Universidade Camilo Castelo Branco
Programa de Pós Graduação em Produção Animal
EDSON FERREIRA DE SOUZA
COMPARAÇÃO DE TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO DE Pseudomonas
fluorescens EM Brachiaria decumbens spp PARA AVALIAÇÃO DE
CRESCIMENTO VEGETATIVO
COMPARISON OF TECHNIQUES IN inoculation of Pseudomonas fluorescens spp
Brachiaria decumbens FOR ASSESSMENT OF GROWTH VEGETATIVE
Descalvado, SP
2014
ii
Edson Ferreira de Souza
COMPARAÇÃO DE TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO DE Pseudomonas
fluorescens EM Brachiaria decumbens spp PARA AVALIAÇÃO DE
CRESCIMENTO VEGETATIVO
Orientadora: Prof. Dra. Käthery Brennecke
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produção Animal da Universidade
Camilo Castelo Branco, Campus de Descalvado, como complementação de crédito para obtenção do título de
Mestre em Produção Animal.
Descalvado, SP
2014
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
iv
v
Aparecida Augusta de Souza, Francisco Ferreira de Souza
Dedico
vi
AGRADECIMENTOS
Á Deus, pela oportunidade de concluir essa etapa na minha vida.
A Universidade Camilo Castelo Branco pelo incentivo aos estudos, acreditando na difusão do
conhecimento, proporcionando o mestrado aos alunos do Estado de Rondônia.
Ao professora Dr. Käthery Brennecke, pela orientação, compreensão, amizade e incentivo, e que
juntamente a UNICASTELO, acreditaram na turma do mestrado.
Aos professores do curso de Mestrado pelas valiosas contribuições, tanto profissionalmente
como pessoalmente;
Aos parentes Francisco F. Souza, Aparecida A. Souza, Edinilson F. Souza, Edneia F. Souza,
Edlaine F. Souza, Edsandra F. Souza.
Aos amigos Juliana Pereira da Silva, Jaqueline Pereira da Silva, Carlos Henrique, Zêni
Lehrbach Martins e Cíntia, pelos momentos vividos.
A banca examinadora, pelas prestimosas contribuições para a conclusão deste trabalho.
E a todos aqueles que de alguma forma colaboraram para realização deste trabalho.
Aos graduandos de Agronomia da Unicastelo, e iniciação científica, Alexandre Antoniazzi e
Fabiana Aparecida Assoni, pelo auxílio na parte experiemental deste trabalho, o meu muito
obrigado.
A todos que de alguma forma direta ou indireta contribuíram para que este sonho se tornasse
realidade.
vii
Tudo o que um sonho precisa para
Ser realizado é alguém que acredite
Que ele possa ser realizado
¨Roberto Shinyashiki¨
viii
SOUZA, E. F. Comparação de técnicas de inoculação de Pseudomonas fluorescens em
Brachiaria decumbens spp para avaliação do crescimento vegetativo.
RESUMO
A possibilidade de se incorporar às práticas agronômicas a aplicação de microrganismos
como inoculantes, vem sendo uma alternativa para se aumentar a produtividade das espécies
cultivadas, principalmente no que se refere as pastagens, pois permite reduzir o uso de
fertilizantes químicos e de pesticidas, a exemplo da Pseudomonas fluorescens, que tem se
destacado como potentes colonizadoras da rizosfera. O objetivo deste trabalho foi comparar
dois métodos de inoculação de Pseudomonas fluorescens e avaliar o crescimento e
desenvolvimento de Brachiaria decumbens. O experimento foi realizado em vasos de
polipropileno de 8l (litros) e constou de três tratamentos (sem inoculação, com inoculação na
água de irrigação e com inoculação na semente) e 10 repetições cada. As bactérias
Pseudomonas fluorescens linhagem CCMA-110 foram fornecidas pelo banco de
germoplasma da Embrapa Meio Ambiente. As sementes receberam o inóculo de cada um dos
64 isolados bacterianos cultivados em tubos de ensaio com meio B sólido por 24 horas. Na
semeadura foram utilizadas dez sementes por vaso, e após a germinação, deixado cinco
plantas homogêneas por vaso. As avaliações ocorreram logo após a emergência das plântulas
em intervalos de observações a cada 48 horas durante 45 dias. Em relação aos parâmetros de
crecimento vegetativo tanto para taxa de alongamento foliar (TAIF), quanto para senescência
foliar (SF) e perfilhamento de Brachiaria decumbens, verificou-se que não houve diferença
significativa entre os métodos de inoculação de Pseudomonas fluorescens seja via irrigação,
seja via sementes. Pode-se observar ainda para inoculação via irrigação que os dias para
senescência apresentaram inferioridade em relação a inoculação via semente, de 0,47cm.dia1
.perfilhos-1. Para TAIF a maior média foi para as plantas que foram submetidas a inoculação
via semente, de 1,85mm.dia-1.perfilho-1. A inoculação de Pseudomonas fluorescens em
Brachiaria decumbens via irrigação quando comparado com o controle, pode se observar que
a TAIF foi que apresentou maior resultado. Porem a inoculação via semente foi o tratamento
de melhor resultado comparado com o controle.
Palavras-chave: Inoculante, Microrganismo, perfilhamento
ix
SOUZA, E. F. Comparison of inoculation techniques of Pseudomonas fluorescens in
Brachiaria decumbens spp for growth assessment vegetative. Advisor: Prof.. Dr. Käthery
Brennecke.
ABSTRACT
The possibility of incorporating agronomic practices the application of microorganisms as
inoculants, has been an alternative to increasing the productivity of cultivated species,
especially as regards the pastures, it allows reducing the use of chemical fertilizers and
pesticides, such Pseudomonas fluorescens, which has emerged as a powerful colonizing the
rhizosphere. The objective of this study was to compare two methods of inoculation of
Pseudomonas fluorescens and evaluate the growth and development of Brachiaria decumbens.
The experiment was conducted in pots polypropylene 8l (l) and consisted of three treatments
(uninoculated, inoculated in irrigation water and inoculated in the seed) and 10 repetitions
each. Pseudomonas fluorescens bacteria strain CCMA-110 were provided by the germplasm
bank of Embrapa Environment. Seeds were inoculum of each of the 64 bacterial isolates
grown in test tubes with solid medium B for 24 hours. The sowing ten seeds per pot were
used, and after germination, homogeneous left five plants per pot. Assessments occurred
shortly after seedling emergence observations at intervals of every 48 hours for 45 days. For
parameters of vegetative crecimento both leaf elongation rate (TAIF), and for leaf senescence
(SF) and tillering of Brachiaria decumbens, it was found that there was no significant
difference between the methods of inoculation of Pseudomonas fluorescens is via irrigation
either via seeds. One can also observe that for inoculation by irrigation day to senescence
showed inferiority to seed inoculation, 0.47-cm.dia 1.perfilhos-1. To TAIF the highest
average was for plants that seed inoculation, 1.85-mm.day 1.perfilho-1 were submitted.
Inoculation of Pseudomonas fluorescens in Brachiaria decumbens by irrigation when
compared with the control, it can be seen that the TAIF was presented the highest result.
However the seed inoculation treatment had the best result compared with the control.
Keywords: Inoculum, Micro Organism, tillering
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Placa de Petri contendo colônias de bactérias Pseudomonas fluorescens..
32
Figura 2.
Placa de Petri, previamente esterilizadas...................................................
32
Figura 3.
Repicagem nas placas de Petri...................................................................
33
Figura 4.
Da direita para esquerda, diluições 10 -1, 10 -2 e 10-3..................................
35
Figura 5.
Colônias bacterianas de Pseudomonas fluorescens....................................
36
Figura 6
Sementes de Brachiaria decumbens em soluções bacterianas...................
37
Figura 7.
Marcação de plantas a serem medidas.......................................................
41
Figura 8.
Medição das plantas com uso de trena.......................................................
41
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Características químicas do solo utilizado no experimento.....................
33
Tabela 2.
Resultados das comparações múltiplas dos parâmetros de crescimento
vegetativo de Brachiaria decumbens quanto a Taxa de Alongamento
Foliar (TAIF), a Senescência Foliar (SF), a Taxa de Alongamento do
Colmo (TAIC), a Taxa de Aparecimento Foliar (TApF) e
perfilhamento, submetida a diferentes vias de inoculação de
Pseudomonas fluorescens (Descalvado-SP, janeiro/2014)......................
44
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABC- Agricultura de Baixo Emissão de Carbono.
BPCPs- Bactéria Promotora de Crescimento Plantas.
IPEAN- Instituto Agropecuário do Norte.
RPCPs- Risobacteria Promotora de Crescimento Plantas.
SF- Sanescência Foliar.
TAIF- Taxa de Alongamento Foliar.
