DIVERSIDADE GENÉTICA E FILOGENIA DE ESPÉCIES
SULAMERICANAS DE HYPOCHAERIS (ASTERACEAE) USANDO
MARCADORES AFLP.
Lucas Milanez Benício (PIBIC/CNPq-UEL), Maikel Reck, Eduardo Augusto
Ruas, Luana Alves Rodrigues, Paulo Maurício Ruas, Claudete de Fátima
Ruas (Orientadora), e-mail: [email protected]
Universidade Estadual de Londrina / Centro de Ciências Biológicas /
Departamento de Biologia Geral – Londrina - PR
Palavras chave: AFLP, Asteraceae, Hypochaeris, filogenia.
Resumo
O gênero Hypochaeris é considerado um modelo para estudos evolutivos e
de especiação. Os marcadores AFLP são ferramentas importantes na
obtenção de informações sobre diversidade genética e estrutura de
populações, dispersão e metapopulações. Como uma contribuição ao
entendimento dos processos que levaram a diversificação do gênero
Hypochaeris na América do Sul, nossa proposta contempla a aplicação de
marcadores AFLP, em estudos de diversidade genética de espécies de
Hypochaeris, com ênfase na espécie endêmica do sul do Brasil H.
catharinensis.
Introdução
O gênero Hypochaeris (Asteraceae, Lactuceae) constitui-se em um
excelente modelo para estudos da flora da América do Sul, especialmente
por tratar-se de um gênero bem representado nas regiões temperadas do
continente. O gênero apresenta cerca de 15 espécies distribuídas na região
Mediterrânea, Ilhas Canárias, Europa e Ásia, e cerca de 45 espécies na
América do Sul, que é considerado o centro de dispersão do gênero
(Tremetsberger et al. 2005).
No Brasil o maior número de espécies de Hypochaeris é
principalmente encontrado na região sul, com alguns dados de ocorrência na
região sudeste. Dentre as espécies concentradas no sul do Brasil encontrase Hypochaeris catharinensis Cabrera que é endêmica daquela região.
O desenvolvimento de métodos moleculares de análise permite
determinar com maior precisão o nível de relação entre espécies,
fornecendo informações mais precisas para o entendimento dos processos
evolutivos. As diferentes técnicas que tem como base o DNA vêm
revolucionando a capacidade de avaliar as relações filogenéticas
interespecíficas e a estrutura genética de populações de plantas (Page e
Holmes, 1998).
Neste trabalho, os estudos com espécies do gênero Hypochaeris
contemplam o uso de marcadores AFLP visando os seguintes objetivos: a)
determinar o nível de diversidade genética de um grupo de espécies de
Hypochaeris e b) determinar a posição filogenética de H. catharinensis,
Anais do XVIII EAIC – 30 de setembro a 2 de outubro de 2009
dentro do grupo sulamericano, visto que nenhuma informação existe para
esta espécie.
Materiais e Métodos
Foram utilizadas nove espécies sulamericanas de Hypochaeris juntamente
com H. angustifolia, espécie marroquina utilizada como outgroup; foi feita
amostragem de 55 indivíduos com o mínimo de três e o máximo de cinco
indivíduos por espécie, exceto em H. catharinensis onde foram utilizados 17
indivíduos de diferentes populações para facilitar a verificação de sua
posição filogenética.
O DNA vegetal foi extraído segundo o protocolo CTAB (DOYLE;
DOYLE, 1987), obtendo uma concentração final para restrição entre 600 e
800ng/l. As reações de AFLP foram realizadas seguindo protocolo de Vos
et al. 1995, com duas enzimas de restrição EcoRI / MseI e primers pré
seletivos baseados na sequência dos adaptadores EcoRI e MseI com a
adição de um único nucleotídeo (EcoRI-A e MseI-C). Nove combinações de
primers seletivos foram utilizadas na reação seletiva de PCR.
