Estudo do complemento
Prof.Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
O sistema do complemento
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Testes funcionais do complemento (I)

CH50
 Baseada na lise pelo complemento de eritrócitos de carneiro
sensibilizados com anticorpo de coelho anti-eritrócitos de carneiro
 Diluições seriadas de soro teste são misturados com igual volume
dos eritrócitos sensibilizados e incubados a 37ºC
 A reacção é parada com PBS frio
 A lise é estimada pela [hemoglobina] por espectrofotometria
 Comparação com 0% de lise (sem soro) e 100% lise (por acção de
água pura).
 Actividade do complemento dada pela diluição necessária para
obter 50% de lise. Resultado expresso pelo inverso desta diluição
em unidades de CH50/mL soro.
 Resultado baixo pode significar deficiência ou consumo
 Heterozigotos têm habitualmente valores normais-baixos de CH50
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Testes funcionais do complemento (II)

AH50
 Semelhante ao CH50, por se basear na
quantificação da lise de eritrócitos
 Baseia-se no facto de a via alterna ser activada
por e provocar a lise de eritrócitos de coelho
 Activação da via clássica inibida por quelatação
do Ca2+ com EGTA
 A maior parte das deficiências de C3 por
consumo são devidas à activação da via alterna,
devido ao ciclo de amplificação do C3
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Testes funcionais do complemento (III)

Outros
 ELISA
 Detecção do componente terminal da
cascata de activação clássica
• C5b-6-7-8-9
 Medida de lise de liposomas contendo
enzimas
 Utiliza processos automáticos de
quimica clínica
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Testes funcionais do complemento (IV)

Testes funcionais para componentes do
complemento
 Fazer CH50 ou AH50 com
 Complementação por soros deficientes
num componente
 Complementação com componentes
puros
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Testes quantitativos do complemento


Quantificação de proteínas do complemento
 Identificação das deficiências
Quantificação de produtos de hidrólise do
complemento
 Diferenciação entre deficiência e consumo
 C4a/C4 ou C4d/C4=> via clássica
 Bb => via alterna
 C3a e C5a => via final (mas têm curtas semividas, pelo que a Protein S é uma melhor
alternativa)
 Nefelometria
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Colheitas







Má colheita => deficiência de complemento
Evitar >2 ciclos de congelação/descongelação
Soro com crioglobulinas tem que ser testado
de imediato
Utilizar tubo sem anticoagulante, deixar
coagular (30 min a 37ºC ou 60 a RT),
centrifugar e guardar a –70ºC
Tempo excessivo de espera origina
deficiência (as proteases celulares degradam
as proteínas do complemento)
Crioglobulinas, complexos imunes, bactérias
e particulas activam o complemento in vitro
provocando falsa deficiência
Hemólise interfere na leitura
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Análise Genética do C4
Prof.Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
O Gene do C4 localiza-se no MHC-III
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
O gene do C4




Prof. Doutor José Cabeda
dois genes:
 C4A (ácido)
 C4B (básico)
6p21.3
41 exões
intrão 9 tem 7 Kb
 Se intrão 7 presente
o gene tem 21 Kb
 Se intrão 7 ausente
o gene tem 16 Kb.
Técnicas de Imunologia
Os Módulos RCCX


Módulo RCCX
 RP1
 C4
 CYP21
 Tenascin X
Normalmente 2 módulos em tandem

RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Os alelos C4A e C4B
C4B
 o aminoácido
nucleofílico (His) ataca
C4A
o grupo tiol de um
C4B
resíduo de cisteína,
formando um
intermediário acídico
 C4A
 a asparagina, não
sendo nucleofílica não
origina a formação do
intermediário pelo que
a reacção de ligação ás
outras moléculas é
mais lenta
Técnicas de Imunologia
Prof. Doutor José Cabeda

P
C
L
D
AC CCC TGT CCA GTG TTA GAC AGG
AC CTC TCT CCA GTG ATA CAT AGG
L
1101
S
1102
I
H
1105 1106
TaqI - RFLP (quantificação dos elementos RCCX)
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Taq I e pshA I RFLP
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Imunofixação de C4A e C4B
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Determinação de fenótipo C4
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
PFGE para genotipagem C4



M
B
T



S => 75Kb; L => 85Kb
LS => 105Kb; LL => 115 Kb
LSS => 135 Kb
LLS => 140 Kb
LLL => 150 Kb
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Número de módulos RCCX
RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB
Prof. Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia