PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇAO
EM GESTÃO AMBIENTAL-UFES
Avaliação de Bioindicadores
de Qualidade de águas
Prof. Servio Tulio Cassini
Labsan - PPGEA-UFES Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambienta/UFES
Microbiologia de Águas
 Tipos e Usos das Águas
 Legislação
 Metodologias
Tubos Multiplos (NMP)
Membrana Filtrante (MF)
Substrato Cromogênico (SC)
 Exemplo de Biomonitoramento de
ambiente costeiro (Vitoria, E.S.)
Principais Tipos e Usos
das Águas
Abastecimento Doméstico
Irrigação
Recreacional
“Produto Comercial”
Lançamentos
“Reuso”
DOENÇAS DE VEICULAÇÃO
HÍDRICA
Patógeno
Aeromonas spp
Pseudomonas
Infecção
Água
Infecções de feridas e
doce/marinha
gastroenterites
Campylobacter spp
Enteritis
doce/marinha
Candida albicans
Dermatites
doce/marinha
Clostridium spp
Botulismo, tétano, gangrena
doce/marinha
gasosa, gastroenterites
Cryptosporidium spp
Gastroenterites
doce/marinha
Escherichia coli OSH11
Gastroenterites
doce/marinha
Giardia spp
Gastroenterites
doce/marinha
Pseudomonas spp
Dermatite folicular, otite
doce/marinha
externa
Salmonella spp
Febre entérica, gastroenterite
doce/marinha
Shigella spp
Disenteria bacilar
doce/marinha
Staphylococcus spp.
Infeção de tecidos,
doce/marinha
bacteremia
Vibrio spp
Cólera, infecções de feridas estuarina/marinha
Fonte: Efstratiou (2001)
Yersinia spp
Gastroenterites
doce/marinha
OS BIOINDICADORES
Indicam a POSSIBILIDADE de ocorrência de
patógenos na amostra
Ocorrencia simultanea com patógenos com a
presença de fezes  esgotos domesticos
Muito caro e trabalhoso ( talvez impossível)
avaliar diretamente TODOS os patógenos nas
amostras de águas.
Indicador Biológico Ideal
Presente em todos os tipos de água
Ocorrência e desaparecimento concomitante
com patogênicos
Densidade populacional diretamente relacionada
com o grau de contaminação
Maior sobrevida que a dos patogênicos
Ausência em água potável
Fácil detecção e recuperação laboratorial
Não prejudicial à pessoas e animais
Manipulação segura
Bioindicadores
Utilizados
•
•
•
•
•
•
Coliformes totais
Coliformes Termotolerantes (fecais)
Coliforme específico: Escherichia coli
Estreptococcus fecais (Enterococcus)
Pseudomonas aeruginosa
ovos de helmintos
“Coliformes”
• Bacilos Gram-negativos não esporulados
• Aeróbios ou Anaeróbios facultativos
• Fermentam a lactose com produção de gás (48
h a 35oC ou 44,5 oC)
• Desenvolvem colônias vermelhas com brilho
verde metálico (24 h a 35oC) em meio Endo
contendo Lactose
• Apresentam atividade de B-galactosidase
(enzima que desdobra a lactose ou substratos
análogos tais como o ONPG desenvolvendo cor
amarelada no meio)
Grupo Coliforme
• Indicador referenciado na legislação
• Além da E. coli inclui os gêneros:
– Klebsiella
– Enterobacter
– Citrobacter
Coliformes
“Ambientais”
Coliformes
Termotolerantes
• XI - coliformes termotolerantes: bactérias gramnegativas, em forma de bacilos, oxidase-negativas,
caracterizadas pela atividade da enzima -galactosidase.
• Podem crescer em meios contendo agentes tensoativos e fermentar a lactose nas temperaturas de 44º 45ºC, com produção de ácido, gás e aldeído.
• Além de estarem presentes em fezes humanas e de
animais homeotérmicos, ocorrem em solos, plantas ou
outras matrizes ambientais que não tenham sido
contaminados por material fecal;
• ANTIGAMENTE E ERROONEAMENTE
DENOMINADAS COLIFORMES FECAIS
O GRUPO COLIFORME
Bactérias Entéricas: (Gram + ou -) Ex:
Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis, e
Enterococcus faecalis
Enterobacteriaceae : (Gram -). Gêneros:
E.coli, Shigella, Salmonella, Enterobacter,
Klebsiella, Serratia, Proteus
Grupo Coliforme: coliformes totais
e fecais (termotolerantes)
Termotolerantes: E. coli, Klebsiella,
Enterobacter e Citrobacter.
E. coli
E.coli
Resumo: Enterobactérias e
Coliformes
Enterobactérias
Coliformes Totais ou
“Ambientais”
Coliformes fecais
Escherichia coli
Enterococcus
Bioindicador referenciado na legislação
CONAMA 274/2000
Características:
• Cocos Gram (+) grupo Estreptococos fecais
•Intestino de Animais homeotermicos --->
poluição fecal
•> Tolerancia a ambientes marinhos
Legislação Qual. Águas
Nova
Legislação
• CONAMA 20/86  357 17/03/2005
Dispõe sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais
para o seu enquadramento, bem como estabelece as condições e padrões
de lançamento de efluentes, e dá outras providências.
