UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA DE NOVOS DERIVADOS DA TIAZOLIDINA-2,4-DIONA BROMADOS E FLUORADOS MARIA ANDRÉA DE SOUZA CARMINO RECIFE 2008 MARIA ANDRÉA DE SOUZA CARMINO SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA DE NOVOS DERIVADOS DA TIAZOLIDINA-2,4-DIONA BROMADOS E FLUORADOS Dissertação apresentada à Banca Examinadora do Programa de PósGraduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como exigência parcial para obtenção do título de Mestre em Ciência Biológicas. Orientadora: Profª Drª Suely Lins Galdino Co-orientadora: Profª Drª Maria do Carmo Alves de Lima RECIFE 2008 Carmino, Maria Andréa de Souza Síntese, caracterização estrutural e avaliação da atividade antiinflamatória de novos derivados da Tiazolidina-2, 4-diona bromados e fluorados / Maria Andréa de Souza Carmino – Recife: O Autor, 2008. 127 folhas: fig., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Departamento de Ciências Biológicas, 2008. Inclui bibliografia. 1. Atividade Antiinflamatória 2. Tiazolidinas I Título. 615.276 615.31 CDU (2.ed.) CDD (22.ed.) UFPE CCB – 2009- 058 OLHAI OS LÍRIOS DO CAMPO “Estive pensando muito na fúria cega com que os homens se atiram à caça do dinheiro. É essa a causa principal dos dramas, das injustiças, da incompreensão da nossa época. Eles esquecem o que tem de mais humano e sacrificam o que a vida lhes oferece de melhor: as relações de criatura para criatura. De que serve construir arranha-céus se não há mais almas humanas para morar neles? É indispensável trabalhar, pois um mundo de criaturas passivas seria também triste e sem beleza. Precisamos, entretanto, dar um sentido humano ás nossas construções. E quando o amor ao dinheiro, ao sucesso, nos estiver deixando cegos, saibamos fazer pausas para olhar os lírios do campo e as aves do céu. Há na terra, um grande trabalho a realizar. É tarefa para seres fortes, para corações corajosos. Não podemos cruzar os braços. É indispensável que conquistemos este mundo, na com as armas do ódio e da violência e sim com as do amor e da persuasão. “Quando falo em conquista, quero dizer a conquista duma situação decente para todas as criaturas humanas, a conquista da paz digna, através do espírito de cooperação.” Érico Veríssimo iii DEDICO A minha mãe Maria Anunciada de Souza, minha companheira, que mesmo sem perceber ajudoume imensamente nesta jornada. A meu esposo, Fernando Carmino companheirismo dedicação e amor. iv pelo AGRADECIMENTOS A Profa. Dra. Suely Galdino, pela orientação e generosidade em todas as etapas desse trabalho. A Profa. Dra. Maria do Carmo Alves de Lima, pela orientação, paciência e amizade. Ao Prof. Dr. Ivan da Rocha Pitta, pela oportunidade de desenvolver esta pesquisa. A profa Dra. Teresinha (UFPE), pela sua ajuda competente e constante no desenvolvimento dos bioensaios. A Adenilda, pelo trabalho realizado junto a secretária do Programa de Pósgraduação. Ao CNPq pela concessão da bolsa de mestrado. A minha mãe, Maria Anunciada de Souza, pelo brilho de seu olhar com meu ingresso na universidade e por este mesmo brilho ao fim do meu curso. A minha irmã, Maria José de Souza, que além de seu carinho, desde o principio desta caminhada vem contribuindo para meu êxito. Aos meus pais e irmãos que iniciaram esta jornada comigo e mesmo sem entender bem o que isso significa animaram-me inúmeras vezes a continuar. A meu esposo, Fernando Carmino, por seu carinho nos meus momentos de vacilação, por sua paciência nas minhas ausências e por seu amor e dedicação. v Aos amigos de outrora, que iniciaram esta caminhada comigo especialmente Ednilsom José (Misso), Fernanda Muriel, Humberto Batista, Alexandra Mergulhão, Maria José (Sinha), Rosa Marise. Eles que ajudaram com os livros, estudos e muitas vezes financeiramente. Aos companheiros do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos, Departamento de Antibióticos da UFPE, Andréa Cristina Apolinário da Silva, Cleiton Diniz, Daniel Tárcio, Diana Malta, Luiz Carlos Apolinário, Aracelly de França Luis, Francimary Guedes, Janaina Couto, Juliana Kelle Limoine, Anekécia, Leila Cabral, Manuela Carvalho, Micheline Mirandada Silva, Ricardo Olímpio de Moura, Diogo Felipe, Luiza Daniele, Breno Moacir Alboquerque, Sara Lira Vasconcelos, Sandra Paula Botelho Sarinho, por toda colaboração e agradável convívio. Aos colegas do Laboratório de Bioensaio para Pesquisa de Fármacos Thiago Ubiratan Lins e Lins; Sílvia Rafaelli Ramos; Anna Sofya V. S. da Silva; Rodrigo Felipe; Marília Maria Sitônio; Pedro Canuto V. da Costa; Sirlene Lucena de Moura e Katariny Calheiros pela colaboração e pelo convívio amigo; Ao companheiro Moises, que me encaminhou ao Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos, Departamento de Antibióticos da UFPE, e com isso me deu não só orientadores, mas também amigos. A todos que de uma forma ou de outra contribuíram para a realização desse trabalho, meu muito OBRIGADA. vi SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS x LISTA DE FIGURAS xiii LISTA DE ESQUEMAS xv LISTA DE TABELAS E DIAGRAMAS xvi LISTA DE ANEXOS xvii RESUMO xviii ABSTRACT xix 1. INTRODUÇÃO 20 2. OBJETIVOS 2.1. Geral 24 25 2.2. Específicos 25 3. REVISÃO DA LITERATURA 3.1. A ciência médica moderna 26 27 3.2. Química Medicinal 28 3.3. Tiazolidina-2,4-dionas 30 3.3.1. Reatividade de Tiazolidina-2,4-dionas 3.3.1.1. Reação de N-alquilação das Tiazolidina-2,4-dionas 31 32 3.3.1.2. Reação de Condensação entre Aldeídos aromáticos e Tiazolidina-2,4-dionas 3.4. Atividade Antiinflamatória 32 34 3.4.1. Inflamação: Considerações Gerais 34 3.4.2. Mediadores inflamatórios 36 3.4.2.1. Citocinas 36 3.4.2.2. Cininas 37 3.4.2.2. Eicosanóides 38 3.5. Fármacos que atuam na inflamação 40 vii 3.5.1. Antiinflamatórios esteroidais – Corticosteróides 40 3.5.2. Antiinflamatórios não-esteroidais 41 3.5.2.1. AINEs não-seletivos 41 3.5.2.1.1. Reações adversas relacionadas aos AINEs não-seletivos 42 3.5.2.2. AINEs seletivos 43 3.5.3. Inibidores Duais da COX/5-LOX 46 3.6. Potencial antiinflamatório do PPAR 48 PARTE QUÍMICA 50 4. SÍNTESE DE DERIVADOS TIAZOLIDÍNICOS 3,5-DISSUBSTITUÍDOS 4.1. Material 51 51 4.1.1. Reagentes e solventes 51 4.1.2. Cromatografia 52 4.2. Equipamentos 52 4.3. Metodologia 53 4.3.1. Obtenção da tiazolidina-2,4-diona 54 4.3.2. Síntese dos ésteres 2-ciano-3-fenil-acrilatos de etila (LPSF/IP). 54 4.3.3. Síntese dos intermediários 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) 55 4.3.4. Método geral para a obtenção dos derivados tiazolidinônicos 3,5-dissubstituídos (LPSF/GQ) 4.4. Resultados e Discussão 56 57 4.4.1. Análise Espectroscópica 59 4.4.1.1. Espectroscopia no Infravermelho (IV) 59 4.4.1.2. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio 61 viii PARTE BIOLÓGICA 65 5. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE INTIINFLAMATÓRIA DOS DERIVADOS TIAZOLIDÌNICOS 66 5.1. Material e método 67 5.1.1. Equipamento 67 5.1.2. Animais 67 5.2. Metodologia 68 5.2.1. Medida da peritonite induzida por carragenina em camundongos 68 5.3. Resultados e Discussão 69 6. CONCLUSÕES 75 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 77 8. ANEXO 89 ix LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AINEs Antiinflamatórios não-esteroidais Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária AVC Acidente vascular cerebral CCD Cromatografia em Camada Delgada COX Ciclooxigenase COX-1 Ciclooxigenase1 COX-2 Ciclooxigenase-2 COX-3 Ciclooxigenase-3 d Dublete dd Duplo Dublete ddd Duplo Duplo Dublete DM2 Diabetes mellitus 2 DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado dt Duplo Triplete EDTA Ácido etilenodiaminotetracético EETs Ácidos epoxieicosatetraenóicos FDA Food and Drug Administration GPIT Glicogênio sintetase 3 quinase HETEs Ácido hidroxieicosatetraenóicos HPETEs Hidroperoxieicosatetraenóicos IkB- Quinase inibidora do fator nuclear Kb IL Interleucina IL-1 Interleucina-1 IL-4 Interleucina-4 IL-6 Interleucina-6 IL-8 Interleucina-8 x IL-10 Interleucina-10 IL-13 Interleucina-1 3 IV Espectroscopia no infravermelho LIKA Laboratório de imunopatologia Keizo Asami 5-LOX 5-lipoxigenase LPSF/IP 2-ciano-fenil-acrilatos de etila LPSF/GQ-54 3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona LPSF/GQ-175 3-(2,6-difluor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona LPSF Laboratório de planejamento e síntese de fármacos LTs Leucotrienos LXs Lipoxinas m Multiplete MM Massa molecular MCP-1 Proteína-1 monocitária NFκB Fator de transcrição kappa B PAF Fator ativador de plaquetas PBS Salina tamponada com fosfato PG Prostaglandinas PGE2 Prostaglandina E2 PGI2 Prostaciclinas l2 PMN Neutrófilos polimorfonucleares PPAR Peroxisome proliferator-activated receptor gamma Receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama PPRE Elementos de resposta ao PPAR Rdt Rendimento Rf Razão de frente RMN1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio s Singlete t Triplete TGF-b Fator transformador de crescimento b TNF Fator de necrose tumoral xi TNF- Fator de necrose tumoral – TXs Tromboxanas TZDs Tiazolidinadionas Deslocamento químico xii LISTA DE FIGURAS – Figura 1 – Estruturas químicas de alguns princípios ativos isolados de plantas. 28 Figura 2 – Percentual de fármacos sintéticos (Montanari, 2001). 30 Figura 3 – Tautomerismo da tiazolidina-2,4-diona 31 Figura 4 – Lesão induzida por corte com bisturi levando à liberação de mediadores (LENT, 2001). 35 Figura 5 – Exemplos de mediadores químicos da Inflamação (KAY, 2005). 36 Figura 6 – Ácido Acetilsalicílico 42 Figura 7 – Estruturas químicas dos inibidores não seletivos da COX, Meloxicam e Nimesulide. 44 Figura 8 – Estrutura química de alguns dos inibidores da COX-2. 45 Figura 9 – Estruturas químicas dos inibidores seletivos da COX-2, Valdecoxib e Refecoxib. 46 Figura 10 – Estrutura química do Benoxaprofen. 47 Figura 11 – Exemplos de inibidores duais derivados da indometacina (LEVAL et al., 2002) Figura 12 – 48 Administração por via oral das substâncias em teste (LPSF/GQ) e administração de 1 ml de carragenina (1%) Figura 13 – Lavagem da cavidade peritoneal com solução de PBS heparinizada e coleta do exsudato inflamatório. Figura 14 – Estrutura química do Estrutura química do 69 3-(2,6-Diflúor-benzil)-5-(4-metilsufonil- benzilideno)- tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-192). Figura 15 – 68 71 3-(2,6-Diflúor-benzil)-5-(4-metilsufonil- benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-192), 3-(2-Bromobenzil)-5-(4-metilsufonil–benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-125) e o 3-(2-Bromo-benzil)-5-(4-flúor-benzilideno)tiazolidina-2,4-diona (LPSF/ GQ-115). xiii 72 Figura 16 – Estrutura química do 5-(4-Cloro–benzilideno)-3-(2,6-diflúor- benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-193). xiv 73 LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1 – Obtenção da tiazolidina-2,4-diona a partir da isomerização do ácido tiocianoacético 30 Esquema 2 – Formação do sal da tiazolidina-2,4-diona 32 Esquema 3 – Formação da 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona 32 Esquema 4 – Formação do ânion da tiazolidina-2,4-diona 33 Esquema 5 – Condensação de aldeídos aromáticos com a tiazolidina-2,4diona 33 Esquema 6 – Biossíntese de Eicosanóides. 