TAIC- Taxa de Alongamento de Colmo.
TApF- Taxa de Aparecimento Foliar.
xiii
SUMÁRIO
Pág
1 - INTRODUÇÃO ...........................................................................................................
15
1.1 Objetivo Geral ....................................................................................................
16
1.2 Objetivos Específicos .........................................................................................
16
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................
17
2.1 Planta Forrageira Braquiaria sp........................................................................
19
2.2 Exigências Nutricionais das Brachiarias sp.......................................................
24
2.3 Bacterias Promotoras de Crescimento ..............................................................
25
2.3.1 Inoculante Pseudomonas fluorencens ............................................................
27
3 - MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................................
29
3.1 Delineamento e caracterização do solo .............................................................
29
3.1.1 Calagem e Adubação ......................................................................................
30
3.1.2 Capacidade de Campo do Solo .......................................................................
30
3.2
Processos
laboratoriais
e
técnicos
para
a
condução
do
experimento...............................................................................................................
31
3.2.1 Esterilização do Solo .......................................................................................
31
3.2.2 Meio de cultura para Bacteria Pseudomonas fluorencens...............................
31
3.2.3 Repicagem das bactérias .................................................................................
33
3.2.4 Quantificação das Populações Bacterianas......................................................
33
3.2.5 Procedimentos Laboratoriais para Testemunha ..............................................
35
3.2.6 Procedimentos Laboratoriais para Tratamento de Inoculação de Pseudomas
as sementes ...............................................................................................................
35
3.2.7 Procedimentos para o tratamento de Inoculação da Pseudomonas na
Semente através da Água de Irrigação......................................................................
37
3.3 Plantio em vasos e medidas................................................................................
37
3.4 Análise Estatística ..............................................................................................
39
xiv
4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................
40
5 - CONCLUSÕES.........................................................................................................
44
REFERÊNCIAS..............................................................................................................
45
15
1.INTRODUÇÃO
A agricultura convencional tem causado impactos ambientais consideráveis, e portanto, há
uma tendência em mudar certas técnicas agrícolas por outras consideradas mais limpas para o
meio ambiente, visto que hoje em dia a preocupação com o meio ambiente tem levado ao
desenvolvimento de técnicas ambientalmente corretas dentro do contexto da produção animal.
Fato esse que o governo brasileiro, através do BNDS e Banco do Brasil, financiam
projetos para a produção e recuperação de pastagem com baixa emissão de carbono, através
do programa ABC (Agricultura de Baixa Emissão de Carbono).
Acredita-se que uma importante estratégia, para atender essa questão, consiste na
inoculação das sementes de Brachiaria com bactérias promotoras de crescimento vegetal, que
já possuem comprovado efeito benéfico em gramíneas.
Desde os anos 50, existem relatos sobre o aumento no crescimento e produção de
plantas, utilizando Rizosbactérias Promotoras de Crescimento Plantas (RPCPs).
O uso de inoculantes com microorganismos RPCPs, consiste em uma alternativa para
melhoria às condições de crescimento, com crescimento da produção agrícola, diminuição da
utilização de agrotóxicos e produtos químicos.
Dentre tais bactérias, a Pseudomonas fluorescens, que se destacam como potentes
colonizadoras da rizosfera, é uma alternativa para reduzir custos e diminuir riscos ambientais
causados por fertilizantes (ZUCARELI et al., 2011).
Esse efeito benéfico da inoculação de bactérias Pseudomonas fluorescens pode afetar
diretamente a qualidade das pastagens, e sua produtividade pode ser avaliada decorrente da
contínua emissão de folhas e perfilhos, que é um processo importante da restauração da área
foliar sob condições de pastejo ou corte (BIRCHAM; HODGSON, 1983).
A produtividade de uma gramínea decorre da contínua emissão de folhas e perfilhos,
processo importante após o corte ou pastejo para restaurar a área foliar da planta e permitir a
perenidade do pasto.
Entender características morfogênicas permite visualizar curvas de produção e
consiste em uma possibilidade de alterações às práticas de manejo, devido as informações
intrínsecas a acúmulos de forragem, estimativa de qualidade e crescimento da pastagem.
Com base no contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o crescimento e
desenvolvimento de Brachiaria decumbens submetida a dois métodos de inoculação de
16
Pseudomonas fluorescens, em relação a resposta do desenvolvimento vegetativo da espécie,
visando produtividade por área planta, aumentando a oferta da base nutricional a pasto para
bovinos de corte em sistema de produção semi e extensivo.
1.1 Objetivo Geral
Comparar metodologias (por água de irrigação e diretamente na semente) de inoculação de
Pseudomonas fluorescens em função do crescimento vegetativo de Brachiaria decumbens.
1.2 Objetivos Específicos
Aferição das taxas de alongamento de folha, alongamento de colmo, taxa de aparecimento
foliar, número de perfilhos e senescência foliar da cultura de Brachiaria decumbens quando
submetida as diferentes métodos de inoculação com Pseudomonas fluorescens.
17
2.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O Brasil é o quinto maior país do mundo em território, com 8,5 milhões de km2 de extensão,
com cerca de 20% da sua área (174 milhões de hectares) ocupada por pastagens. Apesar de
ser um país predominantemente tropical, possui uma grande variabilidade climática,
refletindo nos regimes pluviométricos e conseqüentemente nos sistemas de produção
pecuários. Como a maior parte do rebanho de 209 milhões de cabeças é criada a pasto
(estima-se que somente 3% do rebanho são terminados em sistema intensivo), as chuvas
interferem diretamente na qualidade das pastagens e, portanto, na oferta e preço do gado de
região para região (ABIEC, 2013).
O rebanho bovino brasileiro proporciona o desenvolvimento de dois segmentos
lucrativos. As cadeias produtivas da carne e leite. O valor bruto da produção desses dois
segmentos, estimado em R$ 67 bilhões, aliado a presença da atividade em todos os estados
brasileiros, evidenciam a importância econômica e social da bovinocultura em nosso país
(MAPA, 2013).
No Brasil, as pastagens cultivadas são à base da produção animal, cobrindo extensas
áreas, estimadas em cerca de 180 milhões de hectares e mais de 85% ocupadas com capins do
gênero Brachiaria (MACEDO, 2006). Como resultado dessa extensão tem-se um processo
contínuo e gradual de degradação das pastagens.
A degradação de pastagens pode ser vista como o processo evolutivo de manejo
inadequado, de perda de vigor, de produtividade, de capacidade de recuperação natural da
espécie contra pastejo contínuos, assim como o de superar os efeitos nocivos de pragas,
doenças e plantas daninhas, culminando com a degradação (ALBUQUERQUE et al. 2001;
MACEDO, 2001).
A degradação das pastagens é o fator mais importante, na atualidade, que compromete
a sustentabilidade da produção animal, e pode ser explicada como um processo dinâmico de
degeneração ou de queda relativa da produtividade (MACEDO; ZIMMER, 1993; ZIMMER et
al. 1994; MACEDO, 1999, 2000, 2001a). Dentre os fatores mais importantes relacionados
com a degradação das pastagens destacam-se o manejo animal inadequado e a falta de
reposição de nutrientes. A lotação animal excessiva, sem os ajustes para uma adequada
capacidade de suporte, e a ausência de adubação de manutenção têm sido os aceleradores do
processo de degradação (MACEDO, 2009).
18
Cerca de 60 % das áreas de pastagem apresentam algum grau de degradação em
função do manejo inadequado e uma alternativa para renovação de pastagens é por meio do
consórcio com culturas anuais (FREITAS et al. 2005). Tal degradação provoca queda na
produtividade animal, desgaste do solo e perda de suas propriedades físicas, gerando efeitos
deletérios no ambiente, como a compactação e a erosão (MACEDO; ZIMMER, 1993).
As pastagens de gramíneas forrageiras constituem o principal e o mais barato
componente da dieta de bovinos e, como tal, são a base alimentar da pecuária de corte no
Brasil. Todavia, grande parte das pastagens está na região dos Cerrados, em áreas de menor
fertilidade, explorada de maneira extrativista predatória e, em conseqüência, em processo de
degradação. Essa situação tem contribuído para que a pecuária de corte apresente índices
zootécnicos baixos, com lotação das pastagens em torno de 0,5 UA/ha (UA = 450 kg peso
vivo) e média de produtividade de 100 kg/ha/ano de peso vivo (PRIMAVESI et al., 2012).
O diferimento da pastagem, desde que essa não esteja degradada, tem permitido
aumentar a lotação animal e garantido a sobrevivência dos animais durante o período de seca.
