Pesquisas em genoma funcional
“Revolução” da pesquisa na área de ciências biológicas
Quando?
Porque?
Década de 90
Universalização e desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante
- Barateamento do preço dos sequenciamento
Desenvolvimento de novas tecnologias para sequenciar DNA e proteinas
Fatos:
- O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados
- O genoma de duas plantas completamente sequenciado
- Genoma de Drosophila completamente sequenciado
- Genoma do camundongo completamente sequenciado
- Sequenciamento do genoma humano proximo de seu termino
Grande numero de programas de sequenciamento aleatorio de sequencias (EST)
Expressas está em andamento em vários diferentes organismos e espécies
Consequências atuais
- Grande quantidade de informação disponível
- Formação de grandes consórcios de pesquisa: Projeto 2010
- Análise científica mais holística
Consequências futuras:
- Predição dos fenótipos que resultariam de mudancas genéticas específicas
- Identificar quais mudanças genéticas poderiam acelerar a domesticação de espécies selvagens
Facilitar a manipulacao genética que garantiria a manutenção e expansão das bases de germoplasma
Descrição dos mecanismos responsáveis pela heterose; habilidade de utilizar este fenômeno mais efetivamente
Melhor compreensão da base genética da plasticidade fenotípica
Caracterização do grupo mínimo de genes para o funcionamento de um organismo
Compreensão da base genética da evolução::: melhor compreensão da diversidade da vida na terra
Compreensão das interações entre os organismos e seu ambiente a nível de ecosistema
Estratégia de Genoma funcional: Ex: tolerância a estresses abióticos
Descoberta de genes
Estudo expressão gênica em
larga escala
Homologia como critério para
identificar genes em bancos de
sequências EST e genômicas
cDNA macro/microarrays;
genechips
Seleção de mutantes
EMS, radiação, T-DNA,
transposons
Data mining
Clonagem e sequênciamento
Criação e análise de um banco de dados
Posição no mapa gen. ou físico;
Baseado na inserção de
sequência alvo
Estudos das interações
Sistema duplo-hibrido de leveduras
Phage display
Interação in vitro (crom. Afinidade,
imunoprecipitação
Testes funcionais
Complementação leved.
Mutante em Arabidopsis
Superexpressão
Estudos de expressão in situ
Fusão proteína com GFP
Estudos genéticos
Alelismo
Antisenso.
Supressão por RNAi
Aditividade
Epistasia
Supressão
Expressão GFP ou luciferina com o promotor
Montagem de uma combinação de genótipos em plantas transgênicas
Construção de modelos de controle dos processos envolvidos
Modificação de plantas de interesse agrícola baseados nesses modelos: modificação simultânea
da expressão de vários genes
Transcriptoma:
Análise dos níveis de RNA
de varios genes simultaneamente
Um genoma possui varios
transcriptomas
…varios transcriptomas temporais
Ex: tempo apos sujeicao a um estresse
Ex: tempo apos uma determinada fase do desenvolvimento
…varios transcriptomas espaciais
Ex: transcriptoma celular-especifico
Ex: transcriptoma tecido-especifico
Ex: transcriptoma orgao-especifico
Etapas para a realizacao de um transcriptoma
1) Filme Macroarray.mov
2) Filme oligochip.mov
1a Etapa de um transcriptoma
Isolamento de DNA
do banco de cDNA
Preparacao do Micro/Macroarranjo
(Micro/macroarray)
2a Etapa de um transcriptoma: produção da sonda
Duração
do protocolo:
5 horas
2a Etapa de um transcriptoma: hibridação
3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem
DNA alvo imobilizado: cDNA do genótipo tolerante
Sonda marcada com o fluorocromo “verde”: genótipo tolerante na ausência do estresse
Sonda marcada com o fluorocromo “vermelho”: genótipo tolerante na presença do estresse
Gene com reduzida expressão
na presença do estresse
a
Typhoon: Fosforescência,quimioluminescência;
fluorescênica
b
d
Gene expressão acentuada
na presença do estresse
Nível de expressão na presença do estresse:
a) + x%
b) + y% (y>x)
c) -z%
Genes sem alteração
na expressão
3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem
1
5
1
2
3
4
Exemplo de data mining
Agrupamento
Dinamica da
expressao
Identificação de
sequências regulatórias
6626 genes alvos
19 sondas
5247 genes alvos
sondas: 5 pontos temporais
Caracterizacao
gene/rota
Matriz da expressão
nos orgaos
Agrupamento de
expressão global
Analise da abundância
do transcrito
197 genes orgão-específicos
raiz=64
folha=94
flor=36
influorescencia=3
347 genes constitutivos
8300 genes alvos
Sondas:
Descoberta da função de genes desconhecidos
Análise da homologia das sequências
Análise da biologia molecular do gene: co-regulação?
