UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
TAÍSSA MAÍRA THOMAZ ARAÚJO
ESTUDO DE MUTAÇÕES NOS ÉXONS 7, 8 E 9 DO GENE TP53 E SUA
RELAÇÃO COM A IMUNORREATIVIDADE DA PROTEÍNA P53 EM
AMOSTRAS DE ADENOCARCINOMA GÁSTRICO
BELÉM
2010
TAÍSSA MAÍRA THOMAZ ARAÚJO
ESTUDO DE MUTAÇÕES NOS ÉXONS 7, 8 E 9 DO GENE TP53 E SUA
RELAÇÃO COM A IMUNORREATIVIDADE DA PROTEÍNA P53 EM
AMOSTRAS DE ADENOCARCINOMA GÁSTRICO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à
Faculdade de Biomedicina da Universidade
Federal do Pará, como requisito para obtenção do
grau de Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. André Salim Khayat
BELÉM
2010
TAÍSSA MAÍRA THOMAZ ARAÚJO
ESTUDO DE MUTAÇÕES NOS ÉXONS 7, 8 E 9 DO GENE TP53 E SUA
RELAÇÃO COM A IMUNORREATIVIDADE DA PROTEÍNA P53 EM
AMOSTRAS DE ADENOCARCINOMA GÁSTRICO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à
Faculdade de Biomedicina da Universidade
Federal do Pará, como requisito para obtenção do
grau de Bacharel em Biomedicina.
Data da defesa: 17 de dezembro de 2010.
Banca Examinadora:
_____________________________________
Profº Dr. André Salim Khayat
Professor da Universidade Federal do Pará
Orientador
_____________________________________
Profª Dra. Adriana Costa Guimarães
Professor da Universidade Federal do Pará
Avaliador
_____________________________________
Profº Msc. Ney Pereira Carneiro dos Santos
Professor da Universidade Federal do Pará
BELÉM
2010
AGRADECIMENTOS
Antes de tudo agradeço a Deus, por ter me dado a vida e ter me permitido estar
perto dos meus familiares e amigos todos estes anos da minha vida.
Agradeço, em especial, aos meus pais Luiz Rafael e Alba, por todos os anos de
cuidado, pela preocupação, pelo amor, pelo apoio e por existirem, principalmente, pois sem
eles eu não seria nada!
Aos meus irmãos Tatiana e Rafael, por fazerem parte do meu dia-a-dia e com
certeza fazerem dele muito mais feliz. Ao amor da minha vida, minha princesa, minha jóia
rara, Maria Eduarda, por me fazer sentir a sensação mais prazerosa de ter um bebê para amar
incondicionalmente, cheirar e beijar toda hora! À minha irmã linda, Luna, que por mais
distante, sempre foi muito importante e muito amada!
Ao meu namorado Diego, por toda paciência, pelo amor, pela companhia, pelos
momentos de felicidade e descontração, que foram extremamente importantes para as minhas
conquistas. Obrigada!
Á toda a minha família, Araújo e Thomaz, por me ensinarem o valor da união
familiar. Vocês são essenciais para mim!
Obrigada a todas as minhas SUPER amigas Carol, Samile, Carina, Lorena, Lívia,
Elisa, Gabriela, Priscilla, Tamirys, Lúcia, Débora, Juliana, Ivy e Isabela por todos os
momentos que passamos juntas, pelas risadas, pela companhia e principalmente pela certeza
que me dão de que estarão sempre do meu lado. Amo vocês!
A todos os amigos do LCH, especialmente Gabriela, Fernando e Aline, que foram
fundamentais na minha jornada até a conclusão deste trabalho. Ao professor Rommel, pelo
apoio e dedicação a todos os colaboradores do LCH e por ter me dado a oportunidade de fazer
parte deste grupo de pesquisa, que acima de tudo é um grupo de amigos com quem tenho o
prazer de trabalhar.
Aos professores Adriana e Ney, por terem se disponibilizado em participar da
banca examinadora, contribuindo imensamente para a finalização do meu objetivo.
Ao meu orientador André Salim Khayat, por ter me recebido como aluna, pelo
conhecimento que me proporcionou, pela atenção e dedicação com que me ajudou a realizar
este trabalho e pela amizade durante esses anos de convívio, através da qual aprendi a admirálo não só como um profissional extremamente capacitado, mas como uma pessoa incrível que
tem um coração enorme!
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
i
RESUMO
ii
1 INTRODUÇÃO
1
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS
1
1.2 GENÉTICA DO CÂNCER GÁSTRICO
6
1.3 O GENE SUPRESSOR TUMORAL TP53
8
1.3.1 Mutações no gene TP53
10
1.4 IMUNOHISTOQUÍMICA DA PROTEÍNA p53
14
15
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
15
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
16
3 JUSTIFICATIVA
16
4 MATERIAL E MÉTODOS
16
4.1 AMOSTRAS
16
4.2 HISTOPATOLÓGICO
17
4.3 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA P53 POR IMUNOHISTOQUÍMICA
17
4.4 SEQUENCIAMENTO DIRETO DO TP53
17
4.5 ANÁLISE DOS RESULTADOS DO SEQUENCIAMENTO
19
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
20
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
20
5.1 ANÁLISE DESCRITIVA
21
5.1.1 Amostras
21
5.1.2 PCR
22
5.1.3 Histopatológico e Localização tumoral
22
5.1.4 Imunohistoquímica
24
5.1.5 Sequenciamento
26
5.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA
28
6 CONCLUSÃO
32
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
33
ANEXO A: Termo de Aprovação do Hospital Universitário João de Barros
Barreto.
ANEXO B: Dados clínico-patológicos, IHQ mutações das amostras estudadas.
41
42
i
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1: Anatomia do estômago.
2
Figura 2: Tipos histológicos de câncer gástrico. A e B: Tipo intestinal, em
objetivas de 10x e 40x, respectivamente. C e D: Tipo difuso, em objetivas de 10x e
40x, respectivamente.
6
Figura 3: Domínios da p53.
9
Figura 4: Via de ação da p53.
10
Figura 5: Representação simplificada da via de ação da p53. A: Mecanismo de
ação do tipo selvagem da p53. B: Mecanismo de ação do tipo mutante da p53.
11
Figura 6: Modelos para ilustrar a relação das p53 mutante e selvagem. A: Em
células normais. B: Quando os níveis protéicos de p53 mutante e selvagem estão
baixos. C: Quando o nível protéico de ambas as p53 mutante e selvagem aumenta.
12
Figura 7: Ilustração do domínio de ligação da p53 em associação com o DNA.
13
Figura 8: Diagrama esquemático dos domínios da p53, destacando a região de
ligação ao DNA como a que possui o maior número de mutações. AD1 e AD2
(ativação N-terminal); PXXP (rico em prolina); DNA BINDING CORE DOMAIN
(ligação ao DNA); TETRA (tetramerização); e BASIC (regulatório).
13
Figura 9: Eletroforese em gel de agarose dos primers 7 e 8-9.
22
Figura 10: Eletroferograma do heterozigoto para mutação no códon 244.
28
Figura 11: Relação entre estadiamento do tumor e idade dos pacientes.
29
Figura 12: Presença e ausência de mutação em relação à idade.
30
Figura 13: Presença ou ausência da mutação G244S em relação à idade.
32
Tabela 1: Classificação do TNM patológico.
3
Tabela 2: Grupamento por estadios.
4
Tabela 3: Sistemas de primers, com suas sequências forward (F) e reverse (R), os
tamanhos dos amplicons e suas temperaturas de anelamento.
18
Tabela 4: Polimorfismos descritos localizados nos éxons do gene TP53.
20
Tabela 5: Dados descritivos das amostras estudadas.
26
ii
RESUMO
O câncer gástrico é a quarta neoplasia mais frequente no mundo e a segunda causa mais
comum de mortalidade por câncer. Dentre os genes que, quando acometidos por alterações,
venham a implicar em processos carcinogênicos, o TP53 é encontrado modificado em 50% das
neoplasias humanas. Esse gene é responsável por mecanismos, entre outros, de bloqueio de ciclo
celular e de apoptose. Por meio de estudos com imunohistoquímica é possível evidenciar a
potencial insuficiência funcional da proteína p53, observada como uma superexpressão protéica.
Esta superexpressão se deve ao fato da p53 não ter sido degradada pelo seu regulador negativo (o
gene MDM2) durante o período tido como normal nas células somáticas. Assim, este trabalho visa
pesquisar a presença de alterações nucleotídicas nos éxons 7, 8 e 9 do gene TP53 e
correlacioná-las com a imunorreavitidade da proteína p53 dos adenocarcinomas gástricos
estudados. Os resultados evidenciaram a presença de mutações de sentido trocado T230A,
G244S, E286K, P295H e H296N, assim como a mutação silenciosa R248R, sendo todas já
observadas por outros autores. Foram encontradas também algumas mutações aparentemente
ainda não citadas por outros autores. Não foi encontrada significância estatística entre o
aparecimento de mutações e a imunorreatividade da proteína p53, embora as análises dos
sequenciamentos mostrassem alterações em 64% dos pacientes e 46,5% das amostras
apresentarem imunorreativas para p53. Também não foram encontradas relações
estatisticamente significantes entre os aspectos clínico-patológicos e a mutação E286K, bem
como com a IHQ. Entretanto, foram encontrados resultados significantes entre algumas
características e os pacientes com idade inferior a 60 anos, tais como o aparecimento da
mutação G244S, a presença de mutações e o estadiamento avançado. Estes resultados
provavelmente estão relacionados, entre outros fatores, com o diagnóstico tardio da neoplasia
neste grupo de pacientes, acarretando em um pior prognóstico. Os achados deste estudo são
ainda preliminares, mas abrem novas frentes de investigação e idéias para novos projetos,
contribuindo, assim, para um melhor conhecimento da genética molecular de tumores,
especialmente o câncer gástrico.
Palavras-chave: Câncer gástrico, TP53, imunohistoquímica, sequenciamento direto.
1 1 INTRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS
O câncer é uma doença multifatorial, resultante de fatores extrínsecos (tabaco,
agentes infecciosos, produtos químicos ou radiações) e fatores intrínsecos (mutações
herdadas, hormônios, condições imunológicas e mutações aleatórias). Estes fatores causais
podem agir tanto em conjunto como em sequência para iniciar ou promover a carcinogênese
(American Cancer Society, 2010).
