25 a 28 de Outubro de 2011
ISBN 978-85-8084-055-1
CARACTERIZAÇÃO DE 12 LOCI MICROSSATÉLITES PARA A ESPÉCIE
HYPOCHAERIS CHILLENSIS (ASTERACEAE) E A SUA
TRANSFERÊNCIA EM 10 ESPÉCIES SUL-AMERICANAS E UMA
ESPÉCIE EUROPÉIA
Carina C. F. Lucio1,2, Eduardo A. Ruas1,3, Luana A. Rodrigues1,4, Thiago Vidotto1,5,
Claudete F. Ruas1,6
RESUMO: O gênero herbáceo Hypochaeris apresenta características que o permitem ser um interessante
modelo para o estudo da evolução e biogeografia em plantas. O gênero exibe uma distribuição disjunta,
com mais de 15 representantes na região Mediterrânea e aproximadamente 50 na América do Sul. A
irradiação do gênero Hypochaeris aparentemente ocorreu a partir de uma única espécie ancestral, através
de eventos de dispersão a longa distância. Neste trabalho, foram desenvolvidos e caracterizados um
conjunto de 12 loci de microssatélites através de uma biblioteca enriquecida utilizando o método de captura
e hibridização para a espécie H. chillensis para avaliar a variabilidade genética e os padrões da estrutura
populacional entre as áreas de distribuição dessa espécie no Brasil. A genotipagem de 50 indivíduos dessa
espécie revelou um nível moderado de polimorfismo, com um total de 32 alelos. O número de alelos variou
de um até cinco, com uma média de 1.29 alelos por locus. Todos os pares de primers foram testados para
transferência em outras dez espécies adicionais do gênero e para o possível ancestral do grupo, H.
angustifolia. A transferência teve sucesso na maioria das espécies sul-americanas, bem como para alguns
primers na espécie ancestral. Os loci microssatélites caracterizados podem ser utilizados para a avaliação
da estrutura genética de populações em H. chillensis e a sua aplicação em outras espécies focará na
compreensão dos processos evolutivos de irradiação adaptativa do gênero desde a sua colonização na
América do Sul.
PALAVRAS-CHAVE: Estrutura de Populações, Hypochaeris, Microssatélites, Polimorfismo.
1 INTRODUÇÃO
O Gênero Hypochaeris apresenta características que o fazem um interessante
modelo para o estudo da evolução e biogeografia de plantas. O gênero exibe uma
distribuição disjunta, com mais de 15 representantes na região Mediterrânea e
aproximadamente 50 na América do Sul (Tremetsberger et al., 2005, 2006). Estudos
sugerem que o gênero originou na região Mediterrânea e irradiou na América do Sul após
um evento de dispersão à longa distância de uma espécie ancestral do noroeste da África
(Tremetsberger et al., 2005).
________________
1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brasil.
Mestra em Genética pela Universidade Estadual de Londrina.
3
Doutor em Agronomia pela Universidade Estadual de Londrina.
4
Doutoranda pelo programa de pós-graduação da Agronomia – UEL, bolsista da CAPES.
5
Graduando em Ciências Biológicas pela UEL, bolsista da CNPq.
6
Professora Doutora em Agronomia pela ESALQ – Piracicaba.
2
Anais Eletrônico
VII EPCC – Encontro Internacional de Produção Científica Cesumar
CESUMAR – Centro Universitário de Maringá
Editora CESUMAR
Maringá – Paraná – Brasil
Estudos moleculares e citogenéticos recentes identificaram características similares
àquelas encontradas no grupo de espécies sul-americanas e na espécie marroquina H.
angustifolia, considerada a ancestral mais próxima das espécies sul-americanas
(Tremetsberger et al., 2005, 2006, Weiss-Schenneweiss, 2007).
Hypochaeris chillensis (Kunth) Britton, uma erva perene, nativa da América do Sul,
exibe uma diversidade ecológica e morfológica extensiva através da sua escala de
distribuição. Contrastando com as outras espécies sul-americanas, a espécie se difunde
desde o sudeste ao sul do Brasil, assim como na Argentina, Uruguai, Paraguai, Equador,
Peru, Bolívia e Colômbia (Azevêdo-Gonçalvez e Matzenbacher, 2007).
A grande variabilidade morfológica encontrada em H. chillensis e a sua cocorrência simultânea com outras espécies do gênero facilitam a hibridização
interespecífica. (Cabrera, 1976; Azevêdo-Gonçalvez e Matzenbacher, 2007). Desde já,
estudos populacionais nessa espécie podem ajudar a compreensão da conexão entre a
dispersão à longa distância e a irradiação explosiva do gênero Hypochaeris na América
do Sul.
2 MATERIAL E MÉTODOS
O DNA genômico foi extraído a partir de folhas frescas de um único indivíduo
utilizando o método CTAB, proposto por Doyle & Doyle, 1987. Uma biblioteca enriquecida
em microssatélites foi construída utilizando o processo de hibridização e captura,
seguindo o protocolo descrito por Billotte et al. (1999), com (CT)8 e (GT)8 marcados com
biotina no passo de enriquecimento. Aproximadamente 5 µg de DNA genômico foi
digerido com RsaI e os fragmentos foram ligados à adaptadores Rsa-21 e Rsa-25.
Fragmentos contendo repetições foram selecionados por hibridização com
oligonucleotídeos biotinilados e recuperados com esferas magnéticas revestidas com
estreptavidina (Invitrogen).
