A Genética Molecular em Análises Clínicas 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética A Genética Molecular no Laboratório de Análises Clínicas Hematologia Factores genéticos de Risco em doenças da coagulação Mutações associadas a doenças hereditárias do eritrócito Alterações genéticas associadas a patologias onco-hematológicas Imunologia Imunogenética Genética das imunodeficiências primárias Factores genéticos de risco em algumas doenças autoimunoes Microbiologia e virologia Ajuda ao diagnóstico com a identificação de genes virais ou bacterianos em amostras clínicas Detecção de genes/mutações/polimorfismos no genoma bacteriano ou viral associados a resistência a farmacos Estudos epidemiológicos por métodos genéticos no apoio ao controlo da infecção nosocomial Factores genéticos de Risco em doenças da coagulação Factor-V-Leiden Protrombina MTHFR PAI (4G/5G) HPA-1a/1b Anomalias Genéticas da Hemostase Estados de Hipocoagulação Hemofilia A (anomalias do gene do FVIII) Hemofilia B (anomalias do gene do FIX) Doença de von Wilebrand (anomalias do gene do vWF) Estados de Hipercoagulação Deficiência de Antitrombina III Deficiência de Proteína C Deficiência de Proteína S Resistência à Proteína C Activada (FV-Leiden) Mutações associadas a doenças hereditárias do eritrócito Deficiência em G6PG Deficiência em Piruvato Kinase Anemia Sideroblástica Hemocromatose Esferocitoses Talassémias Alfa beta Mutações associadas a doenças hereditárias do eritrócito Deficiência em Glicose-6-fosfato-desidrogenase 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética ATP ADP NAD NADH ADP ATP ADP ATP NADH NAD Glicose HK Glicose-6-fosfato GPI Frutose-6-fosfato PFK frutose-1,6-difosfato Aldolase Gliceraldeido-3-fosfato GA3PD 1,3-Difosfoglicerato PGK 3-Fosfoglicerato PGM 2-Fosfoglicerato Enolase G6P Fosfoenolpiruvato PK Piruvato 6PG LDH Lactato NADP G6PD NADPH 6-Fosfogluconato NADP 6PGA Ribose-5-fosfato NADPH Via Aeróbica G6PD NADP GSSGR GSH GSHPX H2O2 Catalase NADPH GSSG H2O Gene da G6PD (Xq) Homodimero de monomeros c/ 58 Kd (531 aa) 18 Kb de DNA 13 exons 12 exons codificantes (12-236 bp cada) 1 exon na zona 5’ não transcrita Elevado numero de polimorfismos.Ex: Pvu II (intron 5): Nt 1311 e 1116 Deficiência em G6PD Essencialmente mutações missense: Afectando a actividade enzimática, mas de forma incompleta (ind. Assintomáticos) Inibindo completamente a actividade enzimática (anemia severa) variantes bioquimicas diferentes mas uma só variante genética: reagentes modificações pós-t. variantes genéticas diferentes mas uma só variante bioquímica implicações estruturais e funcionais iguais Teoria de Lyon P P M P M P M P M M P M Mutações associadas a doenças hereditárias do eritrócito Deficiência em Piruvato-quinase 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética Deficiência em Piruvato-quinase (PK) ATP ADP NAD NADH A piruvato quinase catalisa o penultimo passo da via catabólica da glicose ADP AT P ADP ATP NADH NAD Glicose Hexoquinase Glicose-6-fosfato GPI Frutose-6-fosfato PFK frutose-1,6-difosfato Aldolase Gliceraldeido-3-fosfato GA3PD 1,3-Difosfoglicerato PGK 3-Fosfoglicerato PGM 2-Fosfoglicerato Enolase Fosfoenolpiruvato Piruvato quinase Piruvato LDH Lactato Gene da Piruvato-quinase 2 