Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA Código: MET/LACQSA/BH/012 - V.1
Laboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/MG
Fase: Vigente
Divisão Técnica Laboratorial - DLAB / Laboratório de
Aprovado em: 01/09/14
Controle de Qualidade e Segurança Alimentar - LACQSA/BH
Método de Ensaio – MET
Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
1.0 Objetivos e alcance
O MET “Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia gasosa acoplada a
espectrômetro de massa” objetiva descrever os procedimentos analíticos a serem utilizados na determinação de
carbamato de etila em bebidas destiladas de cana-de-açúcar por cromatografia gasosa acoplada ao
espectrômetro de massa / massa (CG-MS-MS) e no registro de dados relacionados às análises, para que estes
sejam corretamente seguidos.
1.1 Abreviações
CE - carbamato de etila
CED - carbamato de etila deuterado
CID – dissociação por colisão induzida
CG – Cromatografia gasosa
CG-MS-MS - cromatografia gasosa/espectrômetro de massa/massa
LD50 – é a dose necessária de uma dada substância ou tipo de radiação para matar 50% de uma população em
teste
LQ - limite de quantificação
MC – material critico
MRM – monitoramento de reação múltipla
PTFE – Politetrafluoretileno (teflon)
SE – Solução estoque
SI – Solução intermediária
2.0 Fundamentos
A determinação de CE na amostra de destilado de cana-de-açúcar é efetuada por injeção direta em um sistema
de cromatografia gasosa acoplada a um espectrômetro de massa, que baseia na dissociação induzida por
colisão (CID), na segunda célula de colisão (quadrupolo 2), do triplo quadrupolo.
Aprovado por:
Eugênia Azevedo Vargas
Nilson César Castanheira Guimarães
Verificado por:
Roseane Brandão de Brito
Elaborado/Revisado por: Anelise Lapertosa Drummond
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Método de Ensaio – MET
Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
Neste método o padrão de CE é injetado no CG-MS-MS no modo MRM e identificado pelo tempo de retenção de
10,7 minutos, pelo perfil de fragmentação que deverá apresentar as transições para o íon quantificador 62 →44
e qualificador 74 → 44 e a intensidade relativa dos íons diagnóstico (% pico quanlificador em relação ao
quantificador) do CE de 49% com faixa aceitável de 37 a 61% para o padrão e a amostra.
A confirmação é feita pela comparação dos espectros de massa do padrão e da amostra. Na amostra é
adicionado um padrão interno. É preparada curva de calibração do analito que será utilizado para quantificar as
amostras. A quantificação é feita pela interpolação em curva analítica e corrigida pelo percentual (%) de
recuperação do padrão dos analitos.
2.1 Características do método
Este método foi desenvolvido, validado e otimizado pelo LACQSA, com base no trabalho desenvolvido por
LACHENMEIER et al (2005, 2006) e BRUNO(2006). Na validação foram determinadas as seguintes figuras de
mérito: veracidade (em termos de recuperação, R%), obtidas por ensaios com amostras artificialmente
contaminadas, linearidade, exatidão e precisão (em termos de desvio padrão relativo, DPr% e DPR%), limite de
quantificação do método A validação do método foi orientada pelo POP/LACQSA/BH/011
métodos analíticos”, pelo Manual de Garantia Analitica
“Validação de
da CGAL/2011 e pelo plano de estudo 073
“Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia gasosa acoplada a
espectrômetro de massa”
O perfil de fragmentação foi feito pela análise em fullscan de cada analito, seguido do estudo dos íons produtos
e a definição das transições dos íons de quantificação e qualificação utilizados na elaboração do método em
modo de monitoramento de reação múltipa (MRM) no triplo quadrupolo apresentados na Tabela 1.
Tabela 1: Transições dos íons de quantificação, qualificação e tempo de retenção dos analitos.
Analitos
Quantificador
Qualificador
Tempo de retenção (min)
Carbamato de etila
62 → 44
74→ 44
10,7
Carbamato de etila deuterado
64 → 44
-
10,5
A intensidade relativa do íon diagnóstico (% do pico qualificador em relação ao quantificador) foi calculada para
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Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
o analito CE que permiti determinar a faixa aceitável para o CE, a qual está dentro dos critérios da CEE
657/2002, que está de acordo com a tolerância máxima permitida para a intensidade relativa dos íons utilizando
várias técnicas de análises de espectrometria de massa (Tabela 2).
Tabela 2: Características obtidas dos íons quantificadores e qualificadores.
Analitos
Quantificador
Qualificador
Intensidade relativa dos íons %
Faixa aceitável (%)
Carbamato de etila
62 → 44
74→ 44
41
31 a 51
Carbamato de etila deuterado
64 → 44
-
-
-
De acordo com CEE 657/ 2002 a razão sinal/ruído dos íons dos analitos devem ser ≥ 3:1 o que pode ser
evidenciado quando se analisa o cromatograma de cada analito. No Plano de estudo 073 quando foram
analisados os cromatogramas de carbamato de etila e carbamato de etila deuterado em sua menor
concentração foi possível verificar que a razão sinal/ruído ≥ 3:1 dos picos eram atendidos.
Os parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de validação encontram-se descritos na Tabela
3 e Tabela 4.
