EDUARDO MACHADO HARTMANN
INVESTIGAÇÃO DA RECUPERAÇÃO DA GLICEMIA
ATRAVÉS DA ADMINISTRAÇÃO ORAL DE GLICEROL,
PIRUVATO E L-LACTATO DURANTE HIPOGLICEMIA
INDUZIDA POR INSULINA
Dissertação
apresentada
ao Programa de Pósgraduação em Ciências
Biológicas
(Área
de
concentração - Biologia
Celular e Molecular) da
Universidade Estadual de
Maringá, para obtenção do
grau
de
Mestre
em
Ciências Biológicas.
Maringá
2008
EDUARDO MACHADO HARTMANN
INVESTIGAÇÃO DA RECUPERAÇÃO DA GLICEMIA
ATRAVÉS DA ADMINISTRAÇÃO ORAL DE GLICEROL,
PIRUVATO E L-LACTATO DURANTE HIPOGLICEMIA
INDUZIDA POR INSULINA
Prof. Dr. Roberto Barbosa Bazotte – Orientador
Profª. Drª. Rosângela Fernandes Garcia - Co-orientadora
BIOGRAFIA
Eduardo Machado Hartmann nasceu em Santa Rosa, RS, em 07 de fevereiro
de 1982. Durante o período de graduação, na condição de bolsista do CNPq
desenvolveu atividades de iniciação científica no grupo de pesquisa do prof. Dr.
Roberto Barbosa Bazotte. Licenciado em Ciências Biológicas pelo Centro
Universitário de Maringá – CESUMAR (2005) deu prosseguimento a sua
formação científica na condição de mestrando junto ao Programa de PósGraduação em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá.
Possui experiência na área de Biologia Celular e Bioquímica, atuando
principalmente nos seguintes temas: Hipoglicemia Induzida por Insulina,
Recuperação da Glicemia e Metabolismo Hepático.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação
(CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
H333i
Hartmann, Eduardo Machado
Investigação da recuperação da glicemia através da
administração oral de glicerol, piruvato e L-lactato
durante hipoglicemia induzida por insulina / Eduardo
Machado Hermann. -- Maringá : [s.n.], 2008.
34 f.
Orientador : Prof. Dr. Roberto Barbosa Bazotte.
Co-orientador : Profª. Drª. Rosângela Fernandes
Garcia.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de
Maringá, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas (Área de concentração - Biologia Celular e
Molecular), 2008.
1. Recuperação de glicemia. 2. Gliconeogênese. 3.
Metabolismo hepático. 4. Hipoglicemia. 5. Hipoglicemia
induzida por insulina. I. Universidade Estadual de
Maringá. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas. II. Título.
CDD 21.ed. 616.466
Aos meus pais,
irmão, amigos e mestres...
AGRADECIMENTOS
À minha família, pelo apoio, compreensão e estímulo;
Aos meus orientadores, Prof. Dr. Roberto B. Bazotte e Profª. Drª. Rosângela
Fernandes Garcia, cuja paciência e dedicação contribuíram para a realização
deste trabalho;
À Universidade Estadual de Maringá, por colaborar em mais esta etapa de
nossas vidas;
Ao departamento de Ciências Morfofisiológicas, em especial ao laboratório de
Fisiologia Humana, pelo acolhimento e apoio;
À coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas;
Aos amigos e colegas, pelos momentos que passamos juntos;
Aos companheiros de trabalho dos laboratórios de Fisiologia Humana e
Farmacologia Endócrina da Universidade Estadual de Maringá: Vilma,
Helenton, Gabriela, Franciele, Elizete, Valéria, Fabiana, Kátia, e aos demais
que partilham de nossa alegria;
À todos que de alguma forma, auxiliaram na realização deste trabalho;
Aos demais que de uma forma sutil, deixam marcas em nossas vidas...
APRESENTAÇÃO
Esta dissertação de Mestrado foi redigida na forma de um artigo
científico “Investigation of glycemia recovery with oral administration of
glycerol, pyruvate and L-lactate during insulin induced-hypoglycemia”.
Neste estudo investigou-se a recuperação da glicemia e a contribuição da
neoglicogênese durante a administração de precursores de glicose nãoaminoácidos em ratos submetidos à hipoglicemia induzida por insulina (HII).