No entanto, as gramíneas C4, que constituem os pastos tropicais, exibem alterações
em suas características morfológicas e químicas, associadas ao desenvolvimento, à
maturidade fisiológica e senescência natural da planta forrageira, que alteram a qualidade e a
disponibilidade de forragem e a estrutura do relvado, influenciando o consumo e o
desempenho dos animais (EUCLIDES et al., 1990; BLASER, 1994; GOMIDE, 1997).
O estudo da morfofisiologia em gramíneas forrageiras vem ao encontro às de
estratégias de manejo dos ruminantes e a fonte de alimentação mais econômica nos sistemas
pecuários (SKONIESKI et al., 2011).
A dinâmica do aparecimento das folhas e perfilhos consituem componentes do produto
básico almejado quando se pensa em produção de forragem, da qual a morfogênese visa
acompanhar esse tipo de estudo (RODRIGUES, 2008).
Segundo Chapman e Lemaire (1993), a morfogênese pode ser definida como o
aumento do corpo da planta no espaço (morphos) e a sua geração (genesis), ou seja, em
relação a sua expansão de forma e a geração de novos órgãos.
Grant e Marriot (1994) observaram que o conhecimento das taxas de aparecimento,
alongamento e senescências foliares e de perfilhamento, é fundamental para a interpretação do
acúmulo de forragem de um determinado sistema de manejo.
Atualmente, a pecuária moderna exige a máxima produção econômica de forragem
com qualidade, com respeito ao meio ambiente. Para isso, uma saída racional para a
19
exploração agrícola em bases sustentáveis seria “adaptar a planta ao solo” a partir do uso de
culturas/cultivares que sejam eficientes no processo de formação de colheita “fazendo mais
com menos”. Nas últimas décadas, especialmente nos anos 90, a produção agrícola tem
aumentado; entretanto, a aplicação de fertilizantes diminuiu, o que poderia ser explicado pela
maior eficiência de uso de nutrientes pelas culturas (EPSTEIN; BLOOM, 2006).
A agricultura moderna tem enfrentado o grande desafio de aumentar a produção das
plantas cultivadas, incluindo as plantas forrageiras, e gerar sustentabilidade, baseando-se em
enfoque que visa à proteção ambiental e, para atingir esse objetivo, uma das alternativas é a
utilização de microrganismos promotores de crescimento vegetal. A capacidade de estimular
o crescimento vegetal apresentada por esses organismos tem sido atribuída a mecanismos
diretos, tais como a fixação do nitrogênio, produção de fitohormônios, e indiretos como
antagonismo em relação a patógenos levando, consequentemente, ao aumento na taxa de
germinação, crescimento das raízes e parte aérea, número de folhas e flores, área foliar e
rendimento de culturas (SILVEIRA, 2001; MARIANO et al. 2004).
2.1.
Planta Forrageira Brachiaria sp.
O gênero Brachiaria (Trininus) Grisebach, pertencente a família botânica Poaceae ou
Gramineae, cujo nome faz uma alusão aos seus racemos armados, é uma gramínea perene ou
anual; ereta ou decumbente; entouceirada, rizomatosa, com enraizamento nos nós inferiores
em contato com o solo, denso pubescente, de coloração geralmente verde-escura, de 30 a 90
centímetros de altura. Suas espiguetas são solitárias, raramente aos pares, subsésseis,
organizadas em duas linhas; as lemas férteis possuem arestas reduzidas e tombadas
(HITCHCOCK, 1935; LORENZI, 2000).
É o mais cultivado em áreas de pastagens no Brasil, sendo intensamente usado na cria,
recria e engorda dos animais. O seu sucesso na produtividade pecuarista é consequência do
manejo adequado. O grande interesse dos pecuaristas pelas espécies de Braquiárias se prende
ao fato destas espécies serem plantas com alta produção de matéria seca, por possuírem boa
adaptabilidade, facilidade de estabelecimento, persistência e bom valor nutritivo; além de se
apresentarem resistentes às doenças e satisfatório crescimento durante a maior parte do ano,
inclusive no período seco (COSTA et al., 2005).
O gênero Brachiaria é atualmente conhecido taxonomicamente como gênero
Urochloa (SILVA, 2000). Devido a tal mudança, a espécie B. decumbens é agora denominada
20
Urochloa decumbens.. Desde a década de 50, as gramíneas do gênero Brachiaria são
conhecidas no Brasil. Entretanto, apenas nas décadas de 70 e 80 a sua expansão foi de fato
significativa, substituindo as gramíneas tradicionalmente cultivadas como o capim gordura e o
Jaraguá, principalmente nas regiões onde há predomínio de clima quente (ZIMMER et al.
1988). Mais da metade das pastagens presentes no país hoje são baseados em braquiárias, uma
área de aproximadamente 100 milhões de hectares (ANUALPEC, 2008).
O gênero Brachiaria é típico do estádio clímax das pradarias na África e impõe uma
série de formas de interferência sobre o crescimento de plantas de porte arbóreo e arbustivo.
Assim, hoje, as espécies de Brachiaria constituem as principais plantas invasoras das culturas
florestais e de pomares de fruteiras tropicais e sub-tropicais; além de constituírem um
importante fator de redução da biodiversidade em reservas de formações vegetais naturais
(PITELLI; PAVANI, 2005).
Este gênero é representado principalmente pelas espécies B. brizantha, B. decumbens e
B. humidicola, é responsável por cerca de 80% de toda a área de pastagens cultivadas no
Brasil (HODGSON; SILVA, 2002). A facilidade na aquisição de sementes de boa qualidade,
boa tolerância a solos de baixa fertilidade, rápido estabelecimento, alta competição com
plantas invasoras e boa eficiência na proteção do solo contra a erosão contribuíram para a
rápida disseminação dessas espécies.
No Brasil, até hoje foram encontradas 16 espécíes deste gênero, das quais cinco são
nativas, três foram provavelmente introduzidas há várias décadas, sendo, portanto
consideradas como nativas, e sete, sendo cultivadas como forrageiras (SENDULSKY ,1977).
Dentre as espécies do gênero que mais se difundiram nas pastagens estão a Brachiaria
decumbens, B. humidicola, B. arrecta, B. brizantha, B. ruziziensis, B. mutica e o hibrido B.
arrecta x B. mutica (Tangola). As plantas deste gênero se adaptam bem a varias condições de
clima, mas sua expansão se deu principalmente devido a sua grande adaptabilidade aos
diversos tipos de solos, com baixa e média fertilidade, presentes nas terras do Brasil, onde
apresentaram boa produtividade (ZIMMER et al, 1988).
A Brachiaria decumbens Stapf foi trazida da África e introduzida no Brasil pelo
Instituto de Agropecuária do Norte (IPEAN) em 1952 sob o nome Brachiaria brizantha Stap.
Em 1965, o material da mesma espécie foi adquirido do Suriname, desta vez como B.
decumbens. Ambos os materiais introduzidos pertenciam a espécie B decumbens, tratando-se
de materiais distintos de B. bryzantha, que também foi introduzida em 1965 (MILLES et al.,
1998). Sua dispersão ocorreu rapidamente, parte por ação do homem, que expandiu suas áreas
21
de plantio com esta pastagem, e parte por agentes naturais de dispersão, incluindo anemofilia
e zoofilia (PITELLI; PAVANI, 2005).
Se adaptou muito bem, principalmente nas áreas dos cerrados. A espécie é vigorosa e
perene. É resistente à seca, adaptando-se bem em regiões tropicais úmidas. É pouco tolerante
ao frio e cresce bem em diversos tipos de solo, porém, requer boa drenagem e condições de
média fertilidade, vegetando bem em terrenos arenosos e argilosos. Os melhores resultados
são obtidos quando se usam 2 a 5 kg de sementes puras e viáveis (1 kg de sementes tem cerca
de 220.000 a 225.000 sementes) por hectare (VILELA, 2013).
A morfologia de B. decumbens é bem variável, mesmo entre as suas variedades
cultivadas. A planta introduzida em Belém via estados Unidos, é decumbente ou rasteira com
30 a 60 centímetros de altura, radicante nos nós em contato com o solo, de folhas macias e
felpudas, com escassa produção de sementes. Já a variedade introduzida em São Paulo, via
Austrália, apresenta-se como uma planta com cerca de 1 metro de altura, mais ereta, pouco
radicante a partir de nós; rizomas muito curtos, contidos nas touceiras; folhas rígidas e
esparsamente pilosas; com grande produção de sementes (LORENZI, 2000).