Tabela 3: Parâmetros de desempenho do método utilizando padrão interno carbamato de etila deuterado
Parâmetros de Desempenho
Veracidade na concentração do LQ (20 µg/L)
Recuperação média: n= 6
Critério/requisito
recuperação 80 a 110% CEE
657/2002
Valor obtido
Aprovação
92% (18,4 µg/L)
Sim
Solução CE
20 µg/L
Precisão
Repetitividade
Valores médios n=6
50 µg/L
RSDr 10%
150 µg/L
400 µg/L
Aprovado por:
Eugênia Azevedo Vargas
Nilson César Castanheira Guimarães
Verificado por:
Roseane Brandão de Brito
RSDr %
5,81
4,08
9,57
2,44
3,23
6,33
7,33
3,92
2,54
2,49
4,90
5,01
1,90
7,90
7,52
8,48
RSDr %
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Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
Precisão
(precisão intermediária)
Valores médio n=6
RSDR 15%
Parâmetros de Desempenho
Solução CE
1,47
RSDR%
20 µg/L
50 µg/L
150 µg/L
8,83
6,70
5,69
400 µg/L
7,52
Critério/requisito
Horrat
Precisão adequada por Horrat <1
Seletividade/especificidade
Teste t de Student com nível de
probabilidade de 95%
Faixa ótima de trabalho
Faixa da curva de calibração
Valor obtido
20 µg/L
0,003
50 µg/L
0,003
150 µg/L
0,003
400 µg/L
0,004
Não há efeito matriz
Sim
Aprovação
Sim
Sim
20 a 400 µg/L
20, 50, 150, 300, 400, 600 µg/L
Parâmetros de Desempenho
Aplicabilidade
(matriz e faixa de concentração)
Limite de detecção* (g/L)
Limite de quantificação* (g/L)
Incerteza de medição no LQ*
Critério/requisito
Valor obtido
IN/SDA número 13 de 2005 Cachaça e aguardente de cana-de-açúcar
Cálculo matemático a partir da
menor concentração da curva 12,9 µg/L
uma previsão do limite superior
20,0 µg/L
± 8,0 µg/L (40%)
Aprovação
Sim
Sim
Sim
Sim
Fonte: * de acordo com análise critica 067/2013 – Reportagem de resultado.
Para análise sem utilizar padrão interno carbamato de etila deuterado observou-se na validação o desempenho
geral do método apresentado na tabela 4.
Tabela 4: Parâmetros de desempenho do método sem utilizar padrão interno carbamato de etila deuterado
Parâmetros de Desempenho
Veracidade na concentração do LQ = 20 µg/L
Recuperação média: n= 6
Critério/requisito
Recuperação 80 a 110%
CEE 657/2002
Valor obtido
Aprovação
93% (18,5 µg/L)
Sim
Solução CE
Precisão
Repetitividade
Valores médios n=6
20 µg/L
RSDr 10%
50 µg/L
Aprovado por:
Eugênia Azevedo Vargas
Nilson César Castanheira Guimarães
Verificado por:
Roseane Brandão de Brito
RSDr %
5,81
4,08
9,67
9,94
3,23
6,64
7,03
4,11
Sim
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Método de Ensaio – MET
Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
150 µg/L
400 µg/L
Parâmetros de Desempenho
Critério/requisito
Precisão
(precisão intermediária)
Valores médio n=6
RSDR 15%
Horrat
Precisão adequada por
Horrat <1
Seletividade/especificidade
Teste t de Student com nível
de significância de 95%
Faixa ótima de trabalho
Limite de detecção (g/L)
Limite de quantificação(g/L)
Valor obtido
Solução CE
RSDR %
20 µg/L
8,73
50 µg/L
6,94
150 µg/L
5,62
400 µg/L
7,52
20 µg/L
0,003
50 µg/L
0,003
150 µg/L
0,003
400 µg/L
0,004
Não há efeito matriz
Aprovação
Sim
Sim
Sim
20 a 400 µg/L
Faixa da curva de calibração
Aplicabilidade
(matriz e faixa de concentração)
2,54
2,49
4,63
5,01
1,88
7,9
7,52
8,47
1,47
20, 50, 150, 300, 400, 600 µg/L
IN/SDA número 13 de 2005 Cachaça e aguardente de cana-de-açúcar
Cálculo matemático a partir
da menor concentração da
13,0 µg/L
curva – uma previsão do
limite superior
20,0 µg/L
± 8,0 µg/L (40%)
Incerteza de medição no LQ*
Sim
Sim
Sim
Sim
Fonte: * de acordo com análise critica 067/2013 – Reportagem de resultado.
2.2 Aplicabilidade
O método validado é aplicável à determinação do contaminante CE em cachaça e aguardente conforme os
resultados obtidos na validação do método. Atende o limite máximo de CE de 150µg / L definido na normativa
SDA Nº 13 (BRASIL, 2005) para o CE cachaça e aguardente de cana-de-açúcar.
3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumos
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Método de Ensaio – MET
Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
A especificação detalhada dos materiais, reagentes e solventes necessários para realização dos procedimentos
descritos neste MET em particular os Materiais críticos (MC - cuja qualidade afeta o resultado analítico)
encontram-se na planilha PLN/DLAB/PL/007 - V.4 – “Lista de Materiais de Consumo por Procedimento” e a
planilha com as peças de reposição do cromatógrafo gasoso Agilent com detector de massas triplo quadrupolo
Agilent 7000A.
Os reagentes, solventes e materiais necessários à análise deverão ser solicitados pelo preenchimento do
formulário FOR/LACQSA/BH/021 “Solicitação de material de consumo”. As quantidades das soluções
necessárias para as análises deverão ser verificadas.
Vidrarias e outros materiais de uso na rotina necessário à análise deverão ser solicitados à Unidade de Preparo
de Material pelo preenchimento do formulário FOR/LACQSA/BH/025 “Solicitação de material ao preparo”.
Quando for identificada a necessidade da aquisição de materiais indisponíveis em estoque devem-se observar
os procedimentos descritos no documento de suporte DS/LACQSA/BH/011 “Aquisição de materiais de consumo”
para solicitação dos mesmos.