Este trabalho representa a continuidade do trabalho “Blood amino acids
concentration during insulin-induced hypoglycemia in rats: the role of alanine
and glutamine in glucose recovery”, que investigou o efeito agudo da
administração oral de L-alanina e L-glutamina e a contribuição destes
aminoácidos para recuperação da glicemia. Em consonância com as normas
estabelecidas pelo Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, o
artigo foi redigido de acordo com as normas da revista Journal of diabetes
and its complications.
Eduardo M. Hartmann, Rosângela F. Garcia, Roberto B. Bazotte. Investigation
of glycemia recovery with oral administration of glycerol, pyruvate and Llactate during insulin induced-hypoglycemia. Journal of diabetes and its
complications.
RESUMO GERAL
INTRODUÇÃO – A hipoglicemia induzida por insulina (HII) é o principal efeito
adverso da insulinoterapia. Porém, considerando que durante a HII a administração de
glicose (Glc) ou glucagon apresentam efeitos transitórios na recuperação da glicemia
(RG), esforços têm sido dedicados à obtenção de antídotos mais eficientes. Assim,
resultados promissores foram obtidos com L-alanina, lipídios, L-lactato (Lac), piruvato
(Pir), terbutalina ou injeção combinada de hormônios contrarreguladores. De acordo
com estes estudos, também demonstramos que a administração oral ou parenteral de Lalanina promoveu RG durante HII de curto e longo prazo. Além disso, demonstramos
que a administração oral isolada ou combinada de glicerol, Lac e Pir promoveu RG
durante HII de curto prazo.
OBJETIVOS – Portanto, visando ampliar estes estudos, o efeito agudo da
administração oral isolada ou combinada de glicerol, Pir e Lac na RG durante HII de
longo prazo e a participação da gliconeogênese hepática neste processo foi avaliado.
MÉTODOS – Utilizaram-se ratos machos Wistar (180-220g) em jejum de 24 h. O
grupo hipoglicêmico (grupo HII) foi constituído de ratos que receberam uma injeção
intraperitoneal (ip) de insulina regular (1.0 U/Kg). Os ratos que receberam injeção ip de
salina constituíram o grupo normoglicêmico, ou seja, o grupo controle (grupo COG). A
primeira série de experimentos caracterizou a resposta glicêmica após a injeção de
insulina. A glicemia foi avaliada 0, 15, 30, 60, 120 e 180 min após a injeção ip de
insulina (grupo HII) ou salina (grupo COG). Como a HII foi mantida até 180 min após a
injeção de insulina, este tempo foi selecionado para avaliar os efeitos agudos dos
substratos gliconeogênicos na RG e produção hepática de Glc. Além disso, neste tempo,
avaliaram-se as concentrações sanguíneas de glicerol, Pir e Lac sendo os resultados
obtidos utilizados como valores de concentração basal nos experimentos de perfusão de
fígado. Para investigar os efeitos do glicerol, Pir ou Lac (100 mg/kg cada) ou a
combinação de glicerol + Pir + Lac (100 mg/kg cada) na RG, estas substâncias foram
administradas via oral por gavagem. Além disso, para fins comparativos, três grupos
adicionais foram incluídos: salina (veículo), Glc (100 mg/kg) e um grupo que recebeu
glicerol + Pir + Lac (33,3 mg/kg cada). A administração ocorreu 15, 150 ou 165 min
após a injeção de insulina e a coleta de sangue ocorreu 180 min após a injeção de
insulina. Assim, realizaram-se as coletas de sangue 165, 30 ou 15 min após a
administração oral dessas substâncias. Para os experimentos de perfusão de fígado, os
ratos foram anestesiados e submetidos à laparotomia e os fígados perfundidos in situ.
Após um período de pré-infusão, as substâncias (isoladas ou combinadas) foram
dissolvidas no fluido de perfusão e infundidas durante 20 min, seguido por um período
de pós-infusão. Amostras do fluido efluente de perfusão foram coletadas e as
concentrações de Glc analisadas. As diferenças na produção de Glc durante e antes da
infusão de cada substrato permitiram o cálculo da área sob a curva (AUC), expresso em
µmol/g e da mesma maneira obteve-se a AUC para a produção de Pir ou Lac. Além
disso, determinou-se a capacidade hepática máxima de produzir Glc a partir do glicerol,
Pir e Lac. Para isto, utilizaram-se concentrações crescentes de glicerol, Pir ou Lac, cuja
adição elevou a produção de Glc até alcançar a concentração saturante, isto é, a menor
concentração na qual obteve-se a máxima produção de Glc. Sendo 2, 5 e 5 mmol/l os
valores obtidos para o glicerol, Pir e Lac , respectivamente (grupo controle) e 2, 2, e 5
mmol/l, respectivamente para o grupo HII, estes valores foram utilizados nos
experimentos de perfusão de fígado.
