GENÉTICA FORENSE
Determinação do limiar
analítico para PowerPlex16 e
Identifiler
Paula Cristina Margotto
Polícia Federal
www.paulomargotto.com.br
Brasília, 19 de agosto de 2011
Garantia de qualidade
•
•
•
•
Excelência do laboratório
Confiabilidade dos resultados
Procedimentos rastreáveis
Maior peso à prova criminal
Validação interna
• Confirmação, por meio exame, de que os requisitos
para um determinado uso são atendidos documentados
• Cada kit de amplificação STR gera variações que
dependem das condições específicas do laboratório.
• Empresas aconselham métodos de validação
baseados ou recomendado pela SWGDAM
(Scientific Working Group on DNA Analysis)
Determinação do limiar
analítico
• Ruído produzido pelo instrumento de
eletroforese em capilar que não reflete
moléculas de DNA
• O valor pode variar com a metodologia aplicada
em cada laboratório. Exemplo: capilar ,idade do
laser, equipamento ,formamida, etc.
Objetivo
• Determinar o valor do limiar analítico para os
kits PowerPlex16 e Identifiler
• A SWGDAM recomenda análise de dados
empíricos coletados no laboratório que se
pretende avaliar. Podem ser usados diversos
métodos científicos derivados de amostras
negativas ou de diluição em série.
1- Método de diluições seriadas
1997 IUPAC ElectroAnalytical Committee Recommendations
=Escolha de amostras com perfis distintos.
BS129,BS132,BS1003,PCM
=Quantificação
=Diluições seriadas em 1ng ,0,5 ng, 0,25ng 0,125
ng ,0,0625ng
=Amplificação com os kits(volume total)
=Eletroforese de Capilar
=Análise no GeneMapper
Verificação da Linearidade
• Cálculos de Média e desvio padrão ,por cor, de RFU
no Excel
• Verificar a linearidade por regressão linear no gráfico
de quantidade de DNA versus média de altura dos
picos para cada fuorófuro.
3500
3000
R² = 0.9904
2500
2000
Series1
1500
Linear (Series1)
1000
500
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
Análise de
Fluoresceína PP16
1
1.2
Cálculos estatísticos com weighted regression
(regressão ponderada) análise exploratória
Ferramenta do Excel disponível pelo Boston University
School of Medicine.
at= y intercept+3*standard error
Weighted regression analysis
5Com todos os dados
xi
yi
si
1/si2
wi
wixi
wiyi
wixiyi
wixi2
wiyi2
0,0625
53,2
24,9799
0,001603
2,340462
0,146279
124,5126
7,782035
0,00914243
6624,068425
0,125
70,75
29,28943
0,001166
1,702398
0,2128
120,4447
15,05558
0,02659997
8521,45951
0,25
99,7674
44,12312
0,000514
0,750154
0,187539
74,84093
18,71023
0,04688463
7466,684767
0,5
241,9792
110,8967
8,13E-05
0,118753
0,059377
28,73583
14,36791
0,02968833
6953,472858
1
406,8958
128,6549
6,04E-05
0,088233
0,088233
35,90157
35,90157
0,08823284
14608,19937
sums
0,003424
5
0,694227
384,4356
91,81734
0,2005482
44173,88493
0,138845
76,88711
means
Output
slope
369,0569091
y intercept
25,64528315
standard error
11,95970687
2- Método de controles negativos
• 20 dados de controles negativos
• Recomendado para pouca quantidade de
DNA.
• Analisa-se as amostras com
GeneMapperID3.2 com 1 RFU , retirando-se
+/- 2 bases da posição do size standard.
2-Análise de controles negativos
• 1) AT= Média de RFU de amostras
brancas+3*Desvio Padrão ( valores dos
resultados) Kaiser (IUPAC 1976)
• 2) AT= 2*( Maior Sinal de Pico da linha de
base-Menor sinal de pico de linha de base) (
valores dos resultados) Example in SWGDAM
Guidelines
Resultados
• Controles negativos
Exemplo C_NEG Identifiler
Resultados Identifiler
• Método de controles negativos:
• 1) AT= Média +3*Desvio Padrão
•
•
•
•
FAM=8,51 RFU
VIC= 13,81 RFU
NED= 15 RFU
PET= 15,41 RFU
• 2) AT= 2*(Max-Min)
•
•
•
•
FAM=38 RFU
VIC=64 RFU
NED= 48 RFU
PET= 44RFU
Resultados PP16
• Método de amostras negativas:
• 1) AT= Média +3*Desvio Padrão
• fluorescein= 11,64
• JOE= 22,28
• TMR= 10,19
• 2) AT= 2*(Max-Min)
• fluorescein= 32
• JOE= 56
• TMR= 32
C_neg PP16
Resultados
• Diluições seriadas
Resultados Identifiler
• Método de diluições seriadas : Retirou-se o ponto
•
•
•
•
0,0625 por falta de dados
FAM -62,9 RFU
VIC- 48 RFU
NED-52,11 RFU
PET- 61,49 RFU
Resultados PP16
•
•
•
•
Diluições seriadas:
Azul = 203 RFU
Verde= 252 RFU
Amarelo = 54 RFU
BS132
1ng PP16
BS132
0,0625ng
PP16
Resultados Power Plex 16
4000
3000
1500
R² = 0.9904
R² = 0.9986
1000
Series1
2000
Linear (Series1)
1000
Series1
Linear
(Series1)
500
0
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0
1.2
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
2000
4000
R² = 0.9888
3000
R² = 0.9983
1500
Series1
2000
Series1
1000
Linear (Series1)
1000
Linear (Series1)
500
0
0
0.5
1
1.5
0
0
0.2
0.4
0.6
xi
yi
si
1/si2
wi
wixi
wiyi
wixiyi
wixi2
wiyi2
0,0625
220,3968
196,8773
2,58E-05
2,643344
0,165209
582,5845
36,41153
0,010326
128399,8
0,125
330,6702
250,105
1,6E-05
1,637948
0,204744
541,6207
67,70259
0,025593
179097,8
0,25
665,6889
454,674
4,84E-06
0,495615
0,123904
329,9256
82,4814
0,030976
219627,8
0,5
1262,56
746,8113
1,79E-06
0,183706
0,091853
231,9398
115,9699
0,045926
292837,9
1
3044,4
1612,864
3,84E-07
0,039387
0,039387
119,9088
119,9088
0,039387
365050,4
sums
4,88E-05
5
0,625096
1805,979
422,4742
0,152208
1185014
0,125019
361,1959
means
Resultados PP16
•
•
•
•
•
Diluições seriadas:
Retirando-se o ponto 1 ng:
Azul =136,49 RFU
Verde =126 RFU
Amarelo=44,42 RFU
Obrigada!