O câncer gástrico (CID-O C16) é a quarta causa mais frequente de câncer no
mundo (Konturek et al., 2009; Mojtahedi et al., 2010), apesar de que dados estatísticos
revelam um declínio da incidência, especificamente nos Estados Unidos, Inglaterra e em
outros países desenvolvidos. A alta mortalidade é registrada atualmente na América Latina,
principalmente nos países Costa Rica, Chile e Colômbia. Porém, o maior número de casos de
câncer de estômago ocorre no Japão, onde existem 780 casos a cada 100.000 habitantes
(INCA, 2009).
No Brasil, esta neoplasia aparece em terceiro lugar em incidência entre homens e
em quinto lugar, entre as mulheres. Numericamente, a estimativa de novos casos de câncer de
estômago, em 2010, é de 13.820 para homens e 7.680 para mulheres (INCA, 2009).
De acordo com o Instituto Nacional do Câncer - INCA (2009), estima-se 650
novos casos de câncer de estômago para o estado do Pará em 2010. Na sua capital, Belém, a
estimativa é de 40 indivíduos acometidos pela doença a cada 100 mil habitantes em 2010.
Sem considerar os tumores de pele não melanoma, o câncer de estômago é o segundo mais
frequente na região Norte entre homens e o terceiro entre mulheres.
Um dos fatores ambientais que tem grande influência na carcinogênese gástrica é
a dieta, principalmente pelo uso excessivo de sal e de comidas contaminadas com composto
N-nitroso, além do tabagismo e da infecção por Helicobacter pylori (Azarhoush et al., 2008).
Atualmente, a infecção pelo H. pylori, é considerada o principal fator de risco etiológico para
o desenvolvimento do câncer gástrico (Konturek et al., 2009).
Indivíduos que apresentam câncer no sistema digestório relatam frequentemente
perda de peso em curto período de tempo (Bresciani et al., 2004; Cecconello & Leite, 2004),
dificuldade de alimentação, dor local, náuseas, vômitos e sensação de plenitude precoce, que
contribuem para o agravamento da doença, dificultam os tratamentos propostos e,
consequentemente, favorecem o pior prognóstico (Bresciani et al., 2004; Cecconello & Leite,
2 2004; Norman & Butrus, 2004). O tratamento desta neoplasia é bastante complexo, sendo a
cirurgia de retirada do estômago ou de parte dele, juntamente com linfonodos próximos, a
única expectativa de cura real. Tratamentos como quimioterapia e radioterapia são
considerados reforços terapêuticos ao paciente pós-cirúrgico (Kelley & Duggan, 2003;
Alberts et al., 2003; Dicken et al., 2005; Liakakos & Roukos, 2008).
O adenocarcinoma é o tumor gástrico mais predominante, sendo responsável por
aproximadamente 90% dos casos de tumores no estômago. Linfomas Não-Hodgkin e
Leiomiossarcomas correspondem pela maior parte dos outros 10% (Aoki et al., 2002).
Antes de discorrer sobre alguns aspectos do adenocarcinoma, é importante
conhecer a anatomia do estômago humano normal. Anatomicamente, o estômago tem início
na junção gastroesofágica e estende-se até o piloro. A parte proximal que se localiza logo
abaixo do diafragma é denominada de cárdia, logo após se encontra o fundo e o corpo, em
seguida a porção distal conhecida como antro, terminando no piloro, anel muscular que
controla o fluxo de alimento do estômago para o duodeno (Figura 1) (AJCC, 2004).
Figura 1: Anatomia do estômago (Adaptado de: www.en.academic.ru, 2010).
O câncer gástrico é uma neoplasia que pode se estabelecer em qualquer região do
estômago, tendo como incidências: antro e piloro (50 a 60%), fundo e cárdia (25%) e corpo
(15%), podendo atingir diferentes camadas de tecidos: mucosa, submucosa, muscular, e
serosa (Shang & Pena, 2005).
3 O adenocarcinoma trata-se do tumor originado na camada mucosa (Shang & Pena,
2005), que se apresenta como uma massa heterogênea com parede espessada, infiltração
difusa, possível ulceração e perda de pregas rugais (Bosoteanu et al., 2009).
Para relatar o comportamento do tumor é necessário um sistema de classificação
que inclua todos os seus atributos patológicos como: extensão do tumor primário (pT),
ausência ou presença de extensão de metástases para linfonodos regionais (pN) e ausência ou
presença de metástases à distância (pM). Este sistema resultante da combinação de T, N e M
em grupos é um método para a designação da extensão anatômica de um câncer e relaciona-se
com a história natural do seu tipo particular. A adição de categorização numérica para os
componentes do sistema pTNM (TNM patológico) indica progressivamente a extensão da
doença maligna (AJCC, 2004).
A partir das combinações do TNM é possível indicar o comportamento tumoral
pelo seu estadiamento, que pode ser classificado como 0, IA, IB, II, IIIA, IIIB ou IV,
dependendo do nível de acometimento da neoplasia. Na tabela 1 estão classificados os tipos
de profundidade do tumor (Tumor primário), a presença de linfonodos comprometidos
(Linfonodos regionais) e a presença de metástase à distância (Metástase à distância). Na
tabela 2, encontra-se o estadiamento do tumor que está relacionado ao prognóstico do
paciente e é resultante da combinação da classificação da tabela 1.
Tabela 1: Classificação do TNM patológico (Sobin & Wittekind, 2004).
pT
Tumor Primário
TX
O tumor primário não pode ser avaliado.
T0
Não há evidência de tumor primário.
Tis
Carcinoma in situ: tumor intra-epitelial sem invasão da lâmina própria.
T1
Tumor que invade a lâmina própria ou a submucosa.
T2
Tumor que invade a muscular própria ou a subserosa.
T2a
Tumor que invade a muscular própria.
T2b
Tumor que invade a subserosa.
T3
T4
pN
Tumor que penetra a serosa (peritônio visceral) sem invadir as estruturas
adjacentes.
Tumor que invade as estruturas adjacentes.
Linfonodos Regionais
4 NX
Os linfonodos regionais não podem ser avaliados.
N0
Ausência de metástase em linfonodos regionais.
N1
Metástase em 1 a 6 linfonodos regionais.
N2
Metástase em 7 a 15 linfonodos regionais.
N3
Metástase em mais de 15 linfonodos regionais.
pM
Metástase à Distância
MX
A presença de metástase à distância não pode ser avaliada.
M0
Ausência de metástase à distância.
M1
Metástase à distância.
Tabela 2: Grupamento por estadios (Sobin & Wittekind, 2004).
Estadiamento
Combinações TNM
Estadio 0
Tis
N0
M0
Estadio IA
T1
N0
M0
Estadio IB
T1
N1
M0
T2a/b
N0
M0
T1
N2
M0
T2a/b
N1
M0
T3
N0
M0
T2a/b
N2
M0
T3
N1
M0
T4
N0
M0
Estadio IIIB
T3
N2
M0
Estadio IV
T4
N1-3
M0
T1-3
N3
M0
Qualquer T
Qualquer N
M1
Estadio II
Estadio IIIA
O câncer gástrico é definido como precoce quando o adenocarcinoma está restrito
à mucosa e submucosa, independentemente de sua extensão em superfície e da presença ou
não de metástase ganglionares. Esse tipo de adenocarcinoma possui um bom prognóstico
(Dekker & Op Den Orth, 1977).
5 O tumor é considerado avançado quando atinge as camadas posteriores à
submucosa podendo ou não apresentar metástase nos linfonodos e órgãos como o pulmão,
glândulas adrenais, fígado, osso e cavidade peritoneal (MacDonald, 1992).
Segundo a classificação histológica de Lauren (1965), os adenocarcinomas
gástricos podem ser subdivididos nos tipos intestinal e difuso. O tipo intestinal forma
estruturas glandulares, exibe um padrão de crescimento expansivo, apresenta coesão celular e
células com núcleos grandes e irregulares. O tipo difuso, por sua vez, é constituído de
pequenas células não coesas, difusamente dispersas, que não formam estruturas glandulares,
podendo apresentar células com núcleos periféricos (células em anel de sinete) em função da
elevada produção de mucina (Espejo & Navarrete, 2003).
Os tumores do tipo intestinal (Figura 2 A e B) normalmente surgem após uma
metaplasia intestinal (Hamilton & Aaltonen, 2000). A variante histológica comumente
presente em populações de alto risco é o tipo intestinal, sendo resultado da ação de vários
fatores ambientais, incluindo a infecção pela bactéria Helicobacter pylori e evolui através de
uma série de eventos sequenciais que incluem gastrite crônica, atrofia, metaplasia intestinal,
displasia, carcinoma precoce, invasão e metástase (Fenoglio-Preiser et al., 2003; Khan &
Shukla, 2006).
O tumor do tipo difuso (Figura 2 C e D) apresenta uma taxa mitótica menor em
relação aos tumores intestinais (Hamilton & Aaltonen, 2000). Em populações de baixo risco
ambiental, o tipo difuso é o mais comum estando também associado com gastrites (FenoglioPreiser et al., 2003).
A importância do tipo histopatológico na análise epidemiológica do câncer
gástrico resulta do fato de que o tipo intestinal é mais frequente em áreas onde o risco de
desenvolver a doença é mais elevado, enquanto o tipo difuso tem frequência similar em áreas
de alto e baixo risco (Muñoz et al., 1968).
Do ponto de vista da distribuição por gênero e idade, o tipo intestinal é mais
frequente em homens, sobretudo em faixas etárias mais avançadas. Por outro lado, o tipo
difuso apresenta a razão de casos entre homens e mulheres próxima à unidade (Howson et al.,
1986; Holburt & Freedman, 1987; Amorosi et al., 1998; Antonioli, 1994).
6 Figura 2: Tipos histológicos de câncer gástrico. A e B: Tipo intestinal, em objetivas de 10x e 40x,
respectivamente. C e D: Tipo difuso, em objetivas de 10x e 40x, respectivamente (Calcagno et al.,
2008).
1.2 GENÉTICA DO CÂNCER GÁSTRICO
O câncer é o resultado de desordens genéticas nas quais diversas alterações são
selecionadas, a fim de proporcionar as células cancerígenas vantagens proliferativas (Rhyu,
1998).
A progressão de um tumor a partir de células normais para pré-tumorais, câncer,
invasão local e finalmente metástases, é o resultado da expansão clonal de células que
adquiriram uma vantagem seletiva de crescimento, que lhes permitem superar as células
circunjacentes (Pharoah & Caldas, 1999). Esta vantagem provém de alterações genéticas que
afetam os mecanismos de controle da proliferação e morte celular, envolvendo mutações em
genes específicos genericamente divididos em duas categorias principais: os proto-oncogenes
e os genes supressores de tumores. Em alguns casos, os genes de reparo de DNA, os fatores
de crescimento e as vias de sinalização também estão envolvidos. (De Vita et al., 2001).
Assim, múltiplas alterações genéticas e epigenéticas de proto-oncogenes, genes
supressores de tumores, genes de reparo de DNA, moléculas de adesão celular e fatores de
crescimento e seus receptores, estão envolvidas no curso das várias etapas da conversão da
célula gástrica normal para o câncer gástrico clínico (Yasui et al., 2000).
7 Os proto-oncogenes são genes que, quando mutados, promovem um estímulo
aumentado à proliferação celular e bloqueiam a apoptose, sendo os oncogenes as formas
hiperativas (alteradas). A mutação de apenas um dos alelos é suficiente para que o protooncogene adquira capacidade de transformação (Hilger et al., 2002; Gartel & Shchors, 2003).
O grupo de proto-oncogenes é constituído por fatores de crescimento e receptores
de fatores de crescimento, além de transdutores intracelulares e fatores de transcrição nuclear.
A abundância de fatores de crescimento, associada a alterações de fatores inibitórios
proporciona às células tumorais auto-suficiência em sua manutenção, além de favorecer a
angiogênese, o crescimento tumoral e a metástase (De Vita et al., 2001).
Entre os fatores de crescimento com expressão aumentada no câncer gástrico
relacionam-se: fator de crescimento epitelial (EGF), fator de crescimento do endotélio
vascular (VEGF), fator de crescimento de fibroblasto (FGF) e fator de crescimento
semelhante à insulina (IGF), além de diversas citocinas como TGF, IL1, IL8 (Zheng et al.,
2004).
Os genes de supressão tumoral apresentam característica fenotípica geralmente
recessiva, ou seja, é necessário que as duas cópias do gene normal, presentes em uma célula
somática diplóide, sejam alteradas para que ele seja inativado ou removido, hipoexpresso ou
expresse uma proteína defeituosa. Os supressores, de modo geral, estão envolvidos em pontos
de checagem inibindo a proliferação celular quando a célula está em estresse (Alberts et al.,
2002).
Diversos genes já foram descritos na literatura como genes supressores de tumor.
Entre eles, o TP53, amplamente estudado, surge em resposta à presença de danos ao DNA. As
células que apresentam seu material genômico alterado, normalmente são detidas na transição
G1/S, permitindo o reparo genômico ou a apoptose (morte celular programada) pelo gene
TP53. Quando ocorre a inativação deste gene, a interrupção em G1 não ocorre e o DNA
danificado é replicado alterado (Kountouras et al., 2005)
A inativação de genes supressores de tumor é um mecanismo genético comum no
câncer gástrico. Para essa inativação são conhecidos seis eventos possíveis, entre eles: a nãodisjunção cromossômica, a não-disjunção e duplicação, a recombinação meiótica, a conversão
gênica, a deleção e a mutação pontual. Para ocorrer perda de sua função, ambos os alelos
devem estar suprimidos (Kountouras et al., 2005).
8 1.3 O GENE SUPRESSOR TUMORAL TP53
A descoberta da p53 em 1979 marca o início da era mais fascinante da pesquisa
moderna do câncer. O gene TP53 (localizado no braço curto do cromossomo 17, região 13.1)
emergiu então como um supressor chave de tumor e um alvo importante para novas terapias
do câncer. Por cerca de 10 anos, o gene TP53 foi considerado um proto-oncogene com
características diferentes, entre outros motivos, pelo fato de existir aumento do conteúdo
protéico em células neoplásicas, o que é característica dos oncongenes. Entretanto, a mudança
neste modelo ocorreu no final dos anos 80, quando novos achados demonstraram que o TP53
normal (tipo selvagem) poderia inibir a transformação de células em cultura e que
apresentava-se mutado em uma grande quantidade de tumores humanos (De Leo et al., 1979;
Kress et al., 1979; Lane & Crawford, 1979; Linzer & Levine 1979).
De fato, o TP53 parece ser o gene mais frequentemente mutado em células
cancerígenas. Trabalhos subsequentes durante os anos 1990 mostraram, dentre outras coisas,
que a proteína p53 é um fator de transcrição que regula muitos outros genes e que pode
provocar apoptose em resposta ao estresse oncogênico. A progressão maligna é dependente da
perda da função da p53, por mutação no gene TP53 ou por defeitos nas vias de sinalização
upstream ou downstream (Hainaut & Wiman, 2005).
A proteína tumoral p53 é uma proteína nuclear constituída de 393 aminoácidos e
tem papel essencial na regulação do ciclo celular. É um fator de transcrição que ativa
processos de contenção do crescimento de células aberrantes em resposta a dano no DNA,
ativação oncogênica, hipóxia ou perda de contato celular normal (Giaccia & Kastan, 1998).
Essa restrição ocorre através de indução da senescência, bloqueio do ciclo celular (em G1 ou
G2) ou por apoptose (Jin & Levine, 2001; Hofseth et al., 2004).
A p53 apresenta domínios de transativação, rico em prolina, ligação ao DNA,
tetramerização e regulação (Figura 3). Na formação tetramérica, liga-se a regiões específicas
no DNA, ativando a expressão de genes downstream que regulam a proliferação celular,
funcionando assim como um supressor do tumor. As p53 mutantes, que ocorrem
frequentemente em vários tipos de neoplasias humanas, não se ligam sistematicamente ao
local consenso do DNA, e assim causam a perda da atividade de supressão tumoral (Entrez
Gene, 2007).
9 Figura 3: Domínios da p53 (Stoklosa & Golab, 2005).
Mutações do TP53 em células somáticas são observadas em cerca da metade dos
cânceres humanos, onde o alelo não mutado é geralmente perdido. A frequência e o tipo de
mutação variam de um tumor para outro, podendo ser do tipo troca de sentido, sem sentido,
deleções, inserções ou mutações de splicing. Existem ainda alguns hot spots para mutação nas
posições 175, 248, 273 e 282. Essas mutações são uma característica prognóstica adversa em
um grande número de neoplasias (Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and
Haematology, 2006).
A p53 pode sofrer numerosas modificações pós-traducionais, como fosforilação,
acetilação e ubiquitinação. É encontrada como um fator de transcrição presente em pequenos
níveis em qualquer célula normal, porém, sob vários tipos de estresses celulares ocorrem
modificações pós-traducionais que levam à ativação e estabilização da p53. Embora o número
de genes ativados pela p53 seja grande, o resultado dessa ativação da p53 é geralmente a
interrupção do ciclo celular em G1 (por p21), em G2 (por 14-3-3σ) ou apoptose (por BAX,
PUMA ou NOXA). Sendo o crescimento celular bloqueado pela atividade da p53, é permitida,
então, a ativação eficiente do sistema de reparo celular (Atlas of Genetics and Cytogenetics in
Oncology and Haematology, 2006; Vogelstein et al., 2000; Haupt et al., 2003).
A ativação da via da p53 através de danos no DNA, raios ultravioletas e
oncogenes (Figura 4), estimulam atividades enzimáticas que modificam a p53 e seu regulador
negativo (MDM2). Isto resulta em um aumento do nível da proteína p53 e a ativação de genes
que estão envolvidos em processos de supressão tumoral. Alguns genes inibem a progressão
do ciclo celular ou a angiogênese (importante para a metástase), outros estimulam a morte
celular programada (apoptose). A ativação da p53 resulta em uma variedade de outros efeitos,
incluindo a manutenção da estabilidade genética e a produção de matriz extracelular. A perda
da função da p53 é muito danosa para a célula e ocorre em praticamente todos os cânceres
humanos (Vogelstein et al., 2000).
10 Figura 4: Via de ação da p53 (Vogelstein et al., 2000).
Muitas funções são atribuídas à p53, como a ativação transcricional, a
permeabilização da membrana mitocondrial, a atividade de exonuclease, o reparo de DNA e a
regulação da angiogênese (Vousden & Lu, 2002; Manfredi, 2003; Meek, 2004; Sengupta &
Harris, 2005). Estudos recentes sugerem que o papel direto da proteína p53 como um fator de
transcrição, que induz genes apoptóticos para eliminar células potencialmente tumorais, é
somente parte de uma via muito mais complexa. De todas as atividades da p53, nenhuma é
mais bem aceita que a função como fator de transcrição (Polyak et al., 1997; Yu et al., 1999;
Zhao et al., 2000; Yee & Vousden, 2005).
1.3.1 Mutações no gene TP53
Alterações que resultem em inativação funcional do gene TP53 é uma
característica quase universal do câncer humano. A via do TP53 é acionada por uma grande
variedade de sinais de danos, que levam a estabilização e a modificações pós-traducionais de
p53. Como um fator de transcrição, a p53 medeia alterações na expressão de genes que
promovem a apoptose, senescência ou parada do ciclo celular. Estes mecanismos eliminam os
danos celulares e suprimem a tumorigênese (Levine & Oren, 2009).
As mutações no gene TP53 podem ser somáticas ou hereditárias. As mutações nas
linhagens germinativas estão associadas à Síndrome Li-Fraumeni, que causa predisposição
11 para o desenvolvimento precoce de uma variedade de neoplasias. As proteínas p53 mutantes
são altamente expressas em muitos tipos de câncer e contribuem para a transformação celular,
metástase e resistência à droga devido à inibição da p53 selvagem e de membros da família da
p53 (Petitjean et al., 2007a).