RESULTADOS E DISCUSSÃO – Ratos HII que receberam glicerol, Pir e Lac oral
(isolados ou combinados) apresentaram maior glicemia 15 e 30 min após a
administração destas substâncias, isto é, 165 e 150 min após a injeção de insulina. Além
disso, exceto para o grupo que recebeu a combinação dos precursores (glicerol + Pir +
Lac, 100 mg/Kg cada), os valores da glicemia foram similares aos do grupo HII-salina
quando estas substâncias foram administradas 165 min antes da coleta de sangue, isto é,
15 min após a injeção de insulina. Os fígados de ratos submetidos à HII e seus
respectivos grupos controle apresentaram elevada produção de Glc, Pir e Lac quando
infundidos com níveis saturantes de glicerol, Pir e Lac isolados ou combinados. Além
disso, em linhas gerais, os fígados de ratos HII e seus respectivos grupos controle
mostraram uma produção similar de Glc, Pir e Lac quando infundidos com
concentrações basais ou supra-fisiológicas de glicerol, Pir e Lac isolados ou
combinados. Portanto, como demonstrado anteriormente na HII de curto prazo, a
administração oral de glicerol, Pir e Lac (isolados ou combinados), promoveu RG.
Além disso, a melhor RG obtida com glicerol + Pir + Lac (100 mg/Kg cada) oral pode
ser atribuída à maior disponibilidade de precursores de hepáticos de glicose. Para
verificar esta possibilidade, comparou-se a produção de Glc a partir de níveis basais e
supra-fisiológicos (isolados ou combinados) de glicerol, Pir ou Lac. Não somente a
produção de Glc, mas também a produção de Pir e Lac foram maiores para
concentrações supra-fisiológicas de substratos gliconeogênicos (Basal vs. Suprafisiológico). Além disso, os níveis de glicerol e Lac necessários para obter a máxima
produção de Glc foram similares para os grupos HII e COG. Mas, para o Pir, a produção
máxima de Glc no grupo HII foi obtida com 40% da concentração no grupo COG.
Assim, ao contrário do glicerol e Lac, a eficiência hepática em produzir Glc a partir do
Pir durante HII foi mais elevada.
CONCLUSÕES – A disponibilidade de glicerol, Pir e Lac no sangue não foi suficiente
para fornecer precursores de glicose em quantidade suficiente para promover RG.
Porém, a administração oral de glicerol, Pir e Lac durante a HII poderia auxiliar na RG
em função da mais elevada disponibilidade portal destes substratos gliconeogenicos.
Portanto, estes resultados abrem a possibilidade para a administração oral (isolada ou
combinada) de glicerol, Pir e Lac no tratamento da HII.
GENERAL ABSTRACT
AIMS – Insulin induced hypoglycemia (IIH) is the major adverse effect of insulin
therapy. However, since during IIH, the administration of glucose (Glc) or glucagon
shown transitory effects on glucose recovery (GR), much effort is being devoted to
obtain better antidotes. Thus, encouraging results were acquired with L-alanine, lipids,
L-lactate (Lac),
pyruvate (Pyr), terbutaline
or
combined
administration of
counterregulatory hormones. In agreement, we also demonstrated that oral and
parenteral administration of L-alanine promoted GR during short term and long-term
IIH. Moreover, we demonstrated that the isolated or combined oral administration of
glycerol, Pyr and Lac promoted GR during short term IIH. Thus, to expand this
previous study, the acute effect of isolated or combined oral administration of glycerol,
Pyr and Lac on GR during long term IIH and the participation of hepatic
gluconeogenesis in this process were done.
METHODS – Male Wistar 24 h fasted rats (180-220 g) were used. The hypoglycemic
group (IIH group) was composed by rats, which received an intraperitoneal (ip)
injection of regular insulin (1.0 U/Kg). Rats that received an ip injection of saline
composed the normoglycemic group, i.e., the control group (COG group). The first set
of experiments characterized the glycemic response after the injection of insulin.