39 Esquema 7 – Esquema simplificado das vias do metabolismo do ácido araquidónico sobre ação de AINEs. Esquema 8 – Esquema 9 – 42 Diagrama de síntese dos derivados bioisósteros da tiazolidína2,4-diona 53 Ionização do cianoacetato de etila 55 Esquema 10 – Reação de condensação entre o cianoacetato e o benzaldeído 55 Esquema 11 – Formação do éster 2-ciano-3-fenil-acrilato de etila 55 xv LISTA DE TABELAS E DIAGRAMAS Tabela 1 – Estrutura geral e intermediários (LPSF/GQ-54) características físico-químicas dos 3-(2-Bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona e 3-(2,6-Diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-175). Tabela 2 – 56 Estrutura geral dos derivados tiazolidinônicos 3,5-dissubstituídos (LPSF/GQ) Tabela 3 – 57 Características dos derivados tiazolidinônicos 3,5-dissubstituídos (LPSF/GQ) Tabela 4 – 58 Freqüências de absorção no infravermelho, em cm-1, dos 5benzilideno-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) Tabela 5 – 60 Freqüências de absorção no infravermelho, em cm-1, dos 5benzilideno-3-(2,6-diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) 61 Tabela 6 – Deslocamentos químicos () dos derivados 5-benzilideno-3-(2bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) Tabela 7 – Deslocamentos químicos () dos derivados 5-benzilideno-3-(2, 6diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ) Tabela 8 – 63 64 Atividade Antiinflamatória apresentada pelos derivados das séries 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) e 5-benzilideno-3-(2,6-diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4dionas (LPSF/GQ) com respectivas doses em mg/Kg. Diagrama 1 – Percentual de inibição da migração celular na dose de 3 mg/Kg dos derivados tiazolidínicos (LPSF/GQ) Diagrama 2 – 70 72 Percentual de inibição da migração celular dos derivados tiazolidínicos (LPSF/GQ) nas doses de 3; 0,3; 0,03 mg/Kg. xvi 74 LISTA DE ANEXOS Anexo 1 – Espectro de RMN1H do composto LPSF/GQ-115 90 Anexo 2 – Espectro de RMN1H do composto LPSF/GQ-116 91 Anexo 3 – Espectro de RMN1H do composto LPSF/GQ-119 92 Anexo 4 – Espectro de RMN1H do composto LPSF/GQ-120 93 Anexo 5 – Espectro de RMN1H do composto LPSF/GQ-122 94 Anexo 6 – Espectro de RMN1H do composto LPSF/GQ-123 95 Anexo 7 – Espectro de RMN1H do composto LPSF/GQ-125 96 Anexo 8 – Espectro de RMN1H do composto LPSF/GQ-128 97 Anexo 9 – Espectro de RMN1H do composto LPSF/GQ-192 98 Anexo 10 – Espectro de RMN1H do composto LPSF/GQ-193 99 Anexo 11 – Espectro de infravermelho do composto LPSF/GQ-115 100 Anexo 12 – Espectro de infravermelho do composto LPSF/GQ-116 101 Anexo 13 – Espectro de infravermelho do composto LPSF/GQ-119 102 Anexo 14 – Espectro de infravermelho do composto LPSF/GQ-120 103 Anexo 15 – Espectro de infravermelho do composto LPSF/GQ-122 104 Anexo 16 – Espectro de infravermelho do composto LPSF/GQ-123 105 Anexo17 – Espectro de infravermelho do composto LPSF/GQ-125 106 Anexo 18 – Espectro de infravermelho do composto LPSF/GQ-128 107 Anexo 19 – Espectro de infravermelho do composto LPSF/GQ-192 108 Anexo 20 – Artigo a ser submetido 109 xvii RESUMO Dando continuidade aos estudos desenvolvidos pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos – LPSF/GPIT, Departamento de Antibióticos, UFPE, sobre o núcleo tiazolidínico, foram obtidos 10 novos derivados da tiazolidina-2,4-diona 3,5-dissubistituídos candidatos a novos fármacos antiinflamatórios tendo seus rendimentos variando de 39 a 85%. Esses novos derivados foram obtidos através de uma via sintética convergente a partir da substituição em posição 3 do anel heterocíclico que foi realizada pela utilização de haletos bromados e fluorados. Em seguida, os intermediários N-alquilado obtidos (3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona LPSF/GQ-54 e 3-(2,6-difluor-benzil)- tiazolidina-2,4-diona LPSF/GQ-175) foram submetidos à reação de adição de Michael na posição 5 do anel tiazolidínico com o 2-ciano-fenil-acrilatos de etila (LPSF/IP) substituídos. As estruturas químicas dos compostos sintetizados foram devidamente comprovadas por espectroscopia de infravermelho e de ressonância magnética nuclear de hidrogênio. A avaliação da atividade antiinflamatória dos derivados tiazolidínicos foi realizada pela análise da medida da inflamação por peritonite induzida por carragenina. A rosiglitazona na dose de 3 mg/kg foi utilizada como substância padrão nos bioensaios. Os resultados obtidos indicaram que os compostos 3-(2,6-diflúor-benzil)-5-(4-metilsufonil-benzilideno)- tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-192), 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-metilsufonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4- diona (LPSF/GQ-125) e 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-flúor-benzilideno)-tiazolidina-2,4diona (LPSF/ GQ-115) apresentaram uma inibição da migração celular de 89%, 73% e 69%, respectivamente na dose 3 mg/Kg. Palavra-chave: Atividade Antiinflamatória; Tiazolidinas. xviii ABSTRACT Continuing to studies undertaken by the group's search laboratory Planning and Summary of drugs - LPSF / GPIT, Department of Antibiotics, UFPE, about the thiazolidinic nucleus, were synthesized ten new benzylidene-thiazolidinediones derivatives candidates for new anti-inflammatory drugs taking their yelds ranging from 38.83 to 85.14. These new derivatives were obtained through a convergent synthetic path from the replacement at position 3 of the heterocyclical ring which was performed by the use of replaced halides. Then, the intermediate N-alkylated obtained (LPSF/GQ-54 and LPSF/GQ-175) were submitted to the reaction of addition of Michael in position 5 of the thiazolidínic ring with ethyl-(2-cyano-phenyl)acrilates (LPSF / IP) replaced. The chemical structures of the compounds synthesized were duly attested by the infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance of hydrogen. The evaluation of the anti-inflammatory activity of the thiazolidínics derivatives was performed by analysis of the measure of inflammation by peritonitis induced by carrageenan. Rosiglitazone at a dose of 3 mg / kg was used as the standard substance in the bioassays. The results indicated that the compounds LPSF/GQ-192, LPSF / GQ -125 and LPSF / QA-115 showed an inhibition of cell migration, 89.06%, 73.32% and 68.89% respectively in the dose 3 mg / kg. Keywords: Thiazolidine; anti-inflammatory. xix Introdução Introdução 1. INTRODUÇÃO Desde os tempos antigos, os povos do mundo tinham uma ampla coleção de produtos naturais que eram usados com objetivos medicinais. Esses produtos eram obtidos a partir de fontes minerais, animais e vegetais, tornaram-se uma importante ferramenta terapêutica no tratamento de muitas enfermidades, sendo responsáveis pela melhora da qualidade de vida das pessoas. Dessa forma, quando foi possível dar início ao progressivo avanço tecnológico que propiciou sua quimiosíntese industrial, a indústria farmacêutica redirecionou todo o processo de seleção de produtos bioativos, dando origem, a Química Medicinal (MONTANARI, 2000). A Química Medicinal surgiu para aperfeiçoar a busca por compostos bioativos de maneira racional. Sendo necessário para isso, o trabalho em conjunto de profissionais das mais variadas áreas. O planejamento racional de fármacos baseia-se, entre outros conceitos, no mecanismo de ação farmacológica pretendida e na modificação molecular de substâncias com conhecida atividade biológica. Para isso, é necessário considerar as características estruturais farmacofóricas de modo a preservar o seu reconhecimento pelo bioreceptor, assim como, sua atividade farmacológica. A tiazolidinadiona (TZD) é o exemplo de um composto sintético que vem despertando cada vez mais o interesse dos pesquisadores devido a sua alta reatividade química. As substituições apropriadas dos grupamentos químicos presentes nas posições 3 e 5 do anel tiazolidínico oferecem a oportunidade de obtenção de compostos análogos potencialmente bioativos. Este heterociclo apresenta diversas atividades biológicas, sendo particularmente importante como agente terapêutico. Dentre essas, pode-se destacar a atividade antiinflamatória (JEONG et al., 2004) e hipoglicemiante (MOURÃO et al., 2005; LEITE et al., 2007). O processo inflamatório consiste na resposta orgânica mais precoce diante de lesão tissular ou infecção, sendo que este processo fisiológico 21 envolve uma ação coordenada entre o sistema imunológico e o tecido no qual ocorreu à lesão (PARISOTTO et al., 2005). O primeiro grande passo para a constituição de uma classe de inibidores do processo inflamatório ocorreu com a produção industrial do ácido acetilsalisílico, também denominado aspirina. Desde então, os diferentes laboratórios farmacêuticos vêm fabricando uma grande variedade de antiinflamatórios não-esteroidais (AINEs) a partir de protótipos que foram bem sucedidos na prática terapêutica, tais como: fenilbutazona e indometacina (OLIVEIRA JUNIOR et al., 2007). Tais mudanças estruturais tinham o objetivo de melhorar a eficácia e diminuir a toxicidade através da relação estrutura atividade sempre conservando seus grupos famacofóricos (LUENGO, 2005). Em 1971, VANE e seus colaboradores identificaram o mecanismo de ação da aspirina, através da inibição da síntese das prostaglandinas a partir do ácido araquidônico pelo bloqueio da enzima ciclooxigenase. O ácido araqüidônico é liberado pela fosfolipase A2 e servirá como substrato para duas vias enzimáticas distintas: a via das ciclooxigenases, que desencadeia a biossíntese das prostaglandinas e dos tromboxanos, e a via das lipoxigenases, responsável pela síntese dos leucotrienos, lipoxinas e outros compostos. As ciclooxigenases (COX) existem como três isoformas a COX-1 é expressada constitutivamente no organismo, a COX-2 induzido principalmente, em locais de inflamação (GILROY et al., 1998), e a COX-3 que é uma variante da COX-1 (SIMMONS et al., 2004). Com a descoberta da via de ação da aspirina foi proposto que todos os antiinflamatórios não-esteróidais atuavam inibindo a COX e dessa forma, foram atribuidas as ações terapêuticas e efeitos colaterais do grupo (LUENGO, 2005). Com o objetivo de eliminar a maior parte dos efeitos não desejados causados pelos AINEs clássicos surgem os antiinflamatórios seletivos COX-2 (BALAJI et al., 2007). Esses fármacos ficaram conhecidos como Coxibes e representavam potencialmente, vantagens em relação os AINEs não-seletivos, pois, permaneciam a eficácia antiinflamatória, sem o aparecimento dos efeitos adversos conseqüentes á inibição da enzima não-seletiva. Infelizmente pouco tempo depois esses fármacos mostraram um significativo aumento no risco de eventos cardiovasculares sendo esses efeitos 22 responsáveis pela retirada do mercado do rofecoxib e do valdecoxib (CHEN et al., 2006). As vantagens e desvantagens dos AINEs levaram a proposição de outra classe desses fármacos com atividade dual para a COX e 5-LOX. A introdução dessa nova classe de substâncias baseava-se no pressuposto de que a inibição 5-lipoxigenase é considerada de vital importância no tratamento de desordens relacionadas com asma alérgica em que os inibidores da COX induzem reações adversas nos pacientes com asma (FIORUCCI et al., 2001). Essa nova classe de substância foi proposta com o objetivo de ampliar a resposta biológica mantendo as atividades analgésica, antiinflamatória e antipirética (CELOTTI e DURAND, 2003). Diante disso, diversos compostos com potencial para inibir dualmente as enzimas COX e 5-LOX foram projetados a partir de modificações estruturais de diversos AINEs conhecido como inibidores de COX (LEVAL et al., 2002). Essa classe de fármacos continua a ser investigada visando, cada vez mais, o aprimoramento dessas substâncias. Porém, a descoberta da participação de agonistas dos PPARs no processo inflamatório (OLIVEIRA et al., 2007) gerou novas possibilidades para a obtenção de fármacos antiinflamatórios. Diante disso, Pereira (2007), sabendo do potencial das tiazolidina-2,4dionas como agonistas do PPAR sintetizou novos derivados das TZDs e testarou sua atividade antiinflamatória tendo obtido resultados promissores com potencial bioativos no tratamento dessas desordenes. Com o objetivo de ampliar as descobertas nessa área propôs-se, nesse trabalho, a síntese de novos derivados tiazolidínicos 3,5-disubstituídos (LPSF/GQ) com potencial atividade antiinflamatória. 23 Objetivos Objetivos 2. OBJETIVOS 2.1. GERAL Obtenção de novas moléculas derivadas da tiazolidina-2,4-diona candidatas a fármacos antiinflamatórios. 2.2. ESPECÍFICOS Síntizar novos derivados das séries 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)tiazolina-2,4-diona e 5-benzilideno-3-(2,6-diflúor-benzil)-tiazolina-2,4diona (LPSF/GQ); Caracterizar estruturalmente os compostos sintetizados através das análises espectrofotométricas no infravermelho e na ressonância magnética nuclear de hidrogênio; Avaliar a atividade antiinflamatória dos compostos sintetizados através do modelo de peritonite induzida por carragenina. 25 Revisão da Literatura Revisão da Literatura 3.1. A ciência médica moderna Na busca de alívio para suas dores e enfermidades, o homem foi impelido, através dos séculos, a analisar os fenômenos da natureza e a buscar soluções que o ajudassem a diminuir seus sofrimentos. O processo de evolução da arte da cura se deu de forma empírica, em processos de descobertas por tentativas, erros e acertos. O consumo de plantas medicinais teria sido a primeira forma de uso de medicamento de que se tem notícia. Muitas descobertas foram feitas pela necessidade de se obter novas fontes de alimentos, mas provavelmente um número expressivo deveu-se à curiosidade humana (MOTA et al., 2004). Os metabólitos secundários produzidos por plantas tiveram um papel fundamental no desenvolvimento da química orgânica sintética moderna. Historicamente, o desenvolvimento da química orgânica ocorreu paralelamente ao estudo de plantas, principalmente a partir do século XIX, quando foram registrados os primeiros estudos sobre plantas, com base científica. Isso resultou no isolamento de alguns princípios ativos de plantas, já então conhecidas como medicinais. Desses estudos foram obtidas algumas substâncias que se consagraram como princípios ativos eficazes, e que até hoje, ainda são muito empregados no tratamento de certas doenças, a exemplo de morfina, cânfora e cocaína (Figura 1) (MONTANARI e BOLZANI, 2001). 