Avaliação Farmacológica dos Mecanismos Transducionais em
Músculo Liso de Extrato Padronizado de Própolis Vermelha do Brasil
Mariana Obara Suzuki
Prof. Niraldo Paulino
Área de concentração: Ciências da vida
INTRODUÇÃO
MATERIAIS E MÉTODOS
A própolis, ou cola de abelha, é uma resina
balsâmica de mistura complexa de metabólitos secundários
e tem sido largamente usada em muitos países para o
tratamento de diversas doenças (GHISALBERT et al,
1979). É produzida por abelhas e usada no interior de suas
colméias para selar e protegê-las contra possíveis invasores.
Possui consistência viscosa, odor agradável, apresenta
variação de cor (amarelo-esverdeado ao marrom-escuro) e
sabor amargo. O nome vem do grego “pro”, em defesa de,
e polis, significando cidade (MARCUCCI, 1996).
Para cultivação das células macrófagos 264.7,
adquiridas comercialmente por fornecedor do Rio de
Janeiro, utilizou-se o meio de cultura Eagle modificado
por Dulbecco (DMEM) de alta glicose.
O Óxido Nítrico é uma importante molécula
envolvida na resposta imune além de outros sistemas.
A partir da ativação dos macrófagos e através de uma
endotoxina como o lipopolissacarídeo (LPS), mediadores
do Óxido Nítrico são ativados resultando na ativação
do sistema inflamatório. Através da Reação de Griess,
padronizado por John Peter Griess em 1879, o nitrito
presente na amostra reage em meio ácido com uma
amina aromática, produzindo um sal de diazônio. Este sal
reagirá com a 3-hidroxi-1,2,3,4-tetraidrobenzilquinolina,
uma molécula orgânica, e produzirá a coloração rósea. A
coloração resultante tem intensidade de cor em proporção
direta com a concentração de nitrito na amostra.
Este projeto avaliou as respostas farmacológicas
produzidas por células macrófagos RAW 264.7 tratadas
com extrato padronizado de própolis vermelha do Brasil
e outros compostos, a fim de avaliar e comparar a sua
atividade antiinflamatória, através da dosagem de produtos
da resposta inflamatória.
OBJETIVOS
O objetivo do presente estudo foi avaliar, através
da dosagem de Óxido Nítrico, as respostas farmacológicas
produzidas por células macrófagos RAW 264.7 tratadas
com própolis vermelha do Brasil e outros compostos,
mediante a indução da resposta inflamatória destas células
com lipopolissacarídeo de Escherichia coli.
Foi preparado 1 litro de meio DMEM em pó
gradualmente adicionado e diluído em 900 ml de água
Milli-Q dentro de Erlenmeyer de 1 litro, sob constante
agitação na velocidade média e em temperatura ambiente.
Após a diluição do pó, adicionou-se 3,7g de Bicarbonato de
Sódio, seguido por 0,15 ml de antibióticos (Estreptomicina
e Penicilina) devidamente homogeneizados.
Dentro do fluxo laminar, previamente esterilizado
de acordo com o seu protocolo de utilização, sendo que a
bancada e os materiais a serem utilizados foram expostos
à luz UV por, pelo menos, 15 minutos, acrescentou-se 50
ml de soro fetal bovino. Com a água Milli-Q, o volume foi
completado até 1litro. Um pouco desse meio foi separado
em Becker para avaliação de pH, que deve ser de 7,7. Caso
o pH não seja adequado, o meio deve ser equilibrado com
solução de HCl ou NaOH.
O meio é então filtrado em membrana 0,20
μm e depositado em um meio estéril, o qual deverá ser
identificado, armazenado em geladeira, e manipulado na
temperatura ambiente (estufa ou banho-maria de 37ºC), e
aberto apenas dentro do fluxo laminar esterilizado.
A garrafa mãe, adquirida comercialmente, foi
repicada e cultivada em 8 garrafas estéreis de cultura de 50
ml contendo 10 ml de meio DMEM. O meio de cultura foi
trocado com 10 ml de meio DMEM estéril a cada dois dias
até que se formasse uma camada monolaminar de células
aderidas na parede da garrafa.
No momento em que a camada monolaminar era
formada, um novo repique era feito através de remoção
de células aderidas à parede com uso de scrapers, e a
suspensão de células no meio DMEM estéril, que eram
Aluna do Curso de Biomedicina
Professor do Programa de Mestrado Profissional em Farmácia
--
então divididas em novas garrafas estéreis 50 ml.
Os testes de dosagem de Óxido Nítrico e
Viabilidade das células foram realizados em placas
multipoços, 96 poços. As células foram suspensas em 5
ml de meio DMEM e contadas em câmara de Newbauer
laminada nos quadrantes laterais do campo superior e o
inferior.