genes da Piruvato-Quinase: PKM2 (isoenzimas M1 e M2) PK-1 ou PKLR (isoenzimas L e R) 1q21 expresso nos RBC e no figado 1629bp; • 12 exons • 543aa; • 68bp-5’non-coding; • 734bp-3’noncoding Gene da Piruvato-quinase Polimorfismos da PKLR: Microssatélite no intron 11 Polimorfismo CA na posição 1705 Mutações 300 variantes bioquimicas 59 mutações diferentes identificadas até 1996 distribuidas ao longo de quase todo o gene (exons 4-12 e região promotora) mutações tipo missense, nonsense e inserções Genética das Hemoglobinopatias HEMOGLOBINA NORMAL HEMOGLOBINAS ANORMAIS GENES QUIMERA DREPANOCITOSE TALASSÉMIAS ALFA - TALASSÉMIAS BETA-TALASSÉMIAS Persistência Hereditária de Hb Prof.Doutor José Cabeda F 2001/2002 Genética 2 As diferentes hemoglobinas a2 a Hemoglobinas e a2 a Gg Ag Yb Hb Gower 1 ( 2e2) Hb Gower 2 (a2e2) Crom. 16 d b Crom. 11 Hb A2 (a2d2) Hb F (a2g2) Hb A (a2b2) Hb Portland ( 2g2) Vida embrionária Vida fetal Vida adulta Genética das Hemoglobinopatias 2001/2002 HEMOGLOBINA NORMAL HEMOGLOBINAS ANORMAIS GENES QUIMERA DREPANOCITOSE TALASSÉMIAS ALFA - TALASSÉMIAS BETA-TALASSÉMIAS Persistência Hereditária de Hb F Prof.Doutor José Cabeda Genética Genética das Hemoglobinopatias 2001/2002 HEMOGLOBINA NORMAL HEMOGLOBINAS ANORMAIS GENES QUIMERA DREPANOCITOSE TALASSÉMIAS ALFA - TALASSÉMIAS BETA-TALASSÉMIAS DELTA-TALASSÉMIAS Persistência Hereditária de Hb F Prof.Doutor José Cabeda Genética Genética das Hemoglobinopatias 2001/2002 HEMOGLOBINA NORMAL HEMOGLOBINAS ANORMAIS GENES QUIMERA DREPANOCITOSE TALASSÉMIAS ALFA - TALASSÉMIAS BETA-TALASSÉMIAS DELTA-TALASSÉMIAS Persistência Hereditária de Hb F Prof.Doutor José Cabeda Genética A genética das a-talassémias a2 a a2 a a2 a a2 aa/aa Normal a2 a2 a-/aheterozigótico aa/aheterozigótico a2 a aa/- heterozigótico a2 a-/- Doença da Hb H --/-Hydrops fetalis Genética das Hemoglobinopatias 2001/2002 HEMOGLOBINA NORMAL HEMOGLOBINAS ANORMAIS GENES QUIMERA DREPANOCITOSE TALASSÉMIAS ALFA - TALASSÉMIAS BETA-TALASSÉMIAS DELTA-TALASSÉMIAS Persistência Hereditária de Hb F Prof.Doutor José Cabeda Genética Genética das Hemoglobinopatias 2001/2002 HEMOGLOBINA NORMAL HEMOGLOBINAS ANORMAIS GENES QUIMERA DREPANOCITOSE TALASSÉMIAS ALFA - TALASSÉMIAS BETA-TALASSÉMIAS DELTA-TALASSÉMIAS Persistência Hereditária de Hb Prof.Doutor José Cabeda Genética Persistência Hereditária de Hb F Delecções db Formas delecionais Formas Primárias Delecções Agdb Delecções LCR Talassémias eGgAgdb Hb Kenya Formas não delecionais Formas Secundárias ß-talassémia drepanocitose Autossómicas não ß-globina Locus ß-globina (promotor g-globina, e Ligadas ao cromossoma X Anemias Hemoliticas Esferociticas 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética O GENE DA ANQUIRINA DO RBC (ANK1) 8p 43 exons 2 formas por splicing alternativo Mutações: 14 variantes causadoras de esferocitose 4 missense 3 splicing 7 delecções 5 polimorfismos informativos a-espectrina ß3 ß4 ß5 ß6 ß7 ß8 ß9 ß10 ß11 ß12 ß13 ß14 ß15 ß16 ß17 ß1 C N ß-espectrina a-espectrina ß1 C ß1 C N N ß1 ß1 C N N C ß1 Cromossoma 1 Existe habitualmente um excesso 3-4X de a-espectrina relativamente à bespectrina, pelo que def. neste gene só são habitualmente sentidas na forma homozigótica ß1 ß2 C N C a-spt20 segmentos homólogos+ 2 não homólogos b-spt17 segmentos homólogos ß1 Unidade de repetição c/ 106a.