ABA: Metabolismo e
mecanismo de ação.
Cristina Filomena Justo
Fisiologia Vegetal Avançada
Lavras – MG
2005
Introdução
• A descoberta:
• Dormina
Ocorrência:
1949,
Paul
Wareing,
–
Em
todas
as F.
plantas
vasculares,
na
Inibidor
de dos
crescimento
gemas de batata e
maioria
tecidos em
vivos;
freixo
– Em Briófitas, exceto hepáticas;
Abscisina
II
– Em Fungos, como metabólito secundário.
 1960, Frederick T. Addicott
 Aceleração da abscisão de folhas e frutos
Identidade química entre dormina e abscisina II.
Consagração do termo ÁCIDO ABSCÍSICO.
Funções
O ABA está relacionado com a indução de:
Introdução (2)
• Dormência de gemas e sementes;
• Fechamento estomático;
• Inibição do alongamento da raiz principal e
formação de raízes laterais;
• Maturação de frutos;
• Morte celular programada;
• Senescência;
• Síntese de proteínas de reserva em sementes;
• Tolerância a stresses diversos (salinidade,
frio,...);
• Tolerância a dessecação;
• Tuberização, etc...
Introdução (3)
A estrutura molecular do ABA determina
sua atividade fisiológica.
trans
cis
OH
15 Carbonos
O
Derivado
isoprenóide
COOH
Introdução (4)
Isômeros
Não ocorre
conversão
Forma ativa de
ocorrência natural
• Ativo na maturação de sementes;
• Inativo no fechamento estomático;
• Presente nos produtos sintéticos.
Presente nos
produtos sintéticos
• Forma inativa conversível para
a forma ativa [cis];
• Não ocorre naturalmente;
Biossíntese
do ABA
Via direta
Rota do
mevalonato
(fungos)
Via indireta
Rota do
DOXP
(plantas)
Giberelinas
DMAPP= dimetilalil
pirofosfato
IPP= isopentenil pirofosfato
FPP= farnesil pirofosfato
GPP= geranil pirofosfato
GGPP= geranilgeranil
pirofosfato
ABA
ABA
C40
Etapas finais da síntese do ABA
Citossol
NCED
C15
NCED = 9cis-epoxicarotenóide
dioxigenase
Xantoxal
SDR = desidrogenase/
redutase de cadeias
curtas
SDR
AO
AO= aldeído
oxidase
Mutantes deficientes em ABA
• Auxiliaram na elucidação
da via de síntese.
• Apresentam:
• Fenótipo murcho e/ou
• Viviparidade de sementes.
• Aplicação de ABA
exógeno restaura
fechamento estomático.
Catabolismo
Desacelerado em caso de stress hídrico
ABA-β-Dglicose éster
Nova via de catabolismo
Não
enzimático ?
• O neoPA foi detectado
principalmente em sementes
e plântulas.
• Ainda não se sabe o destino
posterior do neoPA.
Zhou et al. (2004)
Nova via de catabolismo (2)
(Zhou et al. 2004)
RNAm
•9´OH ABA tem efeito sobre
indução dessa enzima
•O efeito do neoPA é fraco
Regulação do metabolismo
(+)-ABA-G
Taxa de Biossíntese
Formas inativas
ZEP
NCED
ABA-G
apoplasto
-glicosidase
(+)-ABA
Transporte de ABA
Sauter et al. (2002)
Biossíntese no
mesofilo
Carregamento
do floema via
simplasto e
apoplasto
Seiva elaborada
• ABA livre
Sequestro e
catabolismo no
simplasto do mesofilo
Seiva bruta
• ABA livre
• ABA conjugado
• ABA conjugado
Síntese no simplasto da
raiz
Alcalinização da
seiva bruta sob
stress hídrico
Carregamento do xilema
Movimentação via
simplasto e apoplasto
Produção de formas
conjugadas
ABA livre x conjugado
• O ABA conjugado é uma
forma importante de transporte
a longa distância (Sauter et al.
2002).
Transdução de sinal
• A transdução de sinal depende da existência de
um receptor.
• Identidade do receptor do ABA?
