UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
Discente: Laís Freire Santos
Orientador: Júlio Cézar de Mattos Cascardo
Co-orientadores: Márcio Gilberto C. Costa
Abelmon da Silva Gesteira
Estudos funcionais de genes isolados de Chromobacterium violaceum em plantas
transgênicas de fumo
Chromobacterium violaceum é uma bactéria encontrada principalmente na água e no solo de regiões
tropicais e subtropicais [1]. Trata-se de bastonete gram negativo anaeróbio facultativo, que cresce
nos meios usuais formando colônias que normalmente produzem um pigmento violáceo não difusível
[2]. Sua importância médica e diversidade de hábitats levaram à realização de diversos estudos
biotecnológicos, resultando no sequenciamento completo do seu genoma [3]. Dentre as ORFs
("Open Reading Frames") com potencial biotecnológico identificadas, foram isoladas seqüências
codificadoras de proteínas que conferem resistência a estresses bióticos e abióticos, como quitinases
e proteínas induzidas por paraquat, que são seqüências gênicas de grande interesse em pesquisas
devido ao amplo uso em culturas de importância agronômica. Genes isolados de diversos
organismos sequenciados têm sido estudados e utilizados na biologia molecular. Quitinases são
glicosil hidrolases capazes de catalisar a degradação de quitina, polímero encontrado em diversos
organismos [4]. Em plantas, têm sido observadas quitinases atuando no mecanismo de defesa contra
patógenos e quitinases heterólogas têm sido expressas aumentando os mecanismos de defesa
vegetal [5,6]. O paraquat (1-1 -dimetil-4-4 -bipiridilo), por outro lado, é um herbicida de contato nãoseletivo, amplamente utilizado na agricultura em diversos países, por ser um produto de baixo custo,
grande eficácia e não possuir efeitos poluentes cumulativos para o solo [7]. Proteínas induzíveis por
paraquat têm sido alvo de grande interesse, devido à possibilidade de conferir resistência a este
herbicida quando introduzidas em culturas [8,9]. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo
realizar estudos funcionais dos genes CV1897 e CV4240 (quitinases) e CV2547 (proteína induzível
por paraquat), isolados de Chromobacterium violaceum, em plantas de Nicotiana tabacum (fumo),
visando potencial aplicação no melhoramento de espécies de interesse agronômico. Para tanto, as
respectivas seqüências gênicas da linhagem ATCC12472 foram identificadas e isoladas do genoma
de Chromobacterium violaceum. Os fragmentos foram inseridos no vetor pCAMBIA1390, para
expressão em plantas e utilizados na transformação genética de N. tabacum. A transformação dos
brotos regenerados em meio seletivo contendo o antibiótico higromicina foi confirmada por PCR,
utilizando-se primers específicos para a seqüência promotora CaMV35S. Após o seu crescimento e
desenvolvimento, as plantas foram aclimatadas e ensaios biológicos foram realizados a fim de avaliar
as atividades das proteínas heterólogas, bem como para determinar a perda de íons e do teor de
clorofila. De acordo com os resultados obtidos, houve inserção do transgene em todas as plantas
avaliadas. O ensaio da atividade quitinase revelou diferenças significativas entre as plantas
transformadas com as seqüências CV1897 e CV4240 quando comparadas com as plantas controle
(não transformadas). As plantas transformadas apresentaram cerca do dobro de atividade, indicando
assim, expressão e funcionalidade destas quitinases em plantas, o que possibilita o uso destas
proteínas no biocontrole de diversos fitopatógenos, a fim de minimizar o efeito de doenças. Por outro
lado, as análises feitas com as plantas transformadas com a seqüência CV2547, submetidas aos
ensaios de resistência ao paraquat, revelaram uma maior tolerância das plantas transgênicas em
concentrações de até 50 µM, enquanto que as plantas controle mostraram-se intolerantes com
apenas 1µM do herbicida. As análises de extravasamento de eletrólitos e a determinação do teor de
clorofila, onde folhas isoladas das plantas foram borrifadas com paraquat a 10 µM, mostraram menor
perda de eletrólitos e maior conteúdo de clorofila nas plantas geneticamente transformadas quando
comparadas às plantas tipo-selvagens. Estes resultados indicam a funcionalidade destes genes em
plantas, mostrando que a seqüência CV2547 pode ser utilizada na transformação genética de
plantas, a fim de conferir resistência ao paraquat, enquanto que as seqüências CV1897 e CV4240
podem ser utilizadas da mesma maneira, visando conferir resistência a fungos fitopatógenos.