ª estrutura alongada que emparelha (cabeça-a-cabeça) com a a-espectrina formando dímeros, os quais associam cabeça-a-cabeça formando tetrâmeros N b-espectrina 17 segmentos homólogos segmento N-terminal não homólogo que liga actina segmento C-terminal não homólogo que possui um local de fosforilação Devido à relativa falta de b-espectrina, a sua deficiência é habitualmente dominante Gene da a-espectrina 8,001 bp com um ORF de 7,287 originando 2429 a.ª 53 exons 1q21 Polimorfismos dominio aII(africa): tipo I - 701R/809I/853T tipo II- 701H/809V/853R tipo III-701H/809I/853T tipo IV-701R/809V/853R Polimorfismos na zona não codificante: Xba I; Pvu II; Msp I Gene da a-espectrina Mutações 21 variantes causadoras de eliptocitose 1 inserção 1 mut. Splicing 19 missense 4 variantes causadoras de esferocitose 2 splicing 2 missense 1 variante causadora de piropoiquilocitose splicing Gene da b-espectrina 6,773bp com ORF de 6,411bp e 2,137a.a. 32 exons 14q Polimorfismos: 2 variantes não patogénicas do dominio ßIV: soectrin saint-Chamond Spectrin Tlemcen Hind iii; stu I, Pst I, PvuII, Taq I Gene da b-espectrina Mutações: 6 variantes causadoras de esferocitose 1 inserção 5 missense 21 variantes causadoras de heliptocitose 8 missense 6 splicing 4 delecção 3 inserção 1 variante causadora de hidropsia fetal 1 missense Banda 3 Transportador aniónico proteína integral da membrana gene com 20 exons cDNA com 3637bp originando 911 a.a. Banda 3 Mutações: 37 variantes causadoras de esferocitose 22 missense 2 splicing 1 regulador 8 delecções 4 inserções Banda 4.1 A banda 4.1 faz a ponte entre a malha de espectrina e várias proteínas integrais da membrana: glicoforina A e C banda 3 fosfatidilserina numero de exons desconhecido cDNA com 2867 bp originando 589 a.a. Polimorfismos: não foram identificados Mutações: 4 variantes causadoras de eliptocitose 2 missense; 1 inserção; 1 delecção Banda 4.2 Função não completamente esclarecida Estabiliza a ligação anquirina-banda 3 (?) Essencial à estabilidade da membrana (mut. Originam HS) Gene: 13 exons 2 isoformas por splicing alternativo cDNA com 2652bp (721 a.a) ou 2565bp (691a.a. ) Mutações: 6 variantes causadoras de esferocitose (5 missense; 1 splicing) Hemocromatose Hereditária 20 anos à procura de um gene 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética Hereditary Hemochromatosis HLA-linked primary disorder of iron overload One of the most common autosomic recessive disorders in Caucasians. Possible frequency of: homozygotes 1/200 heterozygotes 1/10 Clinically Heterogeneous. Increased iron absorption leads to accumulation of iron in tissues: • Liver • Pancreas • Hypophysis • Unknown Pathogenesis. Heart Joints Skin Search for Hemochromatosis gene 1976: HLA-A3 frequency in Patients physical linkage to HLA-A gene within 1-2cM of HLA-A Families with recombinations in the HLA locus 1986: Gene between HLA-A and HLA-B 1993: Gene centromeric to HLA-F Microsatelite markers 1995: gene telomeric to HLA-F 1995-1996: gene more than 1Mb telomeric to MHC THE HEMOCHROMATOSIS GENE: HLA-H ? Linkage disequilibrium mapping with a combination of maximum allelic association and analysis of probable historic recombination