– Talvez seja um canal de cálcio,
– Talvez ative uma GTPase.
• Localização do receptor?
– Plasmalema ou citossol?
– Núcleo celular?
• Há um receptor ou vários?
– Existem diferenças de respostas aos enantiômeros.
• A busca pelo receptor do ABA não tem tido
sucesso, mesmo com as técnicas de engenharia
genética (Finkelstein et al. 2002).
Evidências da localização
intracelular do receptor
Não descarta a
possibilidade do
ABA ligar-se a um
receptor na
plasmalema “pelo
lado de dentro”.
Microinjeção
UV
ABA
“encaixotado”
(Allan et al. 1994; Schwartz et al. 1994)
Evidências da localização do
receptor na plasmalema
• O ABA é incapaz de atravessar a plasmalema em pH
8, mas ainda ocorre fechamento estomático parcial
(Anderson et al. 1994), portanto o ABA teria de agir
“pelo lado de fora”.
• Ligação do anticorpo JIM19 a glicoproteínas na
membrana plasmática é inibida competitivamente
pelo ABA (Desikan et al. 1999).
• Acúmulo de ABA no apoplasto das células guarda
resulta em fechamento estomático (Zhang e Outlow
2001).
Finalmente localizado o
receptor do ABA?
• bio-ABA e novas técnicas:
– citometria de fluxo (FCM);
– microscopia laser confocal (CLSM).
Composto fluorescente
Yamazaki et al. (2003)
Fluorescência com bio-ABA
 Protoplastos isolados
de células guarda;
 O bio-ABA ligou-se à
plasmalema;
 O receptor forma
“clusters”;
 103 a 104 receptores por
protoplasto.
Yamazaki et al. (2003)
O bio-ABA tem ação fisiológica.
• O bio-ABA foi
reconhecido
pelo provável
receptor e
ocorreu
transdução de
sinal.
Yamazaki et al. (2003)
Inibição competitiva pelo ABA
• Provável
receptor
reconhece
o ABA .
Yamazaki et al. (2003)
Natureza
química do
receptor?
 Proteinase K
causou redução da
ligação do bio-ABA.
 Inibidor da
proteinase ou uso
de proteinase
denaturada
resultaram em
aumento da
ligação do bio-ABA
Yamazaki et al.
(2003)
Seqüência de aminoácidos do
provável receptor do ABA
(Razem et al. 2004)
• Essa proteína recebeu o nome de ABAP1
• Tem um domínio WW similar à proteína de
controle da floração (FCA) em Arabidopsis.
A proteína ABAP1
• Foi obtida da fração microssomal da camada de
aleurona de cevada. É uma proteína de
membrana? Embora seja rica em aminoácidos
3H-(+)-ABA.
hidrofílicos.
• 52 kDa (Razem et al. 2004) X 42 kDa da
epiderme de folhas de “broad bean” (Zhang et al.
2002). Seriam receptores diferentes nas duas
espécies ?
• ABAP1 não se expressa em folhas de cevada.
Múltiplos receptores na mesma planta?
Razem et al. (2004)
A proteína ABAP1
Razem et al. (2004)
• Liga-se ao
isômero
natural do
ABA de
acordo com
o pH.
Um modelo
para o
receptor do
ABA
•Talvez seja um
canal de cálcio
Mensageiros secundários
• ADP ribose cíclico (cADPR) (Schroeder et al.
2001).
• O fosfolipídio esfingosina-1-P (SIP)
• O inositol tri-fosfato está envolvido com a
ativação de canais de íons.
• H2O2 e o óxido nítrico estão envolvidos na
sinalização do ABA (Desikan et al. 2003).
• O nível de Ca2+ no citossol afeta a abertura
estomática.
Mensageiros secundários envolvidos no fechamento
estomático induzido pelo ABA
cADPR = ADP ribose cíclico
PLC = fosfolipase C
InsP3 = inositol trifosfato
Ca2+ exerce feedback
positivo
SV = canais de liberação
de lenta de Ca2+ vacuolar
Schroeder et al. (2001)
Um gerador de mensageiro
secundário?
