Técnicas em Imunologia
Parte I
Métodos Laboratoriais em Imunologia
Prof.Doutor José Cabeda
Técnicas de Imunologia
Técnicas baseadas em
imunoglobulinas
Ensaios Liquídos
(ensaios homogéneos)





Difração da luz
 Nefelometria
 turbidimetria
Outros ensaios liquidos
 EMIT
 CEDIA
Imunofluorescência
Aglutinação
Quimioluminescência
Ensaios Sólidos
(ensaios heterogéneos)



ELISA
 Competitivo
 Não-competitivo
indirecto
RIA
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Técnicas baseadas na difracção da luz
Imunoturbidimetria
Nefelometria



Baseada na reacção de
imunoprecipitação
Mede a quantidade de luz
difractada devido à presença de
complexos imunológicos
O ângulo de difracção e o
comprimento de onda são
aspectos importantes
 31º permite melhor razão
sinal/ruído



Baseada na reacção de
imunoprecipitação
Mede a diminuição de luz que
consegue atravessar uma
solução na presença de
complexos imunológicos
O detector está sempre alinhado
com a fonte de luz (0º), pelo
que a medida não é da luz
difractada, mas da não
difractada
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Curva de imunoprecipitação




Assumindo:
 Ig pelo menos bivalentes IgG
 Antigénio com pelo menos 2
epitopes
Se Ab em excesso, um aumento
de Ag implica um aumento da
reacção
Se Antigénio em excesso, um
aumento de antigénio diminui a
probabilidade de um Ab ligar 2
antigénios, o que diminui a
precipitação
A quantificação só é possível se o
anticorpo estiver em excesso
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Cinética da Curva de imunoprecipitação


A reacção inicia-se
imediatamente, sendo visivel
20s após a adição do antigénio
A reacção prossegue de modo
aproximadamente linear até que
a precipitação dos complexos
origina uma aparente
diminuição da reacção
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Rate Nephelometry




[Ab] é constante
Aumento progressivo da
[antigénio]
Deve ser realizada na zona de
excesso de Ab
Em nefelómetros automáticos
deste tipo, 2 [antig] são
inicialmente ensaiadas.
Dependendo do resultado:
 São testadas novas []
 É testada o excesso de antig
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End-point nephelometers




Medida no ponto
máximo da reacção
Medida de branco ou
no inicio da reacção
Valor interpolado de
uma curva de
calibração
Variações
 Particle enhanced
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Particle enhanced nephelometry

São utilizadas particulas de latex
conjugadas com anticorpo ou antigénio
competidor
 Aumento de sensibilidade
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Ensaios

Requisitos
 Qualquer fluido
 Soro
 Plasma
 Urina
 CSF
 Deve ser diluído (para não
interferir na leitura)
 Amostras ricas em lipídios
devem ser clarificadas por
filtração ou ultracentrifugação
 Amostras ictéricas ou
hemolisadas
 Não afectam a nefelometria
 Afectam a turbidimetria
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Outro ensaios homogéneos



CEDIA
(Cloned enzyme donor assay)
B-galactosidade em 2 fragmentos
inactivos
 enzyme donnor
 Enzyme acceptor
A reacção imune junta-os activando
a enzima.
Se não houver antigénio o
anticorpo liga-se à enzima
inactivando-a

EMIT
(Enzyme multiplied immunoassay
technique)
Aumento ou diminuição da
actividade enzimatica com a
reacção Ag-Ab
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Imunofluorescência





Anticorpos conjugados com
compostos fluorescentes
Conjugado utilizado como
revelador directo
Aumento de 10 a 1000 vezes na
sensibilidade
Grande aumento na rapidez de
detecção
Vantagens relativamente à RIA:
 Tão sensivel
 Reagentes mais estáveis
 Mais fácil de implementar
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Principais fluorocromos utilizados
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Técnicas de imunofluorescência (I)