Análises de segregação, determinação do número de cópias (Southern blot) e o nível de expressão
(qRT-PCR) destes genes nas plantas transgênicas estão em andamento e ajudarão a elucidar os
processos fisiológicos e mecanismos de resistência das plantas.
REFERÊNCIAS:
[1] HUNGRIA, M., NICOLÁS, M.F., GUIMARÃES, C.T., JARDIM, S.N., GOMES, E.A.,
VASCONCELOS, T.R.Stress tolerance and adaptability of Chromobacterium violaceum. Genetics
and Molecular Research 3(1): 102-116, 2004.
[2] SIQUEIRA, I.C.; DIAS, J,; RUF, H. ; RAMOS, E.A.G.;MACIELE.A.P.; ROLIM, A.;JABUR, L.
VASCONCELOS, L.; SILVANY, C. Chromobacterium violaceum in Siblings, Brasil. Emerging
Infectious Diseases, Vol.11, n. 09, 2005.
[3] VASCONCELOS, A.T.R; ALMEIDA, D.F.; HUNGRIA, M.;. The complete genome sequence of
Chromobacterium violaceum reveals remarkable and exploitable bacterial adaptability. Proceedings
of the National Academy of Sciences, 100 (20): 11660-11665, 2003.
[4] COHEN-KUPIEC, R.; CHET, I. The molecular biology of chitin digestion. Current Opinion in
Biotechnology, 9:270-277, 1998.
[5] LORITO, M.; WOO S.L.; FERNANDEZ I.G.; COLUCCII G.; HARMAN, G.E.; PINTOR-TORO, J.A. ;
FILIPPONEI E.; MUCCIFORA, S.; LAWRENCE C. B.; ZOINA, A.; TUZUN S.; SCALA, F. Genes from
mycoparasitic fungi as a source for improving plant resistance to fungal pathogens. Agricultural
Sciences, 95:7860-7865, 1998.
[6] HASSAN, F., MEENS, J., JACOBSEN, H., KIESECKER, H. A family 19 chitinase (Chit30) from
Streptomyces olivaceoviridis ATCC 11238 expressed in transgenic pea affects the development of T.
harzianum in vitro. Journal of Biotechnology 143:302 308, 2009.
[7] ALMEIDA, G.L.; SCHIMITT, G.C.; BAIRROS, A.V.; EMANUELLI, T.; GARCIA, S.C. Os riscos e
danos nas intoxicações por paraquat em animais domésticos. Ciência Rural. 37 (5):1506-1512,
2007.
[8] JO, J.; WON, S.; SON, D.;LEE, B. Paraquat resistance of transgenic tobacco plants overexpressing the Ochrobactrum anthropi pqrA gene. Biotechnology Letters, 26:1391 1396, 2004.
[9] CHU, Y.; DENG, E.X.Y.; FAUSTNELLI, E.P.; OZIAS-AKINS, E.P. Bcl-xL transformed peanut
(Arachis hypogaea L.) exhibits paraquat tolerance. Plant Cell Reports 27 (1):85 92, 2008.
[10] BRASILEIRO, A.C.M. E CARNEIRO, V.T.; Manual de Transformação Genética de Plantas.
Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-Cernagen, 1998.
Ciente,