Nota 1: As vidrarias descritas na PLN/DLAB/PL/007 acima referenciada apresentam especificações completas
compatível com a vidraria desejável e em processo de aquisição. Por uma questão de disponibilidade e
adequação, enquanto não se adquire o material desejado, as análises serão realizadas com as vidrarias
disponíveis.
3.1 Vidrarias em geral
- balão volumétrico calibrado nos volumes de 10, 50, 100 e 1000 mL (MC);
- becker de 25, 50, 100, 600 e 1000 mL;
- frascos reagente de vidro borossilicato, âmbar, capacidade de 250, 500 e 1000 mililitros;
- frasco tipo vial de 15 e 100 mL com tampa de rosca e teflon para guardar amostras e padrões;
- pipetas Pasteur
- proveta de 100, 500 e 1000 mL de preferência calibrada.
3.2 Materiais de suporte
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Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
- barrilhete de polipropileno, capacidade de 5 L;
- bastão em vidro borossilicato;
- bulbo de amostragem de borracha natural;
- cuba para recolher materiais limpos e utilizados;
- espátula em aço inoxidável;
- gás Hélio Analítico (MC);
- gás nitrogênio (MC);
- papel alumínio;
- papel toalha;
- pissetas de 500 mL;
- ponteiras descartáveis para pipetas automáticas com volumes de 20 a 100 µL, 200 a 1000 µL e 1 a 10 mL.
3.3 Materiais específicos para quantificação por CG-MS-MS
- coluna capilar HP-INNOWAX (60 m x 0,25 mm x 0,25 um) (MC);
- septo azul, PTFE/ silicone/PTFE vermelho silicone, com tampa de rosca;
- frasco tipo vial de 2 mL.
3.4 Padrões
Para assegurar que as medições feitas sejam rastreáveis ao Sistema Internacional de Unidades (SI), o
laboratório deve utilizar material de referência certificado acompanhado de uma documentação emitida por um
organismo com autoridade, a qual fornece um ou mais valores de propriedades especificadas com as incertezas
e rastreabilidade associada, utilizando procedimentos válidos. Caso este produto não esteja disponível no
mercado, o laboratório utilizará o de melhor qualidade disponível (padrão de trabalho, segundo o
POP/DLAB/PL/001).
- Carbamato de etila – Padrão Analítico de Uretane, pureza:≥ 99,0%(CG)
- Carbamato de etila deuterado - Padrão Analítico de Uretane-D5, pureza: 99% (CP)
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3.5 Reagentes e solventes
Os reagentes utilizados neste procedimento seguirão a IS/LACQSA/BH/002 “Preparo e controle de lotes de
insumos (reagentes, solventes e soluções)” que descreve os procedimentos a serem adotados no preparo e
controle de lotes de insumos e deverá ser preenchido o formulário FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de
reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas”.
- Água tipo 1 conforme a ISO 3696:1987
- Etanol pa., pureza mínina de ≥ 99,9 %
4.0 Equipamentos
Utilizar os equipamentos observando: os procedimentos descritos em suas respectivas instruções de trabalho , o
Plano de Equipamentos e o POP/LAQCSA/BH/002 “Controle de Equipamentos” considerando a adequação dos
instrumentos aos requisitos e especificações necessárias a adequada execução deste procedimento.
Verificar o desempenho e/ou calibração externa dos equipamentos, antes do início da análise. Para micropipetas
e balanças proceder à verificação diária e registrar nos devidos formulários e planilhas.
Utilizar, preferencialmente, equipamentos e materiais listados nesse MET, sendo que outros podem ser
utilizados desde que sua aplicabilidade tenha sido comprovada e o seu uso devidamente registrado nas fichas
de análise ou formulário. Utilizar, preferencialmente, vidrarias volumétricas, balanças e micropipetas calibradas.
O desempenho do cromatógrafo gasoso acoplado ao espectrômetro de massa deve ser verificado utilizando o
formulário FOR/LACQSA/BH/053 “Verificação de desempenho do cromatógrafo gasosos acoplado ao detector
de massas triplo quadrupolo (CG-QQQ)” antes da análise ou uma vez por semana ou se o equipamento foi
desligado. Também se deve verificar o número de injeções realizadas com o liner e o septo do auto - injetor que
devem ser trocados após ± 250 injeções e se necessário a limpeza ou troca da seringa do auto – injetor
consultando a FOR/LACQSA/BH/118 “Controle de injeções do cromatógrafo gasoso acoplado ao detector de
massas Agilent (CG-QQQ)”.
4.1 Equipamentos críticos
- balança analítica de precisão com ± 4 casas decimais calibrada e tolerância ± 0,00005;
- cromatógrafo gasoso Agilent com detector de massas triplo quadrupolo Agilent 7000A qualificado;
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Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
- geladeira – temperaturas de 2 a 8 °C;
- micropipetas automática calibrada com capacidade de medição de 100 a 1000µL ou 200 a 1000µL, com menor
divisão de escala de 2 µL;
- micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 20 a 100µL ou 10 a 100µL com menor
divisão de escala de 0,2 µL;
- micropipetas automática calibrada com capacidade de medição de 1 a 10mL com menor divisão de escala de
20 µL.
4.1.2 Equipamentos de suporte
- capela de exaustão;
- purificador de água purelab option Q. – marca Elga.
5.0 Precauções analíticas
O CE é classificado pela Internation Agency for Research on Câncer (IARC) como possivelmente carcinogênico
para o homem, da classe 2B. Sua toxicidade aguda é relativamente baixa, sendo a LD50 na ordem 2,5 g/kg de
peso corporal. O CE não é diretamente carcinogênico nem mutagênico, mas sua atuação pelo citocromo P-450,
origina metabólitos tóxicos considerados como genotóxicos, mutagênicos e clastogênicos, especialmente na
presença de ativação metabólica (IARC- 2007-03-01).
