UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
DOUTORADO EM ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO DA TERAPIA FOTODINÂMICA NA
INATIVAÇÃO DA CÂNDIDA: ESTUDO IN VITRO
RACHEL DE QUEIROZ FERREIRA RODRIGUES
Orientadora: Profa. Dra. Ângela Toshie Araki
Co-Orientadora: Profa. Dra. Andrea Sarmento Queiroga
Tese
apresentada
ao
Doutorado em
Odontologia, da Universidade Cruzeiro do
Sul, como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Doutora em
Odontologia.
SÃO PAULO
2014
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA CENTRAL DA
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
R616a
Rodrigues, Rachel de Queiroz Ferreira.
Avaliação da terapia fotodinâmica na inativação da cândida:
estudo in vitro / Rachel de Queiroz Ferreira Rodrigues. -- São Paulo;
SP: [s.n], 2014.
69 p. : il. ; 30 cm.
Orientadora: Ângela Toshie Araki.
Tese (doutorado) - Programa de Pós-Graduação em
Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul.
1. Terapia fotodinâmica - Odontologia 2. Candida 3. Azul de
toluidina 4. Antifúngicos 5. Laser. I. Araki, Ângela Toshie.
II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Pós-Graduação em
Odontologia. III. Título.
CDU: 615.831:616.314(043.2)
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
AVALIAÇÃO DA TERAPIA FOTODINÂMICA NA
INATIVAÇÃO DA CÂNDIDA: ESTUDO IN VITRO
RACHEL DE QUEIROZ FERREIRA RODRIGUES
Tese de doutorado defendida e aprovada
pela Banca Examinadora em 25/11/2014.
BANCA EXAMINADORA:
Profa. Dra. Ângela Toshie Araki
Universidade Cruzeiro do Sul
Presidente
Prof. Dr. Fábio Valverde Rodrigues Bastos Neto
Universidade Cruzeiro do Sul
Profa. Dra. Andréa Kanako Yamazaki Arasaki
Universidade Cruzeiro do Sul
Prof. Dr. Jarbas Eduardo Martins
Associação Paulista dos Cirurgiões Dentistas
Profa. Dra. Maria Stella Nunes Araujo Moreira
Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo
DEDICATÓRIA
À DEUS minha fonte de vida e sabedoria, pelo Teu imensurável amor,
proteção e ajuda, por permitir esta vitória em mais uma etapa de minha vida.
Ao meu esposo Rodrigo, pelo incentivo, compreensão e ajuda na
organização deste trabalho. Pelo exemplo de profissionalismo e determinação; Por
ser pai e mãe nas minhas ausências; Por sempre acreditar em mim e vencermos
juntos o que a vida nos oferece!
Aos meus pais Jailson e Linalda, que desde de criança me ensinaram a
beleza dessa profissão. Pela motivação, não medindo esforços, dando força,
coragem, perseverança e muito auxílio durante esses anos. Pela dedicação, apoio e
exemplos de vida e profissionalismo. Pelo exemplo de caráter e honestidade que
desejo seguir na minha vida, e, principalmente, por todo amor que sempre foi
cultivado dentro de nosso lar. Amo vocês!
A minha linda filha Rafaela. Poucos momentos deixei de está com você, de
ver o seu crescimento intelectual, de não participar de algumas apresentações na
escola devido a este trabalho. Filha, o que posso deixar com esse estudo é o meu
exemplo de perseverança e conquista. Hoje podemos recuperar esse tempo perdido
e posso dizer que TUDO valeu a pena. Mamãe te ama muito!
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
A minha orientadora Profa. Dra. Ângela Toshie Araki, pela simplicidade,
sabedoria, paciência e dedicação. Pelas orientações e ensinos que me tornaram
capaz, me mostrando os caminhos que facilitaram a finalização deste trabalho. Tive
a felicidade de tê-la como orientadora. Muito Obrigada!
A minha co-orientadora Profa. Dra. Andrea Queiroga Sarmento, pela
compreensão, pelos ensinamentos compartilhados e pela maneira que me
tranquilizou durante a realização deste trabalho.
Aos professores Dr. Eduardo Gomes Seabra, Dr. Flávio Roberto Guerra
Seabra, Msc. Michelline Cavalcanti Toscano de Brito pelos ensinamentos
aprendidos, como também pelas oportunidades a mim proporcionadas.
Aos Professores Fábio Bastos e Sueli, por ter aceitado em participar da
banca de qualificação e pela contribuição pertinente em suas observações.
Aos Professores Petrusc e Patrícia e aos técnicos em laboratório
Alexandre, Cenira e Patrícia, pela disponibilidade de horário, auxílio e
compreensão durante a execução desse trabalho.
À Profa. Dra. Ruthinéia Diógenes pela transmissão de seus ensinamentos,
e por introduzir à pesquisa desde da graduação.
AGRADECIMENTOS
Aos meus irmãos, Samara, Ruth e Felipe que sempre me apoiaram e me
ajudaram quando possível.
Aos colegas de Doutorado em Odontologia, em especial Paula Vanessa,
Renata, Faldryene, Luciana, Clarisse, Camila, Manuela e Tássia pelo convivência
e pelos bons momentos que passamos juntas.
Aos Professores do programa de pós graduação em Odontologia por todos
os ensinamentos transmitidos que contribuiram para minha vida acadêmica.
À UFCG em especial a Rodrigo Alves, Gymena e Julierme, pela
compreensão de minhas ausências neste período.
Aos funcionários da UNICSUL pelo auxílio e colaboração.
Aos alunos da UFCG, Taynan Escarião, Brisa Garcia, Lucélia, Francisco
Thaynan, Karoline, Talita, Jéssica, Bruna Honório, Nelmara, Rafael e Alzira pela
colaboração no experimento, sem vocês esse trabalho não poderia ser concretizado.
Ao amigo João Nilton Lopes de Souza, que juntos trabalhamos durante os
testes experimentais dessa pesquisa, por enfrentarmos os mesmos obstáculos e
conseguirmos
juntos
a
conclusão
de
mais
uma
etapa.
Como
foi
bom
compartilharmos essa experiência e podermos perpetuar esta na graduação. Muito
obrigada!
“A glória de Deus está nas coisas
encobertas; mas a honra dos reis,
está em descobri-las”.
Provérbios 25:2
RODRIGUES, R. Q. F. Avaliação da terapia fotodinâmica na inativação da
cândida: estudo in vitro. 2014. 69 f. Tese (Doutorado em Odontologia)–Universidade
Cruzeiro do Sul, São Paulo, 2014.
RESUMO
Novas alternativas estão surgindo devido ao uso indiscriminado de antifúngicos que
vêm acarretando resistência a Candida. O presente trabalho teve como objetivo
avaliar o efeito da Terapia Fotodinâmica utilizando o azul de toluidina (AT) na
inativação de espécies do gênero Candida. Foram avaliados quatro grupos: PDT,
AT, Laser e Solução Salina (SS). Para os grupos AT e PDT avaliamos quatro
tempos de pré-irradiação (1, 5, 10 e 20 minutos) e quatro tipos de concentrações do
fotossensibilizador (FS) (37,5 µg/ml; 75 µg/ml; 150 µg/ml e 300 µg/ml). Para o grupo
PDT, alíquotas de 100µl da suspensão do fungo (106 UFC/ml) foram transferidas
para um poço de uma placa de microdiluição, em seguida, foi acrescentado o
mesmo volume de AT em uma das concentrações testadas. Após os tempos de
incubação, as placas foram irradiadas com um diodo laser (660nm; 100mW; 426
J/cm2) por 128 segundos. No grupo Azul de Toluidina, foi utilizado o mesmo
protocolo sem a exposição da luz laser. O grupo Laser seguiu o protocolo
substituindo o FS por SS, enquanto que no grupo Solução Salina não foi utilizado
nem o FS e nem o Laser. Foram realizadas diluições seriadas de 1:3 a partir das
amostras contidas nos poços das placas e plaqueadas. Após 48 horas de incubação
a 37oC, as placas de Petri foram submetidas à contagem de unidades formadoras de
colônias. Os Resultados mostraram que com exceção do tempo de incubação de 1
minuto para todas as concentrações, como também no tempo de 5 minutos para
concentração de 37,5 µg/ml não observamos diferenças significativas entre os
grupos por concentração e tempo de incubação. Nas demais combinações de
concentração e tempo de incubação foram verificadas diferenças significativas entre
os grupos. A PDT utilizando o AT como FS promoveu inativação de espécies do
gênero Candida albicans.
Palavras-chave: Terapia fotodinâmica, Laser, Azul de toluidina, Candida sp.
RODRIGUES, R. F. Q. Photodynamic therapy evaluation in the inactivation of
candida: in vitro study. 2014. 69 f. Tese (Doutorado em Odontologia)–Universidade
Cruzeiro do Sul, São Paulo, 2014.
ABSTRACT
New alternatives are emerging due to the indiscriminate use of antifungal agents that
are causing resistance to Candida. This study aimed to evaluate the effect of PDT
using toluidine blue (TB) in the inactivation of Candida species. Four groups were
evaluated: PDT, TB, Laser and Saline Solution (SS). For the TB and PDT groups we
evaluated four pre-irradiation times (1, 5, 10 and 20 minutes) and four kinds of
concentrations of the photosensitizer (PS) (37,5 µg/ml; 75 µg/ml; 150 µg/ml e 300
µg/ml). For the PDT group, aliquots of 100µl of the fungal suspension (106 CFU / ml)
weretransferred to a well of a microdilution plate, then, the same volume of TB was
added in one of the tested concentrations. After the incubation time, the plates were
irradiated with a diode laser (wavelength 660nm, power of 100mW and a dose of 426
J / cm2) for 128 seconds. In the Toluidine Blue group, the same protocol without the
exposure of laser light was used. Laser group followed the protocol by substituting
PS for SS, while the Saline Solution group was not used PS nor Laser. 1:3 serial
dilutions were made from the samples contained in the wells of the plates and plated.
After 48 hours incubation at 37 ° C, the Petri Plates were subjected to counting of
colony forming units. Results showed that, with except for the incubation time of 1
minute for all concentrations, as well in the time of 5 minutes to concentration of 37.5
µg / mL, no significant difference between groups by concentration and incubation
time were observed. In other concentration combinations and incubation time
significant differences between groups were observed. We conclude that PDT using
the TB as PS promoted inactivation of species of the genus Candida albicans.
Keywords: Photodynamic therapy, Laser, Toluidine blue, Candida sp.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1
Cepa de Candida albicans utilizada no experimento. ....................... 41
Figura 2
Preparo do meio de cultura ................................................................. 42
Figura 3
Capela de fluxo laminar com a luz UV ligada (germicida) ................ 42
Figura 4
O fotossensibilizador (AT) em pó e suas concentrações utilizadas 43
Figura 5
Período de incubação com ausência de luz ...................................... 44
Figura 6
Laser semicondutor portátil utilizado no estudo .............................. 44
Figura 7
Área do feixe de laser de 3 mm2, a qual coincide com a área da
abertura de cada poço. ....................................................................... 45
Figura 8
Preparo do inóculo............................................................................... 46
Figura 9
Controle do meio de cultura ................................................................ 47
Figura 10 Grupo PDT ............................................................................................ 48
Figura 11 Grupo AT ............................................................................................... 49
Figura 12 Grupo Laser .......................................................................................... 50
Figura 13 Grupo SS ............................................................................................... 51
Figura 14 Esquema das diluições direta e seriadas em duplicatas. ................. 52
Figura 15 Contagem de Colônias......................................................................... 53
Tabela 1
Comparação da média e desvio padrão do log10 do número de
unidades formadoras de colônias (UFC/ml) para os grupos
controles nos diferentes tempos de incubação ................................ 55
Tabela 2
Avaliação do efeito citotóxico das concentrações (37,5; 75; 150 e
300µg/mL) de azul de toluidina, na ausência de luz, com tempos de
incubação de 1, 5, 10 e 20 min. ........................................................... 56
Tabela 3
Comparação da média e desvio padrão do log10UFC/mL entre os
grupos AT e PDT AT segundo as concentrações de AT e tempos de
incubação.............................................................................................. 57
Quadro 1 Comparação da média do log10UFC/mL entre os grupos PDT AM e
grupos controles .................................................................................. 58
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
AM
Azul de Metileno
AT
Azul de Toluidina
ASD
Agar Sabourad Dextrose
CCT
Coleção de Culturas Tropical
CL
Clorofila Líquida
CLX
Clorexidina
CUR
Curcumina
FIP
Faculdades Integradas de Patos
FR
Fluconazol Resistente
FS
Fotossensibilizador
L
Laser
LED
Light Emitting Diode
MEV
Microscópico Eletrônico de Varredura
MIN
Minutos
NAM
Novo Azul de Metileno
PACT
Quimioterapia fotodinâmica como terapia
antimicrobiana
PB
Paraíba
PDI
Inativação Fotodinâmica
RD
Resistência Respiratória
SS
Solução Salina
SPSS
Statistical Package for the Social Sciences
PDT
Terapia Fotodinâmica
UFC
Unidade Formadora de Colônia
UV
Ultravioleta
LISTA DE SÍMBOLOS
µg
Micrograma
ml
Mililitros
He-Ne
Helio-Neônio
µl
Microlitro
O2
Oxigênio
°C
graus celcius
cm
centímetro.