• NADPH oxidase
 Uma proteína de membrana com Ca2+ “binding
motifs”;
NADPH + O2  NADP++O2-+ H+
 Ativada
por G proteínas (GTPases);
O

H
O
2
2
2
 Codificada pelo
gene rbohA (respiratory burst
oxidase homolog A);
•Stress oxidativo
Talvez relacionada com a resistência a
patógenos.
105 a 108 kDa;
Keller et al. (1998)
G proteínas na transdução de sinal
• Uma GTPase (AtRac1) que se expressa
preferencialmente em células-guarda.
• Essa enzima é
inibida pelo ABA.
Adição de
ABA
Lemichez et al (2001)
Transdução de
sinal em
cascata
Membrana
• As MAP
quinases estão
envolvidas na
transdução de
sinal em várias
vias hormonais.
• São também
ativadas por
fosforilação
(MAPKK)
Adaptado de
Morris (2001)
Respostas induzidas pelo ABA
• Rápidas
– Movimentos estomáticos
• Lentas
– Expressão gênica:
• Indução do acúmulo de reservas em sementes;
• Indução de dormência;
• Indução da tolerância à dessecação;
• Inibição da expressão de enzimas hidrolíticas;
• Aumento da tolerância ao stress (hardening).
Respostas rápidas: Canais de íons envolvidos nos
movimentos estomáticos
Inibição da abertura
Indução do Fechamento
• Canais de Ca2+
• Canais de ânions (S e
R)
• Canais de K+ out
• Canais no tonoplasto
(VK e FV)
Inibição da abertura
• Bomba de H+
• Canais de K+ in
Schroeder et al. (2001)
Indução do fechamento
O ABA e o citoesqueleto
• O ABA induz a desorganização dos
filamentos de actina nas células guarda.
• O processo é mediado pelo cálcio
citoplasmático, por quinases e fosfatases.
• Resultando em
fechamento
estomático.
Hwang & Lee (2001)
Actina no fechamento estomático
• Combinou-se
proteínas fluorescentes
com a actina e a
tubulina.
• A adição de ABA
resulta em
desorganização dos
filamentos de actina e
os estômatos fechamse.
• Os mutantes abi1
não apresentam
alteração do
citoesqueleto em
resposta ao ABA.
• A GTPase (AtRac1)
está envolvida nessa
resposta.
Lemichez et al. (2001)
Respostas lentas
Genes ABA - responsivos
• Promotor dos genes
• ABRC = “ABA responsive complex”
– ABRE = “ABA responsive element”
– CE = “coupling element”
Seqüência
consenso
estão
localizadas
• Estas seqüências
upstream em
relação às seqüências codificadoras;
• São reconhecidas por fatores de transcrição.
Seqüência
consenso
•Realizadas para
compreender a
seqüência de
nucleotídeos
necessária para o
reconhecimento pelos
fatores de transcrição
responsivos ao ABA
• Descobriu-se dois
segmentos na
região do promotor
dos genes que são
importantes para
esse
reconhecimento:
– ABRE e
– CE.
Shen & Ho (1995)
Mutações dirigidas
Superexpressão
em resposta
ao ABA.
•Foram inseridas
várias cópias da
seqüência ABRE
na região do
promotor dos
genes
•Quanto mais
cópias maior a
expressão
Shen & Ho (1995)
Promoter
Gene reporter
G-box
• Ocorre em diversas
regiões promotoras de
genes responsivos a fatores
ambientais (Shen & Ho
1995);
• Seqüência- consenso:
ACGT.
• Os elementos ACGT
isolados não conferem
responsividade direta ao
ABA. A determinação da
resposta depende da
seqüência de nucleotídeos
ao redor do ACGT que
provavelmente interage com
os fatores de transcrição
(Velasco et al. 1998).
Tabela gbox e CE
Shen & Ho (1995)
ABRC x GARC
Box 2
W-box
Shen et al. (2001)
Fatores de transcrição (TF)
• São “trans-acting proteins”;
• Ligam-se a regiões específicas do DNA;
• Reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos;
• Podem ser ativados por fosforilação (MAP quinases).
• Vários TFs podem ser necessários antes do acoplamento
da RNA polimerase (pol II).