Para os procedimentos relacionados às condições ambientais e segurança consultar o POP/LACQSA/BH/003
“Ambiente e segurança”. Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado, com precauções
particulares como utilização de equipamentos de proteção individual (luvas, guarda-pó e sapatos fechados),
evitando qualquer contato de solventes e reagentes com a pele e/ou os olhos.
Utilizar vidraria limpa, livres de detergente e resíduos. Ao final da análise, o material utilizado deverá ser lavado
conforme o IP/LACQSA/BH/OO1 “Descontaminação e preparo de material”.
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espectrometria de massas
A manipulação de solventes e/ou reagentes utilizados nas análises deve ser realizada com cuidado,
considerando a natureza de cada um e as informações contidas na FISPQ - ficha de segurança de produtos
químicos. Consultar o POP/LACQSA/BH/004 “Gerenciamento de resíduos e documentação associada”.
6.0 Procedimentos
O analista deve selecionar as amostras que serão analisadas, inclusive aquelas para fins de controle
intralaboratorial em acordo com o responsável.
Os procedimentos referentes ao controle intralaboratorial estabelecidos no POP/LACQSA/BH/009 “Garantia da
qualidade analítica” devem ser realizados com amostras controles (AC) em ensaios cegos e não cegos.
As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento da ficha FOR/LACQSA/BH 024 “Comunicado e
solicitação de amostras”. Estas serão entregues acompanhadas das respectivas fichas de acompanhamento de
amostras
FOR/LACQSA/BH/061
“Registro
de
amostra
para
análise
físico-química
de
bebidas”
e
FOR/LACQSA/BH/062 “Reportagem de resultados analíticos de físico-química de bebidas”.
O formulário FOR/LACQSA/BH/039 “Acompanhamento de análise de bebidas (Carbamato de etila e
congêneres)” deverá ser preenchido com os dados pertinentes. Caso sejam anexados registros da técnica de
detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser rubricadas e numeradas ao final da análise de forma que cada
folha seja identificada com o número total de folhas e número da folha.
Organizar as soluções e materiais utilizados na análise.
Ao final da análise:

Os resíduos de analise (sólidos e líquidos) devem ser coletados em recipientes adequados, devidamente
identificados para coleta de resíduos e devem ser manipulados conforme POP/LACQSA/BH/004 “Gerenciamento de Resíduos”.

Coletar o material utilizado, separando os que serão lavados pelo próprio analista (materiais pequenos e ou
frágeis) e encaminhar o restante para a Unidade de Preparo de Material (UPM). Organizar as soluções e
materiais utilizados na análise.
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espectrometria de massas

Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH 003 -
“Ambiente e Segurança”.
6.1 Preparo de soluções
Os reagentes e soluções utilizadas neste procedimento seguiram a IS/LACQSA/BH/002 “Preparo e controle de
lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções)” que descreve os procedimentos a serem adotados no
preparo e controle de lotes de insumos e deverá ser preenchido o formulário FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de
reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas”.
Rotular as soluções preparadas utilizando etiqueta própria, preenchendo adequadamente o lote de origem dos
insumos registrados no FOR/LACQSA/BH/006 “Controle de lotes e insumos para análise”, descrição da solução,
lote e insumos utilizados, data de preparo, data de validade, responsável/preparo, utilização, temperatura de
armazenamento.
O preparo e as quantidades das soluções necessárias para a análise devem ser preparadas seguindo os
procedimentos descritos neste MET, sendo que as soluções padrões de carbamato de etila devem ser feitas no
dia da análise.
Os volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender as
necessidades das análises respeitando as devidas proporções.
6.1.1 Preparo da solução de etanol a 40% (v/v)
Medir em uma proveta 400 mL de etanol e em outra proveta 600 mL de água tipo 1. Transferir para um para um
frasco com tampa de 1000 mL e homogeneizar a solução. Rotular a solução e armazenar em temperatura
ambiente. Preencher o formulário FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de reagentes, solventes e soluções para
análises de bebidas”.
6.1.2 Preparo das soluções estoque (SE) de carbamato de etila (2000 mg/L)
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Método de Ensaio – MET
Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
Em um balão volumétrico de 10 mL calibrado colocar ± 1 mL de solução de etanol a 40 %. Pesar 20 mg ± 0,05
mg do padrão CE. Completar o volume com solução de etanol a 40 %. Homogeneizar e transferir para um
frasco, rotular a solução e armazenar em geladeira na temperatura de 2 a 8 °C. Preencher o formulário
FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas”.
6.1.3 Preparo das soluções estoque de Carbamato de etila deuterado(1000 mg/L)
Em um balão volumétrico calibrado de 100 mL colocar ± 10 mL de solução de etanol a 40%. Pesar 100 mg ±
0,05mg do padrão CED. Completar o volume com solução de etanol a 40%. Homogeneizar e transferir para um
frasco âmbar, rotular a solução e armazenar em geladeira na temperatura de 2 a 8 °C. Preencher o formulário
FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas”.
6.1.4 Preparo das soluções intermediária (SI) de carbamato de etila (10 mg/L)
Em um balão volumétrico de 10 mL calibrado colocar ± 1 mL de solução de etanol a 40 % e adicionar 50 µL da
solução estoque de carbamato de etila. Completar o volume com solução de etanol a 40 %. Homogeneizar e
transferir para um frasco, rotular a solução e armazenar em geladeira na temperatura de 2 a 8 °C. Preencher o
formulário FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas”.