• 274/2000
Dispõe sobre a qualidade das águas, em relação aos níveis estabelecidos para a
balneabilidade, de forma a assegurar as condições necessárias à recreação de
contato primário;
• MS 36/90 -------> 1469/2000
Especifica os requisitos de amostragem e analises de aguas de
abastecimento público
OMS 1993  Recomendações
PADRÕES DE BALNEABILIDADE
RESOLUÇÃO CONAMA 274/2000
Parâmetro
CT
1
Categorias (NMP/100ml)
Excelente Muito Boa Satisfatória Imprópria
3
3
3
3*
1,25.10
2,5 .10
5,0.10
> 5,0.10
CF
2,5.102
5,0.102
1,0.103
> 2,5.103*
E. coli
2,0.102
4,0.102
8,0.102
> 2,0.103*
Enterococos
25
50
1,0.102
> 4,0.102*
Legenda: as águas na categorias excelente, muito boa e satisfatória são assim consideradas
em 80% ou mais de um conjunto de amostras obtida em cinco semanas, no mesmo local.
* valor obtido na última amostragem
1 Padrão da Legislação CONAMA 20/86.
LEGISLAÇÃO DE BALNEABILIDADE NO
BRASIL E NO MUNDO
País
USA EPA (mar)
USA EPA (água doce)
Canadá (água doce)
Canadá (mar)
Venezuela
(mandatório)
França
Brasil (mar)
Brasil (água doce)
C. Fecais
E. coli
1000
5000
200
2500
2500
126
200
200
400
500
2000
2000
Fonte: Adaptado de Efstratiou apud WHO/ US EPA (1999).
Legenda: número de microrganismos/100ml.
Enterococos
35
33
35
400
-
Cuidados na coleta
• Colher a amostra em recipiente
esterilizado
• Até 4/5 da capacidade do frasco
• Água com cloro: 0,1 ml de tiossulfato a
10%
• Água bruta que contenha metais
pesados: 0,3 ml EDTA a 15%
METODOLOGIAS MAIS UTILIZADAS PARA
REALIZAÇÃO DOS TESTES MICROBIOLÓGICOS
 Tubos Múltiplos
 Membrana Filtrante
 Substrato Cromogênico
Tubos Múltiplos (NMP)
(Procedimento p/ 5 ou 10 Tubos)
Inocular tubos com Caldo Lauril Triptose
24±2 hrs @35 ± 0.5º C
Presuntivo
Gás/ácido=Positivo
Sem gás / ácido=Negativo
Transfere p/ Caldo Verde Brilhante
Incubar 48 ±hrs/35 º C
Confirmativo
Gás=Positivo
Incubar mais 24 hr (48±3 hr total)
Gás/
ácido
Sem gás=Negativo
Continua com ensaio completo
Sem gás=Negativo
Tubos Múltiplos - NMP
Fermentação
Caldo Lauril Triptose
Diagnóstico:
Formação de
Gás
Coliforme
positivo para
2 tubos
NMP: teste confirmativo
Confirmação: Fermentação com
Caldo Verde Brilhante Lactose
-
+
+
Gás
Metodologia da Membrana
Filtrante (MF)
Suportes de filtração de polissulfona, vidro e aço de 47 mm
manifold de PVC e bomba vácuo
Como funciona a
membrana filtrante
Caldo m- Endo / Coliformes Totais
Típicas (Brilho metálico)
Atípicas
Meio m-FC para detecção de
Coliformes fecais
Metodologia com Substrato
Cromogênico / Fluorogênico
• Baseia-se na utilização de substratos
análogos à lactose (glicopiranosídeos)
processados somente por Escherichia coli.
• Exemplos: ONPG: Orto Nitrofenil
galactopiranosídeo e MUG: MetilUmbeliferone Galactopiranosídeo
• Ferramenta poderosa para indentificação de
Escherichia coli (teste confirmativo)
Detecção de Coliformes em Amostras De Águas
Detecção de E. coli
em Agar Nutriente com MUG
Teste P/A
Adição do meio com
substrato à amostra
Incubação por 24 h. Resultados
Incolor: Negativo;
Amarelo Coliforme total +;
Azul Coliforme E. coli +
Teste Quantitativo
1
5
Mesmas placas
amarelas submetidas
a luz ultra-violeta
(UV)
4
Resultado Azul 
Ecoli
2
Se (-) e amarelo 
C. Total
Negativo amarelo e
positivo azul 
anomalo
(impossível)
3
Tabelas de NMP
6
Resultados em
numeros/100 ml
Resultados de
Biomonitoramento
da Praia de Camburi
Vitoria - ES
Projeto Labsan-FACITEC 2000-2001
Bioindicadcadores
Utilizados
Coliformes Totais
Coliformes Fecais
E. Coli
Enterococus
Candida (Levedura) --> areia
MATERIAL & MÉTODOS:
ÁREA DE
ESTUDO: PRAIA
DE CAMBURI/
VITÓRIA/ES.