Directas
 Anticorpo directamente conjugado
Indirectas
 Anticorpo secundário conjugado
Acopladas
 Duas reacções acopladas
Fluorescence polarization immunoassay
 Baseia-se no aumento na polarização da luz emitida
quando um antigénio-FITC forma complexos imunes, o
que se deve às restrições ao movimento rotacional do
antigénio no complexo
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Técnicas de imunofluorescência (II)

Fluorescent Quenching assay
 Método competitivo directo que utiliza [ab] fixa
 Competição para o ab entre o antigénio marcado e o
não marcado (a testar)
 A fluorescência é absorvida (quenched) quando o
antigénio marcado se liga ao anticorpo
 A intensidade de fluorescência é uma medida da
quantidade de antigénio não marcado que competiu
para o anticorpo
 Método indirecto
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Técnicas de imunofluorescência (III)

Substrate labelled Fluorescent immunoassay
 Método indirecto
 Analito ligado a um modulador que
influencia o sinal gerado
 Actividade do modulador
influenciada pela ligação do Ab
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Técnicas de imunofluorescência (IV)

Fluorescent energy transfer immunoassay
 Método competitivo
 Analito conjugado com FITC
 Anticorpo ligado a Rodamina
 Se o analito conjugado ligar ao
anticorpo, por ressonância a energia
do FITC excita a rodamina
 Se por competição, o analito impedir
o anticorpo de se ligar ao conjugado,
não haverá excitação da rodamina
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Problemas da imunofluorescência


Autofluorescencia
 Proteinas do soro (320350nm)
 Bilirubina (430-470nm)
 Urina apresenta elevada
linha de base
Para obviar a estes problemas
pode-se
 Tratar a amostra com
 Enzimas proteoliticas
 Agentes oxidantes
 Agentes desnaturantes


Quenching
 Bilirrubina
 Hemoglobina
Fotodestruição
 Diminuição da
fluorescência ao
longo da excitação
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Aglutinação



Baseada na reacção ag-ab
Observada visualmente
Tipos:
 Directa (ABO)
 IgM aglutina várias RBC
 IgG necessita de reagente de
Coombs (anti-human-ab) para fazer
a ponte
 Indirecta ou passiva
 Antigénio ligado a subtância inerte
 Reversa
 Anticorpo ligado a substância inerte
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Aglutinação de partículas





Mais sensiveis que a aglutinação
Mensurável por nefelometria, turbidimetria,
contagem de particulas
Anticorpo ou antigéneo conjugado com particulas
de látex
Reacção ag-ab aglutina as particulas que saem de
solução
A medida das partículas em solução é
inversamente proporcional ao titulo a determinar
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Ensaio quimioluminescente



Produção de luz por uma reacção quimica, habitualmente uma reacção
de oxidação-redução
O modo mais sensível de detecção em imunoensaios (atomole=10-18 a
zeptomole=10-21)
Compostos utilizados:
 Esteres de acridina (detecção do NaOH e H2O2)
 Limite de detecção de 0.5 atomoles
 Derivados do isoluminol (detecção com H2O2 e um catalizador)
 Limite de detecção de 50 atomoles
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Enzimas utilizadas em ensaios
Quimioluminescentes
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Ensaios em fase sólida

ELISA
 Competitivo

Não competitivo-indirecto
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Ensaios em fase sólida

ELISA
 Sandwich ou de captura
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Resolver problemas do ELISA
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Electroforese de Imunoglobulinas
Electroforese em agarose de alta resolução
 Imunofixação
 Imunosubtracção
 Electroforese capilar

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Electroforese de Ig em agarose
Electroforese + Corar com Ponceau S e secar
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Imunofixação




Electroforese
Aplicação de tira de acetato de celulose com anticorpo
monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um
precipitado onde houver Ig correspondente
Proteinas não pp são lavadas
Corar os pp com amido black nigrosin
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Imunosubtracção
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Crioglobulinas (I)



Tipo I
 Monoclonal (IgG, IgM,
IgA, raramente c.leves)
Tipo II
 Mistas (2 ou mais Ig,
sendo uma monoclonal)
Tipo III
 Policlonal
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Crioglobulinas (II)
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