pH
potencial hidrogeniônico
mm
Milímetro
GaAlAs
Arseneto de gálio e alumínio
InGaAlP
Fosfeto de Índio- Gálio- Alumínio
λ
Lambda
nm
Nanômetro
mW
mm
2
Miliwatts
milímetro quadrado
Log
Logarítmo
J
Joule
%
Porcentagem
NaCl
Cloreto de sódio
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................. 14
2
REVISÃO DE LITERATURA........................................................................ 16
2.1
Terapia Fotodinâmica................................................................................. 16
2.1.1
Histórico ...................................................................................................... 16
2.1.2
Mecanismo de ação .................................................................................... 17
2.1.3
Fotossensibilizadores ................................................................................ 18
2.1.4
Fontes de luz ............................................................................................... 20
2.1.5
Inativação da Cândida pela PDT................................................................ 21
3
OBJETIVOS ................................................................................................. 40
3.1
Objetivo geral .............................................................................................. 40
3.2
Objetivos específicos ................................................................................. 40
4
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 41
4.1
Tipo e local do estudo ................................................................................ 41
4.2
Instrumentos ............................................................................................... 41
4.2.1
Microrganismo e meio de cultura.............................................................. 41
4.2.2
Preparação do fotossensibilizador (FS) e tempo de incubação. ............ 43
4.2.3
Fonte de irradiação para a terapia fotodinâmica (TFD) ........................... 44
4.2.4
Preparo do inóculo de Candida albicans ................................................. 45
4.3
Condições Experimentais .......................................................................... 46
4.3.1
Grupo Terapia fotodinâmica / PDT (Grupo FS+L+) .................................. 47
4.3.2
Grupo Azul de Toluidina/ AT (Grupo FS+L-) ............................................ 48
4.3.3
Grupo Laser / L (Grupo FS-L+) .................................................................. 49
4.3.4
Grupo solução salina/ SS (FS-L-) .............................................................. 50
4.3.5
Avaliação da viabilidade das células de Candida albicans .................... 51
4.3.6
Técnica de Contagem das Unidades Formadoras de Colônias/ml ........ 53
4.3.7
Análise estatística ...................................................................................... 54
5
RESULTADOS ............................................................................................. 55
6
DISCUSSÃ
ÃO ................................................................................................ 59
7
CONCLUSÕES ............................................................................................ 62
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 63
ANEXOS ................................................................................................................... 69
Anexo A Certificado da Cultura utilizada no experimento................................... 69
14
1 INTRODUÇÃO
A cavidade oral é amplamente colonizada por uma variedade relativamente
complexa e altamente inter-relacionada de microrganismos, incluindo espécies
bacterianas aeróbicas e anaeróbicas, Gram positivas e Gram negativas (AVILA;
OJCIUS; YILMAS, 2009), além da presença de alguns fungos, como espécies de
Candida (LEUNG et al., 2000).
As espécies de Candida fazem parte da microbiota comensal da cavidade oral
da maioria dos indivíduos saudáveis. Entretanto, na presença de fatores
predisponentes podem se tornar patogênicas, produzindo infecções que vão desde
lesões mucosas superficiais até disseminações sistêmicas graves e invasivas (DE
REPENTIGNY et al., 2000, LEUNG et al., 2000).
A infecção da cavidade oral por Candida spp. denominada de candidose é
uma infecção significante em pacientes submetidos à terapia antineoplásica
(quimioterapia e radioterapia) bem como em pacientes imunocomprometidos em
decorrência de infecção pelo vírus HIV (CORMICK, et al., 2009). É considerada uma
das infecções oportunistas mais comumente observadas em pacientes portadores
de AIDS e, quando não corretamente tratada e prevenida, pode contribuir
consideravelmente para a mortalidade desses pacientes (SARAMANAYAKE, 2006;
THULER et al., 1998).
O aumento de casos de infecções causadas por cepas de Candida e
consequentemente a utilização excessiva de antimicrobianos, favoreceu nas últimas
décadas a resistência dessas leveduras aos agentes antifúngicos convencionais
(PINTO;
WEIKERT-OLIVEIRA;
LYON,
2008).
Esses
agentes
antifúngicos
demonstram efeito mais fungistático do que fungicida, resultando em uma profilaxia
inadequada (DONNELLY; MCCARRON; TUNNEY, 2007).
Cuidados devem ser tomados quanto aos possíveis efeitos colaterais, frente à
administração de medicações sistêmicas dos antifúngicos. Dentre esses efeitos
destacam-se a irritação local, distúrbios gastrintestinais, náuseas, vômito, diarreia,
anorexia,
cefaleia,
dor
epigástrica,
sangramento
gengival,
parestesia,
15
trombocitopenia e risco de produzir anormalidades hepáticas, sendo necessário
pesquisar alguma forma de tratamento coadjuvante (YAGIELA, 2000).
Frente às limitações da terapia antifúngica convencional, torna-se importante
o estudo de terapias alternativas para tratar as infecções causadas por estes
microrganismos como a terapia fotodinâmica (TFD). Esta técnica foi originalmente
desenvolvida para o tratamento de lesões cancerígenas e vem sendo aplicada com
sucesso na área da Oncologia, promovendo danos irreversíveis nas células do
tecido neoplásico (MACHADO, 2000).
Acredita-se que a terapia fotodinâmica apresenta algumas vantagens em
relação à terapia antifúngica tradicional, como o fato de que a morte celular pode ser
mais veloz, não sendo necessária a manutenção do agente químico em altas
concentrações sobre as lesões por um período de tempo maior, como ocorre com os
agentes antifúngicos e antimicrobianos. Além disso, a morte celular mediada pela
liberação de radicais livres torna improvável o desenvolvimento da resistência pelos
microrganismos.
Desta forma, este estudo tem como objetivo avaliar os efeitos da terapia
fotodinâmica em Candida albicans, variando o tempo de incubação e a concentração
do azul de toluidina.
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Terapia Fotodinâmica
2.1.1 Histórico
A partir da década de 90 que a terapia fotodinâmica começou a ser testada
em bactérias orais, apresentando resultados significativos na redução bacteriana,
utilizando o laser de He-Ne (Hélio-Neônio), l=632,8 nm e 7,3mW de potência,
associada aos fotossensibilizadores azul de toluidina, azul de metileno, ftalocianina e
hematoporfirinas,
em
bactérias
das
espécies
Streptococcus
sanguis,
A.
actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis,
retiradas do biofilme subgengival de pacientes com periodontite crônica (WILSON;
DOBSON; SARKAR, 1993).
A terapia fotodinâmica utiliza luz ativando um agente fotossensibilizador na
presença de oxigênio, que resultará a formação de espécies de oxigênio e radicais
livres, os quais causarão danos e morte celular. Apesar de ser uma terapia
relativamente nova, data-se de 4000 anos atrás, em antigas civilizações, como a
egípcia, indiana, grega, o hábito de ingerir plantas ou extratos associando com a luz
solar para tratar doenças dermatológicas (SIMPLICIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002).
Em 1903, Von Tappeiner e Albert Jesionek utilizaram a aplicação tópica do
corante eosina em exposição à luz para tratamento de câncer cutâneo,
determinando, em 1907, este fenômeno como ação fotodinâmica, englobando todas
as reações fotobiológicas que envolvesse um fotossensibilizador ocorrendo na
presença de oxigênio molecular e levando à destruição de tecidos (FREEDBERG;
EISEN; WOLFF 2003).
Foi relatado, em 1900, a primeira demonstração de fotossensibilização letal
de células por Raab, ao verificar que, no escuro, as baixas concentrações de
acridina não causavam efeito algum ao Paramecium; porém, sob exposição à luz
normal do dia, poderia inativar os microrganismos (ALFENAS, et al. 2011).
17
2.1.2 Mecanismo de ação
A terapia fotodinâmica é baseada na administração tópica de agente
fotossensibilizador não tóxico, o qual é submetido à irradiação com luz visível de
comprimento de onda adequado. O agente fotossensibilizador ativado reage com as
moléculas de oxigênio presentes nas células, por transferência de elétrons ou
hidrogênio, produzindo radicais livres, ou por transferência de energia ao oxigênio,
que leva à produção de oxigênio singleto, induzindo a morte celular. Pode ocorrer,
durante as reações, apoptose ou necrose celular, sendo o primeiro o de maior
ocorrência. O corante pode estar localizado na mitocôndria, onde irá acontecer a
apoptose; ou o corante pode estar localizado nos lisossomos e na membrana
celular, onde irá ocorrer a necrose celular (LAMBRECHTS; AALDERS; MARLE,
2005).
A necessidade de tratamentos alternativos aos convencionais, os quais
apresentavam alta taxa de resistência das doenças infecciosas, induziu a evolução
dos estudos que buscavam alternativas terapêuticas para a inativação de
microrganismos patogênicos. A terapia fotodinâmica surge apresentando vantagens
para o tratamento de infecções originadas por microrganismos, como amplo
espectro de ação, inativação dos microrganismos resistentes e baixo potencial
mutagênico nas células expostas, sendo capaz de promover atividades citotóxicas
contra bactérias, fungos e protozoários; danifica as membranas plasmáticas e as
organelas celulares, alterando a permeabilidade e função de transporte entre os
meios intra e extracelular, além de inibir enzimas mitocondriais (JORI et al., 2006).
A reação do fotossensibilizador no estado excitado com o meio pode ocorrer
de duas formas, os mecanismos do tipos I e II. O mecanismo do tipo I envolve a
transferência de elétrons ou captação de átomos de hidrogênio entre o
fotossensibilizador em seu estado excitado (tripleto) e moléculas de substrato,
formando os radicais livres, que vão reagir com o oxigênio, resultando em espécies
de oxigênio altamente reativas, como superóxido, radicais hidroxila e peróxido de
hidrogênio. Os fotossensibilizadores associados a uma fonte de luz com
comprimento de onda compatível para o seu pico de absorção são excitados,
promovendo a produção das espécies reativas de oxigênio. As subsequentes
reações nos tecidos resultam em inativação das células-alvo através de reações de
18
óxido-redução com lipídeos da membrana celular, ácidos nucléicos e proteínas
(KONOPKA; GOSLINSKI 2007).
O mecanismo do tipo II, o qual é o principal responsável pelo dano fotooxidativo à célula microbiana, é baseado na produção de um estado eletronicamente
excitado e altamente reativo de oxigênio, o oxigênio singleto. O fotossensibilizador,
no estado tripleto, transfere energia para a molécula de oxigênio em seu estado
fundamental (tripleto), acarretando a produção da espécie altamente reativa de
oxigênio, o oxigênio singleto. Esse oxigênio singleto reage com os componentes
celulares, pois os compostos orgânicos insaturados são suscetíveis à ação de O2.
Por ter sua meia-vida curta, o oxigênio singleto possui uma limitada difusão, tendo
os locais das lesões celulares da terapia relacionados com o local da aplicação do
corante fotossensibilizador, ou seja, há uma resposta localizada, sendo ideal para
infecções localizadas (TAKASAKI et al., 2009).
2.1.3 Fotossensibilizadores
A maioria das células não possui componentes fotossensíveis, é necessária a
aplicação de um fotossensibilizador para atrair luz e iniciar a formação de radicais
livres. Os agentes fotossensibilizadores devem ter picos de absorção muito próximos
ao comprimento de onda de luz laser a ser utilizada no tratamento e não podem
apresentar riscos ou danos tóxicos ao paciente (DÖRTBUDAK, et al., 2001).
Foi amplamente observado que a Candida albicans, assim como outras
leveduras, é ligeiramente mais difícil de matar pela terapia fotodinâmica que células
bacterianas gram-positivas, necessitando, assim, de doses maiores de corante
fotossensibilizador (ZEINA, et al., 2002).
Apesar de necessitar de uma dose maior de fotossensibilizador, foi
demonstrado que não ocorre número considerável de morte celular humana, além
de não causar efeitos genotóxicos e mutagênicos detectáveis (ZEINA; GREENMAN;
CORRY; PURCELL, 2003).
A dificuldade de eliminar totalmente a Candida albicans pode ser explicada
pela presença de uma membrana nuclear nas leveduras, além de um maior tamanho
19
da célula e menor número de alvos para o oxigênio singleto por unidade de volume
da célula (DEMIDOVA; HAMBLIN, 2005a).
Existem vários agentes fotossensibilizadores utilizados, podendo citar os
fenotiazínicos, rosa bengala, cristal violeta, ftalocianina, tionina, protoporfirina. O
azul de toluidina e o azul de metileno, pertencentes ao grupo fenotiazínicos, são os
fotossensibilizantes mais utilizados em pesquisas na área odontológica. Apesar
destes pertencerem ao mesmo grupo e possuírem estrutura química e propriedades
físico-químicas semelhantes, as eficiências destas substâncias fotossensibilizadoras
variam entre diferentes microrganismos (DEMIDOVA; HAMBLIN, 2005b).
O sítio de ação primário em bactérias gram-negativas é a membrana externa,
porém em bactérias gram-positivas e fungos, este sítio é a membrana plasmática. O
fotossensibilizador conduz reações que envolvem a modificação de lipídios e/ou
polissacarídeos, além de inativar proteínas e enzimas essenciais, presentes na
membrana plasmática, provocando a morte celular (HARRIS; CHAPDTIELD;
PHOENIX, 2005).
O sucesso da terapia fotodinâmica depende de fatores relevantes do corante,
como a concentração, a qual varia de um material para outro, por haver uma
variação das características químicas de cada composto e da toxicidade. Além da
concentração do corante, pode mencionar, como fator relevante, a interação do
fotossensibilizador com o alvo, em que se espera que o corante se una ao
microrganismo, ou ultrapasse a membrana citoplasmática. Para que isto seja
possível, é fundamental que haja um espaço de tempo entre a aplicação do
fotossensibilizador no alvo e a ativação pela fonte de luz escolhida, geralmente,
variando de um a dez minutos (RIBEIRO et al., 2005).