1, 1A e 1B
2, 2A e 2B
9, 9A
Fonte: www.pmv.es.gov
METODOLOGIAS
Análises bacteriológicas segundo APHA (1995):
 CF meio A1,
 CT e E.coli Colilert®,
 Enterococos Enterolert®,
 Candida meio BIGGY.
Análise de Candida com MF
Cartelas do teste Colilert
Médias Geométricas dos Bioindicadores
Coliformes Totais
Coliformes Fecais
Outono
Inverno
Primavera
1,E+06
1,E+05
1,E+04
NMP CF /100 ml ou
100g de areia seca
NMP CT/100 ml ou
100g de areia seca
Verão
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
1
1A
1B
2
2A
Pontos de Coleta
2B
9
Verão
1,E+06
1,E+05
1,E+04
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
1
9A
NMP E. coli /100ml ou
100g de areia seca
Outono
Inverno
Primavera
1,E+06
1,E+05
1,E+04
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
1
1A
Inverno
1A 1B 2 2A
Pontos de Coleta
Primavera
2B
9
9A
Enterococos
1B
2
2A
Pontos de Coleta
2B
9
9A
NMP Enterococos /100ml
ou100g de areia seca
E.coli
Verão
Outono
Verão
Outono
Inverno
Primavera
1,E+06
1,E+05
1,E+04
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
1
1A
1B 2 2A 2B
Pontos de Coleta
9
9A
Enterococos/Verão
Sem. 2
Sem. 3
Sem. 4
Sem. 5
Média
1,E+06
1,E+05
1,E+04
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
1
1A
1B 2 2A 2B
Pontos de Coleta
9
9A
Sem. 1
NMP
Enterococos/100ml ou
100g de areia seca
NMP
Enterococos/100ml ou
100g de areia seca
Sem. 1
Enterococos/Outono
Sem. 2
Sem. 3
Sem. 4
Sem. 5
Média
1,E+06
1,E+05
1,E+04
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
1
1A
1B 2 2A 2B
Pontos de Coleta
Sem. 5
Média
1
1A
1B 2 2A 2B
Pontos de Coleta
9
9A
Enterococos/Primavera
9
9A
Sem. 1
NMP
Enterococos/100ml ou
100g de areia seca
NMP
Enterococos/100ml ou
100g de areia seca
Sem. 2
Sem. 4
1,E+06
1,E+05
1,E+04
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
Enterococos/Inverno
Sem. 1
Sem. 3
Sem. 2
Sem. 3
Sem. 4
Sem. 5
Média
1,E+06
1,E+05
1,E+04
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
1
1A
1B 2 2A 2B
Pontos de Coleta
9
9A
COMPARAÇÃO ENTRE INDICADORES
Coliformes Totais
V
O
I
P
I
I
I
S
P
P
P
P
P
P
P
P
Coliformes Fecais
V
O
I
P
I
I
S
S
P
P
P
P
P
P
P
P
2
I
I
I
MB
I
S
S
S
I
I
I
E
I
I
I
I
2A
P
P
P
P
P
P
P
P
SP
SP
SP
SP
SP
SP
SP
SP
2B
P
P
P
P
P
P
P
P
SP
SP
SP
SP
SP
SP
SP
SP
9
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
9A
P
P
P
P
P
P
P
P
SP
SP
SP
SP
SP
SP
SP
SP
Pontos
1
1A
1B
V
I
SP
SP
E.coli
O
I
I
S
SP SP
SP SP
P
E
SP
SP
Enterococos
V
O
I
P
I
I
I
I
SP SP SP SP
SP SP SP SP
Amostragens realizadas na praia de Camburi durante as estações do ano em cinco semanas
consecutivas, classificação quanto as categorias de própria (na água: Excelente, Muito Boa
e Satisfatória) e impropria para água e areia de acordo com a Resolução CONAMA e
Limite Proposto em Portugal respectivamente.
Legenda: V(verão), O (outono), I (inverno), P (primavera); I (impróprio), P (próprio), E
(excelente), S (satisfatório), MB (muito boa)
Ponto
1A
1B
2A
2B
9A
O
1
1
P
1
5
Candida
I
1
P
P
P
5
P
3
2
P
1
4
Amostragens na praia de Camburi durante as estações do ano, em cinco semanas de
monitoramento para a levedura do gênero Candida de acordo com o Limite
Proposto em Portugal.
Legenda: O (outono), I (inverno), P (primavera), P (próprio). Os números
representam a frequencia em que o ponto amostrado ficou impróprio em cada
estação do ano.
Agradecimentos:
• UFES (CT-DHS)
• Laboratório de Saneamento CTDHS
• Microbiologistas “tipo coliformes”
• e... Sua paciência
• M. Obrigado