27 HO O O H H H N CH3 HO Cânfora Morfina CH3 O O O N O Cocaína Figura 1 - Estruturas químicas de alguns princípios ativos isolados de plantas. 3.2. Química Medicinal No século XX, o surgimento dos antibióticos produzidos por fermentação microbiana aliado ao desenvolvimento marcante de fármacos sintéticos produzidos pela indústria farmacêutica, logo depois da primeira Grande Guerra, foram causas marcantes no declínio do uso de plantas medicinais e consequentemente, no investimento em fármacos de origem vegetal (MONTANARI e BOLZANI, 2001). A indústria farmacêutica não despreza o potencial que as plantas possuem em fornecer substâncias novas. Entretanto, para otimizar a busca por princípios bioativos de maneira racional, por volta dos anos 80, a indústria farmacêutica redirecionou todo o processo de seleção de produtos bioativos, 28 no que se denominou de “busca racional de drogas”, hoje denominada Química Medicinal (MONTANARI, 2000). A Química Medicinal, em suas inúmeras atribuições, engloba o planejamento racional de novas substâncias bioativas, como citado anteriormente, envolvendo a síntese ou a modificação molecular de substâncias; o isolamento de princípios ativos naturais como, por exemplo, plantas, animais e minerais; a identificação ou elucidação da estrutura; a descrição das moléculas desde a sua constituição atômica, passando por relações entre a estrutura e propriedades, até suas características estruturais quando das interações com os diferentes sistemas biológicos; a compreensão em nível molecular de processos bioquímicos, farmacológicos, toxicológicos e farmacocinéticos (AMARAL e MONTANARI, 2002). E, finalmente, a proposição e validação de modelos matemáticos através dos estudos de relações entre a estrutura química e a atividade farmacológica e/ou toxicológica, permitindo então a proposição de novas entidades de interesse. Este é um exemplo de uma área que requer um trabalho em equipe, envolvendo não somente químicos, mas também especialistas das mais variadas áreas, tais como: biólogos, bioquímicos, farmacologistas, matemáticos, profissionais de informática, médicos e estatísticos (AMARAL e MONTANARI, 2002). No tocante à química, o conhecimento da estrutura molecular é fundamental, uma vez que, a estrutura de um composto afeta propriedades que estão intimamente inter-relacionadas à sua atividade biológica (KOROLKOVAS, 1988). Neste contexto, o bioisosterismo, compostos ou grupos de átomos que têm o mesmo número e disposição de elétrons, caracterizando-se por propriedades físicas semelhantes (LANGMUIR, 1919), apresenta-se como uma das mais importantes ferramentas de modificação molecular de compostos biologicamente ativos. Mediante essa modificação obtêm-se não só produtos de ação idêntica a dos compostos que serviram de modelo, mas também antagonistas (KOROLKOVAS, 1988). Esses conhecimentos propiciaram ao homem atual a preparação de inúmeros compostos de seu interesse nas mais diversas áreas. Um exemplo 29 são os fármacos, que são em sua maioria de origem sintética, cerca de 80% (Figura 2) (MONTANARI e BOLZANI, 2001). Figura 2 - Percentual de fármacos sintéticos (Montanari, 2001). 3.3. Tiazolidina-2,4-dionas Um exemplo de composto sintético bastante citado na literatura, devido ao seu grande expectro de ação, é a tiazolidina-2,4-diona (TZD). As TZDs são compostos estruturalmente relacionados e caracterizados por um anel heterocíclico, ao qual, os diferentes reagentes são ligados para obtenção dos derivados TZDs (DESMET et al., 2005). De acordo com Lima (1998), são descritos na literatura vários métodos de obtenção das TZDs, sendo o mais comumente utilizado o descrito por Brown em 1961 e por Sprague e colaboradores em 1957. A TZD foi a primeira molécula obtida na qual o núcleo tiazol foi caracterizado. A síntese ocorreu através da isomerização do ácido tiocianoacético (BROWN, 1961) (Esquema 1). Cl COS R NH 2 KOH R NH CO S O R NH CO S CH2 COO H CH 2 COO R N S R = H; Alquil O Esquema 1 - Obtenção da tiazolidina-2,4-diona a partir da isomerização do ácido tiocianoacético A estrutura da TZD foi elucidada por Liberman e colaboradores (1848 apud LIMA, 1998) que chamam à atenção para uma possível tautomeria, 30 demonstrando que a TZD poderia reagir também sob a forma de diidrohidroxitiazol (Figura 3). Entretanto, as propriedades físicas e químicas desse núcleo, bem como as de seus derivados, favorecem a forma tiazolidina, uma vez que nenhuma molécula apresenta as propriedades do ciclo tiazol aromático (SPRAGUE e LAND, 1957 apud LIMA, 1998). O H HO N S N S O OH Figura 3 - Tautomerismo da TZD 3.3.1. Reatividade da Tiazolidina-2,4-diona As TZDs possuem uma alta reatividade. Essa reatividade permite a obtenção de diversas substâncias, que pode ser evidenciada, entre outros fatores, pelos vários tipos de reação que o núcleo tiazolidínico permite (LIMA, 1998), tais como: Em posição 3: reações de substituição nucleofílica de segunda ordem (SN2 – reações de N-alquilação) e reação de Mannich; Em posição 4: reações de tionação; Em posição 5: reações de condensação com aldeídos, cetonas e aromáticos (reações de Knoevenagel), reações de adição do tipo Michael e reações com sais de diazônio (acoplamento diazo). Para o desenvolvimento desse trabalho foram utilizados as reações de N-alquilação e reações de condensação com aldeídos aromáticos. 3.3.1.1. Reação de N-alquilação das Tiazolidina-2,4-dionas O mecanismo reacional de obtenção dos derivados N-alquilados ocorre em duas etapas (FINKBEINER, 1965). Primeiramente o átomo de hidrogênio ligado ao nitrogênio na posição 3 do anel TZD é suficientemente ácido para ser 31 suprimido em presença da base, no caso hidróxido de potássio ou hidróxido de sódio (Esquema 2). O O NK H N S S KOH O O Esquema 2 – Formação do sal da TZD Segundo Brown (1961), a reação de N-alquilação, tem melhor rendimento quando o sal da TZD é formado isoladamente e em seguida tratado com haleto de alquila de escolha para formar os derivados 3-benzil-tiazolidina2,4-diona (Esquema 3). O NK S O X C H H O H N S R C H R O Esquema 3 – Formação da 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona 3.3.1.2. Reação de condensação entre aldeídos aromáticos e tiazolidina2,4-diona O grupo metilênico em posição 5 da TZD comporta-se como um nucleófilo, e as reações ocorrem normalmente em presença de uma base, a TZD reage como um ânion. A formação deste ânion é facilitada pela presença do grupamento carbonílico na posição 4 e do heteroátomo (S) visinho (LIMA, 1998). Segundo Lima (1998), os compostos heterocíclicos que apresentam o fragmento –S-CH2-CO permitem reações de condensação com aldeídos aromáticos ou seus derivados. A reação pode ocorrer com TZD N-alquiladas ou não. 32 Os compostos são obtidos através da reação de condensação do tipo Knoevenagel. A reação ocorre basicamente em duas etapas: Ionização do grupo metileno em presença de uma base (Esquema 4): H O BASE N H H S H O O O N H H N S O H S O Esquema 4 – Formação do ânion da TZD Adiciona-se o enolato formado a carbonila do aldeído e o álcool obtido sofre em seguida uma desidratação (Esquema 5). R O R O N N CHO H S O S CH O O | H O C O R R N N S O CH H2O S O OH H Esquema 5 - Condensação de aldeídos aromáticos com a tiazolidina-2,4-diona Ainda segundo Lima (1998), após serem devidamente caracterizadas, pode-se observar que as reações de condensação levam a formação de um único isômero. Sendo esse um fator importante na descoberta de novos fármacos, levando-se em conta os resultados indesejados de um segundo isômero que foi evidenciado em 1961 no caso da tragédia da talidomida, que originou o nascimento de aproximadamente 4000 crianças com deformações congênitas em todo o mundo (DALLY, 1998; LIMA et al., 2001). 33 Estudos recentes mostraram que as TZDs influenciam muitas cascatas moleculares no organismo humano, sobretudo aquelas que regulam processos inflamatórios (BUCKINGHAM, 2005). A intensa reatividade das TZDs facilita a preparação de composto análogo com atividade biológica em diversas áreas tais como: antimicrobiana, antifúngica, amebicida, anticovulsivante, antineoplástica, hipoglicemiante e antiinflamatória além, das atividades pesticida e narcótica (BLANCHET e ZHU, 2004; MURTHY e SRINIVASA, 2003). 3.4. Atividade Antiinflamatória 3.4.1. Inflamação: Considerações Gerais A inflamação é uma resposta orgânica local ou geral que tem como fim proteger o indivíduo contra qualquer tipo de agressão, através de um processo de regulação que mantenha o equilíbrio das diversas funções e composições químicas do corpo (SANTOS JÚNIOR, 2003). Pode ser desencadeada por diversos fatores: agentes físicos (trauma mecânico, radiação, calor, frio), agentes químicos (substâncias irritantes, álcalis e outros) ou fatores biológicos, provocada por microorganismos (fungos, bactérias, vírus ou protozoários) (BALBINO et al., 2005) (Figura 4). 34 Figura 4 - Lesão induzida por corte com bisturi levando à liberação de mediadores (LENT 2001) O processo inflamatório caracteriza-se pela sua complexidade e dinamismo, sendo multimediado com a participação de eventos interdependentes, podendo manifestar-se de forma diversa tanto no tocante à duração quanto na intensidade da resposta inflamatória, que por sua vez depende do tipo de injúria ou estímulo nocivo. Basicamente, a reação inflamatória aguda caracteriza-se por dilatação arteriolar, aumento de permeabilidade vascular, acúmulo de leucócitos e dor. Os leucócitos são atraídos ao local da lesão por mediadores inflamatórios com atividade quimiotática, denominados mediadores químicos (WERNER e GROSE, 2003). Muito embora este mecanismo de defesa seja geralmente benéfico, efeitos indesejáveis são comuns. Estes são ocasionados por uma resposta excessiva que pode causar lesão tecidual progressiva, em alguns casos a utilização de fármacos antiinflamatórios ou imunossupressivos podem ser necessárias para modular o processo antiinflamatório (ABAAS et al., 2002; CECCON e VAZ, 2004). 35 3.4.2. Mediadores inflamatórios Os principais mediadores envolvidos nas alterações vasculares são histamina, fator ativador de plaquetas (PAF), prostaglandinas (PG)E2 e PGI2 (origem celular) ou o sistema das cininas que tem como exemplo bradicinina, fatores do complemento (C3a e C5a), fatores do sistema de coagulação e ou sistema fibrinolítico que são derivados diretamente do plasma (HENSON, 2005; HATANAKA e CURI, 2007) (Figura 5). Figura 5 – Exemplos de mediadores químicos da Inflamação (KAY, 2005) 3.4.2.1. Citocinas Dentre os mediadores endógenos, liberados, primeiramente, pelas células residentes e, posteriormente, pelas células recrutadas para o foco infeccioso, as citocinas desempenham um papel primordial na resposta do hospedeiro (BENJAMIM, 2001). 36 As citocinas são um grupo heterogêneo de proteínas de baixo peso molecular, extremamente potentes, que iniciam sua ação através da ligação a receptores específicos (KRAYCHETE et al., 2006; ALI et al., 2007), provocando alteração da síntese do RNA e de proteínas de diferentes células do organismo (KRAYCHETE et al., 2006). Podem agir no local onde são produzidas, em células próximas ou são secretadas para circulação, com efeitos à distância (SHEERAN, 1997). As citocinas podem ser divididas, basicamente, em pró-inflamatórias e antiinflamatórias. Fazem parte das citocinas pró-inflamatórias o Fator de Necrose Tumoral (TNF-), interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), interferon gama e a proteína-1 monocitária (MCP-1), que funcionam como mediadores endógenos do sistema imune (CECCON e VAZ, 2004; SOARES NETTO, 2004). Dentre as conhecidas como citocinas antiinflamatórias estão: interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10), interleucina 13 (IL-13) e o fator transformador de crescimento b (TGF-b) (CECCON e VAZ, 2004). De acordo com Momoi e colaboradores (1999) e Desmet e colaboradores (2005), vários outros estudos citam na literatura as TZDs como agentes inibidores de várias citocinas incluindo a IL-1 e o TNF. 3.4.2.2. Cininas O termo cininas é um nome genérico atribuído a um grupo de pequenos polipeptídeos endógenos de 9 a 11 aminoácidos que apresentam grande número de efeitos biológicos, incluindo o controle da pressão arterial, motilidade intestinal, angiogênese, indução de dor, hiperagelsia, antinocicepção, febre, aumento de permeabilidade vascular e broncoconstrição (BHOOLA et al., 1992). Dentre as cininas com atividade biológica, a bradicinina constitui seu principal representante, sendo um nonapeptídeo formado a partir de moléculas precursoras. Em células endoteliais, a bradicinina estimula a produção de óxido nítrico promovendo o relaxamento das células do músculo liso vascular que, juntamente com seu efeito arteríolo-dilatador, promove extravasamento de fluídos e proteínas plasmáticas. Além disso, a bradicinina promove efeitos 37 quimiotáticos e (principalmente estimulatórios macrófagos e sobre células neutrófilos), do sistema estimula de defesa degranulação de mastócitos, promove proliferação celular, estimula fibras nervosas simpáticas induzindo reflexo vascular, contrai uma variedade de músculos lisos, excita e sensibiliza neurônios nociceptivos provocando a dor e hiperalgesia entre outros efeitos (HALL, 1992; SANJULIANI, 2002). 