• Vários tipos de TFs já foram identificados em plantas.
Buchanan et al. (2001)
• São fatores de transcrição
formados por duas subunidades Leucine zipper
protéicas.
• O aminoácido leucina está
presente numa seqüência
repetitiva e promove a interação
entre as subunidades.
• Contém uma seqüência de
aminoácidos básicos que interage
com o DNA.
• Podem formar-se heterodímeros e
homodímeros com especificidade
Exemplo:
diferente.
VP1
• Reconhecem as G-boxes
responsivas ao ABA.
ABA e stress
• O déficit hídrico
aumenta a produção de
espécies reativas de
oxigênio (NADPH
oxidase).
• A super-expressão de
alguns genes aumenta a
resistência à seca e à
salinidade.
• As LEA-proteínas
conferem tolerância a
dessecação em
sementes, são induzidas
pelo ABA e também
podem ser expressas
em tecidos vegetativos.
Arroz submetido a stress hídrico
Buchanan et al. (2001)
Arroz nãotransformado
Linhagens com expressão
constitutiva do gene HVA1
Engenharia genética
• Aumentar a sensibilidade ao ABA com
deleção do gene ERA1 , que exerce
regulação negativa na sinalização do
ABA (farnesil transferase).
• Reduzir o catabolismo do ABA para
aumentar a tolerância à seca.
– Como?
Schoereder et al. (2001)
Respostas independentes do ABA
Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki (2000)
“Genes de stress” não-responsivos
ao ABA
Fator de transcrição
Buchanan et al. (2001)
Interação com outros sinalizadores
ABA x Etileno
Ação
antagônica
Beaudoin et al. (2000)
ABA x GA
Modelo para células de aleurona
ABI 1
(Proteína fosfatase 2C)
Ação
antagônica
VP1
(LEA proteínas)
(Fator de transcrição)
(Proteína quinase)
Adaptado de Zentela et al. (2002)
ABA x Citocininas
• As citocininas reduzem a sensibilidade
das células-guarda ao ABA (Radin et al.
1982).
• Efeito antagônico do ABA e citocininas
na senescência foliar:
– O ABA acelera,
– As citocininas retardam.
ABA x Açúcares
• Os açúcares não são considerados hormônios, mas
sinalizam o estado nutricional da planta;
• As respostas promovidas pelos açúcares podem ser
sinérgicas ou antagônicas ao ABA;
• Glicose x sacarose, efeito similar ou antagônicos;
• Vários mutantes para sensibilidade aos açúcares
tem sensibilidade ao ABA alterada (gin, sun, sis);
• Genes similares podem responder de modo similar
aos açúcares e de modo diferente ao ABA.
• Os açúcares potencializam a sensibilidade ao ABA
em células-guarda.
Finkelstein & Gibson (2001)
Análogos do ABA
• Estrutura química
Análogos
permanecem
ativos por mais
tempo.
ABA metileno
Adição de um grupo
metil ao carbono 8´
dificulta catabolismo.
www.abscisicacid.com
ABA acetileno
Análogos do ABA (2)
• Aplicação de análogos pode aumentar a
resistência ao stress hídrico. conífera
abóbora
Controle
10-5 Molar
10 dias após o
tratamento
(www.abscisicacid.com)
Controle
sob stress
hídrico
Análogos do ABA (3)
Yamazaki et al. (2003)
Uso de análogos do ABA
Perspectivas:
• Aumentar a produtividade em áreas
marginais, sujeitas a stress hídrico;
• Melhorar o desempenho de cultivos
comerciais;
• Uso como herbicidas.
Rock (2000)
Em síntese:
“O ácido abscísico exerce influência sobre
quase todos os aspectos do crescimento
e do desenvolvimento da planta em
maior ou menor extensão. Sua ação
ocorre através de uma complexa rede
de sinalização celular. A produção e a
ação do ABA é parte de uma rede de
processos interativos que mudam
continuamente em resposta aos sinais
ambientais e endógenos.”
Obrigada !
cADPR (ADP ribose cíclico)
Grill & Himmelbach (1998)
cADPR
Sanches et al. (2004)