ANÁLISE PRELIMINAR DE AFLATOXINAS POR UPLC ACOPLADO A
ESPECTRÔMETRO DE MASSAS Q-TOF
PRELIMINARY ANALYSIS OF AFLATOXIN BY UPLC COUPLED TO Q-TOF MASS
SPECTROMETRY
Juliana Scofano Barrabin1, Daniel Filisberto Schulz2, Ronoel Luiz de Oliveira Godoy3, Renata
Galhardo Borguini3, Jeane Santos da Rosa4
1
Mestranda – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro - UFRRJ
Doutorando – Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
3
Pesquisador – Embrapa Agroindústria de Alimentos – CTAA
4
Analista – Embrapa Agroindústria de Alimentos - CTAA
2
Palavras-chave: aflatoxinas, UPLC, Q-TOF
Introdução
A presença de contaminantes naturais nos alimentos, como micotoxinas, representa ameaça
à segurança alimentar. As aflatoxinas são metabólitos secundários produzidos pelos fungos
Aspergillus flavus e algumas espécies de Penicillium e são encontradas em diversos
produtos vegetais, como milho, amendoim, castanhas e em frutas secas. São causadoras de
diversos danos à saúde, desde hepatotoxicidade até a morte. Esta preocupação levou
muitos países a estabelecerem na legislação limites máximos aceitáveis de aflatoxinas em
diferentes classes de alimentos. A legislação da União Européia é a mais rígida entre todos
os países, preconizando um limite máximo de 2μg/kg para aflatoxina B1 e de 4μg/kg para a
soma das 4 principais aflatoxinas encontradas nos vegetais – B1, B2, G1 e G2. A falta de
controle acerca destes contaminantes fez com que o Brasil perdesse o mercado da União
Européia gerando grandes perdas econômicas. Para que se possa monitorar o
desenvolvimento destas toxinas é preciso que haja metodologias seguras para analisar sua
presença e quantificá-las. Dentre as técnicas analíticas mais utilizadas para este fim pode-se
citar Cromatografia de Camada Delgada (CCD) e a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
com Detecção por Fluorescência (CLAE-DF) ou por Espectrometria de Massas (CLAE-EM),
sendo esta última a mais avançada no campo analítico, devido à sua maior seletividade e
sensibilidade. Neste trabalho, objetivou-se desenvolver os parâmetros analíticos de um
ensaio para identificação de aflatoxinas por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência e
detecção por Espectrometria de Massas.
Material e Métodos
A etapa cromatográfica foi desenvolvida em um Cromatógrafo Líquido de Ultra Eficiência
Acquity® utilizando-se uma coluna Acquity UPLC® BEH C18, 1.7um, 2.1 x 150mm mantida a
uma temperatura de 40ºC. A fase móvel foi constituída de Acetonitrila e Água na proporção
50:50 (v/v) em modo isocrático, mantendo-se um fluxo de 0,4µL/min. Para a detecção
utilizou-se um Espectrômetro de Massas Synapt® do tipo Quadrupolo – Time of Flight (QTOF). Utilizou-se ionização por electrospray no modo positivo. Os parâmetros otimizados
foram: potencial de capilar e de cone, 3000 e 38 V respectivamente; temperatura da fonte a
110ºC; gás de dessolvatação a uma temperatura de 500ºC e um fluxo de 750L/h; gás do
cone a um fluxo de 50L/h. O instrumento Q-TOF foi operado no modo quadrupolo de larga
passagem (V mode) e os dados foram adquiridos numa faixa entre 200 e 400m/z.
Resultados e Discussão
Com os parâmetros estabelecidos conseguiu-se a eluição das 4 aflatoxinas em menos de
dois minutos para corrida cromatográfica (Figura 1), tempo bastante reduzido se comparado
a uma corrida por CLAE-DF, cujos menores tempos de retenção são em média 10 minutos
(Chan et al., 2004; Tarín et al., 2004; Ghali et al., 2009).
Figura 1 - Cromatogramas das aflatoxinas G2, G1, B2 e B1 respectivamente e seus tempos
de retenção em minutos.
A detecção por espectrometria de massas pelo Q-TOF dispensa a etapa de derivatização e
a necessidade de separação completa dos picos pois, mesmo que eles apresentem tempos
de retenção muito próximos, o software apresenta recurso para se extrair um pico referente
somente à massa exata do íon molecular desejado. Além disso, por trabalhar com massa
exata, o Q-TOF apresenta maior especificidade em relação a outras técnicas de menor
resolução, e evita que se obtenha uma resposta falso-positiva (Williamson e Bartlett, 2007).
Conclusões
O aparelho Q-TOF permitiu simplificar o método analítico para aflatoxinas, pois conhecendose a massa exata de cada íon molecular de cada aflatoxina, pode-se extrair um pico
cromatográfico referente à cada uma delas, sem a necessidade de perder-se tempo
trabalhando na separação.
Referências Bibliográficas
Chan, D.; MacDonald, S. J.; Boughtflower, V.; Grereton, P. Simultaneous determination of
aflatoxins and ochratoxin A in food using a fully automated immunoaffinity column claen-up
and liquid chromatography-flouorescent detection. Journal of Chromatography A, n. 1059,
p.13-16, 2004.
Ghali, R., Belouaer, I., Hdiri, S., Ghorbel, H., Maaroufi, K., Hedilli, A. Simultaneous HPLC
determination of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in Tunisiam sorghum and pistachios. Journal
of Food Composition and Analysis, n. 22, p.751-755, 2009.
Tarín, A; Rosell, M. G.; Guardino, X. Use of high permormance liquid chromatography to
assess airborne mycotoxins Aflatoxins and Ochratoxin A. Journal of Chromatography A, n.
1047, p. 235-240, 2004.
Williamson, L. N.; Bartlett, M. G. Quantitative liquid chromatography/time-of-flight mass
spectrometry. Biomedical Chromatography, v. 21, p. 567–576, 2007.
Autor a ser contactado: Juliana Scofano Barrabin, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro – Seropédica/RJ – email: [email protected]