3.4.2.2. Eicosanóides A liberação dos mediadores químicos originados nos tecidos lesados e nas células migratórias, que provocam a ativação da fosfolipase A2 e consequentemente, à liberação do ácido araquidônico e seus metabólitos que dão origem a inúmeras substâncias biologicamente ativas como prostaglandinas (PGs), tromboxanas (TXs), ácido hidroxieicosatetraenóicos (HETEs) e hidroperoxieicosatetraenóicos (HPETEs), leucotrienos (LTs), lipoxinas (LXs) e ácidos epoxieicosatetraenóicos (EETs), estes têm importante papel na fisiopatologia da inflamação (LEVAL et al., 2002). As PGs são sintetizadas a partir de um precursor primário, o ácido araquidônico (MILLER, 2006) (Esquema 6). Este ocorre a partir das duas vias principais do ácido araquidônico: Via da cicloxigenase: as PGs, TXs e prostaciclinas (PGI2) são obtidas através da ação catalítica das enzimas cicloxigenases. Primeiramente, foram identificadas duas cicloxigenases, a COX-1, que é constitutiva e amplamente distribuída e a COX-2, que é produzida em resposta a um estimulo inflamatório (GILROY et al., 1998; HEATHER et al., 2003; NAKANO et al., 2006). A COX-2 também esta presente em diversos órgãos e tecidos normais e esta envolvida em processos fisiológicos e patológicos (BRICKS et al., 2005). Via da lipoxigenase: as lipoxigenases podem atuar sobre o ácido araquidônico para formar dependendo do tecido, leucotrienos (LT) ou lipoxinas (LEVAL et al., 2002). 38 Existe ainda, uma outra isoforma da cicloxigenases, que é conhecida por COX-3. Essa isoforma é possivelmente, uma variante da COX-1 tendo em vista que é derivada do mesmo gene dessa isoforma. Encontra-se distribuída principalmente no córtex cerebral, medula espinhal e coração, sendo mais sensível ao paracetamol do que a COX-1 e COX-2 (CHANDRASEKHARAN et al., 1999; CARVALHO et al., 2004; SIMMONS et al., 2004). O interessante é que a expressão desta variante não originaria prostaglandinas pró- inflamatórias, mas um membro da família das ciclopentanonas que é agonista dos receptores ativadores de proliferação do peroxissomo (PPARs), com atividade antiinflamatória (DESMET et al., 2005; VANE et al., 2003). Fosfolípides Fosfolipase A2 Ácido araquidônico 5-Lipooxigenase 15 - HPETE Ciclooxigenases 5 - HPETE PGG2 Peroxidase Lipoxina A Lipoxina B Leucotrieno A4 (LTA ) Leucotrieno B4 (LTB4) PGH2 LTC4 Tromboxane Prostaciclina Prostaglandina (TxA2) (PGI2) PGE2 LTD4 PGD2 PGF2 Esquema 6 – Biossíntese de Eicosanóides. . A ação antiinflamatória de muitos fármacos acontece pela inibição da síntese das PGs, que são ácidos graxos insaturados contendo 20 átomos de carbono e uma estrutura cíclica incorporada, e o entendimento da biossíntese desta substância é fundamental para a compreensão da ação desses fármacos antiinflamatórios. Estudos realizados por Unangst e colaboradores (1993) mostraram que derivados das tiazolidinas possuíam ação sobre a via das cicloxigenases. 39 No entanto, outro produto do metabolismo do ácido araquidônico, o leucotrieno B4, é uma substância quimiotática muito potente. A participação dos leucotrienos também possui poderoso efeito quimiotático sobre os eosinófilos, neutrófilos e macrófagos e promovem broncoconstrição e alterações da permeabilidade vascular (LUENGO, 2005; BASILE FILHO et al., 2001). 3.5. Fármacos que atuam na inflamação Os principais agentes antiinflamatórios podem ser classificados em dois grupos: antiinflamatórios esteroidais, também denominado de Corticosteróides e os não-esteroidais (AINES) (RANG et al., 2001). 3.5.1. Antiinflamatórios esteroidais - Corticosteróides Os corticosteróides são substâncias endógenas que estão quimicamente classificadas como esteróides, e são originalmente identificados no córtex da glândula adrenal. O córtex adrenal produz vários hormônios potentes, todos derivados esteróides possuindo o núcleo ciclopentanoperidrofenantreno característico (RANG et al., 2001). A resposta antiinflamatória ocorre por ação local, tanto na fase precoce quanto na fase tardia do processo inflamatório (DAMIANI et al., 2001). Os glicocorticóides têm a capacidade de modificar o processo inflamatório reduzindo dramaticamente a resposta inflamatória e suprimindo a imunidade. A conseqüência dessas poderosas ações dos glicocorticóides é que esses agentes podem assumir grande valor quando utilizado no tratamento de certas condições nas quais ocorrem hipersensibilidade e inflamação indesejável. Os glicocorticóides apresentam o risco de suprimir as respostas protetoras necessárias à infecção e de reduzir os processos essenciais à cicatrização (RANG et al., 2001). 40 3.5.2. Antiinflamatórios não-esteroidais 3.5.2.1. AINEs não-seletivos Seis décadas após a descoberta, por Johann A. Buchner, do princípio ativo ao qual denominou Salicilina, a Bayer introduz o novo fármaco com o nome de "aspirina", em 1899 (BOTTING, 2006). Desde então, os diferentes laboratórios farmacêuticos vêm fabricando uma grande variedade de antiinflamatórios não-esteroidais (AINEs) a partir de protótipos que foram bem sucedidos na prática terapêutica tais como: os derivados dos ácidos propiônico (ibuprofeno, naproxeno, fenoprofeno, cetoprofeno, flurbiprofeno, fembufeno, indoprofeno, suprofeno e oxaprozin). Os derivados dos ácidos indol-acéticos (neste grupo de fármacos está a indometacina e o naproxeno) e a família dos oxicans (piroxican, tenoxican, meloxican) (LUENGO, 2005). Os fármacos antiinflamatórios não-esteroidais constituem um grupo heterogêneo de substâncias, que em geral não estão relacionados quimicamente, e que apesar disso, têm em comum certas ações terapêuticas, como atividade antipirética, analgésica e antiinflamatória e são prescritos como fármacos de primeira escolha no tratamento de desordens reumáticas e outras doenças degenerativas inflamatórias comuns (FIORUCCI et al., 2001). Os AINEs atuam na biossíntese das PGs, agindo diretamente na inibição de enzimas da via cicloxigenase (PARISOTTO et al., 2005; CAMARGO et al., 2007; PETRUZZELLI et al 2007). Porém, segundo Luengo (2005), esses fármacos, não atuam na via lipoxigenase, via esta que dá origem aos leucotrienos (Esquema 7). 41 Esquema 7 - Esquema simplificado das vias do metabolismo do ácido araquidónico sobre ação de AINEs Do ponto de vista geral, a aspirina é o protótipo dos AINEs é o fármaco mais usado e aquele com o qual todos os demais agentes antiinflamatórios são comparados (Figura 7). O C OH O C CH3 O Figura 6 – Ácido Acetilsalisílico 3.5.2.1.1. Reações adversas relacionadas aos AINEs não-seletivos A atividade antiinflamatória dos AINEs tem mecanismo similar ao da aspirina, sendo mediada principalmente pela inibição da síntese das PGs. Em graus variáveis, a maioria dos AINEs são inibidores da síntese de protrombina; são analgésicos, antiinflamatórios e antipiréticos; inibem a agregação 42 plaquetária. São também, irritantes gástricos, embora componentes desse grupo tendam a causar menor irritação gástrica que a aspirina. Essa classe de fármacos conquistou a popularidade mundial no alívio de sintomas dolorosos relacionados a cefaléias, cólicas menstruais, artrite, traumas, dor pós-operatória e em uma enorme variedade de dor de intensidade variável (OLIVEIRA JUNIOR et al., 2007). Porém, segundo dados demonstrados por Gajraj (2003), eventos gastrintestinais relacionado ao uso dos AINEs é uma das mais comuns reações adversas relacionadas a esses fármacos. Estudos mostraram uma prevalência de 15 % - 30 % das úlceras no estômago ou duodeno em pacientes que fazem uso de AINEs regularmente. As reações adversas gastrintestinal ocorriam porque as prostaglandinas, mais especificamente a isoforma COX-1, esta envolvida na manutenção e integridade da mucosa gastrintestinal. Ficando claro, nesse caso, que a toxicidade dos AINEs estava relacionada à inibição da atividade COX-1. Os AINEs são responsáveis por outras reações adversas. A hipersensibilidade ao AINEs está presente em aproximadamente 10 % dos adultos asmáticos e em 30 - 40 % dos pacientes com asma e rinosinusite. Em pacientes com urticária crônica, a prevalência de hipersensibilidade a AAS e dos AINEs varia entre 21 e 30 % (PICHLER, 2001). Os AINEs podem causar manifestações clínicas respiratórias, dermatológicas, urticária e anafilaxia (PERUCHI et al., 2004). Sendo assim, a perspectiva de fármacos com inibição seletiva para a COX-2 certamente causaria menos efeitos colaterais que os AINEs convencionais (GAJRAJ, 2003). 3.5.2.2. AINEs seletivos No período curto de oito anos após a descoberta de COX-2, inibidores seletivos desta enzima foram desenvolvidos buscando-se drogas antiinflamatórias com menos efeitos prejudiciais do que as terapias existentes (SIMMONS et al., 2004). Os primeiros fármacos de inibição seletiva de COX-2 surgiram na década de 1980 (meloxican e nimesulide). Esses AINEs foram 43 denominados de coxibes (LUENGO, 2005; CARVALHO et al., 2004; GAJRAJ, 2003) (Figura 7). S HO O CH3 O S CONH NH N N CH3 S O O O2N Meloxicam O Nimesulide Figura 7 – Estruturas químicas dos inibidores não seletivos da COX, Meloxicam e Nimisulide De acordo com Hoefler (2004), os coxibes foram desenvolvidos baseando-se na hipótese de que a COX-1 sintetizaria, no epitélio gástrico, as mesmas prostaglandinas que a COX-2, proporcionando assim, citoproteção (CARVALHO et al., 2004). Sendo assim, três coxibes (celecoxibe, rofecoxibe e valdecoxibe) foram aprovados pela FDA (Food and Drug Administration) para uso nos EUA; um quarto, o etoricoxibe, foi aprovado pela autoridade reguladora Européia e no Brasil seis coxibes foram aprovados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) os anteriormente citados o lumiracoxibe e o parecoxibe (HOEFLER, 2004) (Figura 8). 44 SO2NH2 F3 C N SO2CH3 N S CH2C C(CH2)3CH3 O O C O CH3 O CH3 APHS Refecoxibe Celecoxibe O SO2NH2 CH3 O CH3 N SO2CH3 CH3 Cl Na O N S N N N Valdecoxibe Parecoxibe sódico CH3 Etoricoxibe Figura 8 - Estrutura química de alguns inibidores da COX-2. Apesar de inicialmente os inibidores da COX-2 terem sido amplamente recomendado por causaram menos efeitos colaterais comparado com os AINEs convencionais, a FDA, que é um órgão governamental norte-americano que controla a introdução e o uso de medicamentos nos EUA, realizaram estudos e concluíram que a redução de risco em eventos gastrointestinais adversos, de um modo geral, não foi observado (BRASIL, 2004). Estudos realizados por Fitzgerald, em 2003, mostraram que agentes terapêuticos não-esteroidais, tais como celecoxib e rofecoxib suprimiam a formação de prostaglandina (PGI) dependente de COX-2 em voluntários sadios e provocavam efeitos cardiovasculares adversos. Estes efeitos que são atribuídos a diminuição do nível PGI2 e um aumento no nível do tromboxanas e, dessa forma, promovem uma cascata de eventos potencialmente trombóticos que levam a um aumento significativo no risco de eventos cardiovasculares, como infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral (AVC) 45 oclusivo (HOEFLER, 2004; ENGH, 2001). Esses eventos foram responsáveis pela retirada recente do rofecoxib e do valdecoxib (CHEN et al., 2006) (Figura 9). O N O O CH3 O NH2 O S S O H3C Valdecoxib O Refecoxib Figura 9 - Estruturas químicas dos inibidores seletivos da COX-2, Valdecoxib e Refecoxib. Como se pode observar todos os AINEs possuem vantagens e desvantagens uns em relação aos outros desta forma a escolha do fármaco aplicável a cada tratamento é uma combinação de necessidades e resposta terapêutica particular a cada paciente. 