Estudos mostraram que 74% das mutações do gene TP53 são mutações missense
(de sentido trocado) que ocorrem dentro de seu domínio central de ligação ao DNA, mais de
30% das quais estão localizadas na região de hot spot (Petitjean et al., 2007b). Estas mutações
podem afetar a estabilidade termodinâmica do domínio de ligação ao DNA em diferentes
graus (Bullock & Fersht, 2001).
Os genes MDM2 e MDM4 são os dois maiores reguladores negativos da p53, que
mantêm os níveis basais de p53 nas células normais. Estresses celulares e ativação de
oncogenes enviam sinais de ativação para ambos os tipos selvagem (wt) e mutante (mut) da
p53, levando ao aumento dos níveis protéicos. O tipo selvagem da p53 (Figura 5 A) forma
tetrâmeros e se liga ao DNA para mediar a transcrição de genes, o que resulta na parada do
ciclo celular, apoptose ou senescência. A p53 selvagem aumenta a transcrição e expressão do
gene MDM2, que promove sua degradação e restaura o nível basal desta proteína nas células
normais. Em contraste, a p53 mutante (Figura 5 B) não consegue desempenhar este
mecanismo de feed-back negativo, e ao contrário, inibe a p53 tipo selvagem e membros da
família da p53 e outras proteínas (Goh et al., 2010).
Figura 5: Representação simplificada da via de ação da p53. A: Mecanismo de ação do tipo selvagem
da p53. B: Mecanismo de ação do tipo mutante da p53 (Goh et al., 2010).
12 As p53 mutantes podem contribuir para o desenvolvimento do câncer exercendo
um efeito dominante negativo sobre as p53 selvagens. Recentes estudos acerca da Síndrome
Li-Fraumeni mostraram que as p53 mutantes com estas propriedades estão associadas com o
desenvolvimento do câncer, uma correlação que tem se confirmado através da análise de mais
de 200 p53 mutantes (Frebourg et al., 1992; Petitjean et al., 2007b). Este efeito dominante
negativo se baseia no fato de que a p53 se liga no DNA como um tetrâmero que consiste em
um dímero de dímeros. Os tipos selvagem e mutante da proteína p53 formam
heterooligômeros incapazes de se associar ao DNA e promover sua atividade transcricional.
(Weinberg et al., 2004; Milner & Medcalf, 1991; Srivastava et al., 1993). As p53 mutantes,
portanto, podem inibir a indução da transcrição gênica e a atividade de supressão tumoral da
p53 selvagem (Goh et al., 2010).
Na figura 6 está ilustrada a relação existente entre as p53 mutante e selvagem. Em
células normais, a p53 selvagem é sintetizada no citoplasma, formando dímeros que são
transportados para o núcleo, onde formam tetrâmeros em sítios de ligação da p53 com o
DNA, promovendo a transcrição dependente de p53 (Figura 6 A). Quando os níveis protéicos
estão baixos, os dímeros de p53 mutantes não bloqueiam a formação do tetrâmero de p53
selvagem e a atividade da p53 só será prejudicada em casos de haplo-insuficiência (Figura 6
B). Quando o nível protéico de ambas as p53 mutante e selvagem aumenta, são formados
heterotetrâmeros inativos que inibem a formação dos tetrâmeros funcionais de p53 selvagem e
não conseguem ativar a transcrição de genes (Figura 6 C) (Goh et al., 2010).
Figura 6: Modelos para ilustrar a relação das p53 mutante e selvagem. A: Em células normais. B:
Quando os níveis protéicos de p53 mutante e selvagem estão baixos. C: Quando o nível protéico de
ambas as p53 mutante e selvagem aumenta (Goh et al., 2010).
A maioria das mutações que inativam a p53 estão situadas no domínio DBD
(DNA Binding Core Domain ou Domínio de Ligação ao DNA) (Figura 7), afetando sua
atividade transcricional. Por este motivo, esta região é considerada um hot spot para mutações
(Alarcon-Vargas & Ronai, 2002; Hainaut & Wiman, 2005; Zilfou & Lowe, 2009).
13 Figura 7: Ilustração do domínio de ligação da p53 em associação com o DNA (RSCB Protein Data
Bank, 2010).
Estas mutações evidentemente prejudicam ou eliminam a habilidade da proteína
p53 de se ligar a sequências específicas de DNA que estão inseridas em seus genes-alvo,
impedindo assim a ativação transcricional destes genes (Snustad & Simmons, 2001).
Mais de 90% das mutações da p53 ocorrem na sequência específica de ligação ao
DNA no domínio central e são codificadas pelos éxons 4, 5, 6, 7, 8 e 9, e 50% alteram os
códons 175 (éxon 5), 248 (éxon 7), 249 (éxon 7), 273 (éxon 8) ou 282 (éxon 8) dentro desse
domínio, regiões chamadas de hot spot (Figura 8) (Cadwell & Zambetti, 2001).
Em geral, as mutações dentro do domínio central podem ser classificadas naquelas
em que os aminoácidos contatam diretamente o DNA (ex: aminoácidos 248 e 273) e naquelas
em que há alteração da conformação da p53, assim evitando a sua ligação específica ao DNA
(ex: aminoácidos 143 e 175) (Cadwell & Zambetti, 2001).
Figura 8: Diagrama esquemático dos domínios da p53, destacando a região de ligação ao DNA como a
que possui o maior número de mutações. AD1 e AD2 (ativação N-terminal); PXXP (rico em prolina);
DNA BINDING CORE DOMAIN (ligação ao DNA); TETRA (tetramerização); e BASIC
(regulatório) (Hainaut & Wiman, 2005).
14 1.4 IMUNOHISTOQUÍMICA DA PROTEÍNA p53
A imunohistoquímica (IHQ) é uma técnica que contribui para a compreensão do
processo que desencadeia várias doenças. Trata-se de um método que envolve técnicas
imunológicas e bioquímicas de localização de proteínas em uma célula de tecido dissecado,
utilizando-se dos princípios de ligação de antígenos do tecido aos seus respectivos anticorpos.
A visualização é permitida porque o anticorpo é rotulado com um marcador visível, podendo
ser uma enzima, elementos radioativos ou fluoróforos, como o FITC (Fluorescein
Isothiocyanate). Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais, sendo os monoclonais
mais específicos (Khayat, 2007).
A IHQ torna possível a visualização da distribuição e localização de componentes
celulares específicos dentro de uma célula ou de um tecido e, por envolver reação
antígeno/anticorpo, tem uma boa vantagem sobre técnicas tradicionais de coloração com
corantes especiais e enzimáticos que identificam um limitado número de proteínas, enzimas e
estruturas de tecidos (Khayat, 2007).
Esta técnica é amplamente utilizada no diagnóstico do câncer, onde marcadores
específicos são conhecidos para determinados tipos de neoplasias, e na pesquisa básica, para a
compreensão da distribuição e localização de biomarcadores em diferentes partes de um
tecido (Sheibani & Tubbs, 1984; Immunoportal, 2006).
A característica da p53 mutante é a sua expressão elevada, devido à maior
estabilidade, o que pode estar atribuído à sua incapacidade de induzir a expressão de seu
regulador primário, o gene MDM2 (Alarcon-Vargas & Ronai, 2002).
O produto do gene MDM2 (localizado no braço longo do cromossomo 12, região
q14.3-q15) tem, entre outras funções, a capacidade de se ligar à p53, através de sua região aminoterminal, induzindo degradação desta proteína por ubiquitinação, sendo assim um regulador
negativo de p53. A transcrição do gene MDM2 é transativada pela proteína p53, logo, a p53
regula sua própria degradação, via transcrição de seu agente degradador. Esta degradação pode ser
impedida por alterações da p53 que impeçam a transativação do MDM2, ou ainda por
surgimento de novos sítios que alterem a interação p53/MDM2 (como sítios de fosforilação).
Por outro lado, alterações na própria mdm2 (produto do gene MDM2), em seu sítio de ligação
com a p53, poderão refletir na não degradação da p53, resultando também na sua superexpressão
(Entrez gene, 2007).
15 A superexpressão protéica, portanto, se deve ao fato da p53 não ter sido naturalmente
degradada durante o período tido como padrão nas células somáticas normais.
A alteração mais comum no TP53 é a mutação de sentido trocado. Em diversos
sítios, estas mutações, entre outras, levarão à síntese de uma proteína com meia-vida elevada,
o que pode ser detectado por IHQ com anticorpos monoclonais (Levine et al., 1991; Kubbutat
et al., 1997).
Em um estudo realizado com 121 pacientes árabes com câncer gástrico, verificouse a expressão positiva da p53 em 54% dos casos, sendo observada principalmente nos
indivíduos com idade inferior a 60 anos e com tamanho do tumor superior a 5 cm. Essa
expressão foi correlacionada com características agressivas do tumor (Al-Moundhri et al.,
2005).
Zafirellis et al. (2005) observaram a expressão da p53 em 65,4% em amostras de
pacientes europeus. Esta expressão estava significativamente correlacionada com o tipo
histológico intestinal de Lauren. Além disso, não foi detectada influência significativa entre a
expressão e a sobrevida do paciente. Soong et al. (1996) observaram correlação entre a
presença de mutações e a superexpressão da p53 em 73% de um grupo de amostras de câncer
gástrico.
Estes dados reforçam a complexidade desta doença e demonstram a necessidade
do desenvolvimento de novos estudos objetivando modificar este panorama por meio da
identificação de características multifatoriais, entre as quais as genéticas (peculiares de um
tumor), que poderiam ampliar a capacidade de elucidação do comportamento desta neoplasia
e permitir o estabelecimento de condutas terapêuticas de forma mais precisa (Pharoah &
Caldas, 1999; Assumpção & Burbano, 2005). Por estas razões, este estudo objetiva verificar a
presença de alterações nucleotídicas em uma região de hot spot do gene TP53, bem como
relacionar os possíveis achados com a imunorreatividade da proteína p53, produto deste gene,
em amostras de adenocarcinoma gástrico.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Verificar a existência de alterações nucleotídicas nos éxons 7, 8 e 9 do gene TP53
e correlacioná-las com a IHQ da proteína p53 dos adenocarcinomas gástricos estudados.
16 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Identificar e caracterizar as mutações novas que possam estar associadas à
etiogênese do câncer gástrico.