A matriz de presença/ausência originada das combinações de primers
foi importada para o programa dBoot ver. 1.1 (Coelho, 2001) a fim de
verificar o coeficiente de variação (CV%), o programa Bood ver. 3.0 (Coelho,
2001) foi utilizado para checar os valores de bootstrap no dendrograma que
foi construído usando o método UPGMA. A similaridade genética foi
estimada usando o coeficiente Dice do NTSYS ver. 2.1 (Rohlf, 2000).
Resultados e Discussão
Foram obtidos 346 fragmentos entre 50 e 100 pb com as nove combinações
de primers, sendo 335 fragmentos (96,8%) polimórficos. As análises
apresentaram um valor de Coeficiente de Variação de 4.76%.
Cinco das espécies estudadas são monofiléticas e receberam mais de
90% de suporte de bootstrap (fig. 1). As espécies H. pampasica e H.
megapotamica ramificaram juntas (38% BS), assim como em Ruas et al.
2005 e Tremetsberger et al. 2006, destas ocorreu uma ramificação formando
uma associação com o clado de H. petiolaris (13% BS); este agrupamento,
por sua vez, se associou com H. pinnatifida (14% BS). As duas últimas
associações apresentam baixo suporte e discordam das associações
apresentadas em Tremetsberger et al. 2006, onde quem se ramificou
diretamente de H. pampasica e H. megapotamica foi a espécie H. pinnatifida
com maior suporte (83% BS). H. variegata apresenta-se como espécie irmã
deste clado anterior (16% BS).
Hypochaeris argentina formou um grupo não monofilético (29,5% BS)
e não se associou com as demais espécies, possivelmente por ter sido esta
a única espécie incluída neste estudo, pertencente ao grupo Microcephala
(Tremetsberger et al. 2006). Isso ocorre também com H. apargioides que foi
a única representante do grupo Apargioides (Tremetsberger et al. 2006)
incluída neste trabalho, formando um grupo separado com 100% de suporte.
Anais do XVIII EAIC – 30 de setembro a 2 de outubro de 2009
Figura 1 – Dendrograma mostrando as associações encontradas entre espécies sulamericanas de Hypochaeris
nos estudos AFLP realizados. O número antes de cada nó da árvore é o valor de bootstrap obtido com 10000
replicações cada.
Em Tremetsberger et al. 2006, H. lutea formou um grupo basal não se
associando com nenhuma outra espécie, já neste estudo H. lutea formou um
clado juntamente a espécie H. catharinensis com 72% de suporte, este
agrupamento não foi visto anteriormente, pois H. catharinensis foi incluída
pela primeira vez em estudos filogenéticos do gênero Hypochaeris neste
trabalho. Estes resultados encontram suporte nos dados citogenéticos, onde
se verifica que H. catharinensis compartilha com H. lutea o mesmo padrão
cariotípico, com ambas apresentando distribuição semelhante dos genes de
rDNA. Os dados de AFLP possibilitaram a definição da posição filogenética
de H. catharinensis entre as espécies sulamericanas de Hypochaeris,
acrescentando mais uma importante informação para os estudos do gênero.
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Conclusões
Estes estudos moleculares juntamente com informações cariotípicas das
espécies sulamericanas podem fornecer subsídios para afirmar com maior
clareza a relação da espécie H. catharinensis com as demais espécies
sulamericanas, em especial com H. lutea que tem se mostrado a espécie
mais aproximada da mesma.
Agradecimentos
Agradeço à minha orientadora Claudete de Fátima Ruas pela oportunidade
de realização da iniciação científica, ao apoio financeiro recebido do CNPq,
e à ajuda de todos que trabalham no Laboratório de Marcadores Moleculares
e Citogenética de Plantas do Departamento de Biologia Geral da UEL.
Referências
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em estimativas de distâncias/similaridades genéticas através do
procedimento de bootstrap, Versão 3.0. Departamento de Biologia Geral,
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiâna,
GO. 2001.
Coelho, A.S.G. Software: DBOOT - Avaliação dos erros associados a
estimativas de distâncias/similaridades genéticas através do
procedimento de bootstrap com número variável de marcadores, Versão
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Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO. 2001.
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