3.5.3. Inibidores Duais da COX/5-LOX A 5-lipoxigenase (5-LOX) é a enzima chave para a formação dos leucotrienos (LEVAL et al., 2002). Sua inibição é considerada de vital importância no tratamento de desordens relacionadas com asma alérgica (FIORUCCI et al., 2001). Em contrapartida, sabe-se que os inibidores da COX induzem reações adversas nos pacientes com asma devido ao aumento da síntese do LTs pela via do ácido araquidônico através da 5-LOX (FIORUCCI et al., 2001). Sendo assim, os fármacos que conseguem inibir ciclooxigenase e lipoxigenase possuem ação antiinflamatória superior (LUENGO, 2005; FIORUCCI et al., 2001). Além disso, inibidores duais do mecanismo da COX/5LOX podem exibir atividade antiinflamatória para as quais os AINEs são ineficazes (HORIZOE et al., 1999). Diante disso, a busca por fármacos que 46 inibam a via de obtenção desses mediadores parecia ser o caminho mais lógico no tratamento de estados inflamatórios agudos e crônicos. Sendo assim, surgi o Benoxaprofen, primeiro composto comercializado como inibidor dual da COX/5-LOX. Infelizmente, esta droga demonstrou-se muito tóxica, sendo conseqüentemente, retirada do mercado (Figura 10) (LEVAL et al., 2002). O Cl N O OH Figura 10 – Estrutura química do Benoxaprofen. Segundo Leval e colaboradores (2002) diversos compostos com potencial para inibir dualmente as enzimas COX e 5-LOX foram projetados a partir de modificações estruturais de diversos AINEs conhecidos como Inibidores de COX, destacando-se aqui a indometacina (Figura 11). Testes demonstraram claramente, que estas drogas possuem potentes efeitos antiasmático, antipirético, analgésico e antiinflamatório sem apresentar risco de se obter úlcera no decorrer do tratamento, ao contrário a AINEs clássicos (LEVAL et al., 2002). 47 H3C CH2COOH O CH3 N Cl O Indometacina OH O H3C N H3C O H2 N O HN CH2 H3C CH3 O N OH H2C CH2 CH3 N N Cl O Cl O Figura 11 - Exemplos de inibidores duais derivados da indometacina. A modificação molecular para a descoberta de novos fármacos inibidores potentes das enzimas COX e 5-LOX é sem dúvida uma ferramenta importante. Tendo em vista que as modificações acarretam alterações na atividade farmacológica e/ou toxicológica permitindo então a proposição de novas entidades de interesse. Porém, como o processo inflamatório é altamente complexo, à medida que surgem, na literatura, novas evidencias da atuação de outros mediadores inflamatório, surgem também, novas possibilidades para a obtenção de fármacos antiinflamatórios, mais potente e menos tóxicos. 3.6. Potencial antiinflamatório dos PPARs Os PPARs são membros de uma superfamília de fatores da transcrição ligantes dependentes que regulam aspectos diversos da reprodução, desenvolvimento e homeostase. Três subtipos principais são identificados: PPAR-α, PPAR-β e PPAR-γ (TSUKAMOTO et al., 2004; RIZZO, 2006). 48 Segundo Tsukamoto e colaboradores (2004), diversos estudos mostraram que os PPARs estão envolvidos em uma grande variedade de funções fisiológicas e farmacológicos tais como o câncer, aterosclerose, metabolismo de lipídios e diabetes mellitus causado pela resistência a insulina (DM2). O envolvimento desses receptores nas funções fisiológicas e farmacológicas ocorre porque, segundo Buckingham (2005), os PPARs são expressados em muitos tecidos nos seres humanos. Estudos recentes mostraram que agonistas do PPARα e do PPARγ desenvolvem papel importante em processos inflamatórios (OLIVEIRA et al., 2007), levantado a hipótese de que ligantes do PPAR, tais como o TZDs, poderiam ser eficiente no tratamento de desordem inflamatória (DESMET et al., 2005). Tsukamoto e colaboradores (2004) relataram que o PPAR, induzido por TZDs inibem fatores de transcrição tais como o fator nuclear-kB e o ativador de proteína-1, que estão ligados à indução de COX-2. Estas evidências sugeriram que as TZDs poderiam modular a produção do prostanóides. Pereira (2007), sabendo do potencial das TZDs como agonistas do PPAR sintetizou novos derivados e testou sua atividade antiinflamatória tendo obtido resultados promissores com potencial bioativos no tratamento dessas desordenes. Com o objetivo de ampliar as descobertas nessa área propôs-se, nesse trabalho, a síntese de novos derivados TZDs 3,5-disubstituídos (LPSF/GQ) com potencial atividade antiinflamatória. 49 Parte Química Parte Química 4. SÍNTESE DE DERIVADOS TIAZOLIDÍNICOS 3,5-DISSUBISTITUÍDOS 4.1. Material Para a síntese e comprovação estrutural dos novos derivados das séries 5-benzilideno-3-(2-bromobenzil)-tiazolidina-2,4-diona e 5-benzilideno-3-(2,6- diflúorbenzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) utilizou-se reagentes e solventes específicos, placas cromatográficas e equipamentos. 4.1.1. Reagentes e solventes Para a síntese dos derivados 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona foram utilizados os seguintes reagentes e solventes: Acetato de etila Dimetilssulfóxido deuterado Acetona Etanol absoluto Ácido monocloroacético 4-Flúor-benzaldeído Benzeno Hidróxido de sódio 4-Bifenil-carboxaldeído Metanol 2-Bromo-benzaldeído 4-Metilsufonil-benzaldeído Cianoacetato de etila 4-Metil-benzaldeído 4-Cloro-benzaldeído n-Hexano 3-Cloro-benzaldeído 4-Nitro-benzaldeído 2-Cloro-benzaldeído Piperidina Cloreto de 2-bromo-benzil Tiouréia Cloreto de 2,6-diflúor-benzil 2, 3, 5-Trimetóxi-benzilideno 51 Todos os reagentes e solventes acima mencionados são de marcas Aldrich, Merck, Nuclear, Sigma ou Vetec, e foram utilizados dentro do prazo de validade. 4.1.2. Cromatografia Na cromatografia em camada delgada foram utilizadas placas Merck Sílica gel 60 F254, de 0,25mm de espessura, reveladas em luz ultravioleta (254 ou 366 nm). Na cromatografia em coluna flesh utilizou-se a sílica gel 60 Merck (230-400 Mesh) como adsorvente. 4.2. Equipamentos Para elucidação estrutural, na espectrofotometria de absorção no infravermelho (IV), utilizou-se um espectrofotômetro FTIR Bruker Modelo IFS 66, em pastilhas de KBr. Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H) foram efetuados em espectrofotômetro Varian Modelo Plus 300 MHz. Determinou-se os pontos de fusão em aparelho Quimis Modelo 340.27. 52 4.3. Metodologia O Esquema 8 representa o diagrama de síntese para a obtenção dos novos derivados TZDs bromados e fluorados (LPSF/GQ). H ClCH2CO 2H C CS(NH2)2 O R O CN H N Br H2C S COOCH2CH3 CN O N COOCH2CH3 R R1 CH2 O CH C S O CH CH2 O R1 CH2 N S O R1 R R = 4-CH3; 4-F; 4-NO2; 4-C6H5; 4-Cl; 4-SO2CH3; 3-Cl; 3-Br; 2-Br; 2-Cl R1 = 2-Br; 2,6-F; Esquema 8 - Diagrama de síntese dos derivados da tiazolidína-2,4-diona. 53 4.3.1. Síntese da tiazolidina-2,4-diona Em um balão de fundo redondo adicionou-se a tiouréia (5 g - 0,0658 mols) e o ácido monocloroacético (6,335 g - 0,0673 mols) previamente dissolvido em água. Aqueceu-se a mistura por 18 horas. Com a obtenção de cristais brancos. C3H3NO2S MM = 117 Rendimento: 84% Ponto de fusão: 121-122oC Ponto de fusão na literatura: 122 °C (KOCHKANYAN; ISRAELYAN; ZARITOUSKII, 1978) Rf: 0,51; CHCl3/CH3OH (96:4) 4.3.2. Síntese dos Ésteres 2-Ciano-3-fenil-acrilatos de etila (LPSF/IP) Em um balão de fundo redondo acoplado à Dean-Starck adicionou-se benzaldeídos substituídos e cianoacetato de etila, além da piperidina como catalisador e benzeno como solvente. A mistura reacional foi aquecida a uma temperatura de 110°C, durante 4 horas. Os precipitados obtidos, os ésteres 2ciano-fenil-acrilatos de etila (LPSF/IP), foram concentrados e purificados por recristalizações em etanol absoluto. 4.3.3. Síntese dos intermediários 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) Em um balão de fundo redondo, contendo uma solução etanólica de tiazolidina-2,4-diona adicionou-se solução etanólica de hidróxido de sódio Deixa-se reagir à temperatura ambiente por 10 minutos. Ao sal da tiazolidina2,4-diona formado adiciona-se o haleto de benzila substituído, a mistura reacional foi aquecida a temperatura de 78ºC. A reação foi acompanhada pela análise de cromatografia em camada delgada (CCD) através do sistema eluente adequado. 54 A estrutura geral e as características físico-químicas obtidas para os derivados 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona encontram-se na Tabela 1. Tabela 1 – Estrutura geral e características físico-químicas dos intermediários 3-(2-Bromo-benzil)tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-54) e 3-(2,6-Diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-175). Molécula F.M. M.M. P.F. (ºC) Rdt.(%) Rf Eluente C10H8BrNO2S 285 60-61 43,61 0,44 n-hex/AcOEt Br O CH2 N S O 7:3 LPSF/GQ-54 F O C10H7F2NO2S CH2 N 243 83-85 54 0,60 7:3 F S n-hex/AcOEt O LPSF/GQ-175 2.3.4. Método geral para a obtenção dos derivados tiazolidinônicos 3,5disubstituídos (LPSF/GQ) A mistura equimolar dos derivados 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona bromados (LPSF/GQ-54) ou fluorados (LPSF/GQ-175) e dos derivados 2ciano-3-fenil-acrilatos de etila (LPSF/IP), em presença catalítica de piperidina (12 gotas) e etanol absoluto (8 mL) como solvente, foi aquecida lentamente até a temperatura de 60ºC. A reação foi acompanhada pela análise de cromotografia em camada delgada (CCD) através do sistema eluente adequado. Após resfriamento ocorre a cristalização dos derivados tiazolidinônicos 3,5-disubstituídos, que foram purificados através de lavagens sucessivas com água destilada e álcool etílico absoluto (Tabela 2). 55 Tabela 2 – Estrutura geral dos derivados tiazolidinônicos 3,5-dissubstituídos (LPSF/GQ). ESTRUTURA GERAL O CH R COMPOSTO CH2 N S O R1 SUBSTITUINTE SUBSTITUINTE R1 R LPSF/GQ-115 2-Br 4-F LPSF/GQ-116 2-Br 4-NO2 LPSF/GQ-119 2-Br 3-Cl LPSF/GQ-120 2-Br 4-CH3 LPSF/GQ-122 2-Br 2-Cl LPSF/GQ-123 2-Br 3-Br LPSF/GQ-125 2-Br 4-SO2CH3 LPSF/GQ-128 2-Br 3,4,5-(OCH3)3 LPSF/GQ-192 2,6-F2 4-SO2CH3 LPSF/GQ-193 2,6-F2 4-Cl 4.4. Resultados e Discussão A comprovação estrutural dos compostos obtidos inicialmente propostos na metodologia deste trabalho foi realizada através das características físicoquímicas e análises espectroscópicas de infravermelho (IV) e ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H). Os dados apresentados não só indicam a obtenção, como também a pureza dos produtos finais. Os dados físico-químicos aqui discutidos compreendem os espectros de RMN1H e IV. As características físico-químicas obtidas para os derivados 5benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona encontram-se na (Tabela 3). 56 Tabela 3 – Características físico-químicas dos derivados tiazolidinônicos 3,5-dissubstituídos (LPSF/GQ) Molécula O CH2 N CH F Br S F.M. M.M. P.F. (ºC) Rdt.(%) Rf Eluente C17H11BrFNO2S 392 173-175 39,9 0,65 n-hex/AcOEt 9:1 O LPSF/GQ-115 O CH2 N CH O2N Br S C17H11BrN2O4S O 419 188-190 56,2 0,62 7:3 LPSF/GQ-116 O Cl CH2 N CH Br S C17H11BrClNO2S O 408,5 146-147 57 0,74 LPSF/GQ-119 O 7:3 Br S CH O C18H14BrNO2S 388 152-154 63,24 0,75 O CH2 N C17H11BrClNO2S 408,5 139-140 40,74 0,86 Br S CH n-hex/AcOEt 7:3 LPSF/SGQ-120 Cl n-hex/AcOEt CH2 N H3C n-hex/AcOEt n-hex/AcOEt 7:3 O LPSF/GQ-122 O Br CH2 N CH C17H11Br2NO2S Br S 451 159-160 38,83 0,82 O n-hex/AcOEt 7:3 LPSF/GQ-123 O H3C CH2 N O S CH O Br S C18H14 Br NO4S O 420 207-210 50,96 0,47 7:3 LPSF/GQ-125 OCH3 O N CH H3CO OCH3 S n-hex/AcOEt CH2 Br C20H18 Br NO5S O 464 199-200 60,75 0,74 LPSF/GQ-128 n-hex/AcOEt 7:3 F O N O H3C S CH CH2 C18H13F2NO4S2 F S O 409 158-160 85,14 0,36 n-hex/AcOEt 7:3 O LPSF/GQ-192 F O N Cl CH S CH2 F C18H13F2ClNO4S O 365,5 154-155 80,78 0,88 n-hex/AcOEt 7:3 LPSF/GQ-193 57 4.4.1. Análise Espectroscópica 4.4.1.1. Espectroscopia no Infravermelho (IV) Os espectros no infravermelho foram realizados em pastilha de KBr. A partir dos espectros de infravermelho (IV) foi possível verificar as bandas de absorção características dos grupos funcionais presentes nos derivados sintetizados. Observou-se as freqüências de absorção referentes às vibrações de estiramento da C=O entre as banda de absorção de 1750-1674 cm-1 e a vibração da ligação dupla C=C foi observada entre as freqüência de 16371620cm-1 (Tabela 4 e 5). Os resultados relativos aos espectros de infravermelhos aqui apresentados são referentes aos derivados 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) e tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ). 