O azul de metileno tem se destacado por absorver na região de luz vermelha
e produzir oxigênio singleto, possuir um máximo de absorção na região de 600 a
660nm, além de exibir um bom valor de atividade fotodinâmica e de ser compatível
com o uso de LED; além disso, tem sido utilizado em pesquisas com ação
antifúngica e antibacteriana (PELOI, 2007).
20
Os fotossensibilizadores da família dos fenotiazínicos se destacam na área
odontológica pelo comprimento de onda necessário para ativá-los (620-700nm),
dando-lhes um maior poder de penetração (ALMEIDA et al.,2008).
O azul de toluidina tem sido muito usado, há vários anos, por ser eficiente na
produção de oxigênio singleto sob o comprimento de onda máximo de absorção de
630nm, além de se classificar como eficiente na inativação de leveduras, bactérias
gram-positivas
e
gram-negativas
com
a
irradiação
do
laser
(DONELLY;
MCCARRON; TUNNEY, 2008).
Dentre as propriedades desejadas para a escolha de um fotossensibilizador,
pode-se citar: pureza química, intervalo pequeno entre a administração da droga e o
acúmulo máximo no local aplicado, ativação por comprimentos de onda com ótima
penetração no tecido, além de uma formulação simples e e baixa toxicidade no
escuro (ISSA; MANELA-AZULAY, 2010).
2.1.4 Fontes de luz
Apesar de, convencionalmente, os lasers de baixa potência ser utilizados
como fonte de irradiação na terapia fotodinâmica, o uso de Diodo Emissor de Luz
(Light Emitting Diode – LED) tem se fortalecido. O LED é considerado uma fonte de
luz contínua de alta eficiência, baseado nas propriedades de um semicondutor
dopado com duas impurezas diferentes, formando um diodo. Possui propriedades
que resultam em bandas de emissão mais largas, beneficiando a agregação com o
fotossensibilizador e a absorção de energia luminosa. Além disso, apresenta
vantagens como: portáteis, fácil manejo e um menor custo (GENOVESE, 2000).
Considera-se como uma fonte de luz ideal aquela que, por um baixo custo,
fornece uma maior quantidade de luz possível no máximo de absorção do
fotossensibilizador, sem causar efeitos térmicos significativos (MACHADO et al.,
2000).
Devem-se considerar as bandas de absorção dos fotossensibilizadores e a
profundidade de penetração da luz nos tecidos biológicos na escolha da região do
espectro eletromagnético de emissão da fonte de luz (NOWIS et al., 2005).
21
O laser pode ser classificado em duas categorias, baseando-se no nível de
excitabilidade que possivelmente causará no tecido alvo biológico. Na primeira
categoria, denominada de alta intensidade, a energia depositada no tecido é amplo,
a ponto de romper as ligações químicas dessas moléculas ou remover elétrons,
rompendo ou modificando de forma permanente o tecido alvo, através de corte,
coagulação e ablação. Na segunda categoria, denominada de baixa intensidade,
ocorre uma menor excitabilidade, ocorrendo bioestimulação ou bioinibição das
reações químicas e fisiológicas naturais do tecido, regulando as funções fisiológicas
celulares. Os lasers de baixa intensidade apresentam um efeito analgésico, antiinflamatório e biomodulador (LIZARELLI, 2005).
O Laser, geralmente, possui um comprimento de onda correspondente ao
pico de absorção do fotossensibilizante, com capacidade de emissão de luz
monocromática de alta fluência, associada à precisão do foco. Além disso, pode ser
aplicada em regiões de difícil acesso, por meio de fibras ópticas (DOVIGO, 2007).
O Laser, forma de radiação não ionizante, altamente concentrada, com efeitos
térmicos e fotoquímicos nos diferentes tecidos, tem sido eleito como fonte de luz por
não ser invasiva e ser bem tolerada pelos tecidos, além de permitir um melhor
controle de energia específica em estudos experimentais e apresentarem maior
definição na penetração em tecidos biológicos (CARVALHO, 2012).
2.1.5 Inativação da Cândida pela PDT
Em 1999, Jackson et al. avaliaram o efeito antimicrobiano da terapia
fotodinâmica contra Candida albicans, utilizando o laser de baixa potência (HeNe),
com energia de 35 mW e comprimento de onda de 632,8 nm, e azul de toluidina
como fotossensibilizador. As variáveis estudadas foram a concentração do azul de
toluidina, a dose de luz laser e o tempo pré-irradiação. Os resultados deste estudo
demonstraram que ambas as formas de C. albicans, levedura e hifas, bem como
cepas resistentes aos antifúngicos azólicos, podem ser sensibilizadas com baixas
doses de luz laser, sendo 42 J dose mais eficaz, quando associadas a azul de
toluidina em curto período de tempo (2-5 min).
22
Teichert et al. (2002) definiram que no tratamento de candidíase com a PDT,
utilizando AM como FS, apresenta algumas vantagens em ralação à terapia
medicamentosa tradicional, pois apresenta mecanismos de ação, nas células,
diferentes das drogas antifúngicas, atenuando os casos de desenvolvimento de
resistência ao medicamento, e pode ser uma alternativa terapêutica eficaz contra
cepas já resistente de C. albicans. Além disso, nos pacientes HIV positivo, que
recebem uma infinidade de prescrição de medicamentos, os profissionais devem
sempre estar em alerta a possíveis interações entre medicamentos. Nestes casos, a
PDT é modalidade de tratamento antifúngica segura, já que o FS é aplicado
topicamente, fazendo com que a probabilidade de interações com outros
medicamentos seja pequena.
Strakhovskaya et al. (2002) pesquisaram novos métodos de controle de
microrganismos patogênicos utilizando PDT. Os autores experimentaram a
inativação de Candida albicans fotossensibilizada por corantes khlorin; estudadas as
características específicas desse efeito; e compararam a fotossensibilidade relativa
do estirpe de referência de C. albilatas, com algumas outras amostras desta espécie
recém-isoladas de material clínico e leveduras não patogênicas dos resultados
gênero Candida. Os resultados deste trabalho mostraram que uma série de
características específicas de inativação da cepa Candida albicans ATCC 24433
fotossensível por corantes khlorin (dependência do efeito sobre a duração da préincubação com corantes, curvas de concentração e eficiência relativa das
concentrações equimolares de fotossensibilizantes) foram semelhantes para as
características específicas de fotossensibilização inativação de C. guilliermondii. Em
outras palavras, as estirpes não patogênicas do gênero Candida podem ser
utilizadas
para
avaliação
laboratorial
preliminar
da
eficiência
de
novos
fotossensibilizadores. Os achados sugeriram que a PDT é um método suficiente e
seletivo para inativar patógenos de superfície de origem microbiana e de fungos sem
causar danos aos tecidos subjacentes.
Bliss et al. (2004) pesquisaram a terapia fotodinâmica (PDT) e definiram que a
mesma é um processo em que as células são tratadas com um agente que torna
susceptíveis
à
morte
por
exposição
à
luz. Estes
agentes,
denominados
fotossensibilizadores, são geralmente compostos macrocíclicos que exibem mínimas
ou nenhuma toxicidade inerente mas resultam na geração de espécies de oxigênio
23
reativas citotóxicos quando ocorre excitação com luz de comprimento de onda
adequado. Os autores usaram como FS o photofrin em PDT, verificando redução
semelhante da atividade metabólica de Candida albicans e Candida krusei. No
entanto, a Candida glabrata mostrou resistência a este tipo de terapia.
Demidova e Hamblin (2005a) testaram o efeito da PDT na fotoinativação de
cepas de Escherichia coli, S. aureus e Candida albicans em suspensões celulares
com diferentes concentrações celulares. Os fotossensibilizadores testados foram o
rosa bengala, azul de toluidina e conjugado de poli-lisina associados a uma fonte de
luz não coerente. As suspensões celulares foram incubadas com os FSs em
concentrações variadas durante 20 minutos. Após o período de incubação, alíquotas
de 200µl das suspensões foram transferidas para uma placa de 96 poços e
iluminadas com doses de luz que variaram entre 0 e 200J/cm2. Os comprimentos de
onda (ʎ) utilizados foram 552nm para as amostras impregnadas com o rosa bengala,
620nm para as amostras tratadas com o azul de toluidina e 400nm para as amostras
tratadas com o conjugado de poli-lisina. Após a irradiação foram obtidas diluições
seriadas de cada amostra que foram plaqueadas e mantidas a 37°C por 48 horas
para a obtenção do número de ufc/ml. Os resultados demonstraram que quanto
maior a concentração celular da suspensão, uma maior concentração do FS é
necessária. O FS mais eficiente na fotossensibilização das espécies testadas foi o
conjugado de poli-lisina. Candida albicans foi a espécie mais resistente aos efeitos
da PDT. Os autores concluíram que, por possuir um tamanho 10 a 50 vezes maior
que a célula bacteriana, a célula fúngica necessita de uma maior quantidade de
oxigênio singleto para sua inativação e que a membrana nuclear das células
fúngicas podem atuar como uma barreira adicional para a penetração do FS.
Lambrechts,
Aalders, Van Marle (2005), usaram a porfirina como um
fotossensibilizador que, em combinação com luz pode inativar bactérias, fungos e
vírus. Para a melhor eficácia da PDT de fungos clinicamente relevantes, como
a Candida albicans, buscaram compreender o mecanismo de funcionamento,
seguindo a resposta da Candida albicans exposta a PDT usando microscopia
confocal de fluorescência e microscopia eletrônica de congelar-fratura. Concluíram
que Candida albicans pode ser desativada com sucesso pelo FS, a membrana
citoplasmática é a organela alvo.
24
Souza et al. 2006 estudaram os efeitos da radiação laser (685 nm)
associados a FS sobre a viabilidade de diferentes espécies do gênero Candida.
Suspensões de Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida tropicalis e
Candida krusei, contendo 106 células viáveis por mililitro foram obtidas de cada uma
das espécies. Dez amostras da suspensão de células foram irradiadas com laser de
díodo (685 nm) com 28 J/cm2 na presença de AM (0,1 mg/ml), 10 amostras foram
tratadas apenas com AM, 10 amostras foram irradiadas com o laser, na ausência do
corante. De cada amostra, uma série de diluições de 10-2 e 10-3 foram obtidas e
alíquotas de 0,1 ml de cada diluição foram plaqueadas em duplicata em ASD. Após
incubação a 37oC durante 48h, o número de unidades formadoras de colônias
(UFC/ml) foi obtido. A radiação laser na presença de azul de metileno, reduziu o
número de UFC/mL em 88,6% de C. albicans, de 84,8% para C. dubliniensis , 91,6
% para C. krusei e de 82,3% de C. tropicalis. Concluíram que a PDT apresentou
efeito fungicida em todas as espécies de Candida estudadas.
Munin et al. (2007) estudaram o efeito da quimioterapia fotodinâmica
antimicrobiana (PACT), como um potencial tratamento antimicrobiano sobre a
formação do tubo germinativo por Candida albicans. Formação do tubo do germe foi
induzida por soro de cabra após diferentes tratamentos com azul de metileno (AM) e
laser (683nm). Os resultados demonstraram que a PDT usando AM, inibe o
crescimento e a formação do tubo germinativo de Candida albicans.
Cadastro et al. (2008) estudaram a queilite angular tendo como agente
etiológico o fungo Candida geralmente do tipo albicans. Frente às limitações das
terapêuticas convencionais para o tratamento da candidíase oral, ou mesmo nos
casos de resistência aos fungos nas medicações instituídas, outras formas de
tratamento devem ser preconizadas. Este artigo evidencia a utilização da terapia
fotodinâmica no tratamento da candidíase, como uma alternativa eficaz de
tratamento, consistindo na associação do laser de baixa intensidade de potência ao
fotossensibilizador azul de metileno, aplicado sobre a queilite angular. Conclui-se
que o tratamento da queilite angular utilizando a PDT evidenciou ausência de lesões
clínicas e citológicas, reforçando fácil aplicabilidade, sem a presença de efeitos
colaterais adversos, tornando-se um método alternativo de tratamento efetivo e
recomendado.
25
Chabrier-Rosello, et al. (2008) estudaram as infecções das mucosas
causadas pelo fungo patogênico Candida. Estudos prévios demonstraram que as
formas filamentosas e biofilmes de Candida albicans foram sensíveis a PDT
utilizando o Photofrin como fotossensibilizador. Relataram que o FS de porfirina é
eficaz na PDT contra as formas de levedura de C. albicans e C. glabrata. Estirpes
com deficiência respiratória (RD) de C. albicans e C. glabrata exibiram um padrão de
resistência pleiotrópica, incluindo a resistência aos membros da família de
antifúngicos de azole. Em contraste com este padrão, RD mutantes de ambos C.
albicans e a C. glabrata foram significativamente mais sensíveis à PDT em
comparação com as estirpes parentais. Estes dados sugeriram que a função
mitocondrial intacta pode fornecer um nível basal de defesa antioxidante contra a
fototoxicidade induzida por PDT em Candida.
Peloi et al. 2008 propuseram o uso do vermelho diodo emissor de luz (LED)
como uma fonte de luz alternativa para o AM como FS em PDT. Sua eficácia foi
testada contra o Staphylococcus aureus (ATCC 26923), Escherichia coli (ATCC
26922), Candida albicans (ATCC 90028) e Artemia salina. O máximo de absorção
das luzes LED era no comprimento de onda de 663 nm a intensidades de 2,4,6 e 12
J/cm2 para 10, 20, 30 e 60 minutos de exposição, respectivamente. Concluíram que
LED vermelho é um dispositivo de luz promissora para PDT que podem
efetivamente inibir bactérias, leveduras e crescimento de microcrustáceos.