A B. decumbens é caracterizada como uma gramínea perene, estolonífera, de hábito de
crescimento de semi-ereto a prostrado. Pode alcançar de 30 a 100 cm de altura. Suas raízes
são fortes e duras, com presença de pequenos rizomas. Os colmos são de formato cilíndrico a
ovalados, podendo ser eretos ou decumbentes de coloração verde escura, glabros ou pilosos,
com a presença de seis a 18 entrenós medindo em média 20 centímetros. Os nós são verdes,
glabros ou pouco pilosos. As folhas medem entre 20 a 40 centímetros de comprimento e de 10
a 20 milímetros de largura, fortemente pilosas. Suas bordas são ásperas e duras. Estas são de
coloração verde escura, principalmente durante o seu primeiro ano de implantação, devido ao
seu alto conteúdo de clorofila (OLIVEIRA et al, 2006).
Lorenzi (2000) comenta que em geral, os colmos de B. decumbens são geniculados,
ramificados, hirtusos ou glabros, sendo os nós sempre glabros e de coloração mais escura.
Entrenós inferiores curtos e entrenós superiores mais longos. No sistema basal ocorrem dois
tipos de rizomas (1) curtos, duros e nodosos e (2) alongados, também duros, de tipo
estolonífero. As raízes são filamentosas.
As folhas são em bainhas estriadas, mais compridas que os entrenós, envolvendo
completamente o colmo. Possui lígulas em forma de densa cortina de cílios com cerca de 1
mm de altura. As lâminas são lanceoladas ou linear-lanceoladas, de base arredondada e ápice
acuminado, com até 18 cm de comprimento por 1,5 cm de largura; hirtusas em ambas as
22
faces; margens espessas, finamente crenuladas em certos trechos. A planta é bastante
enfolhada. Na parte terminal dos colmos surgem panículas racemosas com 2 a 5 racemos
distanciados entre si, que se dispõe de forma ascendente. O eixo das panículas estende-se um
pouco além do último racemo. Podem ocorrer finos dentículos e alguns pêlos, especialmente
junto à base dos racemos, que apresentam de 2 a 12 cm de comprimento, com duas fileiras de
espiguetas que se sobrepõem levemente, de um lado da raque, que é achatada e ciliada nas
margens. Possuem pedicelos com ápice discóide (LORENZI, 2000).
Segundo Oliveira et al., (2006), a inflorescência é em forma de panícula racemosa, de
25 a 47 centímetros de altura. É formada de dois a cinco racemos de 4 a 10 centímetros de
comprimento. As sementes são de tamanho médio, arredondadas e férteis, o que facilita a sua
disseminação. É uma espécie tetraplóide com 36 cromossomos.
Algumas características que diferenciam a B. decumbens das demais Brachiaria estão
em relação a parte morfológica, bem como nos seus hábitos. Ela pode chegar a 1,0 m de
altura. Suas Formas de uso estão relacionadas a pastejo e eventualmente produção de feno.
Quanto ao interesse por parte dos animais, possui digestibilidade e palatabilidade satisfatória.
Tem exigências de precipitação pluviométrica de 12.000 mm/ano. Em relação a tolerância a
insetos, é muito sensível à cigarrinha da pastagem. Possue capacidade de suporte de 2,0
UA/ha/ano média anual. Sua produção de forragem é de 8 a 12 t MS/ha/ano (VILELA, 2013).
Um ponto que deve ser considerado, é que alguns autores e relatos falam sobre a
intoxicação de animais quando alimentados de B. decumbens, causando fotossensibilização.
Quanto a essa intoxicação, são necessários mais estudos para elucidar o papel das saponinas,
na fotossensibilização hepatógena em bovinos a pasto e sua possível interação com Pytomices
chatarum e outros fungos (endófitos) que podem estar presentes na B. decumbens e outras
espécies de Brachiaria. Mesmo se a fotosensibilização em ruminantes e cavalos não é
causada primariamente pelo P. chatarum, a presença de esporos de fungo pode exacerbar a
toxidez (SMITH; MILES, 1993).
Quanto ao manejo das B. decumbens cultivadas, apresenta queda de produção quando
cultivada em solos de baixa fertilidade, por isso, recomenda-se consorciá-la com
leguminosas. Adapta-se bem na faixa de Latitude de 27° N e S. Altitude desde o nível do mar
até 1.750 m. A temperatura ótima para seu crescimento é de 30 a 35°C. Floresce em qualquer
lugar nos dias longos do ano (VILELA, 2013).
Originaria da África equatorial, a B. decumbens pode se desenvolver em solos férteis,
ácidos (pH aproximadamente 4,2), assim como em solos que são calcários e pedregosos com
23
pH próximo a 8,5. Também se estabelece em clima moderadamente úmido, porém não tolera
inundações prolongadas. Ao avaliar o comportamento da Brachiaria decumbens, Chamorro
(1998) determinou que esta gramínea alcançou uma cobertura de solo de 94% nas 13
primeiras semanas de seu estabelecimento, e 96% de cobertura à 22ª semana de
estabelecimento.
Um dos indicadores mais variáveis no comportamento dos pastos é a produção de
matéria seca, devido a essa característica ser afetada pelas condições de manejo a que são
submetidas as plantas: utilização ou não de irrigação, níveis de adubação, intensidade de uso,
corte ou pastejo, época do ano, idade do pasto, entre outros (OLIVERA et al, 2006). Devido a
estes fatores, diversos estudos vêm sendo realizados através dos anos, com o objetivo de obter
uma resposta aceitável para os diferentes ambientes. Segundo Goedert et al. (1988), a B.
decumbens pode alcançar uma produtividade anual entre 5 a 12 t/ha de matéria seca.
Com relação ao valor nutritivo, Gomes Júnior et al. (2001a) avaliaram a composição
químico-bromatológica da B. decumbens sob pastejo em Felixlândia- MG, e observaram que a
mudança da estação chuvosa para seca implicou em maturação do capim braquiária, com
redução dos carboidratos solúveis e aumento da fração não-degradável da parede celular,
acarretando perda de digestibilidade. Observaram também um reflexo semelhante sobre o teor
protéico, gerando nível global deficitário de proteína, agravado pela elevação concomitante da
fração indisponível dos compostos nitrogenados.
Gerardo e Oliva (1979) avaliaram 25 cultivares de gramíneas, sob irrigação e
adubação, sob corte mecânico e observaram uma produção de 19,5, 19,8 e 19,1 toneladas de
Matéria Seca por hectare, para Brachiaria decumbens, Panicum maximum cv. Uganda e
Panicum maximum cv. Makueni, respectivamente. Os mesmos autores observaram que em
condições de sequeiro a B. decumbens produziu 10,9 toneladas de MS/ha. Em trabalho
realizado por Santos et al. (2004a), no município de Felixlândia (MG), observou-se uma
disponibilidade de forragem durante o período seco (julho a setembro) de 8.418 kg/ha.
Analisando a produção de matéria seca em piquetes de Brachiaria decumbens, em
experimento realizado no município de Capinópolis, MG, Moraes et al. (2005), encontraram
produção média de 5.560 kg de MS/ha durante o período de agosto a setembro.
Savidan et al. (1985) ao estudar espécies de braquiárias como cultivo solteiro ou
associado com leguminosas, notaram que a Brachiaria decumbens mostrou uma maior
produção quando em cultura solteira (12 t MS/ha/ano), do que quando associada à
24
leguminosas. Resultados semelhantes foram encontrados por Mosquera et al. (1992) e
Velasco ( 2011).
Segundo Vilela (2006), a B.decumbens tem um bom desenvolvimento eficiente em
solo de baixa fertilidade, o sua época de plantio durante a estação chuvosa, forma de plantio a
lanço, sendo necessário 8-14 kg/ha em uma profundidade do solo em 2 cm, com tolerância
satisfatória a seca e ao frio, e se sobre sai com um bom desenvolvimento em solos mal
drenado, sua temperatura ideal para desenvolvimento varia entre 30 e 35°c, em uma latitude
cerca de 27° N e S, Latitude desde o nivel do Mar até 1.750 m. O seu tempo de utilização de
90 a 120 dias após o plantio. Dormência da semente inexistentes, com uma pureza mínima de
60% e Germinação mínima de 40%.
2.2 Exigências nutricionais da Brachiaria sp.
A fertilidade do solo e a idade fisiológica da planta atuam sobre o valor nutritivo, que é
avaliado pela digestibilidade e pelos seus teores de proteína e da parede celular, características
estreitamente relacionadas com o consumo de matéria seca (LEITE; EUCLIDES, 1994).
A aplicação de nutrientes em quantidades e proporções adequadas, particularmente o
N, é uma prática fundamental quando se pretende aumentar a produção de forragem. O N do
solo, proveniente da mineralização da matéria orgânica, não é suficiente para atender à
demanda das gramíneas de alto potencial de produção (GUILHERME et al., 1995).
As deficiências minerais podem ocorrer sob diversos graus, desde deficiências severas,
com perturbação mais ou menos características, até deficiências leves, com sintomas nãoespecíficos, como desenvolvimento lento, problemas de fertilidade, baixo rendimento da
carcaça e pouca produção de leite (PRADO, 2009).