58 5-benzilideno-3-(2,6-diflúor-benzil)- -1 Tabela 4 - Freqüências de absorção no infravermelho, em cm , dos derivados 5-benzilideno-3-(2-bromobenzil)-tiazolidina-2,4-diona, (LPSF/GQ). Br O CH CH2 N S O R COMPOSTO R -CH= C=O C=O LPSF/GQ-115 4-F 1591 1750 1675 LPSF/GQ-116 4-NO2 1616 1750 1697 1603 1750 1679 1597 1738 1680 1603 1744 1686 1603 1744 1688 LPSF/GQ-119 3-Cl LPSF/GQ-120 4-CH3 LPSF/GQ-122 2-Cl LPSF/GQ-123 3-Br LPSF/GQ-125 4-SO2CH3 1603 1744 1677 LPSF/GQ-128 3,4,5-(OCH3)3 1597 1738 1677 Pastilhas de KBr - Espectrofotômetro FTIR Bruker, modelo IFS66 59 -1 Tabela 5 - Freqüências de absorção no infravermelho, em cm , dos derivados 5-benzilideno-3-(2,6diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ). F CH2 O N F S CH O R COMPOSTO R -CH= C=O C=O LPSF/GQ-192 4-SO2CH3 1603 1750 1691 LPSF/GQ-193 4-Cl 1610 1744 1688 Pastilhas de KBr - Espectrofotômetro FTIR Bruker, modelo IFS66 Os espectros IV dos derivados 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)- tiazolidina-2,4-diona e 5-benzilideno-3-(2, 6-diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ) analisados encontram-se no anexo. 4.4.1.2. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio A espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H) permitiu verificar as absorções características dos prótons presentes nos compostos das séries 5-benzilideno-3-(2,6-difluor-benzil)-tiazolidina-2,4dionas e 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ). Os espectros de RMN 1H foram realizados utilizando-se como solvente o DMSO-d6, marca Acros Organics. As multiplicidades dos sinais são indicados pelas seguintes abreviações: singlete (s), dublete (d), duplo dublete (dd), duplo duplo dublete (ddd), duplo triplete (dt), triplete (t), multiplete (m). Os deslocamentos químicos () foram expressos em ppm e os acoplamentos em Hz. Os derivados TZDs obtidos e caracterizados apresentaram deslocamentos químicos entre 7,1 – 8,39 ppm, correspondentes aos 60 hidrogênios aromáticos do grupamento benzilidênico e do benzílico substituído. Os sinais característicos dos grupos CH3, CH2 e CH aparecem como singleto nas regiões entre 2,29 – 2,37; 4,86 – 4,93 ppm e 7,96 – 8,11 ppm, respectivamente(Tabela 6 e 7). Os resultados relativos aos espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio aqui apresentados, são referentes aos derivados das séries 5benzilideno-3-(2,6-difluor-benzil)-tiazolidina-2,4-dionas bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ). 61 e 5-benzilideno-3-(2- Tabela 6 – Deslocamentos químicos () dos derivados 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4diona (LPSF/GQ). Br O CH CH2 N S O R Molécula LPSF/GQ-115 R 4-F CH CH2 SCH3 OCH3 (s) (s) (s) (s) 8,02 4,86 CH3 Hidrogênios Aromáticos (s) - - Benzilidênicos Benzílicos 7,75 (2H, dd) J=8,7 Hz 7,67 (1H, dd) J=7,49 Hz e J=1,49 Hz e J=5,4 Hz 7,42 (1H, t) J=8,49 Hz 7,37(2H, dd) J=7,5 Hz 7,27 (1H, dt) J=7,49 Hz e J =1,49Hz e J=1,5 Hz 7,21 (1H, d) J=7,49 Hz 7,69 (1H, dd) J=7,79Hz e J=1,19Hz LPSF/GQ-116 4-NO2 8,11 4,88 - - 8,39 (2H, d) J= 8,99 Hz 7,37 (1H, dt) J=7,49 Hz e J=1,49 Hz 7,95 (2H, d) J= 8,99 Hz 7,27 (1H, dt) J=7,79 Hz e J=1,79 Hz 7,26 (1H, dd) J=7,79 Hz e J=1,49 Hz 7,69 (1H, dd) J=7,99 Hz e J=1,49 Hz LPSF/GQ-119 3-Cl 7,99 4,86 - - 7,76 (1H, m) 7,36 (1H, dt) J=7,79 Hz e J=1,49 Hz 7,62-7,59 (3H, m) 7,26(1H, dt) J=7,79 Hz e J=1,49 Hz 7,21 (1H,dd) J=7,79 Hz e J=1,49 Hz 7,67 (1H, dd) J=7,79 Hz e J=1,19 Hz LPSF/GQ-120 4-CH3 7,96 4,86 - 2,37 7,56 (2H, d) J=8,1 Hz 7,34 (1H, dt) J=7,79 Hz e J=1,19 Hz 7,38 (2H, d) J=7,8 Hz 7,26 (1H, dt) J=7,79 Hz e J=1,49 Hz 7,18 (1H, dd) J=7,79 Hz e J=1,49 Hz 7,64-7,70 (1H, m) LPSF/GQ-122 2-Cl 8,09 4,87 - - 7,64-7,70 (2H, m) 7,38 (1H, dt) J=7,49 Hz e J=1,19Hz 7,53-7,59 (2H, m) 7,28 (1H, dt) J=7,49 Hz e J=1,49Hz 7,25 (1H, dd) J=7,79 Hz e J=1,49 Hz 7,89 – 7,90 (1H, m) LPSF/GQ-123 LPSF/GQ-125 3-Br 4-SO2CH3 7,98 8,08 - 4,86 4,87 3,29 - 7,67 (1H dd) J=7,79 Hz e J=1,19 Hz 7,72 (2H, ddd) J=8,1Hz, 7,37 (1H, dt) J=7,49 Hz e J=1,19 Hz J=1,8 Hz e J=0,9 Hz 7,27 (1H, dt) J=7,79 Hz e J=1,49 Hz 7,64 – 7,35 (1H, m) 7,21(1H, dd) J=7,49 Hz e J=7,49 Hz 8,08 (2H, d) J=8,39 Hz 7,69 (1H, dd) J=7,49 Hz e J=1,49 Hz 7,91 (2H, d) J=8,39 Hz 7,37 (1H, dt) J=7,49 Hz e J=1,49 Hz 7,29 (1H, dd) J=7,49Hz e J=1,49 Hz 7,22 (1H, dd) J=7,49 Hz e J=1,49 Hz 7,17 (1H, dd) J=7,79 Hz e J=1,49 Hz LPSF/GQ-128 3,4,5-OCH3 7,94 4,86 - 3,84 (6H, s) - 6,98 (2H, s) 3,74 (3H, s) 7,26 (1H, dt) J=7,49 Hz e J=1,49 Hz 7,37 (1H, dt) J=7,49Hz e J=1,49 Hz 7,67 (1H, dd) J=7,79 Hz e J=1,49 Hz DMSO-d6 – Espectrofotômetro Varian modelo Unity Plus-300 MHz 62 Tabela 7 – Deslocamentos químicos () dos derivados 5-benzilideno-3-(2, 6-diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4dionas (LPSF/GQ). F O CH2 N F CH S O R Molécula R -CH= (s) CH2 (s) SCH3 Hidrogênios Aromáticos (s) LPSF/GQ-192 LPSF/GQ-193 4-S02CH3 4-Cl 8,02 7,94 4,93 4,92 3,27 - Benzilidênicos Benzílicos 8,05 (2H, d) J=8,39 Hz 7,44 (1H, dt) J=8,39 Hz e J=2,09 Hz 7,87 (2H, d) J=8,39 Hz 7,12 (2H, dd) J=8,09 Hz 7,66 – 7,59 (4H, m) 7,43 (1H, dt) J=8,39 Hz e J=2,09 Hz 7,11 (2H,dd) J=8,09 Hz DMSO-d6 – Espectrofotômetro Varian modelo Unity Plus-300 MHz Os espectros de RMN1H dos derivados 5-benzilideno-3-(2-bromobenzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) e 5-benzilideno-3-(2, 6-diflúor-benzil)tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) analisados encontram-se no anexo. 63 Parte Biológica Parte Biológica 5. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE INTIINFLAMATÓRIA DOS DERIVADOS TIAZOLIDÍNICOS Quando a ação de uma determinada substância puder ser associada a um receptor particular no organismo, nos fornecera um valioso meio para a classificação e o aprimoramento ao desenvolvimento de novos fármacos (RANG et al, 2001). Para avaliar a potencialidade biológica de uma substância são utilizados protocolos experimentais específicos, tais como air pouch, peritonite induzida por carragenina, nocicepção induzida por ácido acético e nocicepção induzida pela formalina, entre outros. Esta técnica é denominada bioensaio (RANG et al, 2003). Neste trabalho utilizou-se para avaliar o processo inflamatório o modelo da peritonite induzida por carragenina. Segundo Coelho e colaboradores (2007), a cavidade peritonial é um espaço fechado, estéril e altamente eficaz contra infecção. Porém, a invasão e proliferação de agentes infecciosos na cavidade abdominal provocam processo inflamatório intenso. Na literatura são citados diversos modelos animais de indução de peritonite utilizados para estudo de estratégias terapêuticas. Os modelos utilizados contribuem não só na avaliação de novos compostos como também permite o estudo do processo infeccioso peritoneal e prover dados para melhor avaliar a terapêutica em humanos (KREIMER et al., 2005). Segundo Süleyman e Büyükokuroglu (2001), a carragenina é indicada como um bom meio para indução do processo inflamatório experimental. Por isso, o processo inflamatório produzido pelo modelo da peritonite induzida por carragenina foi escolhida para a investigação dos efeitos antiinflamatórios das novas TZDs obtidas neste trabalho. 65 5.1. Material O protocolo experimental selecionado foi realizado de acordo com algumas modificações no procedimento descrito por Gokhale e colaboradores (2002). Para a realização do bioensaio foram utilizados: 0,25 mL de carragenina, Salina tamponada com fosfato (PBS), solução salina 0,1 %, anticoagulante EDTA e solução de Turk. Os derivados TZDs testados foram: 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-flúor-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/ GQ- 115); 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-metilsufonil–benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-125); 3-(2,6-diflúor-benzil)-5-(4-metilsufonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-192) 3-(2,6-diflúor-benzil)-5-(4-cloro–benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ193). 5.1.1. Equipamento Para a contagem do número de leucócitos polimorfonucleares presentes no exsudato utilizou-se a Câmara de Newbauer. 5.1.2. Animais Foram utilizados camundongos Swiss (Mus musculus) machos, pesando entre 25 a 30 g, com idade média de 60 dias, provenientes do Biotério do LIKA da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram mantidos em pequenos grupos no Laboratório de Oncologia Experimental e Inflamação do Departamento de Antibióticos/UFPE. Os animais foram separados em gaiolas de polipropileno acondicionadas em estantes com ventilação com filtro de exaustão de ar renovado, ambiente aclimatado entre 25°C ± 3° C, fotoperíodo de 12/12 horas, ração e água ad libitum. Os experimentos foram executadas segundo as diretrizes aprovadas pela Comissão de Ética para Experimentos com Animais/UFPE (Processo N°016098/2006-13). 66 5.2. Metodologia 5.2.1. Medida da peritonite induzida por carragenina em camundongos Os animais, adultos machos, em jejum de 8 horas foram divididos em grupos de oito cada. Os animais do grupo I, utilizado como controle, foram tratados com veículo (salina e twenn, v.o.). Os animais do grupo II, utilizado como padrão, foram tratados com roseglitazona (v.o.). Aos animais dos demais grupos foram administrados as TZDs sintetizadas na forma de emulsão twenn/soro fisiológico, por via oral (GRISWOLD et al., 1987). Após, 60 minutos todos os animais foram administrados por via intraperitonial 0,25 mL de carragenina na cavidade peritoneal, para indução do processo inflamatório agudo (Figura 12) (VINEGAR et al., 1973). Figura 12 – Administração por via oral das substâncias em teste (LPSF/GQ) e administração de 1 mL de carragenina (1%) Quatro horas mais tarde, foi induzido óbito dos animais por deslocamento cervical. A cavidade peritoneal foi posteriormente lavada com 2 mL da solução PBS heparinizada, com a finalidade de coletar material para análise, o PBS permaneceu 1 minuto misturada às secreções peritoneais. Em seguida, o lavado foi removido. Para contagem do número total de células foram retirados 20 μL de cada amostra, os quais foram diluídos em 40 μL de solução de Turk. A contagem global de células foi feita em câmara de Newbauer (Figura 13). 67 Figura 13 – Lavagem da cavidade peritoneal com solução de PBS heparinizada e coleta do exsudato inflamatório. Os resultados foram expressos como médias do número de leucócitos totais (x10³/mm³) de cada grupo comparado ao grupo controle (BARROS et al., 2004), as variáveis quantitativas foram expressas por suas médias e respectivos desvios padrão, calculados de acordo com a equação abaixo: Atividade Antiinflmatória (%) = [(n – n’) /n] x 100 Onde n e n’ indicam a média ± erro padrão do exsudato retirados do grupo controle e dos grupos teste respectivamente em uma determinada hora (PALASKA et al., 2003). 5.3. Resultados e Discussão Quatro novos compostos das séries 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ) antiinflamatória no modelo e foram peritonite 5-benzilideno-3-(2,6-diflúor-benzil)testados induzido para por a atividade carragenina em camundongos, nas doses de 0,03; 0,3 e 3 mg/Kg administrados oralmente. Todos os representantes das séries LPSF/GQ testados demonstraram interessante atividade antiinflamatória, com um percentual de inibição da migração celular variando entre 31a 88 % (Tabela 6). 