Cormick, et al. (2009) avaliaram a ação fotodinâmica in vitro da porfirina sobre
a Candida albicans. A inativação através de fotossensibilizadores de suspensão
celular de C. albican aumenta com a concentração do fotossensibilizador, causando
uma redução de aproximadamente 5 log de sobrevivência celular, quando as
culturas são tratadas com 5 µM de porfirina catiônica e irradiada durante 30 min. No
entanto, o fototoxidade diminui com um aumento na densidade das células, de
acordo com a sua baixa ligação às células. A elevada atividade fotodinâmica de
porfirinas catiônicas foi confirmada por experiências de atraso de crescimento. A
capacidade de inativação fotodinâmica destes sensibilizadores também foram
avaliadas em células de C. albicans que cresceram em colônias em superfícies de
ágar. Porfirinas catiônicas produziram um atraso de crescimento de colônias de C.
albicans e a viabilidade das células não foi observada depois de 3 horas de
irradiação, indicando uma inativação completa de células de levedura. Portanto, os
26
resultados
indicaram
que
estas
porfirinas
catiônicas
são
sensibilizadores
interessantes para inativação fotodinâmica de leveduras em suspensões líquidas, ou
localizadas em focos de infecção.
Giroldo et al. (2009) pesquisaram sobre quimioterapia fotodinâmica como
terapia antimicrobiana (PACT) e definiram que
é uma potencial terapia
antimicrobiana que combina luz e uma droga fotossensibilizante, promovendo um
efeito fototóxico das células tratadas, em geral através de dano oxidativo. Neste
trabalho foi estudado o efeito da PACT, usando azul de metileno (AM), sobre a
permeabilidade da membrana Candida albicans. Seus resultados demonstraram que
a combinação de AM e laser (684 nm) promove uma diminuição no crescimento de
Candida. A inibição foi mais pronunciado na presença de 0,05 mg / ml de AM e com
uma densidade de energia de 28 J/cm2. A diminuição no crescimento de Candida foi
associada com um aumento na permeabilização da membrana. Assim, sugere-se
que um mecanismo PACT usando AM pode estar relacionado a danos nas
membranas plasmáticas das células.
Dovigo et al. (2010) avaliaram a suscetibilidade in vitro de C. albicans, C.
dubliniensis , C. tropicalis e C. krusei para a terapia fotodinâmica (PDT), induzida por
Fotogem® e o diodo emissor de luz (LED). Suspensões de cada Cândida estirpe
foram tratadas com três concentrações de FS (10, 25 e 50 mg/L) e expostos a 18,0,
25,5 e 37,5 J/cm2 de luz (LED fluências ~ 455 nm). As suspensões de controle
foram tratadas apenas com concentrações de FS, apenas exposto às influências de
luz LED ou não expostos à luz LED nem ao FS. Diluições em série foram obtidas e
as alíquotas foram plaqueadas em ASD. Depois da incubação das placas (37°C
durante 48 horas), as colônias foram contadas (ufc / mL) e os dados foram
submetidos à análise de variância e teste de Tukey (p=0,05). Foi observada morte
completa de C. albicans após 18,0 J/cm2, em associação com 50 mg/L de FS. C.
dubliniensis foram inativadas após 18,0 J/cm2 utilizando 25 mg/l do FS. A inativação
de C. tropicalis, foi observada após a fotossensibilização com 25 mg/L e
subsequente iluminação de 25,5 J/cm2. Para C. krusei, nenhuma das associações
entre FS e luz resultou na completa morte desta espécie. A PDT se mostrou eficaz
para a inativação de C. albicans, C. dubliniensis e C. tropicalis. Além disso, a
redução na viabilidade de C. krusei foi alcançada com alguns FS e associações de
luz.
27
Mang,
Mikulski,
Sala
(2010)
avaliaram
a
capacidade
de
eliminar
eficientemente isolados resistentes aos antifúngicos de Candida usando Photofrin
induzida pelo PDT. Estirpes de Candida a partir de ATCC, assim como isolados
resistentes e sensíveis fluconazol e anfotericina B a partir de adultos com AIDS
foram cultivadas sob condição padrão. Photofrin foi adicionado às culturas
apropriadas como dito pelo desenho experimental. Foi empregada luz às culturas
utilizando uma fonte de laser de 630 nm, a uma densidade de potência 150 mW/cm2
de energia, pois o tempo apropriado para proporcionar 45-135 J/cm2. Ensaios de
formação de colônias foram usados para determinar a sobrevivência. Depois de
culturas tratadas com PDT, observaram uma significativa redução na capacidade de
formação de colônias em todas as doses de luz examinadas. Isolados de pacientes
com AIDS que tinham demonstrado resistência antifúngica mostraram sensibilidade
à terapia fotodinâmica assim como controle de culturas ATCC da mesma estirpe. Os
autores concluíram que Photofrin induzido por PDT pode eliminar espécies de
Candida com eficiência significativa, revelada pela capacidade de formação de
colônia. Outras Candidas isoladas de pacientes com AIDS demonstraram-se
suscetíveis à morte através da terapia fotodinâmica.
Mima et al. (2010) estudaram a eficácia da terapia fotodinâmica (PDT) na
inativação de Candida albicans in vivo. Selecionaram setenta e um ratos Swiss
fêmeas de 6 semanas de idade, sendo estes imunossuprimidos, com tetraciclina na
água, por via oral, isentos de microorganismos. Foi aplicada suspensão de C.
albicans (107 UFC/mL) e quatro dias após a inoculação oral, a PDT foi realizado no
dorso da língua após a administração tópica de Fotogem a 400, 500 ou 1000 mg/L e
30 minutos mais tarde, seguido pela iluminação com a luz do LED (305 J/cm2) em
455 ou 630 nm (n = 5 cada). Os animais foram sacrificados, as línguas
cirurgicamente removidas e processadas para avaliação histológica da presença de
leveduras e reação inflamatória. A PDT resultou numa redução significativa na C.
albicans quando comparados com os ratos do grupo de controle positivo. Não houve
diferença entre as concentrações de Photogem e comprimentos de onda de luz
utilizada. A avaliação histológica da língua revelou que a PDT não causa efeitos
adversos significativos da mucosa local.
Pereira et al. (2010) estudaram o biofilme e verificaram que o mesmo é
constituído por uma comunidade diversificada de microrganismos aderida sobre
28
superfícies sólidas. Onde sua presença constitui o primeiro passo para o
desenvolvimento de cárie dentária e doença periodontal, o que torna necessário a
avaliação da eficácia de novas alternativas, como a terapia fotodinâmica (PDT), para
promover a sua eliminação. Avaliaram a ação da PDT no desenvolvimento de
biofilmes formados in vitro por C. albicans. Os biofilmes foram formados em discos
de resina acrílica esterilizados, colocados em placas de 24 poços, com 2 mL de
caldo BHI sacarosado, incubadas a 37oC por cinco dias. Após este período foi
avaliada a ação do fotossensibilizador azul de metileno (AM) e aplicação do laser
AsGaAl, isoladamente e em conjunto, seguido da semeadura de alíquotas em
diluição a base de 10 em Ágar Sabouraud Dextrose, e incubação a 37oC/48h. As
UFC/mL foram transformadas em Log, e os resultados analisados estatisticamente.
O AM juntamente com o laser AsGaAl promoveu redução de 1,04 Log em relação ao
grupo controle, com estatística significante (p< 0,05), demonstrando a ação
antifúngica da PDT em biofilmes de C albicans.
Quiroga, Alvarez e Durantini (2010) avaliaram a atividade fotodinâmica de
porfirina tetracatiônica in vitro em células de Cândida albicans, em diferentes
condições experimentais. Esta apresenta como característica ligar-se rapidamente
para as células de C. albicans, atingindo um valor de 1.7 nmol 10-6 células quando
as suspensões celulares (106 UFC/mL-1) foram incubadas com 5 µM de
sensibilizador. A Inativação fotossensibilizada de Candida albicans aumenta com a
concentração de ambos, sensibilizador e tempo de irradiação, causando uma
diminuição no registro de sobrevivência das células quando as culturas são tratadas
com o FS e irradiada durante 30 min. No entanto, a fototoxicidade diminui após um
passo de lavagem, com a diminuição do sensibilizador ligado às células. O
crescimento de células de C. albicans foi detido quando as culturas foram expostas
ao FS e luz visível. Em superfícies de ágar, o efeito fototóxico deste sensibilizador, o
que causou uma inativação das células de C. albicans, manteve-se elevada. Estes
estudos indicaram que a porfirina catiônica é um sensibilizador eficaz na inativação
de leveduras em ambas as suspensões líquidas ou localizadas sobre uma superfície
para terapia fotodinâmica.
Souza et al. (2010) estudaram os efeitos específicos da terapia fotodinâmica
(densidade de energia 15,8 J/cm2, 26,3 J/cm2 e 39,5 J/cm2), utilizando o azul de
metileno, azul de toluidina e verde de malaquita como fotossensibilizantes e baixa
29
potência de irradiação a laser na viabilidade de Candida albican. Suspensões de C.
albicans com 106 células/ml foram padronizadas num espectrofotômetro. Para cada
tipo de corante, 120 ensaios, divididos em quatro grupos de acordo com as
seguintes condições experimentais, foram realizadas: irradiação a laser na presença
do fotossensibilizador, irradiação com laser, o tratamento apenas com apenas o
fotossensibilizador; sem exposição à luz laser ou fotossensibilizador. Em seguida,
foram preparadas diluições em série e semeadas em ASD para a determinação do
número de unidades formadoras de colónias por mililitro (UFC/mL). Os resultados
foram submetidos a análise de variância e o teste de Tukey (P <0,05). A terapêutica
fotodinâmica usando os fotossensibilizadores testados foi eficaz na redução do
número de C. albicans. O número de UFC/ml foi reduzido entre 0,54 log10 e 3,07
log10 e dependeu da densidade de energia do laser utilizado. O AT, AM e verde de
malaquita foram fotossensibilizantes eficazes na terapia fotodinâmica antimicrobiana
contra C. albicans.
Tessarolli (2010) pesquisou sobre efeito da terapia fotodinâmica em seres
humanos, onde verificou que nas últimas décadas o emprego da luz associada a
corantes surgiu como um tratamento alternativo ao uso de agentes antimicrobianos
tradicionais. O objetivo desta pesquisa foi analisar comparativamente o efeito da
clorexidina e da PDT (com dois tipos de fotossensibilizadores: Azul de Toluidina e
Clorofila Líquida (CL)) sobre biofilmes dentários humanos formados in situ. Após 48
horas, diferentes terapias foram aplicadas sobre o biofilme: (1) água destilada:
controle negativo; (2) clorexidina; (3) irradiação por laser; (4) AT; (5) AT + laser; (6)
CL; (7) CL + laser. O biofilme então foi coletado e solubilizado. Em seguida,
amostras foram semeadas em placas de Petri com diferentes meios de cultura, para
contagem do número de microrganismos totais, estreptococos totais, Streptococcos
mutans, Lactobacilos e Candida albicans. Amostras também foram coradas com
Laranja de Acridina e visualizadas em microscopia de fluorescência, para análise da
viabilidade das células presentes. Os resultados dos plaqueamentos apenas nos
deram informações sobre os microrganismos totais e estreptococos totais,
mostrando que a única redução significante dos microorganismos em relação ao
grupo (1) ocorreu no grupo tratado por CLX (2). As outras terapias mostraram uma
sensível redução. A viabilidade por microscopia por fluorescência se mostrou
semelhante em todos os grupos. A pesquisadora concluiu que a clorexidina
30
comprovou seu efeito antimicrobiano, porém mais estudos precisam ser realizados
para verificar o real papel da PDT sobre biofilme dentário humano.
Costa et al. (2011) estudaram culturas de suspensões planctônicas
padronizadas (106 células/ml) de C. albicans e C. dubliniensis tratadas com
concentrações de eritrosina de 0,39-200 µM e LEDs. Os biofilmes formados por C.
albicans e C. dubliniensis, no fundo de uma placa de microtitulação de 96 poços
foram tratados com 400 µM de eritrosina e LEDs. O efeito antimicrobiano da PDT
contra culturas planctônicas e biofilmes foram verificadas através da contagem de
unidades formadoras de colônias (UFC/ mL), e os dados foram submetidos à análise
de variância e teste de Tukey (P<0,05). C. albicans e C. dubliniensis não foram
detectáveis após PDT de culturas planctônicas com concentrações de 3,12 µM
eritrosina ou superior. Concluíram que C. albicans e C. dubliniensis foram sensíveis
à eritrosina e LED mediada por PDT, mas os biofilmes de ambas as espécies de
Candida foram mais resistentes do que os seus homólogos planctônicos.
Costa et al. (2011) avaliaram os efeitos da terapia fotodinâmica (PDT) com
rosa bengala ou eritrosina com diodo emissor de luz (LED) em Candida albicans
culturas planctônicas e biofilme. Culturas planctônicas e biofilme de cada cepa C.
albicans foram submetidos às seguintes condições experimentais: (a) tratamento
com rosa bengala e LED (L+RB+); (b) o tratamento com eritrosina e LED (E+L+); e
(c) grupo controle, sem irradiação LED ou tratamento fotossensibilizador (P-L-). Após
a irradiação das culturas planctônicas e biofilmes, as culturas foram semeadas em
ASD (37°C a 48h) para contagem de unidades formadoras de colônias (UFC ml-1)
seguido por posterior teste ANOVA e teste de Tukey (P<0,05 ). Os biofilmes foram
analisados por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os resultados
revelaram uma redução significativa das culturas planctônicas para culturas que
foram submetidos à PDT usando eritrosina ou Rosa Bengala. Os resultados
mostraram que eritrosina e rosa bengala mediada pela PDT com irradiação LED é
efetiva no tratamento de C. albicans.