6.1.5 Preparo da solução intermediária de carbamato de etila deuterado (10 mg/L)
Em um balão volumétrico de 50 mL colocar ± 5 mL de solução de etanol a 40 % e adicionar 500 µL da solução
estoque de carbamato de etila deuterado. Completar o volume com solução de etanol a 40 %. Homogeneizar e
transferir para um vial de 50 mL, rotular a solução e armazenar em geladeira na temperatura de 2 a 8 °C.
Preencher o FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas” e o
FOR/LACQSA/BH/039 “Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres)”
6.1.6 Preparo da curva de calibração
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Método de Ensaio – MET
Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
Os procedimentos utilizados no preparo das soluções para a curva de calibração de CE devem ser registrados
no formulário o formulário FOR/LACQSA/BH/137 “Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de
bebidas” e no FOR/LACQSA/BH/039 “Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e
congêneres)”, que deverá ser arquivada juntamente com as planilhas de resultado na pasta de
acompanhamento de análise.
A curva de calibração é preparada em 6 níveis de concentração de CE, sendo cada uma preparada em um
balão volumétrico de 10 mL calibrado, numerado de 1 a 6 e registrada no FOR/LACQSA/BH/039
“Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres)”. Em cada balão volumétrico de
10 mL calibrado adicionar ± 1 mL da solução de etanol a 40 %. Colocar 50 µL da solução intermediária do
padrão interno do carbamato de etila deuterado (10 mg/L) em cada balão volumétricos de 10 mL com auxílio de
uma micropipeta calibrada, que corresponderá a concentração de 50 µg/L do padrão interno. Adicionar a
solução intermediária do padrão de carbamato de etila (10 mg/L) em cada balão seguindo a Tabela 5, com
auxílio de uma micropipeta calibrada.
Tabela 5: Preparo da curva de calibração de carbamato de etila.
Níveis da Curva de Calibração
Carbamato de etila
Concentração (µg/L)
Volume SI (µL)
1
20
20
2
50
50
3
150
150
4
300
300
5
400
400
6
600
600
Completar o volume de cada balão volumétrico com solução de etanol 40 %. Homogeneizar as soluções dos
balões volumétricos e colocar cada solução da curva de calibração em 3 vials de 2 mL identificados. Os
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espectrometria de massas
restantes das soluções da curva de calibração serão descartados no final da análise, seguindo o
POP/LACQSA/BH/003 “Ambiente e Segurança” em recipientes adequados, devidamente identificados para
coleta posterior.
6.2 Preparo dos controles analíticos
Em cada batelada de análise será injetado 1 branco reagente, 1 branco de amostra e 3 brancos de amostra
fortificadas em três níveis de concentração do analito carbamato de etila que serão utilizados para avaliar o
processo de análise.
- Preparar o branco reagente em um balão volumétrico calibrado de 10 mL identificado, adicionar ± 1 mL da
solução de etanol a 40 % e com auxílio de uma micropipeta calibrada colocar 50 µL da solução intermediária do
padrão interno do carbamato de etila deuterado (10 mg/L), que corresponderá a concentração de 50 µg/L.
Completar o volume do balão volumétrico de 10 mL com solução de etanol 40% e homogeneizar. Em um vial
identificado colocar ± 500 µL desta solução e fechá-lo com uma tampa com septo novo (não devem ser
reutilizados os septos).
- Preparar a amostra branco em um balão volumétrico calibrado de 10 mL identificado, adicionar ± 1 mL da
amostra branco e com auxílio de uma micropipeta calibrada colocar 50 µL da solução intermediária do padrão
interno do carbamato de etila deuterado (10 mg/L), que corresponderá a concentração de 50 µg/L. Completar o
volume do balão volumétrico de 10 mL com a amostra branco e homogeneizar. Em um vial identificado colocar ±
500 µL desta solução e fechá-lo com uma tampa com septo novo (não devem ser reutilizados os septos).
- Preparo das amostras fortificadas será realizado em 3 balões volumétrico de 10 mL calibrado identificados
R1, R2 e R3. Colocar ± 1 mL da amostra branco e com auxílio de uma micropipeta calibradas adicionar 50 µL da
solução intermediária de carbamato de etila deuterado (10 mg/L), que corresponderá a concentração de 50 µg/L
do padrão interno, e as quantidades da solução intermediária de carbamato de etila (10 mg/L) em cada balão
seguindo a Tabela 6.
Tabela 6 - Concentração do padrão de carbamato de etila utilizados para preparo das amostras fortificadas.
Amostras fortificadas
Carbamato de etila
Concentração (µg / L)
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Volume SI (µL)
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Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
R1
20
20
R2
50
50
R3
150
150
Completar o volume de cada balão volumétrico com amostra branco. Homogeneizar os balões volumétricos e
colocar cada amostra fortificada em vials de 2 mL identificados com uma tampa com septo novo (não devem ser
reutilizados os septos).
Nota 02: caso não tenha amostra branco para realizar a análise, o controle (amostra branco) será uma solução
de etanol 40 % adicionada de 50 µL da solução intermediária de carbamato de etila deuterado (10 mg/L), que
corresponderá a amostra fortificada.
Nota 03: podem ser usadas outras concentrações para o preparo das amostras fortificadas, desde que estejam
contemplados na faixa de trabalho.
6.3 Preparo das amostras
As amostras são injetadas sem nenhum processo de extração, somente será adicionado o padrão interno
carbamato de etila deuterado (10 mg/L).