A adubação das pastagens, principalmente a nitrogenada, é um dos fatores mais
importantes na determinação do nível de produção de forragem por unidade de área e os
maiores incrementos de produção ocorrem, de modo geral, na faixa de 300 a 400 kg/ha/ano de
N. A aplicação de uréia, fertilizante nitrogenado mais comum no mercado brasileiro, na
superfície do solo, pode causar perdas de N por volatilização de amônia (NH3). Vários
estudos de campo, no entanto, mostraram eficiência agronômica semelhante entre a uréia e
outras fontes de N não sujeitas a perdas de NH3 por volatilização (PRIMAVESI et al, 2012).
O efeito do N, no aumento da relação lâmina/colmo, é importante, pois o aumento da
proporção da lâmina foliar diminui o tempo de pastejo do animal para satisfazer suas
25
exigências. E ainda, avaliações agronômicas têm demonstrado que a qualidade do capim
aumenta com o uso de cultivares com maior relação folha/caule (BOVAL et al., 2002).
Entretanto, o vigor do caule influencia no número de gemas axilares, e, por sua vez, a
capacidade de perfilhamento é uma característica altamente desejável em plantas forrageiras.
O potencial de perfilhamento influencia na produção, na qualidade e na persistência das
espécies perenes. Dessa forma, maior número de perfilhos significa maior número de folhas e,
conseqüentemente, maior número de sítios para o desenvolvimento de perfilhos axilares
(JACQUES, 1994).
No início do estádio vegetativo, o conteúdo de proteína bruta e a digestibilidade in
vitro da matéria orgânica da B. decumbens são geralmente altos, entretanto, à medida que a
planta amadurece, há decréscimos nestes (EUCLIDES et al., 1996), e o baixo valor nutritivo,
então, pode-se tornar o principal limitante da produção animal.
2.3 Bactérias Promotoras de Crescimento
Os hormônios vegetais são reguladores naturais de crescimento das plantas, influenciando os
processos fisiológicos em baixas concentrações. Microrganismos endofíticos têm apresentado
a capacidade de estimular o crescimento das plantas por mecanismos diretos (fixação de N
e/ou produção de fitohormônios) e por mecanismos indiretos (antagonismo contra patógenos
ou resistência a drogas) (PEDRINHO, 2009).
Bactérias que crescem próximo às raízes e que são estimuladas pelos exsudatos
radiculares são chamadas de rizobactérias. Algumas dessas rizobactérias têm a capacidade de
promover o crescimento vegetal através de diferentes mecanismos quando inoculadas nas
sementes ou no solo e são, por isso, conhecidas como RPCPs (Rizobactérias Promotoras do
Crescimento de Plantas).
Geralmente o crescimento vegetal é aumentado porque as RPCPs solubilizam fosfatos
minerais ou outros nutrientes do solo e produzem ou alteram a concentração de hormônios
vegetais como ácido indolacético, ácido giberélico, citocininas e etileno, ou fixam nitrogênio
associativamente. As RPCPs também podem apresentar efeito sinergístico com a fixação
biológica de nitrogênio, no caso das leguminosas. Além de promover o crescimento vegetal,
as RPCPs também controlam organismos fitopatogênicos provenientes do solo ou das
sementes, especialmente fungos, através da produção de sideróforos, beta 1-3 glucanase,
quitinases, antibióticos e ácido cianídrico (CATTELAN, 1999).
26
As rizobactérias que habitam o solo e são promotoras do crescimento de plantas
(RPCPs) são com frequência isoladas da rizosfera de diversas plantas cultivadas. Entre os
gêneros mais estudados, destacam-se: Bacillus, Pseudomonas, Azospirillum e Rhizobium. Os
efeitos desses microrganismos sobre o desenvolvimento das plantas são amplos e incluem os
efeitos benéficos na germinação de sementes, emergência de plântulas e crescimento das
plantas (FIGUEIREDO et al., 2010).
A influência das rizobactérias no crescimento das plantas tem sido atribuída a efeitos
indiretos associados ao controle biológico de patógenos secundários (ARAUJO et al., 2005).
No entanto, em alguns trabalhos, a promoção de crescimento de plantas, por rizobactérias,
também tem sido relacionada à produção de fitohormônios e enzimas líticas (VASSILEV et
al., 2006).
As Bactérias Promotoras de Crescimento de Plantas (BPCPs) são residentes epifíticas
ou endofíticas, não patogênicas, que atuam diretamente promovendo o crescimento ou
indiretamente como agentes de controle biológico de doenças de plantas. Os efeitos benéficos
das BPCPs podem ser observados principalmente pelo aumento da área foliar, altura da
planta, diâmetro do caule, número de folhas e matéria seca, redução do tempo de aclimatação,
maior sobrevivência das mudas, controle de doenças e aumento da produtividade (MARIANO
et al., 2004).
A introdução de rizobactérias promotoras do crescimento de plantas no solo traz
benefícios diretos para a produção agrícola e, ao mesmo tempo, uma alternativa de cultivo
com menor uso de insumos agrícolas (SOTERRO, 2003), estas representam uma ampla
variedade de bactérias do solo que, em associação com as plantas hospedeiras, resultam na
estimulação de seu crescimento (PEREIRA et al., 2008).
Freitas (2007) menciona que as RPCPs constituem um grupo muito amplo de
microrganismos, uma vez que sob essa designação incluem-se quaisquer bactérias que vivam
na rizosfera e afetem beneficamente o crescimento de uma ou mais espécies vegetais.
Convencionalmente, entretanto, não têm sido incluídos os rizóbios enquanto fixadores de
nitrogênio, atividade que, embora benéfica ao desenvolvimento vegetal, resulta de uma
relação simbiótica com as leguminosas, interação que não é considerada para as RPCPs.
Essas bactérias tem sido estudadas em uma extensa variedades de plantas, incluindo
muitas de interesse agrícola, tais como, milho (ARAÚJO et al., 2000), trigo (LUZ, 2001),
feijão (SILVEIRA et al., 1995), citrus ( AMORIM; MELO, 2002), plantas ornamentais
(YUEN; SCHROTH, 1986), alface (FREITAS et al., 2003), citros (FREITAS; AGUILAR-
27
VILDOSO, 2004), árvores florestais (GARCIA et al., 2004), eucalipto (MAFIA et al., 2005),
entre outras.
Nesses casos citados, a promoção de crescimento está ligada a vários fatores, como
aumento na produção de grãos e no crescimento da planta, diminuição na incidência de
patógenos ou na severidade da doença, antecipação da idade de mudas para o campo, além de
outros. O efeito no crescimento da planta pode ser expresso tanto pela massa da matéria seca
de parte aérea ou raízes, como pela altura.
O tipo de solo e o tipo de planta são os principais fatores responsáveis pela diversidade
da comunidade de bactérias rizosféricas. Estudos mostram que a rizosfera de alface favorece o
desenvolvimento de bactérias fluorescentes do gênero Pseudomonas. Essa característica pode
ser decisiva na produção de inoculantes comerciais (COELHO et al., 2007).
2.3.1. Inoculante Pseudomonas fluorescens
Entre os grupos de bactérias do solo, as espécies do gênero Pseudomonas destacam-se por sua
grande versatilidade nutricional e pela habilidade de crescer em ampla variedade de ambientes
e substratos. São reconhecidas como Pseudomonas (stricto sensu) apenas as espécies que se
agrupam com P. aeruginosa e P. fluorescens no grupo I de homologia DNA-rRNA
(PALLERONI et al., 1973) e na subclasse g das Proteobactérias (WOESE, 1987), com pelo
menos 30 espécies validadas (FERREIRA et al., 2009).
Com base nas características fenotípicas, as espécies do gênero Pseudomonas do
grupo I DNA-rRNA são divididas em dois grupos distintos, segundo suas propriedades de
produzir pigmentos fluorescentes (pioverdinas) ou de acumular nas células inclusões de polia-hidroxibutirato (não-fluorescentes) (KIMURA; RIBEIRO, 1994). No entanto, muitas
dúvidas ainda permanecem quanto à taxonomia desse gênero. Em estudos recentes, o
rearranjo nomenclatural acarretou a criação de muitos novos agrupamentos gênicos a partir de
espécies anteriormente classificadas como Pseudomonas, como os Gêneros Comamonas
(TAMAOKA et al., 1987), Acidovorax (WILLEMS et al., 1990), Brevundimonas (SEGERS
et al., 1994) e Burkholderia (YABUUCHI et al., 1992).