Glycemia was measured 0, 15, 30, 60, 120 and 180-min after ip insulin (IIH group) or
saline (COG group) injection. Since hypoglycemia was maintained until 180 min after
insulin injection, this time was selected to evaluate the acute effects of gluconeogenic
substrates on GR and liver Glc production. Moreover, at this time the blood
concentration of glycerol, Pyr and Lac were measured and the values obtained were
used as basal concentrations to the liver perfusion experiments. To investigate the effect
of isolated glycerol, Pyr and Lac or combined glycerol + Pyr + Lac (each 100 mg/kg) on
GR, these substances were orally administrated (gavage). Moreover, for comparative
purpose 3 additional groups were included: saline (vehicle), Glc (100 mg/kg) and a
group which received glycerol + Pyr + Lac (each 33.3 mg/kg). The administration of all
these substances occurred 15 min, 150 min or 165 min after insulin injection and the
blood collection occurred 180 min after insulin injection. Thus, the blood collection
occurred 165, 30 or 15 min after the oral administration of these substances,
respectively. For liver perfusion experiments the rats were anaesthetized and submitted
to laparotomy and the livers were perfused in situ. After a pre-perfusion period, the
gluconeogenic substrates (isolated or combined) were dissolved in the perfusion fluid
and infused during 20 min, followed by a post-infusion period. Samples of the effluent
perfusion fluid were collected and the concentrations of Glc were analyzed. The
differences in the Glc production during and before the infusion of substrate allowed
calculation the areas under the curves (AUC), expressed as µ mol/g. Therefore, the AUC
which shown the liver production Pyr and Lac were obtained from similar procedure.
Furthermore, the maximal hepatic capacity to produce Glc from glycerol, Pyr and Lac
was determined. For this purpose, increasing concentrations of glycerol, Pyr or Lac
were used. The addition of these substances increased the Glc production until
saturating concentration was reached, i.e., the lowest concentration at which the
maximal Glc production was obtained. The saturating concentrations obtained to
glycerol, Pyr and Lac in the COG group were 2 mmol/l, 5 mmol/l and 5 mmol/l,
respectively, whereas for the IIH group, the values were 2 mmol/l, 2 mmol/l and 5
mmol/l, respectively. These values were used in the liver perfusion experiments.
RESULTS AND DISCUSSION – IIH rats that received oral glycerol, Pyr or Lac
(isolated or combined) showed higher glycemia when administered 15 and 30 min
before the blood collection, i.e, 165 and 150 min after insulin injection, respectively.
Furthermore, except to the group which received combined glycerol + Pyr + Lac (each
100 mg/kg), the values of glycemia were similar to saline-IIH group when these
substances were administered 165 min before the blood collection, i.e, 15 min after
insulin injection. Livers of rats submitted to IIH and their respective COG groups
shown higher production of Glc, Pyr and Lac when infused with saturating
concentrations of isolated or combined glycerol, Pyr and Lac. On the other hand, in
general terms, livers from IIH rats and their respective COG groups showed similar
production of Glc, Pyr and Lac when infused with basal or supraphysiological
concentrations of isolated or combined glycerol, Pyr and Lac. Therefore as previously
demonstrated to short term IIH, isolated or combined oral glycerol, Pyr, and Lac
promoted GR. Moreover, the best GR, obtained with oral glycerol + Pyr + Lac (each
100 mg/kg) could be attributed to the higher liver availability of Glc precursors. To
verify this possibility, Glc production from basal and supraphysiological levels (isolated
or combined) of glicerol, Pyr and Lac were compared. Not only Glc production, but also
Pyr and Lac production were higher to supraphysiological levels of gluconeogenic
substrates (Basal vs. Supraphysiological). Furthermore, the concentration of glycerol
and Lac necessary to obtain the maximal Glc production was not different (IIH vs. COG
group). But, to Pyr, the maximal Glc production from livers of IIH rats was obtained
with 40% of the concentration to COG rats. Thus, in contrast with glycerol and Lac, the
hepatic efficiency to produce Glc from Pyr during IIH was increased.
CONCLUSIONS – The blood availability of glycerol, Pyr and L-lac was not enough to
furnish an amount the glucose precursor enough to help glucose recovery. However, the
oral administration of glycerol, Pyr and L-lac during IIH could help GR due to the
increased portal blood availability of these gluconeogenic substrates. Therefore, these
data open the possibility to the oral administration of glycerol, Pyr and Lac (isolated or
combined) in the treatment of IIH.