events identification of an area with 250Kb identification of 15 genes in the area 12 histone genes 1 HLA gene (HLA-H) 2 other genes THE HEMOCHROMATOSIS GENE: HLA-H ? Linkage disequilibrium mapping with a combination of maximum allelic association and analysis of probable historic recombination events identification of an area with 250Kb identification of 15 genes in the area 12 histone genes 1 HLA gene (HLA-H) 2 other genes His63Asp Cys282Tyr THE HEMOCHROMATOSIS GENE: HLA-H ? C282Y HLA-H mutation: present in 85% of the patient’s chromossomes present in 3.2% of the control chromossomes predicted to abolish ligation to ß2-Microglobulin H63D HLA-H mutation present in 8 of the 9 C282Y heterozygotes present in 17% of control chromossomes predicted to lye in the putative peptide binding pocket Alterações genéticas associadas a patologias onco-hematológicas Translocações envolvendo os genes do TCR e Ig Genes hibridos resultantes de translocções Delecções Inversões Mutações pontuais Alterações do padrão de metilação Translocações envolvendo os genes TCR e Ig Translocações envolvendo os genes do TCR e das Ig IgH IgK Ig TCR-ad TCR-ß Translocação Doença Gene afectado t(8;14)(q24;q32) t(11;14)(q13;q32) t(14;18)(q32;q21) t(14;19)(q32;q13) t(3;14)(p27;q32) t(5;14)(q31;q32) t(2;8)(p12;q24) t(2;3)(p12;q27) t(8;22)(q24;q11) t(3;22)(q27;q11) t(1;14)(p32;q11) t(10;14)(q24;q11) t(11;14)(p14;q11) t(11;14)(p13;q11) t(8;14)(q24;q11) t(1;7)(p32;q35) t(7;9)(p34;q32) t(7;11)(p35;p13) t(7;9)(q34;q34.3) t(;7)(q34;q34) t(7;19)(q34;p13) Burkitt LNH-manto LNH-foliculares LLC-B C-Myc bcl-1 (CCND1/PRAD1) bcl-2 (apoptose) bcl-3 (ciclina?) LLA-pre B Burkitt LNH-célula grande Burkitt IL-3 (citocina) LLA-T LLA-T LLA-T LLA-T LLA-T LLA-T LLA-T & LNH LLA-T LLA-T bcl-6 (zinc-finger) Tal-1 TCL-3 (Hox11) Rhombotin 1 Rhombotin 2 (TCL-2) C-Myc Tal-2 dominio LIM TAN-1 lck LYL1 Translocação Doença Genes afectados t(9;22)(q34;q11) LMC;LLA adulto/LMA abl bcra t(15;17) (q22;q21) LMA-M3 PMLb RARad t(11;17)(q35;q21) LMA-M3 PLZFc RARad t(5;17)(q35;q21) NPMe RARad t(8;21)(q22;q22) LMA-M2 ETOc AML1 Inv(16)(p13;q22) LMA-M4Eo MYHf CBFBg t(6;9)(p23;q34) LMA,LMA-TdT+ DEK CAN inv(3)(q21;q26) LMA-M1 EVI1c t(3;3)(q21;q26) t(1;9)(q23;q13) LLA-pre B PBX1h E2A t(12;21)(p13;q22) LLA-prec.B infantis TEL AML1 a t(2;5)(p23;q35) LNH-anaplásico ALK NPMe t(4;11)(q21;q23) LLA-pre B ALLc AF4i t(1;11)(q32;q23) LAM AF1Pe t(6;11)(q27)(q23) LAM AF6i t(9;11)(p21;q23) LAM-M5,prec.B AF9i t(11;17)(q23;q21) LAM AF19 t(11;19)(q23;p13) LAM,LLA-prec. B ENLi t(8;13)(p11;q12) sindrome mieloproliferativo ZNF198 FGFR-1 a) tirosina cinase b) guanosina trifosfatase c) zinc finger d) receptor acido retinoico e) fosfoproteina f) gene da miosina g) factor de transcrição h) gene homeótico i) transdução de sinal Genes hibridos resultantes de translocções Bcr/abl Os genes BCR e ABL normais, e as translocações que originam as proteínas p190 e p210 do gene quimera BCR-ABL. A proteína p210 é característica da CML, sendo a p190 a proteína BCRABL encontrada na maioria dos casos de ALL pml/rar A localização cromossómica e estrutura normal dos genes PML e RARa, e a translocação t(15;17)(q22;21) que origina o gene quimera PML-RARA.
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