• Comparar a frequência de mutações no TP53 observadas nestes tumores em
relação a outros tumores descritos na literatura.
• Correlacionar os dados encontrados com os aspectos clínico-patológicos dos
adenocarcinomas estudados.
3 JUSTIFICATIVA
Os dados obtidos pela realização deste trabalho podem auxiliar na compreensão
do significado de resultados comumente adquiridos no diagnóstico e pesquisa oncológica,
permitindo um melhor entendimento das alterações envolvidas na carcinogênese gástrica, para
que possam ser utilizadas como marcadores de diagnóstico ou prognóstico.
Os achados encontrados nestes estudos poderão colaborar no direcionamento de
terapias atuais e futuras, assim como no desenvolvimento de tratamentos porvindouros.
Os resultados observados em amostras obtidas desta população poderão
demonstrar alguma característica regional que potencialmente esteja favorecendo o alto índice
desta neoplasia na região Norte.
Populações nas quais o câncer gástrico é endêmico, como a população paraense,
beneficiar-se-ão com as informações obtidas nesta proposta.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 AMOSTRAS
Foram analisadas 58 amostras de tumores gástricos primários provenientes da
Universidade Federal do Ceará e do Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB),
localizado na cidade de Belém, Estado do Pará. Todas as amostras foram obtidas antes da
administração de tratamentos quimioterápicos e/ou radioterápicos. A amostra a fresco foi
seccionada em duas partes, uma para análise histopatológica e outra para análise genética.
Dos fragmentos tumorais reservados para o diagnóstico histopatológico e para a
IHQ, que foram previamente emblocados em parafina e fixados em formol, foram obtidas
lâminas com cortes histológicos, como é realizado nos procedimentos de rotina. A análise
17 histopatológica dos fragmentos tumorais a fresco foi realizada pelo Serviço de Cirurgia Geral
e Departamento de Patologia do HUJBB.
O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética do HUJBB (Anexo A) e
todos os pacientes foram informados sobre os estudos realizados a partir das amostras obtidas.
4.2 HISTOPATOLÓGICO
Os dados histopatológicos, tais como: subtipo tumoral, grau de diferenciação,
profundidade da invasão, acometimento dos linfonodos e/ou metástases à distância foram
extraídos dos laudos patológicos realizados pelo Departamento de Patologia do HUJBB. Cabe
ressaltar que a análise histopatológica dos fragmentos tumorais foi realizada segundo a
classificação de Lauren (1965).
4.3 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA P53 POR IMUNOHISTOQUÍMICA
Foi realizado um corte de 4 µm do tecido emblocado em parafina, previamente
fixado em formol, que foi submetido aos processos de desparafinização em lâmina, incubação
com anticorpos monoclonais primários para p53 (DO-7, diluição 1:50, DakoCytomation, CA,
USA) e incubação com anticorpos secundários seguido do complexo streptoavidina-biotinaperoxidase (DakoCytomation, CA, USA) (Calcagno et al., 2006). As lâminas foram reveladas
pelo uso de DAB-H2O2 e contracoradas com hematoxilina de Harris e em seguida passaram
pelo processo de análise e captura de imagem.
4.4 SEQUENCIAMENTO DIRETO DO TP53
Para a análise genética, os fragmentos do tumor foram transportados em
nitrogênio líquido para o Laboratório de Citogenética Humana (LCH) do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal do Pará, onde foram estocadas em freezer a -80 °C até a
realização da extração do DNA. Cabe ressaltar que as amostras provenientes do Estado do
Ceará foram obtidas na forma de DNA previamente extraído.
Para a extração de DNA, foi utilizado aproximadamente 1 cm3 de amostra de
tecido. Cada amostra foi submetida a um processo de digestão com proteinase K, seguido de
extração por fenol-clorofórmio, como descrito por Sambrook et al. (1989), e então estocados
em freezer a -20 °C.
18 Para a análise do segmento de interesse, foi empregada a técnica de PCR (Reação
em Cadeia da Polimerase ou Polymerase Chain Reaction) que utilizou iniciadores (primers)
específicos construídos com o auxílio do programa online Primer3 versão 4.0 (Rozen &
Skaletsky, 2000). As quantidades dos reagentes utilizados no PCR para um volume final de
12 μL foram as seguintes: 6,25 µL de H2O nuclease free, 0,5 µL de primer forward (10
ng/µL), 0,5 µL de primer reverse (10 ng/µL), 4,25 µL de GoTaq Colorless Master Mix 2X
(Promega Corporation, Madison, USA) e 1 µL de DNA (≈10 ng/µL).
Para o desenho dos primers do gene TP53 foram utilizados contigs específicos do
genoma referência para a espécie Homo sapiens, descritas no banco de dados do NCBI
(Centro Nacional de Informação Biotecnológica) referentes ao código NC_000017.10. Os
primers para o estudo do gene TP53, foram desenhados visando uma região de hot spot
localizada no domínio de ligação com o DNA, sendo eles: éxon 7, éxon 8 e éxon 9. Vale
ressaltar que o éxon 9 não está localizado no domínio de ligação com o DNA, no entanto, foi
incluído no estudo porque os mesmos primers forward e reverse foram utilizados para
analisar os éxons 8 e 9 em um único amplicon.
As condições de termociclagem utilizando o termociclador Mastercycler Gradient
(Eppendorf, USA) foram de 1 ciclo a 95 ºC por 3 minutos para desnaturação inicial, seguido
de 35 ciclos: desnaturação a 94 ºC/ 2 minutos, anelamento dos primers 61,1 °C/ 1 minuto e
extensão da cadeia a 70 ºC/ 2 minutos, finalizando com 1 ciclo de 70 ºC para extensão final
com tempo de 30 minutos para o primer 7 e 60 minutos para o primer 8-9. Na tabela 3 serão
apresentados os sistemas dos primers utilizados com suas sequências nucleotídicas,
temperaturas de anelamento e tamanho dos amplicons.
Tabela 3: Sistemas de primers, com suas sequências forward (F) e reverse (R), os tamanhos dos
amplicons e suas temperaturas de anelamento.
Região
Iniciador
Éxon 7
F-CCTGCTTGCCACAGGTCT
R-GTGATGAGAGGTGGATGGGTA
Éxons 8-9
F-GACAAGGGTGGTTGGGAGTA
R-GCCCCAATTGCAGGTAAAAC
Temp.(ºC)
Amplicon
61,1 °C
295 pb
61,1 °C
500 pb
19 Após a PCR, os produtos da reação foram aplicados em gel de agarose 1,5% e
submetidos à eletroforese (100V), permitindo a visualização das bandas do material genético.
Na a etapa seguinte, de sequenciamento direto do produto do PCR, as quantidades
dos reagentes utilizados para um volume final de 20 μL foram as seguintes: 15 µL de H2O
nuclease free, 0,5 µL de primer forward ou reverse (10 ng/µL), 0,5 µL de Big Dye,,3 µL de
Save Money e 1 µL da reação de PCR. Para esta reação foi utilizado o kit da ABI PRISMTM
Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystem, USA).
A reação de sequenciamento foi feita utilizando-se o termociclador Mastercycler
Gradient (Eppendorf), de acordo com as seguintes condições de termociclagem de 25 ciclos:
96 ºC/ 50 segundos para desnaturação, 61°C/ 1 minuto para o anelamento do primer e 60 ºC/
4 minutos para a extensão da cadeia, finalizando com 1 ciclo de 4 ºC/ 5 minutos.
Após este procedimento, foi realizada uma etapa de precipitação, com o intuito de
purificar o produto da reação antes dar continuidade a análise. Para tanto, as amostras
sofreram lavagens com isopropanol 70% e etanol 70%. Posteriormente, foi realizada a leitura
do sequenciamento, utilizando-se o sequenciador automático ABI Prism – 3130 (Applied
Biosystems). A metodologia utilizada foi baseada na síntese bioquímica da cadeia de DNA,
pelo do método de Sanger et al. (1977), tendo sido utilizado o polímero POP7 (Applied
Biosystem, USA). As sequências nucleotídicas produzidas foram diretamente editadas no
programa Sequencing analysis versão 5.2 (Applied Biosystem, USA) em computador Dell,
acoplado ao sequenciador ABI prism 3130 DNA Sequencer.
4.5 ANÁLISE DOS RESULTADOS DO SEQUENCIAMENTO
As sequências referências de cada éxon foram obtidas a partir do contig NC
0017.10, através dos bancos de dados encontrados no site do NCBI. Cada sequência
referência e as sequências de DNA correspondentes aos pacientes foram exportadas do
programa Sequence Scanner v. 1.0 (Applied Biosystems) para o Bioedit Sequence Alignment
Editor v. 7.0.9.0 (Hall, 1999), onde foram alinhadas, possibilitando a visualização das
alterações existentes. As análises foram feitas com a utilização do programa Gene Runner v.
3.01 (Hastings software), através do qual é possível localizar a posição exata de cada
alteração, permitindo inferir o efeito desta alteração na síntese protéica. Os resultados obtidos
a partir do sequenciamento dos éxons 7, 8 e 9 do gene TP53 encontram-se no ANEXO B.
20 4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram analisados através do programa estatístico BioEstat® versão
5.0 (Ayres et al., 2007). Os testes utilizados para estas correlações foram o exato de Fisher e o
Odds Ratio, sendo considerados estatisticamente significativos valores de p<0,05.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dentre as alterações genéticas observadas nos éxons analisados, nenhuma
consistiu em polimorfismo, segundo dois bancos de dados, resumidos na tabela abaixo. Sendo
assim, todas as alterações observadas nos éxons estudados são consideradas mutações.
Tabela 4: Polimorfismos descritos localizados nos éxons do gene TP53 (IARC TP53 database;
*SNP500Cancer, 2010).