Em um balão volumétrico calibrado de 10 mL identificado, adicionar ± 1 mL da amostra e com auxílio de uma
micropipeta calibrada colocar 50 µL da solução intermediária do padrão interno do carbamato de etila deuterado
(10 mg/L), que corresponderá a concentração de 50 µg/L. Completar o volume do balão volumétrico de 10 mL
com a amostra e homogeneizar. Em um vial identificado colocar ± 500 µL desta solução e fechá-lo com uma
tampa com septo novo (não devem ser reutilizados os septos).
6.4 Injeção das amostras
Antes de injetar a curva padrão de CE deve-se injetar o padrão CE de maior concentração da curva de
calibração (600µg/L) por duas vezes. Avaliar o tempo de retenção, as características dos íons quantificador e
qualificador de acordo com a Tabela 1 e a intensidade relativa do íon diagnóstico (% do pico qualificador em
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relação ao quantificador) se atende a faixa de aceitável de acordo com os critérios da CEE 657/2002
apresentado na Tabela 2 e registrar no formulário FOR/LACQSA/BH/044 “Controle de injeção do padrão
carbamato de etila”.
Injetar os padrões da curva de calibração, o branco reagente, o branco da amostra, as amostras fortificadas e as
amostras no cromatógrafo gasoso acoplado ao espectrômetro de massa utilizando o método CE1.M com as
seguintes condições:
Injetor:
Capacidade da seringa: 10 µL
Modo: split Razão:5:1 Temperatura do injetor: 230 oC
Volume de injeção: 2 µL
Tabela 7: Lavagem e ambiente da seringa de injeção do auto injetor do CG-MS-MS
Lavagem
Pré injeção
Pós injeção
Volume (µL)
Solvente (Etanol 40%)
6
8
Máximo
Amostra
6
-
2
Ambiente da amostra
6
-
-
Forno:
Tempo de equilíbrio: 0,5 minutos
Coluna: HP-INNOWAX (60 m x 250 µm x 0,25 µm)
Gás de arraste: hélio 1,5 mL/min
Tabela 8: Programação do forno do CG-MS-MS
Taxa 0 oC / min
Valor oC
Tempo de espera min
90
1
10
185
0
30
230
2
Inicial
Tempo de corrida min
14,00
Célula de colisão:
Gás da célula de colisão: Nitrogênio 1,5 mL/min
Hélio
2,25mL/min
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Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
Linha de transferência (Transfer Line):
Temperatura: 230 oC
- Montar a sequência de injeção no CG de modo aleatório colocando os padrões da curva de calibração, o
branco reagente, a amostra branca, as amostras fortificadas e as amostras a serem analisadas.
7.0 Resultados
7.1 Cálculos
Calcular a concentração do CE nas amostras pela interpolação em curva analítica que será realizado utilizando
a planilha PLN/LACQSA/BH/057 ‘‘Resultado da determinação de carbamato de etila em bebidas destiladas de
cana-de-açúcar’’, que permite a obtenção do resultado final corrigido pela recuperação e expressa o valor da
incerteza expandida (U) (K=2) para esta medida, expressos em µg/L representada pela equação abaixo.
C CE µg / L  
( APCA  a )
 FC R  C RI
b
Equação 1
 ACPA = área cromatográfica do pico da amostra
 a = intercepto da curva de calibração (µg/L);
 b = inclinação da curva de calibração (µg/L);
 FCR = fator de correção devido ao erro sistemático da recuperação FCR=1 e
 CRI = correção devido à reprodutibilidade interna do laboratório CRI=0;
Utilizar a planilha PLN/LACQSA/BH/057 ‘‘Resultado da determinação de carbamato de etila em bebidas
destiladas de cana-de-açúcar’’ para obter o resultado final de cada amostra e das amostras branco
contaminadas.
7.2
Reportagem do resultado
- Declarar se o resultado é corrigido ou não pela recuperação do controle.
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espectrometria de massas
- Declarar os valores em porcentagem da recuperação obtida pelos controles.
- Declarar a Incerteza expandida estimada com probabilidade de abrangência 95%.
- Reportar o fator de abrangência K.
A expressão do resultado e da incerteza de medição deve ser (y±U: Resultado ± Incerteza). Quando expressa em
tabela ou Quadro a incerteza deve ser reportada sem o sinal ±.
Sendo: y = resultado= mensurando e U= incerteza expandida com 95% de probabilidade de abrangência.
Importante:
y= corrigido pela recuperação quando aplicável
y= corrigido pelo erro sistemático a princípio somente para procedimentos analíticos quando o erro sistemático
impactar significativamente os resultados.
A incerteza expandida de medição declarada é baseada em uma incerteza padrão multiplicada pelo fator de
abrangência K, com uma probabilidade de abrangência de aproximadamente 95%. Podendo reportar também o K
calculado pelas planilhas que sempre é calculado com uma probabilidade de abrangência de aproximadamente
95%.
A incerteza é estimada pontualmente por amostra, respeitando a faixa de trabalho de cada método. Quando a
concentração do analito exceder a faixa de trabalho a amostra deve ser diluída de forma que sua concentração
fique dentro da faixa de trabalho validada pelo laboratório para cada um dos seus métodos.
A incerteza é reportada na mesma unidade do mensurando (do analito) de acordo com a unidade da legislação
vigente ou limite crítico estabelecido pelo Laboratório.
A incerteza será reportada com dois (2) algarismos significativos, conforme o proposto pelo GUM, 2012.
O número de algarismos significativos da incerteza poderá ser maior que dois para atender o valor e a unidade
da legislação quando justificável.
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Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
A unidade da reportagem de resultado poderá ser modificada, quando necessário ou quando o cliente assim
exigir. Logo a unidade poderá ser modificada para continuar atendendo a premissa de a incerteza ser
representada por dois (2) algarismos significativos.