Dai et al. (2011) investigaram a terapia fotodinâmica (PDT) utilizando corante
azul e luz vermelha, para a profilaxia e tratamento de infecções cutâneas por
Candida albicans em camundongos. Um modelo de rato de abrasão da pele
infectada com C. albicans foi desenvolvido em feridas medindo 1,2 centímetros por
31
1,2 centímetros, com 106 ou 107 UFC. Os sais fenotiazínicos azul de toluidina, azul
de metileno, e novo azul de metileno (NAM) foram comparados como
fotossensibilizadores para a inativação fotodinâmica de C. albicans in vitro. A PDT in
vivo, foi iniciada em 30 min ou 24 h após a inoculação do fungo para investigar as
eficácias de ambos as PDT, para a profilaxia e tratamento de infecções. Luz a
635±15 nm ou 660± 15 nm foi entregue com uma dose de luz de 78 J/cm2 ou 120
J/cm2 (para PDT em 24h após a infecção) em várias exposições com a tomada de
imagem de bioluminescência. Os estudos in vitro mostraram que o NAM foi superior
a AT e AM como FS na inativação fotodinâmica de C. albicans. A eficácia de PDT foi
relacionada com a proporção de concentração de FS à densidade da célula fúngica.
PDT in vivo iniciada em 30 min ou 24 h após a infecção reduziu significativamente a
carga de C. albicans nas feridas dos camundongos infectados por abrasão da pele.
Estes dados sugeriram que a PDT é uma abordagem viável para a profilaxia e
tratamento de infecções cutâneas de C. albicans.
Dovigo et al. (2011a) pesquisaram terapia fotodinâmica e verificaram que a
mesma tem sido uma grande promessa para a inativação de espécies de
Candida. Os autores descreveram a associação do Photogem®, com LED (diodo
emissor de luz) para o fotoinativação de Candida albicans e Candida glabrata de
resistentes ao fluconazol (FR). Suspensões de cada estirpe de Candida foram
tratadas com cinco concentrações de Fotogem® por 30 min. E irradiadas com luz
LED 125 mW/cm2 e comprimento de onda de 450 nm,e expostas a quatro
densidades de energia (10,5, 18, 25,5, 37,5 J/cm2) resultando nos seguintes tempos
de iluminação (14, 24, 34 ou 50 min.). Após incubação (48 horas a 37°C), foram
contadas as UFC. Suspensões planctônicas de estirpes de FR foram efetivamente
inativadas após PDT. Observou-se que o efeito fungicida da PDT foi dependente da
estirpe. Os resultados desta investigação demonstraram que, embora a PDT foi
eficaz contra espécies de Candida, as cepas resistentes ao fluconazol mostraram
sensibilidade reduzida a PDT.
Dovigo et al. (2011b) avaliaram a terapia fotodinâmica (PDT) mediada pela
curcumina (CUR) contra isolados clínicos de C. albicans, C. tropicalis e C. glabrata,
na planctônicas e formações de biofilme. As suspensões de Candida foram tratadas
com três concentrações de CUR e expostas a quatro densidades de energia LED.
Os resultados demonstraram que o uso de CUR em associação com luz foi capaz de
32
promover um efeito antifúngico significativo contra a forma planctônicas das
leveduras. Quando se utiliza 40 µM e fluência 18 J/cm2, a atividade metabólica de C.
albicans, C. glabrata, C. tropicalis e biofilmes foram reduzidos em 85%, 85%, e 73%.
A CUR mediada por PDT também diminuiu a biomassa do biofilme de todas as
espécies avaliadas. Concluíram que as concentrações baixas de CUR podem ser
altamente eficazes para inativação de isolados de Candida, quando associada com
excitação luz.
Lyon et al. (2011) ao pesquisar sobre a terapia fotodinâmica (PDT),
verificaram ser uma abordagem minimamente invasiva, em que um composto
fotossensibilizador é ativado por exposição à luz visível. A ativação dos resultados
de drogas sensibilizantes em várias reações químicas, tais como a produção de
espécies reativas de oxigênio e de outras moléculas reativas, cuja presença no local
biológico leva à deterioração das células alvo. Uma vasta gama de microrganismos,
incluindo bactérias Gram positivas e Gram negativas, vírus, protozoários e fungos
demonstraram
susceptibilidade
a
terapia
fotodinâmica
antimicrobiana.
Este
tratamento pode consistir de uma alternativa para o tratamento de infecções
fúngicas. Terapia fotodinâmica antifúngica tem sido empregada com sucesso contra
Candida albicans e outras espécies de Candida e também contra dermatófitos. O
efeito antifúngico dependente da estirpe e a influência do meio biológico são
problemas importantes que devem ser considerados. Além disso, a escolha do
fotossensibilizador para ser utilizado em PDT devem considerar as características
dos fungos e o meio a ser tratado, bem como a profundidade de penetração de luz
para dentro da pele.
Martins et al. (2011) avaliaram os efeitos da PDT sobre a patogenicidade de
Candida albicans. Cinquenta e seis ratos foram submetidos ao desenvolvimento da
candidíase no dorso da língua por C. albicans. Após 5 dias, foram administrados
tratamentos diferentes: laser e azul de metileno (L+AM+); laser somente (L+AM-);
apenas o fotossensibilizador (L-AM+); e solução fisiológica única (L-AM-). As
amostras da cavidade oral foram coletadas para a contagem de unidades
formadoras de colônias por mL. Colônias foram isoladas para avaliação de
atividades proteinase e fosfolipase. Os ratos foram mortos para análise microscópica
do dorso da língua. Os dados foram analisados por análise de variância, teste de
Kruskal-Wallis, e Bonferroni. O número de C. albicans recuperadas da cavidade oral
33
dos ratos foi semelhante entre os grupos (P=0,106). O grupo L+AM+ apresentaram
menos lesões microscópicas de candidíase do que o grupo L-AM- (P=001). O grupo
L+AM+ apresentou atividade de proteinase menor em comparação com os outros
grupos, com diferença significativa entre os grupos L+AM+ e L-AM+ (P=0,018).
Concluiram que a terapia fotodinâmica reduziu as lesões microscópicas de
candidíase experimental em ratos, e inibiu a atividade de protease de C. albicans.
Mima et al (2011) avaliaram a eficácia da terapia fotodinâmica (PDT) para a
inativação de diferentes espécies de Candida em próteses totais superiores.
Colheram amostras de referência de C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C.
dubliniensis e C. krusei para a realização dos testes. Trinta e quatro próteses foram
fabricadas em um procedimento padronizado e submetido a esterilização por óxido
de etileno. As próteses foram inoculados individualmente com uma das estirpes e
foram incubadas a 37°C durante 24h. As Próteses submetidos à PDT (FS+L+) foram
pulverizadas individualmente, com 50 mg/L de Photogem (PS) e, após 30 min,
iluminado por uma luz LED (37,5 J / cm2) por 26 min. Dentaduras adicionais foram
tratadas apenas com FS (FS+L-) ou laser (FS-L +). As amostras das diluições em
série foram espalhadas em ASD e incubadas a 37°C durante 48h. As colônias foram
contadas e os valores de log (ufc / mL) foram analisadas através de Kruskall-Wallis e
Dunn testa (p<0,05). Concluíram que PDT foi um método eficaz para reduzir a
Candida spp. em dentaduras.
Pereira et al. (2011) avaliaram os efeitos específicos de inativação
fotodinâmica (PDI), usando AM como FS em baixo consumo de energia de
irradiação laser sobre a viabilidade de biofilmes formados por C. albicans, S. aureus
e S. mutans. Os biofilmes foram cultivados em discos de acrílico imersos em caldo
de infusão de cérebro e coração, contendo 5% de sacarose, inoculados com
suspensão microbiana (106 células/ml) e incubou-se durante 5 dias. No quinto dia,
foram avaliados os efeitos do fotossensibilizador azul de metileno (AM), a uma
concentração de 0,1 mg/ml, durante 5 min e laser AlGaInP (660 nm) durante 98s,
por si só e conjugados. Em seguida, os discos foram colocados em tubos com
solução fisiológica estéril. Diluições em série de dez vezes foram realizadas e as
alíquotas semeadas em ágar seletivo, que foram então, incubadas durante 48h. Em
seguida, os números de UFC/ml (log10) foram contados e analisados
estatisticamente (ANOVA, Tukey, p<0,05). Fizeram microscopia eletrônica de
34
varredura (MEV) e controle de biofilmes em discos tratados com grupos PDI. Foram
observadas reduções significativas na viabilidade de todos os microorganismos para
biofilmes expostos ao PDI mediada por corante AM. Reduções (log10) de biofilmes
de uma única espécie foi maior (2,32 a 3,29 log10) do que a associação de biofilmes
(1,00 a 2,44 log10). Os resultados mostraram que o PDI mediada pelo corante AM,
pode ser uma abordagem útil para o controle de biofilme oral.
Rezusta
et
al.
(2012)
estudaram
o
Hypericin
como
sendo
um
fotossensibilizador natural considerado para nova geração de medicamentos de
terapia fotodinâmica (PDT). Avaliaram o efeito in vitro do fungicida Hypericin durante
a terapia fotodinâmica em várias Candida spp. Avaliando sua fotoxicidade aos
queratinócitos e fibroblastos dérmicos para determinar possíveis efeitos colaterais.
Um efeito fungicida 3 log foi observado a 0,5 McFarland para duas estirpes de
Cândida albicans, Cândida parapsilosis e Cândida krusei com concentrações de
hipericina de 0,625, 1,25, 2,5 e 40 µM, respectivamente, a uma fluência de 18 J/cm-2
(lâmpada de diodo emissor de luz que emite a 602 ± 10 nm). Para obter uma
redução de 6 log, significativamente maior concentração de Hypericin foi necessária
com maiores doses de luz (C. albicans 5 µM, C. parapsilosis 320 µM e C. krusei 320
µM; dose de luz 37 J cm2). Queratinócitos e fibroblastos podem ser preservados,
mantendo a concentração abaixo de 1 µm e a dose de luz inferior a 37 J/cm2.
Concluíram que o Hypericin associada a PDT parece ser adequada para o
tratamento de C. albicans sem dano significativo para as células cutâneas.
Snell,
Foster,
Haidaris
(2012)
observaram
infecções
cutâneas
e
mucocutâneas por Candida que são consideradas alvos importantes para a terapia
fotodinâmica antimicrobiana (PDT). A aplicação clínica desta terapia depende de
estratégias que potencializam a morte microbiana enquanto minimizam o dano ao
tecido hospedeiro. Aumentar a sensibilidade de agentes infecciosos para PDT irá
ajudar a alcançar este objetivo. Os autores demonstraram que o aumento do nível
de estresse oxidativo na Candida, por interferir com a respiração do fungo aumentou
a eficiência do PDT. Assim, buscaram identificar os compostos em uso clínico que
aumentassem o estresse oxidativo causado por PDT, contribuindo para espécies
reativas de oxigênio, utilizando como FS o AM. Os dados sugeriram que o miconazol
poderia ser utilizado para aumentar a eficácia da PDT contra C. albicans, e o seu
mecanismo de ação é provavelmente multifatorial.
35
Questionando o efeito da terapia fotodinâmica no crescimento, aderência e
fatores de virulência da Candida albicans, Costa et al. (2012) avaliaram a ação desta
terapia, mediada por eritrosina e diodo emissor de luz verde (14,34 J/cm2),
no
tratamento de candidíase oral em ratos imunossuprimidos. Além disso, foi avaliada,
in vitro, a adesão de leveduras às células epiteliais bucais. Após os ratos
imunossuprimidos infectados com candidíase oral serem submetidos à terapia
fotodinâmica, as leveduras recuperadas a partir destes foram quantificadas e
analisadas para os efeitos da terapia sobre a sua adesão às células epiteliais bucais.
Macroscopicamente, foi revelado que não houve diferença significativa nas lesões
de candidíase. Porém, microscopicamente, os resultados demonstraram que a
terapia fotodinâmica, mediada por eritrosina e LED, exibiu atividade antifúngica na
candidíase, sem danificar o tecido adjacente; além disso, reduziu significativamente
a adesão de Candida albicans às células epiteliais bucais.
Dai et al (2012) consideraram os fungos como patógenos oportunistas que
podem causar infecções invasivas superficiais ou graves, especialmente em
pacientes imunocomprometidos ou debilitados. Micoses invasivas representam uma
ameaça exponencialmente crescente para a saúde humana devido a uma
combinação de diagnósticos lentos e a existência de poucas classes de drogas
antifúngicas disponíveis e eficazes. Portanto infecções fúngicas sistêmicas resultam
em alta mortalidade. Há uma necessidade urgente de buscar e implantar novas
medidas antifúngicas eficazes. A terapia fotodinâmica (PDT) foi estabelecida como
uma modalidade de sucesso para doenças malignas e degeneração macular
relacionada com a idade, mas a inativação fotodinâmica só recentemente foi
intensamente investigada como uma descoberta e desenvolvimento da plataforma
antimicrobiana alternativa. O conceito de inativação microbiana fotodinâmica requer
exposição a moléculas do fotossensibilizador, quer endógenos ou exógenos,
seguido por energia luminosa visível, normalmente comprimentos de onda na região
do infravermelho, ou próximo ao vermelho que causam a excisão dos
fotossensibilizadores, resultando na produção de oxigênio singleto e outras espécies
reativas de oxigênio que reagem com componentes intracelulares, e inativação de
células.