Embora algumas espécies de Pseudomonas apresentem fitopatogenicidade, muitos
membros desse grupo, como as espécies P. fluorescens e P. putida, têm sido relacionados a
efeitos benéficos observados em plantas (JI et al., 2006), o que as caracteriza como
promissoras rizobactérias promot oras de crescimento de plantas (RPCPs). As rizobactérias
28
promotoras de crescimento de plantas (RPCPs) usam diferentes mecanismos para supressão
de patógenos de plantas e promoção de crescimento vegetal, como a competição por
nutrientes por meio da produção de sideróforos (DOBBELAERE et al., 2003), antibiose
(JETIYANON; KLOEPPER, 2002), síntese de hormônios vegetais como: auxinas (PICARD
& BOSCO, 2005), citocininas (ASLANTAS et al., 2007) e giberelinas (PROBANZA et al.,
2002) e fornecem nutrientes às plantas, como o nitrogênio, pela fixação biológica de
nitrogênio (DOBBELAERE et al., 2003).
Dentre as rizobactérias, bactérias do grupo P. fluorescens, tem-se destacado como
potentes colonizadoras da rizosfera (QUEIRÓZ et al., 2006). P. fluorescens têm seu
desenvolvimento influenciado por fatores como o tipo de substrato e o ambiente em que se
desenvolvem, bem como pela rizosfera em que estão estabelecidas (FREITAS; AGUILARVILDOSO, 2004). As Pseudomonas spp. fluorescentes são bactérias gram – negativas e
produzem um pigmento verde amarelado fluorescente, observado sob a luz com comprimento
de onda próximo do ultravioleta. Esses organismos podem ser encontrados na água e no solo.
As espécies mais importantes são Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas putida,
geralmente estudadas com o objetivo de avaliar a promoção de crescimento em plantas, e
Pseudomonas aeruginosa, considerada patogênica em animais. A diversidade metabólica de
bactérias do grupo fluorescente do gênero Pseudomonas dá a essas bactérias uma grande
habilidade de adaptação a vários ambientes, tais como solo e rizosfera (COELHO, 2006).
Embora algumas das espécies de Pseudomonas spp. fluorescentes sejam bem
conhecidas como fitopatógenos (como P. syringae), muitos membros deste grupo têm sido
considerados promissores como rizobactérias promotoras de crescimento em plantas (RPCPs),
pela produção de reguladores de crescimento vegetal e/ou outros metabólitos secundários
(sideróforos, β-1,3-glucanase, quitinases, antibióticos e ácido hidrociânico) que inibem
microrganismos deletérios, além da indução de resistência sistêmica nas plantas (FONSECA
et al., 2000).
A manipulação das comunidades microbianas para promover interações benéficas com
a planta, como a produção de fitohormônios, melhorar a disponibilidade de nutrientes e a
supressão natural de doenças causadas por fitopatógenos, tem exigido uma maior
compreensão sobre a influência dos fatores ambientais na dinâmica e atividade desses
microrganismos (MARSCHNER et al., 2004).
Sabe-se que as alterações antrópicas (adubações, produtos químicos, etc) podem
modificar significativamente a composição e a dinâmica ecológica microbiana do solo
29
(MÄDER et al., 2002; TU et al., 2006). Na rizosfera, onde a atividade microbiana é muito
alta, tanto as populações de microrganismos, quanto a sua diversidade, podem responder
drasticamente a essas mudanças (ZAGO et al, 2011).
Em sistemas artificiais, como a agricultura, há uma modificação no balanço natural
das populações microbianas que pode conduzir a perdas de microrganismos benéficos e/ou
facilitarem o ingresso de fitopatógenos, com efeitos devastadores na produtividade das plantas
(GARBEVA et al., 2006; AVIS et al., 2008).
Estudos realizados com a inoculação de Pseudomonas fluorescens mostraram que
estas bactérias podem aumentar a disponibilidade de fósforo (P) às plantas (KLOEPPER et
al., 1988), podendo proporcionar incrementos na produtividade das culturas. Sendo assim,
este incremento, pela baixa mobilidade do P no solo, pode ser intensificado em sistemas de
produção irrigado.
3.MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Delineamento e caracterização do solo
O delineamento experimental adotado foi inteiramente casualizado, composto por 3
tratamentos (testemunha, inoculação na semente e inoculação na água de irrigação) e 10
repetições cada, totalizando 30 vasos de polietileno de 8L, dispostos em bancadas a 1,5 m do
solo, em estufa não climatizada da Universidade Camilo Castelo Branco em Descalvado, SP
O clima da região é tropical de altitude, (Cwa), com inverno frio e seco e verão quente
e chuvoso, de acordo com a classificação climática de Köppen.
O solo é de textura argilosa, coletado de barranco, nas dependências da Universidade
Camilo Castelo Branco.
Foi feita análise de solo a fim de se fazer as devidas correções de fertilidade e de
acidez. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Características químicas do solo utilizado no experimento.
pH
M.O.
P resina
H + Al
K
Ca
Mg
SB
CTC
V%
CaCl2
4,5
(g/dm3)
13
(mg.dm3) -------------------- mmolc.dm3 ---------------------16
38
0,3
16
6
22,3 60,3 37
30
3.1.1 Calagem e adubação de plantio
Após o período de 40 dias de solarização, para esterilização através da inativação térmica
(CRUZ e SILVA, 2006) o solo foi distribuído em 30 vasos de polipropileno de 8L, para
composição dos 3 tratamentos.
Não foi realizada a calagem. A adubação foi realizada de acordo com os resultados
obtidos na análise de solo e as recomendações técnicas do Boletim 100 (RAIJ et al., 1997). A
adubação de plantio e cobertura foi realizada utilizando 1,6 g/vaso da fórmula 10–10–10.
O desbaste foi efetuado no 15° dia, ficando somente 5 plantas por vaso.
3.1.2 Capacidade de Campo do solo
A capacidade de campo foi determinada pela técnica de COSTA (1983). Foram colocados
150 g de solo em um Béquer e, adicionou-se 2 mL de água. Após 40 segundos retirou-se o
torrão úmido (separado da terra seca pela frente da parte molhada). Formou-se um torrão
úmido. Em seguida o torrão foi colocado para secar a 60ºC em estufa por 24h. Após esse
período o solo foi pesado e a capacidade de campo calculada pela diferença de peso entre os
solos úmido e seco.
Sendo:
Massa de solo seco no vaso = 8500 g
Amostra úmida = 21,6 g
Amostra seca = 18 g
= 20%
Cálculo do volume de água (Va) necessário para manter 70% da capacidade de campo:
31
Considerando o solo totalmente seco (U = 0), então:
1120mL
Portanto, 1120 mL é o volume de água suficiente para irrigar os vasos sem que ocorra
drenagem (70% da CC).
3.2 Processos laboratoriais e técnicos para a condução do experimento
3.2.1 Esterilização do Solo
Anteriormente ao de plantio e correção do solo, o mesmo passou por uma esterilização
realizada através do processo de solarização, que é um método de desinfestação do solo para o
controle de fitopatógenos, plantas daninhas e pragas (inativação térmica), que consiste na
cobertura, com um plástico transparente, do solo, preferencialmente úmido, durante o período
de maior radiação solar (CRUZ; SILVA, 2006). O solo foi ensacado em sacos de polietileno
transparente, de 20L, conforme figura 3, que ficaram expostos ao sol por um período de 40
dias (GHINI, 2001).
3.2.2 Meio de cultura para bactérias Pseudomonas fluorescens
As bactérias Pseudomonas fluorescens linhagem CCMA-110 foram fornecidas pelo banco de
germoplasma da Embrapa Meio Ambiente, e armazenadas em geladeira (Figura 1).
O meio de cultura utilizado foi o NA, de composição 0,5% peptona, 0,3% extrato de levedura,
1,5% de Agar e 0,5% de NaCl, e o pH permaneceu na neutralidade (MORETINI et al., 2000
com modificações).
Os componentes foram pesados utilizando uma balança analítica. Foi produzido 1L de
meio de cultura, que foi autoclavado durante 20 minutos a 121 oC e vertido em placas de Petri.
32
Figura 1. Placa de Petri contendo colônias de bactérias Pseudomonas fluorescens.
Fonte: Arquivo Assoni (2013)
O meio de cultura foi preparado utilizando 5g de peptona, 3g de extrato de levedura,
15g de ágar e 5g de NaCl. O pH do meio de cultura foi ajustado para 7 (neutro) empregandose as soluções NaOH/HCl.
Esse meio de cultura foi vertido em 34 placas previamente esterilizadas, depois foram
vedadas e armazenadas em geladeira ate o momento do uso (Figura 2)
Figura 2. Placas de Petri, previamente esterilizadas.