Fragmentos ricos em microssatélites foram amplificados por PCR com o adaptador
Rsa-21 como primer, clonados no pGEM®-T Easy (Promega) e transformados através de
células supercompetentes de Escherichia coli XL1 Blue MRF’ (Stratagene). Após o
aparecimento das colônias, os clones branco-positivos tiveram seus insertos amplificados
por PCR (MJ Research PTC-200) usando o primer universal M13 direto e reverso.
Plasmídeos de 280 clones positivos foram sequenciados utilizando BigDye Terminator
version 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) com 5pM do primer M13 reverso
ou direto, em reações de 10µL de volume. As sequências foram submetidas à eletroforese
no sequenciador automático ABI 3130XL (Applied Biosystems). Dos 280 insertos
sequenciados, 40 (14.29%) clones continham microssatélites perfeitos e ininterruptos. No
entanto, apenas 25 (8.93%) provaram ser adequados para o desenho de primers. Os
primers foram construídos utilizando o programa PRIMER 3 versão 0.4.0 (Rozen e
Skaletsky, 2000). A amplificação por PCR e a consistência de cada primer foi testada em
uma amostra de cinco indivíduos da mesma população, utilizando amplificação em um
ciclo de touch down de acordo com Ruas et al. (2009). A PCR foi realizada em reações de
10 µL, contendo 3.5 µL de GoTaq Green Master Mix (Promega), 0.25µL (5 pmol) de cada
primer locus-específico direto e reverso e 2.0 µL (10ng) de DNA genômico, sendo o
volume final ajustado com água estéril. Os produtos de amplificação foram separados por
eletroforese em um gel de poliacrilamida 7.0%, juntamente com um marcador de 50 pares
de bases, que foi visualizado após ser corado com prata. 12 pares de primers foram
selecionados para análises posteriores.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para caracterização dos 12 loci de microssatélites, DNA genômico foi extraído de
50 indivíduos, representando três populações nativas de H. chillensis do Brasil,
consistidos de: 32 amostras de Lages LAG, 27° 31’ S, 50° 53’ W), rodovia entre São José
do Cerrito e Campos Novos, no estado de Santa Catarina; cinco amostras de Sapopema
(SAP, 23°53’ S, 50°36’ W), no estado do Paraná; e 13 amostras de Itapetininga (ITA,
23°36’ S 48°07’ W), no Km 189 da rodovia Raposo Tavares, no estado de São Paulo.
Exemplares de cada população foram depositados no Herbário FUEL da Universidade
Estadual de Londrina seguindo a certificação LAG: FUEL 48681, SAP: FUEL 48680, e
ITA: FUEL 48810. Para testes de transferência, foi extraído DNA de 22 indivíduos
representando 10 espécies sul-americanas adicionais (duas amostras de cada) e H.
angustifolia. Dos 12 pares de primer selecionados, 11 amplificaram com sucesso as
regiões alvo dos 10 loci, demonstrando polimorfismo, enquanto um (Hchi211) foi
monomórfico e outro (Hchi160) amplificou regiões não possíveis de identificação dos
alelos e, portanto, foi excluído da análise de H. chillensis. A estatística avançada de
genética de populações foi calculada utilizando Genepop versão 1.2 (Raymond and
Rousset, 1995). A genotipagem dos 50 indivíduos de H. chillensis revelou um moderado
nível de polimorfismo, com um número total de 32 alelos. O número de alelos variou de
um (Hchi211) até cinco (Hchi274), com uma média de 2.91 alelos por locus. Conteúdo
informático de polimorfismo (PIC) foi 0.323. Em média, a heterozigosidade observada (HO)
e esperada (HE) para cada locus variou de 0.023 a 1.000 e de 0.063 a 0.640,
respectivamente, com valores médios de 0.390 e 0.384. Cinco loci demonstraram
frequências alélicas que desviaram significativamente das proporções esperadas para o
equilíbrio de Hardy-Weinberg (P ≤ 0.001), incluindo dois loci (Hchi36, Hchi159) com déficit
de heterozigosidade e três (Hchi105, Hchi108, Hchi233) com excesso. Comparações par
a par para testes múltiplos entre os 11 loci demonstraram um desequilíbrio de ligação
significativo apenas entre Hchi36/Hchi75, Hchi36/Hchi274 e Hchi75/Hchi274 (P ≤ 0.05).
Os 12 SSR loci selecionados foram também testados para transferência em outras 10
espécies sul-americanas do gênero Hypochaeris e em H. angustifolia, o possível ancestral
do grupo. Sete loci foram amplificados em todas as espécies sul-americanas testadas,
produzindo alelos de tamanhos similares àqueles observados em H. chillensis. Três loci
(Hchi75, Hchi105, Hchi159) falharam ao amplificar cada um em uma espécie, um (Hchi15)
falhou em quatro espécies e outro (Hchi274) falhou em duas espécies. O sucesso da
transferência foi previsto dada a similaridade genética entre as espécies sul-americanas,
como um resultado de um processo recente de divergência nesse ambiente
(Tremetsberger et al. 2006). A transferência também foi bem sucedida para cinco loci em
H. angustifolia, indicando maior distância genética quando comparada às espécies sulamericadas do gênero.
4 CONCLUSÃO
Os 12 primers microssatélites aqui descritos são a primeira série de marcadores
moleculares desenvolvidos para H. chillensis e possuem um alto nível para a investigação
da diversidade genética e da estrutura genética de populações nessa espécie. Aplicada a
outras espécies relacionadas, esses marcadores são úteis no entendimento da relação
entre essas espécies, no processo de irradiação adaptativa e na especiação do gênero
desde a sua chegada à América do Sul.
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