68 Tabela 8 - Atividade Antiinflamatória apresentada pelos derivados das séries 5-benzilideno-3-(2-bromobenzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) e 5-benzilideno-3-(2,6-diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ) com respectivas doses em mg/Kg. Derivado Substituinte no anel benzílico LPSF/GQ-115 ED50 – 1,44 mg/Kg LPSF/GQ-125 ED50 – 1,14 mg/Kg LPSF/GQ-192 ED50 – 1,1 mg/Kg LPSF/GQ-193 Substituinte no anel benzilidênico 2-Br Concentração molar 4-F 2-Br 4-SO2CH3 4-SO2CH3 2,6-F 2,6-F 4-Cl Salina + twenn Total de PMN 5 (x 10 /mL) Percentual de inibição da migração celular 7,65 x 10 -6 3 29,40 ± 4,05 67 7,65 x 10 -7 0,3 61,66 ± 5,43 30 7,65 x 10 -8 0,03 70,08 ± 6,70 21 7,14 x 10 -6 3 25,21 ± 3,02 72 7,14 x 10 -7 0,3 56,80 ± 3,66 36 7,14 x 10 -8 0,03 71,58 ± 7,30 19 7,33 x 10 -6 3 10,33 ± 4,83 88 7,33 x 10 -7 0,3 56,50 ± 3,1 36 7,33 x 10 -8 0,03 74,50 ± 6,6 16 8,21 x 10 -6 3 60,8 ± 7,01 31 3 17,50±2,4 81 10 Rosiglitazona + twenn Dose mg/Kg -5 88,5 ± 5,95 PMN = Leucócitos polimorfonucleares. Camundongos tratados oralmente com os novos derivados tiazolidínicos nas doses mencionadas. Cada valor representa a média ± erro padrão de n = 8 animais. O percentual de inibição foi calculado de acordo com a equação: Atividade antiinflamatória % = (m-m’/m) x 100 A peritonite avalia a migração leucocitária, por meio da contagem de leucócitos (x 103/mm3), presentes no exsudato liberado na cavidade peritoneal, após a administração de carragenina, 4 horas antes da contagem das células. Neste experimento o composto 3-(2,6-diflúor-benzil)-5-(4-metilsufonil- benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-192) (Figura 14) revelou-se o mais efetivo dentre os testados na dose de 3 mg/kg, alcançando um nível de inibição (88 %) da migração celular superior ao da rosiglitazona, droga padrão (81 %). Observou-se também uma redução satisfatória da migração celular com os 69 compostos 3-(2-Bromo-benzil)-5-(4-metilsufonil–benzilideno)-tiazolidina-2,4- diona (LPSF/GQ-125) (72 %) e o 3-(2-Bromo-benzil)-5-(4-flúor-benzilideno)tiazolidina-2,4-diona (LPSF/ GQ-115) (67 %) na dose de 3 mg/Kg. F O O H3C CH2 N S F S CH O O Figura 14 – Estrutura química do 3-(2,6-diflúor-benzil)-5-(4-metilsufonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-192). Os resultados acima mencionados demonstraram que a introdução dos grupamentos halogenados (bromo, cloro e flúor) no anel benzílico pode ser responsável pelo aumento ou diminuição da resposta biológica. A presença do bromo ou do flúor nos compostos 3-(2,6-diflúor-benzil)-5(4-metilsufonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-192), 3-(2-bromobenzil)-5-(4-metilsufonil–benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-125) e o 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-flúor-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-115) (Figura 15) não apresentaram efeitos significativos, visto que, o percentual da migração celular não apresentou grande variação (Diagrama 1). O N F CH S O CH2 N O Br H3C O S CH S CH2 Br O O (LPSF/GQ-125) (LPSF/ GQ-115) F O N O H3C S CH CH2 F S O O (LPSF/GQ-192) Figura 15 – Estrutura química do 3-(2,6-diflúor-benzil)-5-(4-metilsufonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-192), 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-metilsufonil–benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-125) e o 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-flúor-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/ GQ-115). 70 100 90 88 81 80 70 % IMC 72 67 Rosiglitazona 60 LPSF/GQ-115 50 LPSF/GQ-125 31 40 LPSF/GQ-192 LPSF/GQ-193 30 20 10 0 Dose 3mg/Kg Diagrama 1: Percentual de inibição da migração celular na dose de 3 mg/Kg dos derivados tiazolidínicos (LPSF/GQ). Contrariamente, a presença do cloro em para no anel benzilidênico do 5(4-Cloro–benzilideno)-3-(2,6-diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-193) ocasionou uma redução do percentual da migração celular. Corroborando com estudos realizados por Ottaná e colaboradores em 2005, demonstraram que a presença cloro em posição para reduziram a atividade antiinflamatória em teste in vivo (Figura 16). F O N Cl CH S CH2 F O Figura 16 – Estrutura química do 5-(4-cloro–benzilideno)-3-(2,6-diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4diona (LPSF/GQ-193). Os dados obtidos neste experimento com os derivados das séries 5benzilideno-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona benzilideno-3-(2,6-diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ) (LPSF/GQ) e 5- sugerem que estes compostos são dose-dependentes, visto que, a atividade inibitória relacionada à migração de PMN diminuiu com a diminuição da dose administrada (Diagrama 2). 71 100 88 90 81 80 72 67 70 % IMC 60 50 40 36 30 30 36 21 19 16 20 10 ) e se (d os (d o LP SF /G Q1 92 92 Q1 0, 03 m g/ Kg g/ Kg ) ) 0, 3m 3m g/ Kg ) e os 92 LP SF /G LP LP SF /G 25 Q1 (d os (d e 0, 03 m g/ Kg g/ Kg ) ) se (d o SF /G Q1 Q1 25 25 LP SF /G Q1 SF /G 0, 3m 3m g/ Kg ) e os (d e os (d LP SF /G Q1 15 15 Q1 LP LP SF /G 0, 03 m g/ Kg g/ Kg ) 0, 3m (d o (d 15 Q1 SF /G LP se os e Ro si g lita zo n 3m g/ Kg ) a 0 Diagrama 2: Percentual de inibição da migração celular dos derivados tiazolidínicos (LPSF/GQ) nas doses de 3; 0,3; 0,03 mg/Kg. O resultado aqui apresentado não nos permite sugerir um mecanismo de ação antiinflamatória. Porém, esses resultados mostram-se bastantes significativos, fato que sugere um estudo mais aprofundado destas séries. 72 Conclusões Conclusões 6. CONCLUSÕES Foram obtidos 10 novos derivados TZds sendo 8 compostos da série 5benzilideno-3-(2-bromo-benzil)-tiazolina-2,4-diona e 2 compostos da série 5benzilideno-3-(2,6-diflúor-benzil)-tiazolina-2,4-diona (LPSF/GQ): 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-flúor-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (GQ-115); 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-nitro-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (GQ-116); 3-(2-bromo-benzil)119); 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-metil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona 120); (GQ- 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-cloro-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona 122); (GQ- 5-(2-bromo–benzilideno)-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona 123); (GQ- 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-metilsufonil–benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (GQ-125); 3-(2-bromo-benzil)-5-(2,3,5-trimetóxi-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (GQ-128); 3-(2,6-diflúor-benzil)-5-(4-metilsufonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (GQ-192); 5-(4-cloro–benzilideno)-3-(2, 6-diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (GQ193). 5-(3-cloro-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (GQ- Todos os compostos obtidos tiveram suas fórmulas estruturais comprovados através dos espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e infravermelho. 74 O rendimento na última etapa dos compostos da série 5-benzilideno-3(2-bromobenzil)-tiazolina-2,4-diona (LPSF/GQ) variaram de 39 % a 63 % e o rendimento dos compostos da série 5-benzilideno-3-(2,6-diflúorbenzil)-tiazolina2,4-diona (LPSF/GQ) variaram de 81 % a 85 %. Foram escolhidos quatro representantes das séries LPSF/GQ que tiveram sua atividade antiinflamatória investigada no modelo de inflamação peritonite induzido por carragenina em camundongos. Todos os derivados TZDs testados demonstraram uma atividade antiinflamatória, com um percentual de inibição da migração celular variando entre 31 a 88 % para a dose de 3 mg/Kg. Destaca-se o derivado 3-(2, 6-diflúor-benzil)-5-(4-metilsufonilbenzilideno)- tiazolidina-2,4-dionas (LPSF/GQ-192) demonstrou ser o composto mais ativo dentre os testados na dose de 3 mg/kg, com um nível de inibição da migração de PMN de 88 % e com perfil de atividade superior ao fármaco rosiglitazona. 75 Referências Bibliográficas Referências Bibliográficas AMARAL, A.T.; MONTANARI, C. A. Química medicinal: 25 anos de planejamento racional de fármacos Química Nova, v. 25, Supl. 1, p. 39-44, 2002. ALI, S.; O’BOYLE, G.; MELLOR, P.; KIRBY. J. A. 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Their structural elucidation was carried through by IR and 1H NMR. The a antiinflammatory activity of the compounds 4a,g and 5a,b were evaluated in mice. Keywords: Thiazolidine; anti-inflammatory; Medicinal Chemistry, peritonitis * e-mail: [email protected] 110 INTRODUÇÃO A síntese de fármacos é um importante capítulo da química orgânica, uma vez que permite a construção de moléculas, em seus diversos níveis de complexidade. Nesse contexto, a Química Medicinal surgiu para aperfeiçoar a busca por compostos bioativos de maneira racional. Sendo necessário para isso, o trabalho em conjunto de profissionais das mais variadas áreas1. Esta área de conhecimento, utilizando diferentes estratégias metodológicas complementares, é tradicional e reconhecidamente usada no planejamento de fármacos. A TZD é o exemplo de um composto sintético que vem despertando cada vez mais o interesse dos pesquisadores devido a sua alta reatividade química. As substituições apropriadas dos grupamentos químicos presentes nas posições 3 e 5 do anel tiazolidínico oferecem a oportunidade de obtenção de compostos análogos potencialmente bioativos 2. Este heterociclo apresenta diversas atividades biológicas, sendo particularmente importante como agente terapêutico. Dentre essas, pode-se destacar a atividade antiinflamatória 3,4,5 e hipoglicemiante 6,7,8. A inflamação é uma resposta dos organismos vivos a uma agressão sofrida. Esta resposta padrão é comum a vários tipos de tecidos e é mediada por diversas substâncias produzidas pelas células danificadas que se encontram eventualmente nas proximidades da lesão 9. A TZD é o ligante farmacológico do receptor ativado por proliferador de peroxissome (PPAR)-g que é usado extensivamente no tratamento do diabetes tipo II 2,10,11,12,13 . Os PPARs são fatores transcricionais pertencente a super família de receptores nucleares ligante ativado. E coexistem como três principais subtipos: PPAR- 111 α, PPAR-β e PPAR-γ para as TZDs 2,16,17 14,15 ). Recentemente, um potencial antiinflamatório foi sugerido gerando novas possibilidades para a obtenção de fármacos antiinflamatórios. Diante disso, Pereira18, sabendo do potencial das tiazolidina-2,4-dionas como agonistas do PPAR sintetizou novos derivados e avaliou a sua atividade antiinflamatória tendo obtido resultados promissores com potencial bioativos no tratamento dessas desordenes. Com o objetivo de ampliar as descobertas nessa área propôs-se, nesse trabalho, a síntese de novos derivados tiazolidínicos 3,5-disubstituídos com potencial atividade antiinflamatória. PARTE EXPERIMENTAL Todos os compostos sintetizados tiveram suas estruturas químicas elucidadas por espectroscopia de IV, RMN1H. Os espectros no infravermelho foram realizados em pastilha de KBr 1% e 2% em um espectrofotômetro FTIR Bruker Modelo IFS 66 ou Bomem Modelo MB 100. Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) foram efetuados em espectrofotômetro Varian Modelo Plus 300 MHz, utilizando-se como solvente o DMSO-d6. Os pontos de fusão foram determinados em um aparelho Quimis Modelo 340.27. Na cromatografia em camada delgada foram utilizadas placas de sílica gel 60 Merck F254, de 0,25 mm de espessura, reveladas em luz ultravioleta (254 ou 366 nm) ou através de vapores de iodo. 112 Procedimentos experimentais Tiazolidina-2,4-diona (1) Adicionou-se em um balão a tiouréia à solução aquosa de ácido monocloroacético. Aqueceu-se a mistura por 18 horas. Em seguida, o produto obtido foi cristalizado em geladeira. Formaram-se cristais brancos, cuja purificação foi feita por cristalizações sucessivas em água destilada. A tiazolidina-2,4-diona, de fórmula molecular C3H3NO2S (MM = 117), após purificação, apresenta-se na forma de cristais brancos. Este composto foi obtido com rendimento de 84%, apresentando ponto de fusão 121-122ºC (ponto de fusão na literatura 122°C)22 e Rf = 0,51, em sistema de eluição CHCl3/CH3OH 96:4. Procedimento geral de obtenção dos derivados 3,5-dissubstituídos Quantidades equimolares da 3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (2) ou 3(2,6-diflúor-benzil)-thiazolidina-2,4-diona (3) e dos derivados 2-ciano-3-fenil-acrilatos de etila substituídos dissolvidos em etanol, em presença de 350 μL piperidina como catalisador, foram aquecidas sob refluxo durante 4 horas. Após resfriamento, ocorre a cristalização dos derivados tiazolidina-2,4-diona-3,5-disubstituidos, 4a-h e 5a-5b, que foram purificados através de lavagens sucessivas com água destilada e álcool etílico absoluto. 113 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-flúor-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona, 4a C17H11BrFNO2S, rendimento: 39,9%. Mp. 175 °C. TLC n-hexeno: acetate de etila (9:1) Rf: 0,65. IR cm-1 (KBr): ν 1750, 1675, 1591. 1H NMR (δ ppm, DMSO-d6): 8,02 (s, CH), 4.86 (s, CH2), 7,75 (dd, 2H Benzilideno), 7,37(dd, 2H Benzilideno), 7,67 (dd, 1H benzil), 7,42 (t, 1H benzil), 7,27 (dt, 1H benzil), 7,21 (d, 1H benzil). 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-nitro-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona, 4b. C17H11BrN2O4S, rendimento: 56,2%. Mp. 190°C. TLC n-hexeno: acetate de etila (7:3) Rf: 0,62. IR cm-1 (KBr): ν. 1750, 1697, 1616. 1H NMR (δ ppm, DMSO-d6): 8,11 (s, CH), 4.88 (CH2), 8,39 (d, 2H Benzilideno), 7,95(d, 2H Benzilideno), 7,69 (dd, 1H benzil), 7,37 (dt, 1H benzil), 7,27 (dt, 1H benzil), 7,26 (dd, 1H benzil). 3-(2-bromo-benzil)-5-(3-cloro-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona, 4c C17H11BrClNO2S, rendimento: 57%. Mp. 147 °C. TLC n-hexeno: acetate de etila (7:3) Rf: 0,74. IR cm-1 (KBr): ν 1750, 1679, 1603. 1H NMR (δ ppm, DMSO-d6): 7,99 (s, CH), 4.86 (s,CH2), 7,76 (m, 1H Benzilideno), 7,62-7,59 (m, 3H Benzilideno), 7,69 (dd, 1H benzil), 7,36 (dt, 1H benzil), 7,26 (dt, 1H benzil), 7,21 (dd, 1H benzil). 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-metil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona, 5d. C18H14BrNO2S, rendimento: 63%. Mp. 154 °C. TLC n-hexeno: acetate de etila (7:3) Rf: 0,75. IR cm-1 (KBr): ν 1738, 1680, 1597. 