Éxon
Nucleotídeo
Códon
Efeito
2
63C>T
D21D*
Silencioso
-
Rs1800369
4
102C>A
P34P
Silencioso
-
Rs11575998
4
108G>A
P36P
Silencioso
0.012738
Rs1800370
4
139C>T
P47S
Sentido trocado
0.029329
Rs1800371
4
215C>G
P72R
Sentido trocado
0.492248
Rs1042522
329G>C R110L*
329G>T
R110P*
Sentido trocado
-
6
639A>G
R213R
Silencioso
0.023526
Rs1800372
6
649G>A
V217M
Sentido trocado
0.0098
Rs35163653
10
1079G>C
G360A
Sentido trocado
0.009892
Rs35993958
4
Freq. Heterozigotos
Identificação
Rs11540654
21 5.2 ANÁLISE DESCRITIVA
5.1.1 Amostras
As amostras são provenientes de pacientes com idade entre 31 e 89 anos (62 ±
12), sendo 74% do gênero masculino e 26% do gênero feminino. Portanto, neste estudo a
ocorrência da neoplasia gástrica em homens se apresentou mais frequente em relação às
mulheres, como referido pelo Instituto Nacional do Câncer (2009).
Segundo o National Cancer Institute (2010), a idade avançada se apresenta como
um fator de risco para o desenvolvimento do câncer gástrico, o que justifica a maior
incidência de pacientes com idade superior a 60 anos (60%) neste estudo.
Em uma pesquisa realizada por Magalhães et al. (2008), 42 dos 70 pacientes
(60%) eram homens, sendo a média de idade equivalente a 60 anos.
A maior incidência do câncer gástrico em homens pode ser explicada em virtude
da exposição mais intensa a fatores ambientais, tais como o tabagismo, alcoolismo e os maus
hábitos alimentares, que sabidamente predispõem ao câncer gástrico.
De acordo com Chen et al. (2009), a predominância de homens com câncer
gástrico é uma importante característica etiológica. Em seu estudo, 42 dos 52 pacientes eram
homens e ao investigarem a razão desta predominância, concluíram que o maior esforço físico
desempenhado pelos homens, bem como o hábito alimentar mais saudável das mulheres,
devido ao maior consumo de vegetais e frutas, têm contribuído para a diferença na incidência
da neoplasia gástrica entre os gêneros.
O intenso consumo de vegetais e frutas, portanto, é considerado um fator de
proteção para o desenvolvimento de câncer gástrico nas mulheres. Outro estudo realizado por
Sipetić et al. (2005) sustenta esta hipótese, uma vez que demonstraram que a dieta rica em
vegetais e frutas e a redução da ingestão de sal pode prevenir 65 a 75% dos casos de câncer
gástrico entre os não fumantes.
Por outro lado, o menor acometimento de mulheres pode ser justificado por
fatores hormonais. Um estudo realizado por Duell et al. (2010), demonstrou que fatores
menstruais e reprodutivos, como a quantidade de ciclos menstruais e a ovariectomia, alteram
o risco de desenvolver câncer gástrico, de maneira que as mulheres submetidas à ovariectomia
apresentaram um risco aumentado de 79%.
22 Freedman et al. (2007) reportaram elevado risco para o desenvolvimento de
adenocarcinoma gástrico em pacientes que haviam sido submetidas à ovariectomia, apesar de
que as associações não foram estatisticamente significantes.
Portanto, os resultados destas análises fornecem algum suporte para a hipótese de
que os hormônios sexuais ovarianos estão relacionados com a menor incidência de câncer
gástrico nas mulheres.
5.1.2 PCR
Todas as Reações em Cadeia da Polimerase tiveram como resultado a
amplificação do fragmento de interesse, uma vez que foi possível a visualização das bandas
no gel de agarose, como mostra a figura 9.
Figura 9: Eletroforese em gel de agarose dos amplicons 7 e 8-9.
5.1.3 Histopatológico e Localização tumoral
Em relação ao sítio de acometimento do tumor, a maioria dos pacientes teve a
região do antro atingida (48,5%), seguido da cárdia (23%), corpo (18,5%), piloro (7%) e
fundo (3%).
De acordo com Shang & Pena (2005), as áreas do estômago com maior incidência
são o antro e o piloro (50 a 60%), seguidos do fundo e cárdia (25%) e corpo (15%), dados que
corroboram com os resultados encontrados no presente estudo.
Outro estudo, realizado por Lazăr et al. (2010), encontrou uma incidência maior de
tumor nas regiões do antro (51%) e corpo (24,5%).
Uma grande quantidade de evidências sugere que a diminuição da prevalência da
infecção pelo H. pylori no Japão pode ser associada com o declínio da incidência de
adenocarcinomas na parte distal (antro e piloro) do estômago (Liu et al., 2004). Portanto, o
elevado índice de infecção por H. pylori nas regiões Norte e Nordeste, de onde foram
23 coletadas as amostras do presente estudo, pode estar relacionado com a alta frequência de
adenocarcinomas na região distal (55,5%) do estômago.
Em relação ao estadiamento do câncer, a maioria dos pacientes apresentou
estadiamento IV (33%), acompanhado do IIIA (27,5%), II (15,5%), IIIB (14%), IB (8%) e IA
(2%).
Atualmente, a neoplasia gástrica em estadiamento inicial (I ou II) só representa 10
a 20% de todos os casos diagnosticados nos Estados Unidos (National Cancer Insitute, 2010).
Yu et al. (2010) observaram em seu estudo uma frequência elevada do
estadiamento IV em ambos os gêneros e em diferentes grupos etários, com p<0,05. Outro
estudo, realizado por Wu et al. (2001), encontrou 80% dos tumores com estadiamento
avançado em detrimento de 20% com estadiamento inicial.
Ihemelandu et al. (2009) relataram que a maior incidência do estadio IV
observada em seu estudo estava relacionada com o aumento da mortalidade nos pacientes com
câncer gástrico.
A frequência mais elevada de estadios avançados pode ser explicada baseando-se
no fato de que a maioria das neoplasias gástricas é diagnosticada na fase avançada, em função
dos sintomas se manifestarem geralmente nessa fase da doença (MacDonald, 1992).
Verificou-se no presente estudo que 45% dos pacientes apresentaram tumor do
tipo difuso e 55% tipo intestinal, de acordo com a classificação de Lauren.
Em populações de baixo risco, o tipo difuso é mais comum, em contrapartida, a
variante histológica mais comumente presente em populações de alto risco é o tipo intestinal,
o que resulta da maior exposição aos fatores ambientais, incluindo infecção por H. pylori.
(Fenoglio-Preiser et al., 2000).
Um estudo realizado por Schneider et al.(1995), encontrou uma frequência de
64% dos casos de tumor analisados sendo do tipo intestinal e 36% do tipo difuso.
De forma semelhante, Shinmura et al. (1999), observaram 59% dos casos de
adenocarcinoma gástrico relacionados ao tipo intestinal e 41% ao tipo difuso e afirmaram que
a atual distribuição dos tipos tumorais de acordo com a classificação de Lauren revela um
predomínio do tipo intestinal.
Um estudo realizado por Karim & Ali (2009) encontrou uma frequência de
22,44% das amostras do tipo intestinal com alteração nos éxons do gene TP53. Em um estudo
24 anterior, realizado na população paraense, foi observado 47% de imunorreatividade positiva
da p53 associada ao tipo intestinal de Lauren (Khayat et al., 2009).
Uma vez que o tipo intestinal é mais frequente em áreas onde o risco de
desenvolver a doença é mais elevado (Muñoz et al.,1968), estes achados permitem inferir que
a predominância do tipo intestinal nos pacientes estudados pode estar relacionada com a alta
incidência desta neoplasia nas regiões Norte e Nordeste do Brasil.
5.1.4 Imunohistoquímica
A análise por IHQ da proteína p53 permitiu verificar que 46,5% dos tumores
apresentaram-se imunohistoquimicamente positivos e 53,5% apresentaram imunorreatividade
negativa.
O tipo selvagem da p53 forma tetrâmeros e se liga ao DNA para mediar a
transcrição de genes, o que resulta na parada do ciclo celular, apoptose ou senescência. A p53
selvagem aumenta a transcrição e expressão do gene MDM2, que promove sua degradação e
restaura o nível basal desta proteína nas células normais. Em contraste, a p53 mutante não
consegue desempenhar este mecanismo de feed-back negativo, levando ao aumento da meiavida desta proteína, o que pode ser detectado por IHQ com anticorpos monoclonais (Levine et
al., 1991; Kubbutat et al., 1997; Goh et al.,2010)
A IHQ positiva da p53 está relacionada a tipos histológicos de alto grau,
aneuploidias e proliferação acentuada (Visakorpi et al., 1992). Estudos sugerem que tumores
com níveis intermediários de expressão da p53 possuem um risco menor de desenvolver
metástase, enquanto que tumores com IHQ fortemente positiva são mais propensas a
desenvolver metástase (Setala et al., 1998 & Shiao et al., 2000).
A superexpressão da p53 foi significantemente correlacionada com o estágio da
doença, a presença de metástase à distância e o tipo intestinal do câncer em um estudo
desenvolvido por Victorozon et al. (1996).
Os resultados obtidos no presente estudo tiveram frequência equivalente aos
estudos de Khayat et al. (2009), que apresentou 38,5% dos tumores com imunorreatividade da
p53, Lazăr et al. (2010), que apresentou 41% das amostras com IHQ positiva, Al-Moundhri et
al. (2005), que verificou expressão positiva da p53 em 54% dos casos e Karim & Ali (2009),
que detectou positividade da IHQ da p53 em 36% dos pacientes.
25 De acordo com Alsner et al. (2008), o acúmulo da p53 observado por
imunohistoquímica é sabidamente um marcador prognóstico para o câncer de mama. Shi et al.
(1999), encontraram uma relação estatisticamente significante entre a imuorreatividade da p53
e a presença de mutações no gene TP53 em câncer de esôfago.
Soong et al. (1996) observaram correlação entre a presença de mutações e a
superexpressão da p53 em 73% de um grupo de amostras de câncer gástrico, 68% de câncer
colorretal e 79% de câncer de mama.
Ao contrário do que foi analisado por Soong et al. (1996), no presente estudo a
imunohistoquímica positiva da p53 não teve uma relação estatisticamente significante com o
aparecimento de mutações nos éxons estudados, o que poderia ser observado, uma vez que a
característica da p53 mutante é a sua expressão elevada, devido em parte à sua incapacidade
de induzir a expressão de seu regulador primário, o gene MDM2 (Alarcon-Vargas & Ronai,
2002).