Confirmação pela genética reversa
folha =6
raizes=4
flores=2
Siliqua=3
Influorescencia=2
Plantula=2
Zhu et al. (2001) Plant Physiol Biochem 39,221-241
Exemplos de análise dos dados de um transcriptoma
Análise de agrupamento da expressão de fatores
transcripcionais na resposta a diferentes estresses
ambientais em Arabidopsis
Comparação dos transcriptomas na presença
de dois diferentes estresses
Análise de Grupos: 2 genótipos
Genótipo sensível ao
estresse salino: IR29 (direita)
Genótipo tolerante ao
estresse salino: Pokkali (esquerda)
Comparação de diferentes transcriptomas temporais durante um
processo celular
Diferentes Transcriptomas de genes
que responde a estresses abióticos
Classe 1: genes da rota de transdução de sinal
à estresses abióticos associada ao f ator
transcripcional DREB1A
Classe 2: genes da rota de transdução de sinal
à estresses abióticos independente do f ator
transcripcional DREB1A
Confirmação dos resultados do transcriptoma: análise por Northern Blot
Classes de genes afetadas pelo estresse salino
Análise de grupos: Transcriptomas da resposta a patógeno
DNA alvo: fatores transcricionais do genoma
de Arabidopsis
Sonda 1e 2: Mutantes na síntese de ácido salicílico
Sonda 3: Mutantes na síntese de ácido jasmônico
Sonda 4: Mutantes na síntese do etileno
Kits completos com microarranjos com oligonucleotideos e sonda
de referencias
oligonucleotideos escolhidos baseados em regioes com baixa homologia a outros genes
Vantagens:
- estringencias das pos-lavagens pode ser maior: menor nivel de hibridizacao cruzada
Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic and cold stress
8100 genes (Genechip)
Raízes: 3 horas após
Genes
> 2x = Total 2678 Genes
4oC
Controle
Meio Fresco
741 genes
58%
Manitol
(200 mM)
4 oC
2086 genes235
1008 genes
42%
NaCl
(100 mM)
1123 genes
46%
78
53%
29
65
375
NaCl
106
85
Manitol
Folhas: 3 horas após
Raízes: 3 horas após
4oC
4oC
235
243
78
29
65
78
29
375
65
120
NaCl
68
NaCl
279
Manitol
106
85
Manitol
Raízes: 27 horas após
Folhas: 27 horas após
4oC
4oC
1111
59
1094
47
23
90
5
19
9
87
Manitol
NaCl
4
59
63
Manitol
NaCl
Raízes: 3 horas após
4oC
Folhas: 3 horas após
4oC
235
243
78
78
29
375
106
29
65
65
NaCl
82
120
85
Manitol
NaCl
68
279
Manitol
Estresse salino:
por frio:sobreposição
sobreposição3-27
3-27h
Estresse
h na raiz
Raízes: Sobreposição entre 3 e 27h
Folhas: Sobreposição entre 3 e 27h
4oC
4oC
173
9
188
5
8
2
22
NaCl
4
40
8
5
6
Manitol
NaCl
4
40
Manitol
Maioria das mudanças são estimulo-específicas: sob. De 5% e 0,5% (3-27h)
200 mM Manitol=100 mM NaClÇ 40% sobreposição foi observada em folhas (sem contato)
Frio alterou 2 vezes mais a expressão gênica do que os outros estresses
Mais induzido gene ELIP: liga a chl a
Maioria das sobreposições foram específicas à folhas ou raízes
Sobreposições podem ser perdidas em experimento que examina um limitado
número de pontos temporais ou ignora as diferenças tecido-específicas
3 -> 27h: redução em 4 vezes nas respostas comuns: respostas
mais específicas a cada estresse se seguem após o choque inicial
Transcriptoma do estresse ao frio: movimento para um novo e diferente “steady-state”
Raízes e folhas apresentam diferentes modificações no seu transcriptoma para cada estresse:
ExÇ 86% das mudanças induzidas pelo frio não são compartilhadas entre folhas e raízes
Estresses regula a expressão de mais de 370 genes cuja função é totalmente desconhecidaÇ
Pistas: especificidade de tecido e regulação por múltiplos estresses: CBF1 e ABA2 sim folha, não raiz
Maioria 2409 genes reg. pelo estresse: não tem seq tipicas dos fat. transc. CBF1 e DREB1:
a) Presença de outros elementos importantes nas sequências dos promotores
b) Um grande número de mudanças podem ser causadas por diferenças na estabilidade do
RNA ao invés da reg transc.
Identificacao de
genotipos tolerantes
e susceptiveis
Transcriptoma
e proteoma
Caracteriz. do fenotipo
Segregacao alelica
Mapeamento de
populacoes
Transcriptoma
Proteoma
QTL
Identificacao de genes e
proteinas associados a tolerancia
Selecao assistida por marcadores
Locus genico candid.
Locus quant. transcrito
Identificacao de
genes/marcadores
ligados a
tolerancia
Melhoramento
molecular
Locus quant. proteina
Transformacao
Caracteriz. do genotipo
Mapa genetico
Sugestao de proposta para elaboracao de projeto genoma funcional na UFV:
1) transcriptoma
Em colaboracao:
Instituto de Quimica USP
Embrapa-Cenargem
Unicamp
UNESP-Araraquara
Realizado na UFV
Múltiplas repetições : teste de repetibilidade: anãlise estatística : seq. diferentes
Melhores resultados