Os cálculos dos resultados analíticos e da incerteza de medição analítica, realizados na planilha
PLN/LACQSA/BH/057 ‘‘Resultado da determinação de carbamato de etila em bebidas destiladas de cana-deaçúcar’’ serão efetuados considerando todos os algarismos significativos e não serão arredondados até a
emissão do resultado final. Ao final, quando o resultado for reportado, será utilizada a mesma regra de
arredondamento realizado pelo EXCEL.
Os limites de detecção e quantificação serão representados nas mesmas condições descritas acima.
Considerar como NQ (não quantificado) resultados inferiores ao limite de quantificação do método, conforme
apresentado na Tabela 1 – “Parâmetros de desempenho do método”. Os limites de quantificação e de detecção
do método são respectivamente 20,0 g/kg e 13,0 g/kg.
A amostra que apresentar resultado maior que o limite da legislação deve ser reanalisada para confirmação.
Caso os resultados dêem diferentes (considerando a incerteza) repetir a análise.
Nota 04: os resultados da recuperação servirão para alimentar a planilha PLN/LACQSA/BH/038 “Carta controle
para monitoramentoi físico-quimica de bebidas”.
Nota 05: também serão monitorados em carta controle os resultados das áreas do padrão interno carbamato de
etila deuterado utilizados nas análises de rotina na planilha PLN/LACQSA/BH/038 “Carta controle para
monitoramentoi físico-quimica de bebidas”.
Reportar o resultado da análise caso os resultados obtidos dos controles analíticos estiverem dentro dos
critérios de aceitabilidade do método estabelecidos durante a validação e da CEE 657/2002 Tabelas 3, 4, como
as transições dos íons de quantificação e qualificação determinados, o tempo de retenção (Tabela 1) e a
intensidade relativa do íon diagnóstico (% do pico qualificador em relação ao quantificador) Tabela 2.
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espectrometria de massas
Se os resultados estiverem dentro dos critérios de aceitabilidade do método os resultados deverão ser
registrados no FOR/LACQSA/BH/062 “Reportagem de resultado analítico de físico-química de bebidas” que
deverá ter todos os campos não utilizados fechados e após verificação deverão ser encaminhados à URPA.
7.3
Eventualidades
Desvios dos procedimentos estabelecidos neste MET somente devem ocorrer se esses desvios estiverem
documentados, tecnicamente justificados e autorizados pelo Responsável e aceitos pelo cliente (conforme
descrito na norma ABNT NBR ISO/IEC 17025: 2005, página 13, item 5.4.2).
Em caso de trabalho de ensaio não conforme, registrar no FOR/LACQSA/BH/071 “Controle de trabalho de
ensaio não conforme (TNC)”, arquivar cópia em pasta específica na GTA e junto aos registros da análise em
questão. Referenciar o registro do TNC no campo de observações do formulário de acompanhamento de análise
FOR/LACQSA/BH 039 “Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres)”.
8.0 Responsabilidades
As atribuições e responsabilidades estão definidas na DS/LACQSA/BH/001 “Atribuições e Responsabilidades” e
na DS/LACQSA/BH/005 “Descrição de Função”.
9.0 Referências
BRASIL. Instrução Normativa no 31, de 29 de junho de 2005. Diário Oficial da União. Brasília, 30 de junho de 2005.
BRUNO, S. N. F. Adequação dos processos de destilação e de troca iônica na redução dos teores de carbamato de
etila em cachaças produzidas no estado do Rio de Janeiro. Tese de doutorado – UFRJ. 2006.
CEE 657/2002 (CCα e CCβ). Decisão da Comissão de 12 de agosto de 2002. Jornal Oficial da União Européia, L221,
pp 8-36, 17.08.2002.
Etanol: http://www.qca.ibilce.unesp.br/prevencao/produtos/etanol.html. Acesso outubro 2012.
IARC (2007-03-01
Feb2007.pd
http://www.apolnet.ca/resources/pubs/respapers/IARC-Vol96-AlcoholicBeverage
Consumption-
LACHENMEIER, D.W.; FRANK, W.; KUBALLA, T. Application of tandem mass spectrometry combined with gas
chromatography to the routine analysis of ethyl carbamate in stone-fruit spirits. Rapid Communicantions in Mass
Spectrometry.19, 108-112,.2005.
LACHENMEIER, D.W.; NERLICH, U.; KUBALLA, T. Automated determination of ethyl carbamate in stone-fruit spirits
using headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry. J.
Crhomatography A. 1108, 116 -120, 2006.
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Método de Ensaio – MET
Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
NIT-DICLA-030. Rastreabilidade metrológica ao sistema internacional de unidades na acreditação \de laboratórios e
no reconhecimanto da conformidade aos princípios das BPL. revisão 04; página 1-5, jul 2011.
Relatório do plano de estudo 073- Análise e carbamato de etila em cachaça. MAPA- LACQSA. 06/07/2012.