Segundo Teh & Tan (2005), a imunohistoquímica positiva da p53 tem sido usada
como marcador de mutações no TP53 em diversas neoplasias. No entanto, relatam alguns
problemas acerca desta afirmação. Primeiro, pelo fato de que os níveis de p53 podem estar
aumentados em consequência de uma resposta do organismo a diversos estresses celulares,
como ativação de oncogenes e estresse ribossomal. Por outro lado, algumas mutações no gene
TP53 podem não produzir níveis detectáveis de p53.
De acordo com Gilkes & Chen (2007) o estresse ribosomal, como a interrupção da
biogênese de rRNA, causa um aumento dos níveis de p53 na célula devido à liberação de
proteínas ribossômicas do nucléolo, que se ligam à proteína mdm2 e inibem a degradação de
p53 dependente de mdm2.
Formas truncadas de mdm2 inibem a sua atividade normal dificultando a
ubiquitinação do seu alvo, resultando em elevação dos níveis de p53 (Alarcon-Vargas &
Ronai, 2002).
O produto do gene supressor de tumor p14ARF (Alternative Reading Frame)
sequestra a mdm2 e inibe sua atividade de ubiquitina ligase, levando ao acúmulo de p53.
Portanto, a superexpressão de p14ARF também pode estar relacionada com o aumento dos
níveis de p53 na célula (Kondo et al., 2008).
O resultado positivo de IHQ da p53 nem sempre reflete um acúmulo de p53
mutante, pois talvez resulte da estabilização da proteína tipo selvagem, que pode estar
26 superexpressa em células normais em decorrência de danos ao DNA. Estudos em diversos
tipos de câncer têm mostrado muitos exemplos em que a proteína p53 acumula-se na aparente
ausência de mutação genética (Soong et al., 1996).
Desta forma, a ausência de correlação entre o aparecimento de mutações nos
éxons 7, 8 e 9 do gene TP53 e a IHQ positiva da p53 pode ser atribuída a estes fatores.
Na tabela abaixo estão resumidos todos os dados referentes às características
clinico-patológicas dos pacientes estudados.
Tabela 5: Dados descritivos das amostras estudadas.
Idade (média ± DP)
62±12 anos
Gênero
<60 23 (40%)
Masculino 43 (74%)
>60 35 (60%)
Feminino 15 (26%)
Localização
Estadiamento
Não-cárdia 42 (72,5%)
I –II 15 (26%)
Cárdia 16 (27,5%)
III-IV 43 (74%)
Classificação de Lauren
Imunohistoquímica
Difuso 26 (45%)
+ 27 (46,5%)
Intestinal 32 (55%)
-
31 (53,5%)
5.1.5 Sequenciamento
A presença de mutações foi uma característica encontrada em 64% dos pacientes,
entre elas, as mutações de sentido trocado G244S e E286K tiveram uma frequência de 55% e
20,5%, respectivamente. Além disso, estas duas mutações juntas foram observadas em 18%
dos pacientes. Em relação à análise para a presença de duas ou mais mutações quaisquer,
observou-se que 38% dos pacientes apresentam pelo menos duas mutações em relação aos
éxons estudados, estando estas mutações no mesmo éxon ou não.
Alguns autores evidenciaram a deleção de TP53 como a alteração mais comum
em gastrite, metaplasia, displasia e câncer gástrico (Williams et al., 2005), e em outro estudo,
a deleção de TP53 foi observada em todos os estadios tumorais em câncer gástrico, sugerindo
que este evento faça parte da iniciação e progressão neoplásica (Khayat et al., 2009). Assim,
27 deve-se considerar também que no presente estudo algumas das alterações observadas como
alelo únicas, supostamente em homozigose, podem eventualmente estar em hemizigose
devido à perda de um dos alelos.
Alterações no gene TP53 estão relacionadas com o aparecimento do
adenocarcinoma gástrico. Perda alélica ocorre em mais de 60% dos casos e mutações pontuais
são identificadas em 30% a 50% dos casos. Apesar das alterações no TP53 ocorrerem
predominantemente no estágio avançado da neoplasia, algumas mutações têm sido
identificadas em estágios iniciais (Hollstein et al., 1996).
A presença de mutações no gene TP53 em pacientes com câncer gástrico
predispõe ao desenvolvimento de metástase quando comparada com tumores sem mutação
(Kakeji et al., 1993; Shiao et al., 2000). O risco de metástase é aumentado se as mutações
ocorrerem na região de hot spot (Shiao et al., 2000).
Um estudo realizado por Solcia et al. (2009), observou que mutações nos éxons 7
e 8 do gene TP53 foram relacionados com um pior prognóstico do câncer gástrico.
Zhu et al. (2010), relataram em seu estudo que mudanças na atividade
transcricional da p53 exercem um papel importante no desenvolvimento do câncer gástrico,
enfatizando o papel do gene MDM2 na regulação negativa desta proteína.
Em uma pesquisa realizada por Skaug et al. (2000), 54% dos pacientes com
câncer de pulmão apresentaram mutações no gene TP53. Erber et al.(1998), analisaram 86
casos de pacientes com câncer de cabeça e pescoço e verificaram que 43% dos pacientes
possuíam mutações no gene TP53. Ao analisar 222 pacientes com câncer colorretal, BorresenDale et al. (1998), encontraram uma frequência de 45,9% de indivíduos com mutações no
gene TP53. Outro estudo, que analisou amostras de câncer de mama, observou que todos os
tumores que tinham uma perda da função do gene BRCA1 continham mutações no gene TP53
(Holstege et al., 2009). Vale ressaltar que estes estudos analisaram a região do TP53 que
compreende os éxons 5, 6, 7 e 8 (com exceção do último que analisou a regão dos éxons 2 ao
9), no entanto apenas mutações nos éxons 7 e 8 foram correlacionadas com um pior
prognóstico da neoplasia em todos os casos estudados.
Estes dados da literatura reforçam a hipótese de que o elevado número de
mutações encontradas nos pacientes desta pesquisa pode ter relação com o aparecimento da
neoplasia, bem como com a progressão do tumor, principalmente em virtude de estarem
localizadas em uma região dentro do domínio da p53 que interage com o DNA.
28 O sequenciamento do éxon 7 permitiu a visualização da presença da mutação no
códon 244 da proteína p53 (G244S), sendo todos os pacientes heterozigotos (Figura 10). Em
seis indivíduos foi observada uma mutação no códon 248 (R248R), sendo apenas um
homozigoto, e em três pacientes observaram-se mutações no códon 230 (T230A), sendo todos
heterozigotos. Segue a figura do eletroferograma em que foi verificada a mutação mais
frequente G244S.
Figura 10: Eletroferograma do heterozigoto para mutação no códon 244.
A partir da análise do éxon 8 foi possível observar a mutação no códon 286 da
proteína p53 (E286K), sendo todos heterozigotos. Em quatro pacientes observou-se uma
mutação em heterozigose no códon 295 (P295H), e mutações nos códons 282, 285, 288, 296 e
305 apareceram apenas uma vez e somente a última se apresentou na forma homozigota.
As mutações de sentido trocado T230A, G244S, E286K, P295H e H296N, assim
como a mutação silenciosa R248R estão reportadas no banco de dados do IARC
(International Agency for Research on Cancer, 2010). No entanto, não foi encontrado
nenhum trabalho publicado na literatura que apresentasse estudo acerca de alguma dessas
mutações no gene TP53. Vale ressaltar que não foi encontrada nenhuma alteração no éxon 9
utilizando-se a técnica de sequenciamento direto.
Todas as alterações observadas estão listadas no ANEXO B, juntamente com os
dados dos pacientes e a análise por imunohistoquímica da proteína p53.
5.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise da relação entre o estadiamento do tumor e a idade dos pacientes
(Figura 11) demonstrou que a maioria dos pacientes com idade superior a 60 anos apresentam
estadiamento inicial, o que significa que estão em estágio I ou II na classificação do câncer.
29 Esta ocorrência pode ser justificada pelo fato de que estes pacientes, por serem
mais idosos, possuem um acompanhamento médico intenso, o que provavelmente foi
fundamental para o diagnóstico precoce da neoplasia.
Segundo Adán-Merino et al. (2010), o adenocarcinoma gástrico é raro em adultos
jovens, no entanto a maioria dos casos observados apresenta um estágio avançado da doença.
Outros autores enfatizaram que o prognóstico de adultos jovens com câncer
gástrico geralmente é pior em relação aos idosos, atribuindo este fato ao diagnóstico tardio e
ao curso mais agressivo da doença neste grupo de pacientes (Bloss et al., 1990; MedinaFranco et al., 2000).
Nos Estados Unidos, aproximadamente dois terços dos pacientes com
adenocarcinoma gástrico apresentam um estágio avançado da doença (III ou IV). Isto é
atribuído ao fato de que os sintomas iniciais não podem ser detectados por exames
laboratoriais comuns, sendo o diagnóstico por imagem a maneira mais eficiente de
diagnosticar esta alteração (Layke & Lopez, 2004).
Por estas razões, é importante estar atento aos sintomas e fatores de risco no
intuito de realizar um diagnostico precoce e proceder um tratamento com intenções curativas
(Adán-Merino et al., 2010).
25
22 21
20
14
15
<60 anos
10
5
>60 anos
1
0
I‐II
III‐IV
Figura 11: Relação entre estadiamento do tumor e idade dos pacientes.
Através da análise dos dados foi constatada uma tendência estatística (p=0,09)
para o fato dos pacientes com menos de 60 anos apresentarem mais mutações em relação aos
pacientes com mais de 60 anos (Figura 12).
30 Este achado pode estar relacionado com a incidência maior de estadios avançados
nestes pacientes, podendo-se inferir que a presença de mutações nestes éxons inluenciou na
severidade do adenocarcinoma. Desta forma, a presença de mutações está relacionada com
um pior prognóstico da doença (Hollstein et al., 1994).
Isto se deve ao fato de que as mutações no domínio de ligação ao DNA
prejudicam ou eliminam a habilidade da proteína p53 de se ligar a sequências específicas de
DNA que estão inseridas em seus genes-alvo, impedindo assim a ativação transcricional
destes genes e, consequentemente causam a perda da atividade de supressão tumoral (Snustad
& Simmons, 2001; Entrez Gene, 2007).
