.. Pilocarpine improves
olfactory discrimination and social recognition memory deficits in 24 month-old rats.
42
European journal of pharmacology, Netherlands, v. 531, n. 1-3, p. 176-182, fev.
2006.
RADÁK, Z. et al. Regular exercise improves cognitive function and decreases
oxidative damage in rat brain. Neurochemistry International, v. 38, p. 17-23, 2001.
________. The effects of training and detraining on memory, neurotrophins and
oxidative stress markers in rat brain. Neurochemistry International, 2006.
RAJASEKARAN, K. Seizure-induced oxidative stress in rat brain regions: blockade
by nNOS inhibition. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, v. 80, p. 263-278,
2005.
RIGATTI, M.; TREVISOL-BITTENCOURT, P. C. Causas de epilepsia tardia em uma
clínica de epilepsia do estado de Santa Catarina. Arquivos de Neuro-Psiquiatria,
São Paulo, v. 57, n. 3-B, p. 787-792, 1999.
ROBERGS, R. A.; ROBERTS, S. O. Princípios fundamentais de fisiologia do
exercício: para aptidão, desempenho e saúde. São Paulo: Phorte, 2002.
RÖCKL, K. S. et al. Skeletal muscle adaptation to exercise training: AMP-activated
protein kinase mediates muscle fiber type shift. Diabetes, v. 56, n. 8, p. 2062-2069,
ago. 2007.
SCHNEIDER, C. D.; OLIVEIRA, A. R. Radicais livres de oxigênio e exercício:
mecanismos de formação e adaptação ao treinamento físico. Revista Brasileira de
Medicina do Esporte, Niterói, v. 10, n. 4, jul./ago. 2004.
SMITH, C.M.; MARKS, A.; LIEBERMAN, M.A. Marks' Basic Medical Biochemistry:
A Clinical Approach. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
WILLCOX, J. K.; ASH, S. L.; CATIGNANI, G. L. Antioxidants and prevention of
chronic disease. Critical reviews in food science and nutrition, v. 44, n. 4, p. 275295, 2004.