10.0 Documentos referenciados
IP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de material
IS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções)
POP/DLAB/PL/001-Inventário e Especificação de Materiais de Consumo
POP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratório
POP/LACQSA/BH/009-Garantia da qualidade analítica
POP/LACQSA/BH/011-Validação de métodos analíticos
11.0 Anexos referenciados
DS/LACQSA/BH/001-Atribuições e responsabilidades
DS/LACQSA/BH/005-Descrição de Função
DS/LACQSA/BH/011-Aquisição de materiais de consumo
FOR/LACQSA/BH/006-Controle de lotes de insumos para análise
FOR/LACQSA/BH/021-Solicitação de material de consumo
FOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostras
FOR/LACQSA/BH/025-Soliciação de material ao preparo
FOR/LACQSA/BH/039-Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres)
FOR/LACQSA/BH/044-Controle de injeção do padrão carbamato de etila
FOR/LACQSA/BH/053-Verificação de desempenho do cromatógrafo gasosos acoplado ao detector
de massas triplo quadrupolo (CG-QQQ)
FOR/LACQSA/BH/061-Registro de amostras para análises fisico-químicas de bebidas
FOR/LACQSA/BH/062-Reportagem de resultados analíticos de físico-química de bebidas
FOR/LACQSA/BH/071-Controle de trabalho de ensaio não conforme (TNC)
FOR/LACQSA/BH/118-Controle de injeções do cromatógrafo gasoso acoplado ao detector de
massas Agilent (CG-QQQ)
FOR/LACQSA/BH/137-Controle de reagentes, solventes e soluções para análises físico-químicas de
bebidas
PLN/DLAB/PL/007-Lista de Materiais de Consumo por Procedimento
PLN/LACQSA/BH/038-Carta controle para monitoramento físico-químico de bebidas
PLN/LACQSA/BH/057-Resultado da determinação de carbamato de etila em bebidas destiladas de
cana-de-açucar
12.0 Informações de registro
Controle de injeções do cromatógrafo gasoso acoplado ao detector de massas Agilent (CG-QQQ) FOR/LACQSA/BH/118
Acompanhamento de análises de bebidas (carbamatode etila + congêneres) - FOR/LACQSA/BH/039
Aprovado por:
Eugênia Azevedo Vargas
Nilson César Castanheira Guimarães
Verificado por:
Roseane Brandão de Brito
Elaborado/Revisado por: Anelise Lapertosa Drummond
Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques
Cópia não controlada
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Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA Código: MET/LACQSA/BH/012 - V.1
Laboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/MG
Fase: Vigente
Divisão Técnica Laboratorial - DLAB / Laboratório de
Aprovado em: 01/09/14
Controle de Qualidade e Segurança Alimentar - LACQSA/BH
Método de Ensaio – MET
Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
Carta controle para monitoramento físico-química de bebidas - PLN/LACQSA/BH/038
Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024)
Controle de injeção do padrão de carbamato de etila - FOR/LACQSA/BH/044
Controle de lotes de insumos para análise (FOR/LACQSA/BH/006)
Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas - FOR/LACQSA/BH/137
Controle de trabalho de ensaio não conforme (TNC) (FOR/LACQSA/BH/071)
Lista de Materiais de Consumo por Método de Ensaio/Procedimento Operacional Padrão/Instrução de
Serviço/Instrução de Preparo/Instrumento de Medição/Plano de Estudo (PLN/DLAB/PL/007)
Registro de amostra para análises físico-químicas de bebidas (FOR/LACQSA/BH/061)
Reportagem de resultado analíticos de físico-química de bebidas - FOR/LACQSA/BH/062
Resultado da determinação de Carbamato de Etila em bebidas destiladas de cana-de-açúcar _
PLN/LACQSA/BH/057
Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025)
Solicitação de material de consumo (FOR/LACQSA/BH/021)
Verificação de desempenho do cromatógrafo gasosos acoplado ao detector de massas triplo quadrupolo
(CG-QQQ)-FOR/LACQSA/BH/053
13.0 Arquivos anexados
14.0 Controle de alterações
Este MET foi elaborado a partir do POP 110, conforme o sistema de gestão da qualidade do LACQSA/BH
vigente na época, com o seguinte histórico de revisão:
Revisão
Data
Responsável
Descrição
00
10.10.2012
Anelise L. D.
Eugênia A. V.
Elaboração do POP.
01
25.09.2013
Anelise L. D.
Eugênia A. V.
- Alteração dos títulos dos itens 1, 2.1 e 2.2;
- O item 3.1 Equipamentos foi dividido em 3.1.1 Equipamentos críticos e
3.1.2 Equipamentos de suporte;
- O item 3.1 foi colocado a definição de material critico e atualizados
equipamentos
- O item 3.2 Materiais foi dividido em 3.2.1 Vidrarias em geral, 3.2.2
Materiais de suporte e 3.2.3 Materiais específicos para quantificação por
CG-MS-MS;
- No item 3.2 foi colocado a definição de material critico e atualizados os
matérias dos sub-itens 3.2.1 Vidrarias em geral, 3.2.2 Materiais de suporte
e 3.2.3 Materiais específicos para quantificação por CG-MS-MS;
- No item 3.5.1 alteração na redação do preparo da solução de etanol 40 %;
- O item 4.4 Reagentes foi alterado o titulo para Reagentes e solventes;
- Alteração do item 3.10 Reportagem de resultado incluindo decisões
tomadas na análise critica 067/2013.
Aprovado por:
Eugênia Azevedo Vargas
Nilson César Castanheira Guimarães
Verificado por:
Roseane Brandão de Brito
Elaborado/Revisado por: Anelise Lapertosa Drummond
Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques
Cópia não controlada
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Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA Código: MET/LACQSA/BH/012 - V.1
Laboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/MG
Fase: Vigente
Divisão Técnica Laboratorial - DLAB / Laboratório de
Aprovado em: 01/09/14
Controle de Qualidade e Segurança Alimentar - LACQSA/BH
Método de Ensaio – MET
Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a
espectrometria de massas
Controle de alterações do MET/LACQSA/BH/012
Versão
Data
Responsável
00
13/02/2014
Anelise L. Drummond
Descrição
- Inserido no software Docnix módulo MaxDoc.
Aprovado por:
Eugênia Azevedo Vargas
Nilson César Castanheira Guimarães
Verificado por:
Roseane Brandão de Brito
Elaborado/Revisado por: Anelise Lapertosa Drummond
Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques
Cópia não controlada
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