Khan et al. (2012) exploraram a partícula de ouro reforçada de nanopartículas
na terapia fotodinâmica utilizando como FS o AM contra agentes patogênicos como
36
Candida albicans no biofilme. Foram utilizados métodos físico-químicos (difração de
raios-X, absorção ultravioleta-visível, fóton de correlação cruzada e espectroscopia
de
fluorescência)
e
técnicas
microscopia
eletrônica
para
caracterizar
as
nanopartículas de ouro, bem como nanopartículas de ouro conjugados com azul de
metileno. A densidade de energia de 38,2-J/cm2 de 660 nm de laser de diodo foi
aplicada para a ativação de nanopartículas de ouro com azul de metileno contra
biofilme de C. albicans e células de azul de metileno. Os ensaios antibiofilme,
utilizaram de microscopia eletrônica de varredura e laser confocal e investigaram os
efeitos do conjugado. Concluíram que se pode usar a terapia fotodinâmica de
nanopartículas de ouro mediada por conjugado contra biofilme de Candida albicans.
Junqueira et al. (2012) estudaram os biofilmes formados por leveduras
oportunistas, que
servem como um reservatório persistente de infecção e
prejudicam o tratamento de doenças fúngicas. Os mesmos avaliaram a inativação
fotodinâmica (PDI) de biofilmes formados por Candida spp. e os patógenos
mucóides Trichosporon emergentes e Kodamaea ohmeri por uma nanoemulsão
catiônica de zinco. Os biofilmes formados por leveduras, após 48h, na parte inferior
das placas de microtitulação de 96 poços foram tratadas com o fotossensibilizador
zinco catiônico e um laser de GaAIAs (26,3 J/cm-2). As células do biofilme foram
raspadas da parede de poço, homogeneizadas, e semeadas em placas ASD que
foram então incubadas a 37°C durante 48h. As cepas do gênero Candida foram
mais resistentes à PDT de que os patógenos emergentes T. mucoides e K. ohmeri.
Assim, a PDI por tratamento com formulações nanoestruturadas zinco catiônico e
laser reduziu o número de células nos biofilmes formados por estirpes de C. albicans
e Candida não albicans, assim como os patógenos T. mucoidesemergentes e K.
ohmeri.
Mitra et al. (2011) consideraram o fungo Candida albicans como sendo o que
comumente causa infecções das mucosas em pacientes com imunidade
comprometida. Investigaram a eficácia do fotossensibilizador à base de porfirina
(TMP-1363) para o tratamento fotodinâmico (PDT) de C. albicans, in vitro e da sua
seletividade, em um modelo animal. Utilizaram um ensaio de UFC. Estabeleceram
infecção in vivo nos ratos por inoculação de C. albicans no espaço intradérmico do
pavilhão auricular. Dois dias após a infecção, 0,3 mg/mL-1 de TMP-1363 foi
administrado por via tópica. Trinta minutos após a aplicação de TMP-1363, as
37
orelhas foram irradiadas a 514 nm, utilizando uma fluência de 90 J/cm-2 aplicada
com uma irradiação de 50 mW/cm-2. Concluíram que a fotossensibilização com
TMP-1363 resultou em um aumento maior na eliminação de C. albicans do que em
comparação com AM. Ouvidos infectados submetidos à PDT exibiram cura completa
ao longo do tempo, sem danos observáveis ao pavilhão auricular.
Oriel e Nitzan (2012) estudaram e encontraram o mecanismo de
fotoinativação de Candida albicans por 3,5 µM de porfirinas não carregadas,
catiônicas ou aniônicas sob a luz azul (407-420 nm), dependendo da absorção de
porfirinas em células de levedura, de acordo com a presença ou ausência de
proteínas no meio de fotossensibilização. A terapia fotodinâmica resultou na
erradicação de todas as três porfirinas. As análises de Raio-x depois da terapia
fotodinâmica pelas porfirinas não carregadas ou catiônicas resultou na perda de íons
para o meio e exibiu proteínas de baixa, indicando os danos da membrana celular.
Microscopia eletrônica de transmissão indicou dano celular e cromossômico. A
eficiência da fotoerradicação de C. albicans é dependente da absorção de porfirina,
o que pode levar (mediante iluminação) para processos que facilitem a formação de
espécies de oxigênio reativas que danifiquem as células. A absorção de porfirinas
carregadas depende da quantidade e qualidade da proteína no microambiente
fotossensibilização. Este fato deve ser levado em conta quando se utiliza
fotossensibilizantes carregadas.
Szentmáry et al. (2012) verificaram que estudos experimentais têm
demonstrado que a PDT com maiores concentrações de fotossensibilizantes podem
induzir necrose e apoptose de células da córnea e que a sobrevivência de cepas de
Candida albicans pode ser reduzida em uma escala LogMar por 1-2 linhas. Assim,
alguns autores afirmaram que a terapia fotodinâmica pode ser uma alternativa na
terapia de doenças oculares infecciosas resistentes. No entanto, as limitações desta
opção terapêutica em particular necessitam de maior investigação.
Chien et al. (2013) verificaram ser a resistência de infecções por Candida a
medicamentos
como
um
importante
problema
de
saúde
entre
pacientes
imunocomprometidos. A terapia fotodinâmica foi introduzida como uma alternativa
de tratamento para infecções locais. Embora a Candida demonstrou susceptibilidade
para PDT, são necessárias doses elevadas de fotossensibilizador (FS) e a energia
38
da luz, o que pode ser prejudicial para as células eucarióticas humanas. Eles
descreveram a capacidade da quitosana, um biopolímero policatiônico, para
aumentar a eficácia de PDT contra C. albicans, assim como isolados clínicos
resistentes ao fluconazol em planctônicos ou estados de biofilme. A quitosana foi
mostrada para aumentar a eficácia do efeito da PDT mediada por azul de toluidina.
A Quitosana em concentrações tão baixas quanto 0,25% erradicaram C. albicans;
No entanto, sem tratamento da PDT, a quitosana sozinha não demonstrou atividade
anti-microbiana significativa nos 30 minutos de incubação. Os resultados
evidenciaram que a quitosana só aumentou o efeito fungicida, depois de as células
terem sido danificadas pela PDT. O aumento da dose de quitosana ou o
prolongamento do tempo de incubação permitiu uma redução na condição PDT
necessária para erradicar completamente a C. albicans. Concluíram que a
combinação de quitosana com a PDT é uma abordagem promissora para o
tratamento antimicrobiano de doenças infecciosas.
Kato et al. (2013), em seu estudo, avaliaram características da Candida
albicans em condições subletais da terapia fotodinâmica, além de avaliarem se as
alterações foram mantidas nas células filhas. Como fotossensibilizador, o azul de
metileno (0,05 mM) foi eleito, associado a um laser diodo GaAIAs (660nm), como
fonte de luz eleita. In vitro, foram avaliadas características como crescimento da
espécie, formação de tubo germinativo, sensibilidade para o estresse oxidativo e
osmótico, integridade da parede celular, além da susceptibilidade ao fluconazol. In
vivo, utilizando ratos com infecção fúngica sistêmica, foi avaliada a patogenicidade
da C. albicans. As sessões subletais da terapia fotodinâmica reduziram a taxa de
crescimento e a capacidade da C. albicans formar tubos germinativos, quando
comparadas com células não tratadas. Além disso, a resistência ao fluconazol foi
reduzida após a terapia fotodinâmica. Embora, tenha ocorrido alterações, nenhum
dos parâmetros patogênicos foi alterado nas células filhas de C. albicans. In vivo, foi
observado que houve um aumento na sobrevivência dos ratos pré-tratados com
terapia fotodinâmica, comparados com ratos não tratados. Segundo os dados
sugerem, a terapia fotodinâmica, em doses subletais, podem inibir fatores de
virulência e reduzir in vivo a patogenicidade da espécie. Porém, a ausência de
alterações nas células filhas indica que os efeitos, nestas condições, são
transitórios.
39
Paz-Cristobal et al. (2014) investigaram o efeito fungicida da terapia
fotodinâmica contra cepas de Candida albicans resistentes a antifúngicos. Dois tipos
de fotossensibilizadores com mecanismos de ação diferentes foram utilizados,
hipericina e AM, comparando sua eficácia e comparando as espécies reativas de
oxigênio envolvidas na citotoxicidade do corante. As leveduras foram irradiadas por
diodos emissores de luz (LED); para o AM irradiância de 19mW/cm-2; para a
hipericina irradiância de 10,3mW/cm-2. Os dados indicaram que a terapia
fotodinâmica foi eficaz na eliminação in vitro de cepas de Candida albicans,
independente de seu nível de resistência e independente do fotossensibilizador
utilizado no estudo. Porém, a hipericina foi mais eficiente em baixas concentrações,
enquanto que AT foi eficiente em concentrações maiores. Em relação às espécies
de oxigênio reativas, o peróxido de hidrogênio foi a principal espécie fototóxica,
enquanto o dioxigênio singleto foi a espécie mais importante no tratamento a base
de AM
40
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar, in vitro, o efeito da terapia fotodinâmica utilizando o azul de toluidina
como substância fotossensibilizadora, na inativação de espécies do gênero Candida
albicans.
3.2 Objetivos específicos
- Avaliar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica com azul de toluidina
em suas diferentes concentrações na inativação de espécies do gênero Candida;
- Avaliar o efeito antimicrobiano da TFD, utilizando o azul de toluidina em
diferentes tempos de incubação na inativação de espécies do gênero Candida;
- Avaliar a toxicidade do Azul de Toluidina em diferentes concentrações de
espécies do gênero Candida;
- Verificar o efeito do Laser na inativação celular de Candida albicans.
41
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Tipo e local do estudo
Esta pesquisa é do tipo experimental laboratorial e foi realizada no laboratório
do curso de Biomedicina das Faculdades Integradas de Patos- FIP/ PB no período
de abril a julho de 2014.
4.2 Instrumentos
4.2.1 Microrganismo e meio de cultura
Foram utilizadas cepas de Candida albicans (ATCC10231) adquiridas da
coleção de culturas tropical (CCT) da fundação André Tosello (figura 1). O certificado
da cultura encontra-se no anexo A.
Figura 1 – Cepa de Candida albicans utilizada no experimento.
Fonte: Do autor
Para a realização dos experimentos foi utilizado o meio de cultura Agar
Sabouraud Dextrose - ASD (União Química, São Paulo, Brasil) com 5µg/ml
cloranfenicol, conforme preconiza Pereira et al. (2011).
O ASD contendo 5µg/ml de cloranfenicol é um meio seletivo para fungos e
será usado nas semeaduras das placas de Petri após procedimentos experimentais
envolvendo as culturas planctônicas. Para o preparo do meio de cultura, foram
utilizados 65 g do pó para 1L de água destilada, conforme a proporção recomendada
42
pelo fabricante. Após dissolução completa do meio de cultura, o béquer contendo a
mistura foi levado à autoclave vertical para esterilização a 121°C por 15 minutos.
Após a esterilização, ainda na fase líquida, cerca de 20 ml do meio foi vertido em
placas de Petri estéreis descartáveis, mantendo proximidade de 10 cm da chama do
bico de Bunsen (figura 2). As placas de Petri foram individualmente fechadas e
mantidas em temperatura ambiente até a completa solidificação do meio de cultura.
Após a solidificação, todas as placas de Petri foram devidamente identificadas e
datadas e ainda na capela de fluxo laminar era ligada a luz UV com a finalidade de
diminuir a carga microbiana e reduzir a contaminação durante o procedimento (figura
3). Quando essas placas não eram utilizadas no mesmo dia, as mesmas eram
armazenadas em geladeira.
Figura 2 – Preparo do meio de cultura
Fonte: Do autor
Figura 3 – Capela de fluxo laminar com a luz UV ligada (germicida)
Fonte: Do autor
43
4.2.2 Preparação do fotossensibilizador (FS) e tempo de incubação.
O agente fotossensibilizador (FS) utilizado foi o azul de toluidina (AT) PA
(Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil). Soluções de estoque a partir do AT PA, nas
concentrações 75 µg/ml; 150 µg/ml; 300 µg/ml e 600 µg/ml baseados no estudo
piloto (figura 4), foram preparadas por dissolução do pó em solução salina estéril
(SOUZA et al., 2006).
Figura 4 – O fotossensibilizador (AT) em pó e suas concentrações utilizadas
Fonte: Do autor
As soluções com o FS foram filtradas através de uma membrana de filtro
estéril de 0,22 mm e armazenadas em recipiente de cor âmbar por no máximo 14
dias a 4°C no escuro antes de usar, conforme metodologia de diluição fornecida pela
farmácia de manipulação. Durante o experimento, em poços de placas de
microtitulação, 100 µL das soluções de estoque (FS), em temperatura ambiente,
foram novamente diluídas pelo acréscimo 100 µL de suspenção de Candida albicans
em solução salina, resultando em um volume final de 200 µL por cada poço e
concentrações finais de AT reduzida pela metade: 37,5 µg/ml; 75 µg/ml; 150 µg/ml e
300 µg/ml.
Em seguida, o corante AT ficou em contado com as células de Candida
albicans, no escuro e a temperatura ambiente, antes da iluminação, por um período
de incubação de 1, 5, 10 e 20 minutos (tempo de pré-irradiação). As placas de
microtitulação ficaram em um ambiente sem luminosidade e envolvidas por uma
lâmina de papel alumínio para impedir a passagem de luz (Figura 5).