Fonte: Antoniazzi (2013)
33
3.2.3 Repicagem das Bactérias
Para a repicagem das bactérias, uma alça de platina flambada na chama do bico de Bunsen, foi
utilizada, esfriando depois a ponta no meio de cultura, posteriormente, passando a ponta da
alça sobre as colônias das bactérias, elas foram sendo transferidas para as placas de Petri que
foram preparadas previamente.
As bactérias foram repicadas na forma de estrias. Esta etapa foi realizada dentro da
capela de exaustão (sem ultravioleta), próximo a chama do bico de Bunsen, com as mãos e as
bancadas desinfetadas com álcool 70% (Figura 3).
Figura 3. Repicagem nas placas de Petri
Fonte: Antoniazzi (2013)
Após a repicagem, as placas foram vedadas com filme plástico de PVC e levadas para
a estufa a uma temperatura de 35oC durante 24h.
3.2.4. Quantificação das populações bacterianas
Uma placa de Petri contendo colônias de bactérias Pseudomonas fluorescens foi raspada com
uma alça de Driglalski, utilizando 2 ml de água destilada autoclavada. Essa solução bacteriana
foi coletada em um Becker de 5ml (Figura4).
34
Figura 4. Da direita para esquerda, diluições 10-1, 10-2 e 10-3
Fonte: Antoniazi (2013)
Com uma pipeta de 1ml foi retirada uma amostra de 0,1ml que foi diluída em 0,9 ml
de água destilada autoclavada, num tubo de ensaio (diluição 10-1). Dessa suspensão diluída,
foi retirado 0,1ml e diluído novamente em 0,9 ml de água destilada autoclavada, num segundo
tubo de ensaio (diluição 10-2).
Por fim, dessa diluição, foi retirado uma terceira amostra de 0,1ml e diluído em 0,9 ml
de água destilada autoclavada (diluição 10 -3).
Dessa última diluição foi retirada uma amostra de 10 microlitros (0,01ml) com auxílio
de uma micropipeta, que foi semeada em uma placa de Petri previamente preparada com o
meio de cultura adequado.
Após 24h foi feita a contagem visual das colônias de bactérias que se desenvolveram
nas placas, e este procedimento foi realizado com 3 placas. Oo valor final da quantidade de
bactérias foi obtido através da média. A quantidade média foi de 1,67 x 10 7 UFC/ml (Figura
5).
35
Figura 5: Colônias bacterianas de Pseudomonas fluoresnces.
Fonte: Arquivo Fabiana Assoni (2013)
3.2.5. Procedimentos Laboratoriais para Testemunha
Foram separadas 100 sementes do lote, previamente separado. Essas sementes foram lavadas
em água destilada autoclavada para efeito de desisfestação.
Posterioemente essas sementes foram plantadas em 10 vasos, sendo utilizadas 10
sementes por vaso.
A irrigação foi realizada diariamente com 100 mL de água destilada por vaso.
3.2.6. Procedimentos Laboratoriais para o tratamento de Inoculação da Pseudomonas
na Semente
As sementes foram tratadas momentos antes da semeadura.
Foram separados 100 sementes, lavadas com água destilada autoclavada, para efeito
de desisfestação.
Logo em seguida as sementes ficaram imersas em 100 mL de solução bacteriana
(utilizando uma placa de Petri com colônias já crescidas), na quantidade de 1,67 x 10 7
UFC/mL durante 5 minutos (Figura 6).
Depois foram plantadas diretamente em 10 vasos, na quantidade de 10 sementes por
vaso, de acordo com SOTTERO (2003). A irrigação foi realizada diariamente até a
germinação, utilizando 100 mL de água destilada por vaso.
36
Figura 6. Sementes de Brachiaria decumbens em solução
bacteriana. Fonte: Arquivo Pessoal
3.2.7. Procedimentos para o tratamento de Inoculação da Pseudomonas na Semente
através da Água de Irrigação
Após desinfestação, 100 sementes foram lavadas com água destilada autoclavada.
Em
seguida as sementes foram plantadas diretamente nos vasos, na quantidade de 10 sementes
por vaso.
A irrigação foi feita durante 10 dias consecutivos com 100 ml de solução bacteriana na
quantidade de 1,67 x 106 UFC/mL/vaso (utilizando uma placa de Petri a cada dia).
A diluição da bactéria para esse tratamento foi diminuída para 106 UFC, pois como a
irrigação foi feita em 10 dias, ao final desse período o total recebido por planta passa a ser de
10 7 UFC.
A suspensão bacteriana usada na irrigação foi obtida raspando-se a placa com a Alça
de Driglalski, lavando e transferindo 2 mL da solução em um Béquer (SOTTERO, 2003).
Esses 2 mL de suspensão bacteriana foram adicionados a 998 mL de água estéril (diluição 10
3
-
) e divididas em 10 partes de 100 mL. Cada vaso foi irrigado com 100 mL dessa suspensão,
por 10 dias consecutivos. Após os 10 dias, a irrigação foi feita com 1200 mL de água
destilada por vaso, para todos os tratamentos, sempre quando necessário aproximadamente 10
a 12 dias de intervalo entre uma irrigação e outra, de acordo com as condições climáticas do
dia.
Portanto, em todos os tratamentos a irrigação foi feita sempre quando o solo estava
seco, utilizando-se o mesmo volume de água, nunca ultrapassando os 70% da capacidade de
campo (1200 mL) e irrigados sempre no mesmo horário para todos os tratamentos.
37
3.3 Plantio em vasos e medidas
A semeadura foi feita diretamente nos vasos e foram utilizadas dez sementes por vaso e após
a germinação, foram raleadas, deixando cinco plantas homogêneas por vaso. Um perfilho foi
marcado com arame branco para identificação da planta a ser medida (Figura 7).
Figura 7. Marcação da planta a ser medida.
Fonte: Antoniazzi (2013).
Após o aparecimento da terceira folha começaram as medidas de alongamento foliar,
alongamento de colmo, para posterior cálculo das taxas. Essas medidas foram feitas com o
auxilio de uma trena de bolso de 1m (Figura 8).
As medições foram realizadas em intervalos de 48 horas, de 26 de dezembro de 2012 a
08 de fevereiro de 2013.
38
Figura 8. Medição das plantas com uso de trena.
Fonte: Antoniazzi (2013).
Os cálculos das respectivas taxas foram de acordo com o preconizado por PETERNELLI
(2003):
 Intervalo de Aparecimento foliar (IApF – dias.folha-1.perfilho-1). É a média do
intervalo de tempo (em dias) para o aparecimento de duas folhas sucessivas em cada
perfilho, dividindo-se o resultado da somatória para cada perfilho pelo número de
perfilhos em avaliação.
 Taxa de Aparecimento Foliar (TApF – folha.dia-1.perfilho-1). É considerado o inverso
de IApF.
 Taxa de alongamento foliar (TAlF – cm.dia-1.perfilho -1). É a diferença entre
comprimento final (CF) e o comprimento inicial (CI) das folhas em expansão dividido
pelo número de dias entre as medidas.
39
 Taxa de alongamento de colmo (TAlC – cm.dia-1.perfilho-1). É a diferença entre o
comprimento final (CFC) e o comprimento inicial (CIC) do colmo, dividido pelo
número de dias entre as medidas (ND).
O Alongamento do colmo foi avaliado tomando-se por base a altura da lígula da
última folha expandida em relação ao nível do solo. Também foi analisado a quantidade de
perfilho por vaso.
A análise estatística foi realizada seguindo-se a metodologia do sistema estatístico
STAT.
3.4 Análise Estatística
Os dados experimentais após avaliação das prerrogativas de normalidade, homogeneidade de
variância e análise de resíduo foram submetidos a um delineamento inteiramente casualizado
e as comparações múltiplas foram aferidas pelo teste tukey.
40
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em relação aos parâmetros de crecimento vegetativo (Tabela 2) tanto para taxa de
alongamento foliar (TAIF), quanto para senescência foliar (SF) e perfilhamento de Brachiaria
decumbens, verificou-se que não houve diferença significativa entre a diferentes metodos de
inoculação de Pseudomonas fluorescens seja via irrigação, seja via sementes.
Salientando que as maiores médias foram observadas para a inoculação via irrigação
para TAIF e perfilhamento, com médias 0,44 folhas.dia-1.perfilho e 3,86 números de
perfilhos, respectivamente, mostrando-se mais eficiente desta forma.
O perfilhamento é uma característica da planta altamente influenciada pela altura.
Hume (1991) considera a capacidade de perfilhamento como ponto chave de um bom
estabelecimento e permanência da pastagem. Apesar do número de folhas vivas de uma planta
ser característica determinada geneticamente, pode também variar com as condições de meio
e de manejo. Já o número de folhas mortas por perfilho está correlacionado com a altura da
planta, pois o número de lâminas foliares mais velhas atingem o limite de duração de vida
(SANTOS et al., 2011).