A inativação de genes supressores de tumor é um mecanismo genético comum no
câncer gástrico. As células que apresentam seu material genômico alterado, normalmente são
detidas na transição G1/S, permitindo o reparo genômico ou a apoptose (morte celular
programada) pelo gene TP53. Quando ocorre a inativação deste gene, a interrupção em G1
não ocorre e o DNA danificado é replicado alterado (Kountouras et al., 2005).
Uma pesquisa realizada por Bookstein et al. (1993) encontrou uma correlação
entre mutações no gene TP53 e o estadiamento avançado do tumor de pacientes com câncer
de próstata, sugerindo que mutações neste gene estão relacionadas com a progressão da
doença. Em outro estudo, com exceção de um caso, todas as mutações encontradas no gene
TP53 estavam associadas com o estadiamento avançado do tumor gástrico (Rugge et al.,
2000).
Portanto, a maior incidência de mutações nos pacientes com idade inferior a 60
anos provavelmente está favorecendo o pior prognóstico, o que pôde ser observado a partir da
análise do estadiamento do tumor, que se apresentou avançado em sua maioria.
20
18
19
16
15
10
<60 anos
5
>60 anos
5
0
Presença
Ausência
Figura 12: Presença e ausência de mutação em relação à idade.
31 Em relação à mutação G244S (Figura 13), observou-se que a maioria dos
pacientes com idade superior a 60 anos não apresentam esta alteração (p=0,03) e que os
pacientes co menos de 60 anos apresentam um risco aproximadamente quatro vezes maior de
desenvolver o câncer gástrico se contiverem esta mutação (OR=3,77; IC 95% 1,2-11,9).
Mutações de sentido trocado podem afetar a função da proteína e causar uma
variedade de patologias, incluindo o câncer, em virtude da alteração que esta mutação pode
provocar na estrutura da proteína em regiões críticas para a atividade protéica normal (Chen,
2009).
Como a mutação G244S provoca uma troca do aminoácido glicina pelo
aminoácido
serina,
esta
alteração
potencialmente
modifica
a
estrutura
protéica
particularmente no domínio de ligação do DNA e, além disso, pode ser responsabilizada por
gerar um novo sítio de fosforilação protéica.
Segundo Kleihues et al. (1997), a modificação estrutural da p53 ocasionada por
mutações no domínio de ligação pode estar associada com o início ou a progressão do câncer.
Estudos mostraram que 74% das mutações do gene TP53 são mutações missense
que ocorrem dentro de seu domínio central de ligação ao DNA, mais de 30% das quais estão
localizados na região de hot spot (Petitjean et al., 2007b). Estas mutações podem afetar a
estabilidade termodinâmica do domínio de ligação ao DNA em diferentes graus (Bullock &
Fersht, 2001).
Mais de 100 genes relacionados ao câncer são caracterizados por mutações de
sentido trocado. Entre eles, o TP53 apresenta mutações missense nas células somáticas de
diversas neoplasias, incluindo o câncer de mama, colorretal e pulmão (Cancer Gene Census,
2010), assim como no câncer gástrico.
Estes achados permitem inferir que a intensa presença da mutação de sentido
trocado G244S no éxon 7 nos pacientes com idade inferior a 60 anos pode ter desencadeado o
desenvolvimento da neoplasia, bem como influenciado na presença da forma mais severa do
câncer, o que também justificaria a prevalência de estadiamentos avançados observada neste
grupo de pacientes.
32 25
20
20
17
15
15
<60 anos
10
6
>60 anos
5
0
Presença
Ausência
Figura 13: Presença ou ausência da mutação G244S em relação à idade.
6
CONCLUSÃO
Este estudo reforça os dados observados na literatura, uma vez que corrobora com
o fato de que o gene TP53 se encontra mutado na maioria das neoplasias, incluindo as
neoplasias gástricas. A frequência das mutações encontradas no gene TP53 no presente estudo
está de acordo com as frequências observadas em outros tipos de tumores relatados na
literatura, como os cânceres de cabeça e pescoço, mama, pulmão e colorretal.
Não foi encontrada significância estatística entre o aparecimento de mutações e a
imunorreatividade da proteína p53, embora as análises dos sequenciamentos mostrassem
alterações em 64% dos pacientes e imunorreatividade da p53 em 46,5%. No entanto, apesar
da ausência de correlação estatística, estas características podem ter influenciado no início do
processo neoplásico ou até mesmo estar influenciando na progressão destes tumores gástricos.
Não foram encontradas relações estatisticamente significantes entre os aspectos
clínico-patológicos e o aparecimento de mutação nos éxons. Entretanto, foram encontrados
resultados significantes entre algumas características e os pacientes com idade inferior a 60
anos, tais como o aparecimento da mutação G244S, a presença de mutações e o estadiamento
avançado. Estes resultados provavelmente estão relacionados, entre outros fatores, com o
diagnóstico tardio da neoplasia neste grupo de pacientes, acarretando em um pior prognóstico.
33 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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41 ANEXO A: Termo de Aprovação do Hospital Universitário João de Barros Barreto.
42 ANEXO B: Dados clínico-patológicos, IHQ e mutações das amostras estudadas.
Amostra Gênero Idade Localização
Estadio
Lauren
Éxon 7
Éxon 8
Éxon 9
IHQ
-
X
X
X
-
X
X
X
+
X
X
X
-
X
X
X
S01
M
64
Corpo
IV
Difuso
S02
M
66
Antro
II
Intestinal
S03
M
56
Cárdia
IV
Difuso
S04
M
45
Antro
IIIA
Difuso
S05
M
48
Antro
IV
Intestinal
S06
M
72
Antro
II
Difuso
S07
M
51
Antro
IIIA
Intestinal
S08
F
77
Antro
IV
Difuso
S09
F
61
Antro
IIIA
Intestinal
S10
M
38
Cárdia
IIIB
Difuso
S11
F
45
Antro
IV
Difuso
S12
M
77
Antro
IV
Intestinal
S13
M
70
Cárdia
II
Intestinal
S14
M
67
Cárdia
II
Intestinal
S15
M
74
Antro
IB
Intestinal
S16
M
73
Antro
IV
Difuso
S17
F
64
Antro
IV
Difuso
S18
M
65
Corpo
IV
Intestinal
S19
M
65
Cárdia
IV
Intestinal
S20
M
77
Antro
II
Intestinal
+
S21
F
48
Antro
IIIA
Intestinal
-
S22
M
58
Co/An
IB
Intestinal
+
S24
F
71
An/Pi
IB
Difuso
-
S25
F
S26
F
41
68
Co/An/Pi
Antro
IIIA
IB
Intestinal
Intestinal
hG244S
X
X
-
X
X
X
-
X
X
X
-
X
X
X
+
X
X
X
-
hG244S/ hR248R
X
X
-
X
X
X
-
X
X
X
-
X
X
X
-
X
X
X
+
X
X
X
+
X
X
X
-
R248R
X
X
-
X
X
X
-
hG244S/ hR248R
hE286K
X
X
hE286K
X
hG244S
hE286K
X
hG244S
hE286K
X
hG244S
hE286K
X
hG244S
hE286K/
hP295H
X
hG244S/hR248R
hE286K/
hG282G/
hN288S/
hK285E/
hP295H
X
+
+
43 S28
F
41
Todo
S31
M 52 Co/Ca S33
F
50
S36
M
S37
IIIA
hG244S
P295H
X
hG244S/ hR248R
X
X
hG244S
X
X
X
X
X
hG244S
X
X
-
X
X
X
-
hT230A/hG244S
X
X
+
hG244S
X
X
+
hT230A/hG244S
X
X
Difuso
-
IIIB
Intestinal
+ An/Pi
IV
Intestinal
+
31
Co/An/Pi
IIIA
Difuso
-
M
74
Corpo
IV
Intestinal
S38
M
72
Cárdia
IIIB
Intestinal
S39
M
65
Cárdia
IV
Difuso
S40
M
57
Cárdia
IV
Intestinal
S41
F
48
Antro
IV
Difuso
S42
M
48
Corpo
IIIA
Difuso
S43
M
77
Antro
II
Difuso
S44
M
56
Antro
IIIA
Intestinal
S45
M
67
Cárdia
II
Difuso
S46
M
59
Corpo
IV
Intestinal
S47
F
71
Antro
IV
Difuso
S48
F
61
Cárdia
IIIB
Intestinal
S49
M
48
Cárdia
IIIB
Difuso
S50
M
55
Antro
IV
Intestinal
S51
M
61
Antro
IIIA
Intestinal
S52
M
69
Antro
II
Difuso
S53
M
62
Cárdia
IIIA
Intestinal
S56
M
69
Cárdia
IIIA
Intestinal
S57
M
62
Antro
IV
Difuso
S58
M
49
Antro
IIIB
Difuso
S61
M
63
Antro
II
Intestinal
S62
M
47
Corpo
IIIA
Difuso
S63
M
78
Antro
IB
Intestinal
S64
M
77
Antro
IIIA
Difuso
S66
F
89
Fundo
IIIA
Intestinal
hG244S
X
X
-
hT230A/hG244S
hE286K
X
-
hG244S
hH296N
X
+
X
X
X
-
hG244S
X
X
+
X
X
X
+
X
X
X
+
hG244S
X
X
-
hG244S
X
X
+
hG244S
X
X
-
hG244S
X
X
-
hG244S
X
X
-
X
X
X
+
hG244S
X
X
+
hG244S
X
X
+
hG244S
X
X
-
X
hE286K
X
+
X
X
X
+
hG244S
X
X
+ hG244S/hR248R
hE286K
X
44 + S67
M
73
Corpo
IIIB
Intestinal
S71
F
78
Corpo
IA
Difuso
S72
M
55
Antro
IIIB
Difuso
S76
hE286K/
X
X
P295H
+ hG244S
X
X
+ hG244S
X
X
+ hG244S
hE286K/
K305E
X
M
79
Cárdia
IIIA
Intestinal
Legenda: h= heterozigoto para a mutação; X= ausência de mutação; An = antro; Ca = cárdia; Co = corpo; Fu =
fundo; Pi = piloro; IHQ (-) não imunoreativa, (+) imunoreativa.