44
Figura 5 – Período de incubação com ausência de luz
Fonte: Do autor
4.2.3 Fonte de irradiação para a terapia fotodinâmica (TFD)
A fonte emissora de luz foi um Laser semicondutor portátil (Figura 6) (Laser
DUO®, GaAlAs, InGaAlP, λ880nm e λ660nm, MM OPTICS LTDA, São Carlos, SP –
Brasil). Este aparelho apresenta potência de saída constante em 100 mW e área do
feixe de laser de 3 mm2, a qual coincide com a área da abertura de cada um dos 96
poços de fundo U das placas de microtitulação utilizadas neste estudo (Figura 7).
Antes de serem realizados os experimentos, o laser foi calibrado com auxílio de um
dispositivo (Check MM OPTICS LTDA, São Carlos, SP – Brasil).
Figura 6 – Laser semicondutor portátil utilizado no estudo
Fonte: Do autor
45
Figura 7 – Área do feixe de laser de 3 mm2, a qual coincide com a área da
abertura de cada poço.
Fonte: Do autor
Para o protocolo de irradiação o equipamento foi ajustado para um
comprimento de onda de 660nm, que correspondente à faixa de absorção do AT, e
para o tempo de iluminação de 128s, resultando em uma densidadede energia de
426 J/cm2.
Previamente a irradiação, a ponteira do laser ficou imersa em solução de
digluconato de clorexidina a 2% por 5 min. para promover a sua desinfecção. Em
seguida, o agente antimicrobiano era removido do inserto por meio de irrigação com
10 ml de solução salina estéril (0,9%) e secado com gaze estéril.
4.2.4 Preparo do inóculo de Candida albicans
Células de Candida albicans (ATCC 10231) foram subcultivadas a partir de
frascos estoques em Agar Sabouraud Dextrose – ASD sob condições aeróbicas a
37oC. Inóculos da levedura, em solução fisiológica esterilizada a 0,85% de NaCl
(MUNIN et al., 2007), foram preparados a partir de culturas de 24h. Após
homogenização com o auxílio do aparelho Vortex (Vision®) durante 2 minutos, a
turbidez da suspensão de células foi ajustada com auxílio de um espectofotômetro
(Biospectro®) a 530 nm para obter suspensões com densidade óptica de 0,284
(Figura 8), correspondente a uma concentração de fungos de 106 unidades
formadoras de colônias por ml (UFC/ml) (PEREIRA et al., 2011; QUEIROGA et al.,
2011; KATO et al., 2013).
46
Figura 8 – Preparo do inóculo
Fonte: Do autor
4.3 Condições Experimentais
Todas as condições testadas foram realizadas no escuro à temperatura
ambiente e em condições assépticas no interior de uma câmara de fluxo laminar
realizadas em duplicata. A luz UV (Lâmpada germicida UV) é ligada antes do
trabalho na câmara afim de diminuir a carga microbiana e reduzir a contaminação
durante a análise, sendo previamente realizado assepsia com álcool 70%. As placas
microtitulação foram cobertas com lâminas de papel alumínio para impedir a
penetração da luz do ambiente.
Foram realizados para todos os grupos, controles da suspensão celular, do
fotossensibilizador, da solução salina e do meio de cultura (Figura 9) em
temperatura ambiente e em estufa, garantindo a ausência de contaminação.
47
Figura 9 - Controle do meio de cultura
Fonte: Do autor
4.3.1 Grupo Terapia fotodinâmica / PDT (Grupo FS+L+)
No grupo terapia fotodinâmica, grupo PDT (FS+L+), as cepas de Candida
albicans foram sensibilizadas com o fotossensibilizador (FS), azul de toluidina (AT),
e expostas ao laser (L). Com agitação constante, alíquotas de 100µl da suspensão
do fungo (106 UFC/ml) foram transferidas individualmente para um poço de uma
placa de microdiluição com 96 poços. Em seguida, foi acrescentado o mesmo
volume de AT (100µl) em uma das concentrações testadas (75, 150, 300 e 600
µg/ml). Posteriormente, as placas contendo as suspensões resultantes foram
deixadas em repouso, no escuro, durante um dos tempos de incubação (1, 5, 10 e
20 min.). Após cada tempo de pré-irradiação, as placas foram abertas e as células
da levedura foram continuamente irradiadas, a partir do topo da placa de
microtitulação, com um diodo laser (comprimento de onda de 660nm; potência de
100mW e dose de 426 J/cm2) por 128 segundos (figura 10). O conteúdo dos poços
foi devidamente agitado no vórtex antes da irradiação e da amostragem para
assegurar que as células da levedura não se depositam no fundo dos poços.
48
Figura 10 - Grupo PDT
Fonte: Do autor
Neste grupo, em todas as condições testadas (concentração do AT x tempo
de incubação) a aplicação foi única.
A ponteira do equipamento foi colocada
perpendicularmente a abertura dos poços e a irradiação foi efetuada com ângulo de
incidência de 90°. Para evitar um possível efeito cumulativo devido ao espalhamento
da radiação, cada amostra foi irradiada e coletada individualmente (QUEIROGA et
al., 2011).
4.3.2 Grupo Azul de Toluidina/ AT (Grupo FS+L-)
No grupo azul de toluidina, grupo AT (FS+L-), o efeito do fotossensibilizador
sozinho, na inativação de células de Candida albicans, foi testado pela a aplicação
49
da solução de AT seguindo o mesmo protocolo estabelecido para o grupo PDT
(FS+L+), principalmente com relação ao volume (100µL), as concentrações testadas
(37,5; 75; 150 e 300 µg/ml) e tempos de incubação com ausência de luz (1, 5, 10 e
20 min.), porém sem o tratamento com o laser (Figura 11). Neste grupo foi possível
avaliar a toxicidade das diferentes concentrações de AT de acordo com o tempo de
contato direto.
Figura 11 - Grupo AT
Fonte: Do autor
4.3.3 Grupo Laser / L (Grupo FS-L+)
No grupo laser, grupo L (FS-L+), as cepas de Candida albicans foram
expostas à luz laser (L), mas não foram sensibilizadas pelo Fotossensibilizador. Com
este grupo foi possível avaliar o efeito da luz laser isoladamente na inativação das
células da levedura. Alíquota de 100µl da suspensão celular foram transferidas
individualmente para um dos poços de uma placa de microtitulação. Em seguida, o
mesmo volume de solução salina 0,9% estéril foi transferido para o poço. O sistema
de ensaio foi mantido no escuro pelos mesmos tempos de incubação dos grupos
anteriores (1, 5, 10 e 20min.). Após cada período de pré-irradiação, as placas foram
abertas e o mesmo protocolo de iluminação do grupo PDT foi aplicado (Figura 12).
50
Figura 12 - Grupo Laser
Fonte: Do autor
4.3.4 Grupo solução salina/ SS (FS-L-)
No grupo solução salina, grupo SS (FS-L-), as células de Candida albicans
não receberam nenhum tratamento, ou seja, nem foram sensibilizadas pelo
fotossensibilizador, nem foram expostas à luz. Alíquotas de 100 µL da suspensão
(106 UFC/ml) foram transferidas para os poços da placa de microtitulação e, em
seguida, o mesmo volume de solução salina a 0,85% foi depositado no poço e a
placa ficou em repouso no escuro pelos mesmos tempos de incubação dos grupos
anteriores (1, 5, 10 e 20 min.) (Figura 13).
51
Os resultados obtidos com as culturas dessas amostras foram utilizados
como parâmetro para comparação com aqueles que foram obtidos com as culturas
das amostras submetidas às condições experimentais.
Figura 13 - Grupo SS
Fonte: Do autor
4.3.5 Avaliação da viabilidade das células de Candida albicans
Para todas as condições avaliadas, foram realizadas diluições seriadas de 1:3
a partir das amostras contidas nos poços das placas. Para isso, uma alíquota de 100
µl foi removida de cada poço e transferida para um tubo de ensaio contendo 900 µl
de solução salina (0,85%) estéril. Este tubo foi agitado vigorosamente em agitador
de tubos (Vortex - Vision®) e uma nova alíquota de 100 µl foi removida do mesmo e
colocada em outro tubo de ensaio contendo 900 µl de solução salina estéril. Esse
procedimento foi realizado três vezes para cada amostra e, desta forma, as diluições
seriadas de 10-1 a 10-3 foram obtidas. Foram utilizadas as diluições seriadas (10-1,
10-2, e 10-3) para a realização da semeadura nas placas de Petri contendo o meio de
cultura Ágar Sabouraud Dextrose.
A seguir, alíquotas de 25 µl de cada diluição seriada foram pipetadas em
duplicata. Adicionalmente, alíquotas de 25 µl foram removidas do poço das placas e
52
transferidas diretamente para uma da placa de Petri, sem a realização de diluição.
Uma alça de Digralsky estéril foi utilizada para espalhar a solução sobre o meio de
cultura na placa. Também os procedimentos de semeadura foram realizados em
duplicata. Após 48 horas de incubação a 37 oC, as placas de Petri referentes às
amostras das condições experimentais avaliadas foram submetidas à contagem de
colônias. Para este procedimento, a quantificação das colônias foi realizada e os
números de unidades formadoras de colônias foram calculados (Figura 14).
Figura 14 - Esquema das diluições direta e seriadas em duplicatas.
Fonte: Do autor
53
4.3.6 Técnica de Contagem das Unidades Formadoras de Colônias/ml
A leitura das placas foi realizada pela contagem padrão de colônias
de Candida albicans (Unidade Formadora de Colônias - UFC/ml) com o auxílio de
um contador de colônias (Phoenix ®) (Figura 15).
Figura 15 - Contagem de Colônias
Fonte: Do autor
As placas de Petri selecionadas para a contagem foram as que continham um
número de colônias que se encontrava dentro do intervalo de precisão e
repetibilidade de 30 a 300 colônias conforme o método de Swanson; Petran; Hanlin
(2001). Para cada diluição (10-1; 10-2 e 10-3), os resultados do número de colônias
foram obtidos pela média aritmética dos resultados das placas em duplicata,
multiplicada pela diluição correspondente (10, 100 ou 1000). O resultado de cada
grupo foi encontrado por meio da média aritmética das três diluições. Em seguida,
para encontrar o número de UFC por ml, converteu-se resultado de cada grupo a
partir da quantidade inoculada de 25 µl para 1ml, dividindo o resultado por 0,025,
obtendo o resultado final de UFCs/ml em potência de 10. Para analisar a contagem
de UFC/ml de Candida albicans, optou-se por transformar os valores em potência de
10, utilizando-se o logarítimo decimal deste número para a análise estatística, como
pode ser observado no exemplo abaixo:
54
Exemplo:
Quando nos deparamos com todas as placas que apresentaram menos que
30 colônias, o resultado foi expresso pelo número de colônias da placa de menor
diluição. Nas situações em que as placas apresentaram mais de 300 colônias na
maior diluição e foi possível realizar a contagem, o resultado foi encontrado
multiplicando o valor do número de colônias em cada placa pelas respectivas
diluições e, em seguida, calculando a média aritmética. Quando o número de
colônias
foi
excessivamente
alto
para
contar,
escolheu-se
uma
porção
representativa da distribuição das colônias em toda placa e estimou-se o número de
colônias presentes (SWANSON; PETRAN; HANLIN, 2001).
4.3.7 Análise estatística
Os resultados dos log10 (UFC/ml) para cada condição testada foram
comparados utilizando o teste estatístico Kruskal-Wallis e no caso de diferença
significativa foram utilizadas comparações múltiplas do referido teste. Valores de P
inferiores a 0,05 foram considerados significativos.
A escolha do referido teste foi devido ao número de amostras. A margem de
erro utilizada nas decisões dos testes estatísticos foi de 5%. Os dados obtidos foram
digitados na planilha EXCEL e o programa utilizado para obtenção dos cálculos
estatísticos foi o SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na versão 21.
55
5 RESULTADOS
Na Tabela 1, apresentam-se as estatísticas do logaritmo decimal do número
de unidades formadoras de colônias por ml (UFC/ml) nos grupos controles, laser e
solução salina (SS), segundo tempo de incubação. Desta tabela, destaca-se que
não houve diferenças significativas no número de UFC/ml em nenhum dos tempos
de incubação testados.
Tabela 1 - Comparação da média e desvio padrão do log10 do número de
unidades formadoras de colônias (UFC/ml) para os grupos controles nos
diferentes tempos de incubação
Tempo de incubação (minutos)
Grupos
p
1
5
10
20
Média ± DP
(Mediana)
Média ± DP
(Mediana)
Média ± DP
(Mediana)
Média ± DP
(Mediana)
SS
5,68 ± 0,79
(5,89)(A)
5,51 ± 0,67
(5,60) (A)
5,54 ± 0,72
(5,60) (A)
5,62 ± 0,75
(5,74) (A)
p(1) =
0,955
Laser
5,62 ± 0,75
(5,78) (A)
5,57 ± 0,71
(5,69) (A)
5,47 ± 0,64
(5,56) (A)
5,49 ± 0,66
(5,57) (A)
p(1) =
0,937
p
p(1) ˃0,05
p(1) ˃0,05
p(1) ˃0,05
p(1) ˃0,05
(*): Diferença significativa ao nível de 5,0%.
(1): Através do teste de Kruskal Wallis.
Obs.: Se todas as letras entre parênteses são distintas, comprova-se diferença significativa entre as avaliações correspondentes pelas
comparações pareadas do referido teste.
Na tabela 2, apresentam-se os resultados comparativos entre os grupos
solução salina e azul de toluidina nas concentrações de 37,5, 75, 150 e 300 µg/ml.
Nestes grupos, estas substâncias permaneceram em contato com as células de
Candida albicans pelos períodos de incubação de 1, 5, 10 e 20 min. Ao comparar o
número do log10 de UFC/ml nos grupos, observou-se não houve diferença
significativa, mesmo aumentando-se a concentração e tempo em que o corante foi
mantido em contato com as células do fungo.