Podendo observar ainda para inoculação via irrigação que os dias para senescência
apresentaram inferioridade em relação a inoculação via semente, de 0,47cm.dia-1.perfilhos1
(Tabela 2) mostrando maior eficiência pois reduzindo o dia de senescência melhor para a
continuidade da parte vegetativa, podendo ser aproveitada com maior tempo pelos animais em
pastejo.
Fagundes et al (2005), acharam para taxas de senescência em relação a pastos de
Brachiaria decumbens nas quarto estações do ano, as médias de 6,5kg.ha-1/dia para verão e
inverno, para outono achou-se 6,0 kg.ha-1/dia, já na primavera a senescência foi de 21,9 kg.ha1
/dia.
Em pastagens, o perfilho consiste na unidade básica das gramíneas, que utilizam o
perfilhamento como forma de crescimento e, sobretudo, como forma de sobrevivência na
pastagem (HODGSON, 1990).
Segundo Langer (1963), o perfilhamento é influenciado por fatores de ambiente,
destacando-se a temperatura e o suprimento de água e de nutrientes, principalmente de
nitrogênio (N), que assume papel importante no crescimento e na produção das plantas
forrageiras, pois seu suprimento eleva o número de perfilhos por planta (LANGER, 1963;
MCKENZIE, 1998; ALEXANDRINO et al., 1999; GARCEZ NETO et al., 2002; BAHMANI
41
et al., 2002). Nabinger (1996) atribuiu o efeito positivo do N sobre o perfilhamento à maior
rapidez de formação das gemas axilares e à iniciação dos perfilhos correspondentes.
Tabela 2. Resultados das comparações múltiplas dos parâmetros de crescimento vegetativo
de Brachiaria decumbens quanto a Taxa de Alongamento Foliar (TAIF), a Senescência Foliar
(SF), a Taxa de Alongamento do Colmo (TAIC), a Taxa de Aparecimento Foliar (TApF) e
perfilhamento, submetida a diferentes vias de inoculação de Pseudomonas fluorescens
(Descalvado-SP, janeiro/2014).
Parametros de crescimento vegetativo
Diferentes vias de
inoculação
TAIF
SF
TAIC
TApF
(folha.dia-
(cm.dia-
(mm.dia-
(folha.dia-
1
-1
.perfilho )
1
-1
.perfilho )
1
-1
.perfilho )
1
Perfilhamento
-1
Número de
.perfilho )
perfilos
Sem inoculação
0,421±0,11A
0,33±0,15A
1,48±0,36B
3,78±0,49AB
3,60±0,52A
Inoculação via Irrigação
0,44±0,09A
0,47±0,21A
1,63±0,29AB
4,04±0,29A
3,86±0,96A
Inoculação via sementes
0,39±0,05A
0,53±0,15A
1,85±0,31A
3,65±0,39B
3,35±0,82A
1
TALF: taxa de alongamento foliar. SF: senescência foliar. TALC: taxa de alongamento de colmo. TApF: taxa
de aparecimento foliar. Médias de 10 repetições por parâmetro. Médias seguidas pela mesma letra na vertical,
não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Já para taxa de alongamento do colmo (TAIC) e taxa de aparecimento foliar (TApF),
ainda segundo Tabela 2, verificou-se que houve diferença significativa em relação as vias de
inoculação de Pseudomonas fluorescens. Para TAIC a maior média foi para as plantas
submetidas a inoculação via semente, de 1,85mm.dia-1.perfilho-1, diferindo das plantas que
não sofreram inoculação com 1,48 mm.dia-1.perfilho -1.
Hodgson (1990), Observou que estudar os componentes do relvado, como o
surgimento de perfilhos e folhas, auxilia no entendimento da relações entre manejo de
pastagem e as respostas da forrageira.
Foi observado ainda que, para taxa de aparecimento foliar a maior média foi evidente
para inoculação via irrigação com 4,04 folha.dia-1.perfilho -1, seguida por 3,78 folha.dia1
.perfilho -1 de plantas que não foram submetidas a inoculação de P. fluorescens (Tabela 2).
Segundo Pedrinho (2009), os microrganismos endofíticos têm apresentado a
capacidade de estimular o crescimento das plantas por mecanismos diretos (fixação de N e/ou
42
produção de fitohormonios) e por mecanismos indiretos (antagonismo contra patógenos ou
resistência a drogas).
O uso de microrganismos promotores de crescimento associado a um adequado
manejo do solo, baseado em comparações com a aplicação de fertilizantes, parece ser mais
vantajoso economicamente (OKON; VANDERLEYDEN, 1997) e não apresenta, do ponto de
vista ecológico e ambiental, impacto negativo ao meio ambiente (ITZIGSOHN et al., 2000).
O nitrogênio proporciona incrementos na biomassa de forragem em pasto de
Brachiaria decumbens sob lotação contínua.
Em pastagens adubadas com nitrogênio, a
variação na taxa de lotação tem papel determinante na eficiência de utilização da forragem
produzida. O padrão de acúmulo de forragem, em pasto de Brachiaria decumbens sob lotação
contínua e adubado com nitrogênio, é influenciado por variações climáticas nas diferentes
estações do ano (FAGUNDES et al., 2005)
Em estudo de bioprospecção de Bacillus sp. na cultura do milho, Araujo e Guerreiro
(2010) concluíram que a maior produção de AIA não foi uma característica principal dos
melhores isolados bacterianos que promoveram o crescimento do milho. Entretanto, Khalid et
al., (2004) relataram correlação positiva entre a produção de auxina in vitro e o aumento do
crescimento das plantas após a inoculação das rizobactérias. Com relação à atividade de
solubilização de fósforo encontrada em isolados bacterianos e a correlação com parâmetros
fitotécnicos, Idris et al. (2009) encontraram correlação significativa apenas com massa seca da
raiz em sorgo.
Existem bactérias na rizosfera de Brachiaria que são caracterizadas como Bacillus sp.
e podem promover o crescimento das plantas quando inoculadas previamente nas sementes. A
avaliação de produção de auxinas e fosfatases mostra-se relevante para os protocolos de
seleção dos isolados de Bacillus sp. como promotores de crescimento de Brachiaria brizantha
(ARAUJO et al., 2012).
Conforme Corsi e Nascimento Jr. (1986), os bovinos só atingem produções elevadas
quando consomem quantidades adequadas de alimentos de alta qualidade; para que isso
ocorra em regime de pastejo, há necessidade de grande disponibilidade e proporção de folhas
verdes na pastagem.
Fagundes et al. (2006), avaliando o efeito da adubação nitrogenada sobre as
características morfogênicas e estruturais de Brachiaria decumbens aplicaram quatro doses de
nitrogênio (75, 150, 225 e 300 kg/ha) e observaram que a taxa de alongamento foliar
apresentou resposta linear positiva com as doses de N aplicadas sendo superior com a maior
43
disponibilidade hídrica e maiores temperaturas ocasionados por condições ambientais
favoráveis.
Silva (2006) estudando as características morfogênicas e estruturais da Brachiaria
brizantha e Brachiaria decumbens, submetidas a diferentes doses de nitrogênio em casa de
vegetação, encontrou valor de máxima produção para TALC em Brachiaria decumbens de
356 kg ha-1 de N.
Em alguns estudos foram observadas várias modificações na morfologia das raízes das
plantas devido à inoculação de isolados de Azospirillum spp., como aumento em número,
comprimento, área e aumento na absorção mineral, que podem estar relacionadas a
substâncias promotoras de crescimento secretadas pela bactéria (MARTIN et al., 1989,
ROESCH et al., 2005). BHATTARAI & HESS (1998) concluíram que, ao lado da FBN, o
efeito de estimulação do crescimento pela bactéria no desenvolvimento das raízes, nos
primeiros estádios de crescimento da planta, pode ser responsável pelo impacto positivo da
inoculação.
Segundo Mantelin e Touraine (2004), a absorção de N e a estrutura das raízes das
plantas são influenciadas por bactérias promotoras de crescimento de plantas (BPCPs), assim
como pela disponibilidade de N do ambiente. O efeito causado por essas bactérias na
absorção de N e no desenvolvimento das raízes é similar ao observado em situação de baixa
disponibilidade de N, ou seja, aumento do desenvolvimento de raízes laterais e estimulação da
absorção de N (SILVEIRAFRETAS, 2007).
44
5. CONCLUSÕES
A inoculação de Pseudomonas fluorescens em Brachiaria decumbens via irrigação quando
comparado com o controle, pode se observar que a taxa de alongamneto foliar (TAIF) foi que
apresentou maior resultado. Porem a inoculação via semente foi o tratamento de melhor
resultado comparado com as demais.
45
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