1H NMR (δ ppm, DMSO-d6): 7.96 (s, CH), 4.86 (s, CH2), 2,37 (s, CH3), 7,56 (d, 2H Benzilideno), 7,38 (d, 2H Benzilideno), 7,67 (dd, 1H benzil), 7,34 (dt, 1H benzil), 7,26 (dt, 1H benzil), 7,18 (dd, 1H benzil). 114 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-cloro-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona, 4e. C17H11BrClNO2S, rendimento: 41%. Mp. 140 °C. TLC n-hexeno: acetate de etila (7:3) Rf: 0,86. IR cm-1 (KBr): ν 1744, 1686, 1603. 1H NMR (δ ppm, DMSO-d6): 8,09 (s, CH), 4.87 (s, CH2), 7,64-7,70 (m, 2H Benzilideno), 7,53-7,59 (m, 2H Benzilideno), 7,64-7,70 (m, 1H benzil), 7,38 (dt, 1H benzil), 7,28 (dt, 1H benzil), 7,25 (dd, 1H benzil 5-(2-bromo–benzilideno)-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, 4f. C12H11Br2NO2S, rendimento: 39%. Mp. 160 °C. TLC n-hexeno: acetate de etila (7:3) Rf: 0,82. IR cm- 1 (KBr): ν 1744, 1688, 1603. 1H NMR (δ ppm, DMSO-d6): 7.98 (s, CH), 4.86 (s, CH2), 7,89 – 7,90 (m, 1H Benzilideno), 7,72 (ddd, 2H Benzilideno), 7,64 – 7,35 (m, 1H Benzilideno), 7,67 (dd, 1H benzil), 7,37 (dt, 1H benzil), 7,27 (dt, 1H benzil), 7,21 (dd, 1H benzil). 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-metilsufonil–benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona, 4g. C18H14 Br NO4S, rendimento: 51%. Mp. 210 °C. TLC n-hexeno: acetate de etila (7:3) Rf: 0,47. IR cm-1 (KBr): ν 1744, 1677, 1603. 1H NMR (δ ppm, DMSO-d6): 8,08 (s, CH), 4.87 (s, CH2), 3,29 (s, SCH3), 8,08 (d, 2H Benzilideno), 7,91 (d, 2H Benzilideno), 7,69 (dd, 1H benzil), 7,37 (dt, 1H benzil), 7,29 (dt, 1H benzil), 7,22 (dd, 1H benzil). 3-(2-bromo-benzil)-5-(2, 3, 5-trimetóxi-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona, 4h. C23H16N2O4S, rendimento: 51%. Mp. 203 °C. TLC n-hexeno: acetate de etila (7:3) Rf: 0,60. IR cm-1 (KBr): ν 1745, 1682, 1604. 1H NMR (δ ppm, DMSO-d6): 7.94 (s, CH), 4.86 (s, CH2), 3.84 (s, 6H OCH3) e 3.74 (s, 3H OCH3), 6,98 (s, 2H Benzilideno), 7,67 (dd, 1H benzil), 7,37 (dt, 1H benzil), 7,26 (dt, 1H benzil), 7,17 (dd, 1H benzil). 115 3-(2,6-diflúor-benzil)-5-(4-metilsufonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona, 5a. C18H13F2NO4S2, rendimento: 85%. Mp. 160 °C. TLC n-hexeno: acetate de etila (7:3) Rf: 0,36. IR cm-1 (KBr): ν 1750, 1691, 1603. 1H NMR (δ ppm, DMSO-d6): 8.02 (s, CH), 4.93 (s, CH2), 3,27 (s, SCH3), 8,05 (d, 2H Benzilideno), 7,87 (d, 2H Benzylic), 7,44 (dt, 1H benzyl), 7,26 (dd, 2H benzyl 5-(4-cloro–benzilideno)-3-(2, 6-diflúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona, 5b. C18H13F2ClNO4S, rendimento: 81%. Mp. 155 °C. TLC n-hexeno: acetate de etila (7:3) Rf: 0,88. IR cm-1 (KBr): ν 1744, 1688, 1610. 1H NMR (δ ppm, DMSO-d6): 7.94 (s, CH), 4.92 (s, CH2), 7,66 – 7,59 (m, 4H Benzilideno), 7,43 (dt, 1H benzil), 7,11 (dd, 2H benzil). DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA Para realização da atividade antiinflamatória todos os compostos foram dissolvidos em salina com 2% de Tween 80 (veículo). Atividade antiinflamatória - peritonite induzido por carragenina A inflamação foi induzida em ratos albinos suíços (Mus musculus) machos, com peso entre 25 ± 5 g, oriundos do Biotério do LIKA da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram separados em gaiolas de polipropileno acondicionadas em estantes com ventilação com filtro de exaustão de ar renovado, ambiente aclimatado entre 25°C ± 3° C, fotoperíodo de 12/12 horas, ração e água ad libitum. O procedimento 116 experimental foi aprovado pelo Comitê Local de Ética Animal / UFPE (Processo N°016098/2006-13). Os animais em jejum de 8 horas receberam por via oral, os compostos testes (4a, 4g, 5a e 5b) em doses de 0,03, 0,3 e 3 mg/kg, o controle (veículo) e o padrão (rosiglitazona), numa dose de 3 mg / Kg, dissolvida na solução de Tween 80/água destilada (1:99 v / v) considerado como o veículo. 1h após a Inflamação foi induzida através de uma injeção intraperitoneal de 0,25 mL de carragenina 19. Quatro horas mais tarde, os animais foram eutanasiados (deslocamento cervical) e 2 ml de Ca2+ e Mg2+ Solução salina tampão fosfato (PBS) foi injetado na cavidade peritoneal. Na sequência de uma massagem peritoneal suave, os exsudatos foram removidos, o total de leucócitos foi determinado em câmara de Newbauer e o % inibição do recrutamento de leucócitos foi calculada em relação ao controle. Estatística Os dados foram analisados estatisticamente por meio de análise de variância (ANOVA) e Bonferroni teste com um intervalo de confiança de 95%, utilizando o software Origem 7,0. A percentagem de inibição da migração celular dos compostos testados foi calculada de acordo com a equação: Atividade antiinflamatória% = (mm '/ m) x 100. Onde m e m" representam a média do número de células do grupo controle (veículo) e tratados, respectivamente. O diferencial do número total de células no grupo controle (veículo) corresponde a 100% da inflamação. Tomando-se por referência o valor do grupo controle (veículo), estima-se a percentagem de inibição da inflamação dos outros compostos. Todos os valores descritos nas imagens e texto foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM), para o número de animais estudados (n = 7). 117 RESULTADOS E DISCUSSÃO As tiazolidina-2,4-diona-3,5-disubstituidas, 4a-h e 5a-b, foram preparadas a partir da reação de adição de Michael entre a tiazolidina-2,4-diona-3-benzil substituída (2 e 3), com ésteres cianocinâmicos 20, 21 , de acordo com Daboun et al 22 . A via de síntese está demonstrada no Esquema 1. A tiazolidina-2,4-diona (1) foi N-(3)-alquilado em presença de hidróxido de potássio, formando o sal potássio da tiazolidina, que reage com o haleto de benzila em meio alcoólico aquecido 23. O O H N S Benzil/ Haletos KOH / MeOH O N O CH2 R ArCH(CN)COOC2 H5 Piperidina / EtOH S O N H S R 2e3 1 CH2 O R 4a-1h e 5a-b R1 2 ---- R = 2-Br 3 ---- R = 2,6-F2 4a ---- R = 2-Br; R1 = 4-F 4b ---- R = 2-Br; R1 = 4-NO2 4c ---- R = 2-Br; R1 = 3-Cl 4d ---- R = 2-Br; R1 = 4-CH3 5a ---- R = 2,6-F2; R1 = 4-SO2CH3 4e ---- R = 2-Br; R1 = 2-Cl 5b ---- R = 2,6-F2; R1 = 4-Cl 4f ---- R = 2-Br; R1 = 3-Br 4g ---- R = 2-Br; R1 = 4-SO2CH3 4h ---- R = 2-Br; R1 = 3,4,5-(OCH3)3 Esquema 1. Rota sintética das tiazolidina-2,4-diona-3,5-disubstituidas. 118 O método reacional utilizado proporcionou bons rendimentos sendo considerado de mais fácil manuseio. A comprovação estrutural dos compostos obtidos inicialmente propostos na metodologia deste trabalho foi realizada através das características físico-químicas e análises espectroscópicas de infravermelho (IV) e ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H). Os dados apresentados não só indica a obtenção, como também a pureza dos produtos finais. A partir dos espectros de infravermelho (IV) foi possível verificar as bandas de absorção características dos grupos funcionais presentes nos derivados sintetizados. Observou-se as freqüências de absorção referentes às vibrações de estiramento da C=O entre as banda de absorção de 1750-1674 cm-1 e a vibração da ligação dupla C=C foi observada entre as freqüência de 1637-1620 cm-1 A espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio permitiu verificar as absorções características dos prótons presentes nos compostos das séries 5benzilideno-3-(2,6-difluor-benzil)-tiazolidina-2,4-dionas (5a-b), e 5-benzilideno-3-(2bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-dionas (4a-h). Os espectros de RMN 1H foram realizados utilizando-se como solvente o DMSO-d6, marca Acros Organics. Os deslocamentos químicos () foram expressos em ppm e os acoplamentos em Hz. Os derivados TZDs obtidos e caracterizados apresentaram deslocamentos químicos entre 7,1 – 8,39 ppm, correspondentes aos hidrogênios aromáticos do grupamento benzilidênico e do benzílico substituído. Os sinais característicos dos grupos CH3, CH2 e CH aparecem como singleto nas regiões entre 2,29 – 2,37; 4,86 – 4,93 ppm e 7,96 – 8,11 ppm, respectivamente. 119 No que concerne à avaliação biológica, os compostos 4a, 4g, 5a e 5b foram submetidos ao estudo da atividade antiinflamatória. Os efeitos das novas TZDs obtidos após a administração oral foram avaliados utilizando o modelo experimental de inflamação induzida por carragenina na cavidade peritoneal 19,25 . Os resultados dos análogos da thiazolidina, 4a-4g e 5a-5b, testados em inflamação induzida em camundongos estão resumidos na Tabela 1 120 Tabela 1 – Resultados do teste antiinflamatório dos compostos 4a-g, 5a-b e ROSIGLITAZONA Derivado O CH 1,44 Br S O Total de PMN (x 105/mL) Percentual de inibição da migração celular 7,65 x 10-6 3 29,40 ± 4,05 67 7,65 x 10-7 0,3 61,66 ± 5,43 30 7,65 x 10-8 0,03 70,08 ± 6,70 21 7,14 x 10-6 3 25,21 ± 3,02 72 7,14 x 10-7 0,3 56,80 ± 3,66 36 7,14 x 10-8 0,03 71,58 ± 7,30 19 7,33 x 10-6 3 10,33 ± 4,83 88 7,33 x 10-7 0,3 56,50 ± 3,1 36 7,33 x 10-8 0,03 74,50 ± 6,6 16 8,21 x 10-6 3 60,8 ± 7,01 31 10-5 3 17,50 ± 2,4 81 CH2 N O S Dose mg/Kg O (4a) H3C Concentração molar CH2 N F ED50 mg/Kg CH Br S O 1,14 O (4g) F O H3C CH2 N O S CH F S 1,1 O O (5a) F O N Cl CH S CH2 F O (5b) O Me H N S O N O N ROSIGLITAZONA Salina + twenn 88,5 ± 5,95 Camundongos tratados oralmente. Cada valor representa a média ± erro padrão de n = 6 animais. Os valores apresentados são significativos para o intervalo de confiança de 95% (ANOVA, teste de Bonferrori. 121 A peritonite avalia a migração leucocitária, por meio da contagem de leucócitos (x 103/mm3), presentes no exsudato liberado na cavidade peritoneal, após a administração de carragenina, 4 horas antes da contagem das células controle 26 . Neste experimento o composto 5a revelou-se o mais efetivo dentre os testados na dose de 3 mg/kg, alcançando um nível de inibição (88 %) da migração celular superior ao da Rosiglitazona, droga padrão (81 %). Observou-se também uma redução satisfatória da migração celular com os compostos 4g (72 %) e 4a (67 %) na dose de 3 mg/Kg. Os resultados acima mencionados demonstraram que a introdução dos grupamentos halogenados (bromo, cloro e flúor) no anel benzílico pode ser responsável pelo aumento ou diminuição da resposta biológica. A presença do bromo ou do flúor nos compostos 5a, 4a e 4b não apresentaram efeitos significativos, visto que, o percentual da migração celular não apresentou grande variação Contrariamente, a presença do cloro em para no anel benzilideno do composto 5b ocasionou uma redução do percentual da migração celular. Corroborando com estudos realizados por Ottaná et al 27, que demonstraram que a introdução do cloro em para reduziram a atividade antiinflamatória em testes in vivo. Os dados obtidos neste experimento com os derivados 5a, 4a e 4b sugerem que estes compostos são dose-dependentes, visto que, a atividade inibitória relacionada a migração de PMN aumentou com o aumento da dose administrada (DIAGRAMA 1). 122 100 90 88 81 80 70 % IMC 72 67 60 50 40 36 30 21 30 36 19 16 20 10 0 Figura 3. Percentual de inibição da migração celular dos diferentes grupos experimentais, aferido 240 min (efeito máximo) após administração da carragenina. 0,3 e 3 mg/kg; vo), 4b (0,03; 0,3 e 3 mg/kg; vo), Rosiglitazona (3 mg/kg; v.o.), 4a (0,03; 5a (0,03; 0,3 e 3 mg/kg; vo). CONCLUSÃOS Dez novos derivados tiazolidínicos sendo 8 da série 5-benzilideno-3-(2bromobenzil)-tiazolina-2,4-diona (4a-h) e 2 da série 5-benzilideno-3-(2,6- diflúorbenzil)-tiazolina-2,4-diona (5a-b). Através dos dados obtidos para as propriedades físico-químicas, que neste estudo compreenderam o ponto de fusão, a determinação do Rf em cromatografia de camada delgada, os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e infravermelho foi confirmada a obtenção dos compostos inicialmente propostos em elevado grau de pureza. O rendimento dos compostos da série 5-benzilideno-3-(2-bromobenzil)tiazolina-2,4-diona (4a-h) variaram de 38,83% a 63,24% e o rendimento dos compostos 123 da série 5-benzilideno-3-(2,6-diflúorbenzil)-tiazolina-2,4-diona (5a-b) variaram de 80,78% a 85,14% sendo todos, de forma geral, considerados bons. Quatro compostos tiveram sua atividade antiinflamatória investigada no modelo de inflamação peritonite induzido por carragenina em camundongos. Todos os derivados tiazolidínicos testados demonstraram uma atividade antiinflamatória, com um percentual de inibição da migração celular variando entre 31 a 88% para a dose de 3 mg/Kg. O análogo 5a apresentou uma atividade superior a rosiglitazona, droga de referência. AGRADECIMENTOS Agradecemos ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil). REFERÊNCIAS 1. Montanari, C. A.; Quím. Nov. 2000, 23, 1, 134-137. 2. 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