56
Tabela 2 - Avaliação do efeito citotóxico das concentrações (37,5; 75; 150 e
300µg/mL) de azul de toluidina, na ausência de luz, com tempos de incubação
de 1, 5, 10 e 20 min.
Tempo de incubação (minutos)
Grupos
SS
AT 37,5
µg/ml
5
10
20
Média ± DP
(Mediana)
Média ± DP
(Mediana)
Média ± DP
(Mediana)
Média ± DP
(Mediana)
5,68 ± 0,79
(5,89)
5,51 ± 0,67
(5,60)
5,54 ± 0,72
(5,60)
5,62 ± 0,75
(5,74)
p(1) =
0,955
5,67 ± 0,80
(5,78)
5,68 ± 0,78
(5,92)
5,67 ± 0,77
(5,89)
5,83 ± 0,95
(5,98)
p =
0,943
5,64 ± 0,75
(5,80)
5,66 ± 0,77
(5,84)
5,71 ± 0,82
(5,90)
5,55 ± 0,67
(5,72)
5,60 ± 0,70
(5,82)
5,69 ± 0,80
(5,87)
5,43 ± 0,71
(5,40)
5,67 ± 0,80
(5,79)
p =
0,925
5,69 ± 0,80
(5,87)
5,71 ± 0,82
(5,89)
5,52 ± 0,63
(5,77)
5,68 ± 0,81
(5,80)
p =
0,904
p(1) ˃0,05
p(1) ˃0,05
p(1) ˃0,05
p(1) ˃0,05
AT 75
µg/ml
AT 150
µg/ml
AT 300
µg/ml
p
p
1
(1)
(1)
p =
0,946
(1)
(1)
(1): Através do teste de Kruskal Wallis.
Na Tabela 3, com exceção do tempo de incubação de 1 minuto para todas as
concentrações, como também no tempo de 5 minutos para concentração de 37,5
µg/ml, não foram observadas reduções significativas no número do log10UFC de
Candida albicans por ml. Nas demais combinações de concentração e tempo de
incubação foram verificadas reduções significativas entre os grupos, para estas
situações se comprova diferença significativa entre AT e AT PDT, sendo a média
menos elevada no grupo AT PDT.
57
Tabela 3 - Comparação da média e desvio padrão do log10UFC/mL entre os
grupos AT e PDT AT segundo as concentrações de AT e tempos de incubação
Tempo de incubação (minutos)
Concentração
Grupo
37,5 µg/ml
1
Média ± DP
(Mediana)
5
Média ± DP
(Mediana)
AT
5,67 ± 0,80 (5,78)
5,68 ± 0,78 (5,92)
(1)
5,67 ± 0,77 (5,89) (A) 5,83 ± 0,95 (5,98) (A) p = 0,943
PDT AT
2,38 ± 2,76 (2,30)
3,60 ± 2,41 (4,63)
(1)
2,11 ± 2,44 (2,04) (B) 2,25 ± 2,60 (2,15) (B) p = 0,488
p(2) = 0,053
p(2) = 0,089
Valor de p
75 µg/ml
Valor de p
p(2) = 0,030*
(1)
5,64 ± 0,75 (5,80) 5,66 ± 0,77 (5,84) (A) 5,71 ± 0,82 (5,90) (A) 5,55 ± 0,67 (5,72) (A) p = 0,946
PDT AT
(1)
2,40 ± 2,78 (2,30) 2,26 ± 2,61 (2,19) (B) 1,06 ± 2,13 (0,00) (B) 2,14 ± 2,47 (2,12) (B) p = 0,658
p(2) = 0,104
p(2) = 0,031*
p(2) = 0,008*
p(2) = 0,016*
AT
(1)
5,60 ± 0,70 (5,82) 5,69 ± 0,80 (5,87) (A) 5,43 ± 0,71 (5,40) (A) 5,67 ± 0,80 (5,79) (A) p = 0,925
PDT AT
(1)
4,02 ± 2,73 (5,10) 2,23 ± 2,57 (2,15) (B) 0,97 ± 1,95 (0,00) (B) 2,37 ± 2,76 (2,19) (B) p = 0,239
Valor de p
300 µg/ml
p(2) = 0,007*
20
Média ± DP
(Mediana)
AT
Valor de p
150 µg/ml
10
Média ± DP
(Mediana)
p(2) = 0,298
p(2) = 0,012*
p(2) = 0,014*
p(2) = 0,031*
AT
(1)
5,69 ± 0,80 (5,87) 5,71 ± 0,82 (5,89) (A) 5,52 ± 0,63 (5,77) (A) 5,68 ± 0,81 (5,80) (A) p = 0,904
PDT AT
(1)
3,73 ± 2,51 (4,76) 2,09 ± 2,42 (2,06) (B) 2,15 ± 2,49 (2,06) (B) 2,26 ± 2,62 (2,12) (B) p = 0,350
Valor de p
p(2) = 0,163
p(2) = 0,020*
p(2) = 0,017*
p(2) = 0,032*
(*): Diferença significativa ao nível de 5,0%.
(1): Através do teste de Kruskal Wallis com comparações múltiplas do referido teste.
Obs.: Se todas as letras entre parênteses são distintas, comprova-se diferença significativa entre concentrações correspondentes.
No Quadro 1, foi observado que os grupos controles, azul de toluidina, Laser
e solução salina não influenciaram na viabilidade celular de Candida albicans. No
entanto, o grupo experimental, AT PDT, foi efetivo na inativação dessas leveduras,
todavia para a concentração de 37,5 µg/ml observou-se a viabilidade a partir de 10
minutos do tempo de incubação e para as demais concentrações o tempo de
incubação que permitiu a inativação de C. albicans foi a parir de 5 minutos.
58
(#): Diferença significativa ao nível de 5,0%.
(1): Através do teste de Kruskal Wallis com comparações múltiplas do referido teste.
Quadro 1 - Comparação da média do log10UFC/mL entre os grupos PDT AM e
grupos controles
59
6 DISCUSSÃO
O aumento de casos de infecções causadas por cepas de Candida e
consequentemente a utilização excessiva de antimicrobianos, favoreceu nas últimas
décadas a resistência dessas leveduras aos agentes antifúngicos convencionais
(PINTO;
WEIKERT-OLIVEIRA;
LYON,
2008).
Esses
agentes
antifúngicos
demonstram efeito mais fungistático do que fungicida, resultando em uma profilaxia
inadequada (DONNELLY; MCCARRON; TUNNEY, 2008).
A terapia fotodinâmica foi conhecida desde o século passado quando a
associação de luz com corantes não permitiam com que os microrganismos se
desenvolvessem, mas o interesse por essa terapia diminuiu com a introdução aos
antimicrobianos. No entanto, a procura por novas alternativas foi retomada devido à
grande resistência de microrganismos aos medicamentos (KANOPKA; GOSLINSKI,
2007).
O aparecimento de resistência à terapia fotodinâmica parece ser menos
provável, uma vez que nas células microbianas, o oxigênio singleto e os radicais
livres interagem com estruturas celulares nas mais diversas vias metabólicas. Além
disso, a efetividade contra microrganismos resistentes ou não a antimicrobianos é
igual, e a fotossensibilização, mesmo que realizada diversas vezes não induz o
selecionamento de cepas resistentes (WAINWRIGHT, 1996). Outra vantagem da
TFD à terapia convencional é que ela é mais segura em pacientes soropositivos
devido a não existir interações medicamentosas (TEICHERT et al., 2002) e a não
causar danos aos tecidos subjacentes (STRAKHOVISKAYA et al., 2002,
CADASTRO et al., 2008, MIMA et al., 2010).
Estudos comprovam a efetividade da terapia fotodinâmica frente aos
microorganismos, no entanto, algumas variáveis podem sofrer influências sobre
essa terapia, como o tipo e a concentração dos fotossensibilizadores, a fonte de luz
empregada, o tipo de microrganismo, o tempo de pré irradiação e a dose da luz
empregada (JORI et al., 2006).
60
Este estudo avaliou, in vitro, o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica
na fotoinativação de cepas de Candida albicans (ATCC10231) por meio de
diferentes concentrações finais (37,5 µg/ml; 75 µg/ml; 150 µg/ml e 300 µg/ml) do
azul de toluidina como agente fotossensibilizador e da irradiação com um Laser
DUO®, GaAlAs, InGaAlP, λ880nm e λ660nm, variando o tempo de pré-irradiação (1,
5, 10 e 20 minutos).
Assim como neste estudo, a maioria dos estudos realizados in vitro com
microrganismos utilizaram a fonte de luz laser de baixa potência como componente
da terapia, por apresentar maior versatilidade de manuseio sem fonte de enrgia,
podendo ser aplicado em ambientes domésticos, clínicos e hospitalares (SOUZA et
al., 2006, MUNIN et al., 2007, CADASTRO et al., 2008, GIROLDO et al., 2009,
MANG; MIKULSKI; SALA, 2010, PEREIRA et al., 2010, KHAN et al., 2012,
JUNQUEIRA et al., 2012, KATO et al., 2013), outros optaram pela luz LED ( PELOI
et al., 2008, MIMA et al., 2010., COSTA et al., 2012, PAZ-CRISTOBAL et al., 2014).
Foi utilizado neste estudo o azul de toluidina como fotossensibilizador, por ser
eficiente na produção de oxigênio singleto sob o comprimento de onda máximo de
absorção, além de se classificar como eficiente em bactérias gram-positivas e gramnegativas (DONELLY; MCCARRON; TUNNEY, 2008) como também na inativação
de leveduras, com a irradiação do laser (JACKSON et al., 2009, SOUZA et al., 2010,
DAI et al., 2011). Em outros estudos, diversos fotossensibilizadores também foram
eficazes na inativação leveduras como o azul de metileno (GIROLDO et al., 2009), o
photogen (MIMA et al., 2010), o verde de malaquita (SOUZA et al., 2010), a
curcumina (DOVIGO et al., 2011).
Poucos
estudos
investigaram
a
variação
das
concentrações
dos
fotossensibilizadores na efetividade da TFD. Zeina et al. (2002) afirmaram que doses
maiores de corantes necessitaram em Candida albicans devido a presença da
membrana nuclear , corroborando com o nosso estudo que observou-se diferença
estatisticamente significativa entre as concentrações no grupo AT PDT.
O período de pré-irradiação do fotossensibilizador preconizado na terapia
fotodinâmica antimicrobiana varia de um a dez minutos (RIBEIRO et al., 2005).
Neste estudo, a permanência do azul de toluidina em contato com a solução celular,
61
previamente à aplicação do laser foram de 1, 5, 10 e 20 minutos, com exceção do
tempo de incubação de 1 minuto para todas as concentrações, como também no
tempo de 5 minutos para concentração de 37,5 µg/ml não observamos diferenças
significativas. Nas demais combinações de concentração e tempo de incubação
foram verificadas diferenças significativas entre os grupos, para estas situações se
comprova diferença significativa entre AT e AT PDT, sendo a média menos elevada
no grupo AT PDT. Jackson et al. (1999) verificaram, in vitro, que o período ideal de
incubação do azul de toluidina foi de cinco minutos para leveduras de C. albicans.
De acordo com Lambrechts; Aalders; Van Marle (2005), o aumento no tempo de
incubação não altera a quantidade de FS que entra na célula previamente a
iluminação, nem tão pouco a efetividade da TFD.
Em nosso estudo, houve redução significativa no número de ufc/ml após a
aplicação da terapia fotodinâmica em Candida albicans, corroborando com vários
estudos (LAMBRECHTS; ALDRES; VAN MARLE, 2005, SOUZA et al., 2006,
JACKSON et al., 2009, MANG; MIKULSKI; SALA, 2010, DAÍ et al., 2011) Para o
estudo de Queiroga et al. (2007), a espécie de C. albicans apresentou-se mais
sensível do que as demais espécies avaliadas, estudo animador tendo em vista que
a mesma é a espécie fúngica predominante na cavidade oral.
Embora grande parte dos trabalhos relatem a susceptibilidade da Candida
albicans a Terapia fotodinâmica, Souza et al. (2006) acrescenta outras espécies
que também foram susceptíveis como, C. Krusei, C. Tropicalis e C. dubliniensis.
Todavia, Costa et al. (2011) relataram que no biofilme essas espécies foram mais
resistentes do que nas culturas planctônicas, corroborando com Tessarolli 2010; Já
a C. glabrata mostrou-se resistente a terapia fotodinâmica. A diferença nos
resultados pode ser atribuída aos parâmetros utilizados para a irradiação.
Muitos trabalhos demonstraram efetividade da terapia fotodinâmica frente a
inúmeros microrganismos, no entanto os resultados são limitados pela dificuldade de
comparação entre os estudos, devido aos diferentes protocolos metodológicos. Seria
interessante para comparação desenvolver protocolos para cada tipo de laser e de
microrganismos, para garantir uma validação metodológica.
62
7 CONCLUSÕES
•
A terapia fotodinâmica utilizando o azul de toluidina como substância
fotossensibilizadora, promoveu inativação de espécies do gênero Candida
albicans;
•
Os tempos de pré-irradiação de 5, 10 e 20 minutos apresentaram melhores
resultados na redução no número do log10UFC/ml, no entanto este resultado
está diretamente relacionado com a concentração de azul de toluidina
aplicado;
•
O Laser não alterou a viabilidade celular de Candida albicans na ausência do
azul de toluidina;
•
Em nehuma das concentrações ou tempos de pré-irradiação o azul de
toluidina não apresentou citotoxidade no escuro sobre Candida albicans.
63
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ANEXOS
Anexo A Certificado da Cultura utilizada no experimento