Pipetou-se 100 µl de suspensão de células nos
campos superior e inferior da câmara de Newbauer e as
células nos quatro quadrantes laterais foram contadas
(dezesseis quadrados/ quadrante). O total de células
contadas em cada campo foi submetida à fórmula:
nº total de células x 104 x fator de diluição =
Média de células/ ml número de quadrantes contados
Sabe-se que o fator de diluição da quantidade de
ml utilizado para suspensão de células, ou seja, 5 ml, e o
número de quadrantes contados é igual a quatro.
As médias totais de células obtida em cada
campo foram somadas e dividas por dois, obtendo-se a
média total de células/ ml.
Para se obter a quantidade total de células na
suspensão inteira, multiplicou-se a média de células/ ml
pelo volume da suspensão, ou seja, cinco.
Foram utilizadas 2,5x105 células/ poço, o que
equivale a 250x105 ou ainda 2,5x107 células/ placa.
No primeiro dia de teste, 100µl de meio de
cultura com 2,5x105 células foram pipetados em cada poço
e armazenados com tampa em estufa 37ºC, 5%CO2 por 24
horas.
No segundo dia, o meio de cultura das placas foi
desprezado e, a 100µl de meio de cultura estéril, foram
aplicados mais 2µl de LPS (Lipopolissacarídeo de E. coli
diluído em meio DMEM) em cada poço. Os testes foram
realizados em triplicatas. Nas duas placas foram realizados
os testes controles: positivo (células + LPS) e negativo (só
células).
poços, 2µl, 6 µl e 20 µl e com o estoque de 20 mg/ml
foram pipetados 6µl e 20 µl por linha, obtendo então as
respectivas concentrações de 20 µg/ml, 60 µg/ml, 200 µg/
ml, 600 µg/ml e 2000 µg/ml por poço.
As placas foram armazenadas novamente na
estufa a 37ºC, 5% de CO2 por 22 horas.
No terceiro e último dia utilizou-se a mesma
técnica de Dosagem de Óxido Nítrico (reação de Griess) e
Viabilidade das células (MTT) para as duas placas teste.
Foram retirados 100µl do sobrenadante de cada
poço transferindo-os para uma nova placa, respeitando a
mesma ordem de coluna e linha. Nesta nova placa foi feita
a dosagem de óxido nítrico enquanto que a outra que ainda
contém células deverá testar a viabilidade das células.
Foi preparada uma solução de 1 ml de MTT
(5mg/ml) + 9ml de meio DMEM para o teste de uma placa.
Na placa destinada ao teste de viabilidade das células,
adiciou-se 100 µl da solução diluída de MTT. A placa foi
tampada e embrulhada no alumínio para vedá-la da luz e
deixada por 45 minutos na estufa a 37º, 5% CO2.
Depois dos 45 minutos, todo sobrenadante é
desprezado e é adicionado 100 µl de DMSO. A placa é
novamente tampada e vedada com alumínio e deixada
por 1 hora na estufa a 37º, 5% CO2. Após 1 hora, realizar
leitura no espectrofotômetro.
Para a reação de Griess, foi seguido o protocolo
de dosagem de óxido nítrico, utilizando 50 µl de cada
reagente (Griess I e Griess II) em cada poço e realizada
leitura em espectrofotômetro.
Foi feita a Curva Padrão de Nitrito de Sódio
para que esta servisse de parâmetro de comparação dos
resultados obtidos.
Na placa 1, os composto testados foram: Própolis
Vermelha 20%, LX-1, LX-2 e LX-22. As soluções estoques
foram diluídas em DMSO (Dimetil sulfóxido), com exceção
da Própolis vermelha que se encontrava em estado líquido
e foi diluída em PBS (Solução Tampão Fosfato), porém
todas foram preparadas na concentração de 1mg/ml. As
diluições para o teste foram preparadas com a diluição dos
estoques em PBS para obtenção das concentrações 10 µg/
ml e 100 µg/ml por poço. Houve uma diluição em cada
linha da placa e 100 µl pipetados em cada poço.
Na placa 2, o composto testado foi a Própolis
Vermelha 20% com concentrações variadas. Foram feitos
dois estoques com concentrações diferentes: 2 mg/ml e
20 mg/ml. Com o estoque 2 mg/ml foram pipetados nos
--
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
RESULTADOS
Absorbância (550nm)
Curva de calibração nitrito
0 .3
CLERICI, M. T. P. S. Uso da própolis na dermatologia
e produção de cosméticos. Revista da Universidade de
Franca, São Paulo: Associação Cultural e Educacional de
Franca, p. 24, ago., 1999
0 .2
0 .1
0 .0
0
5
10
15
20
25
Concentração de Nitrito (nmol)
Absorbance (550nm)
NO in RAW 264.7
0.4
MARCUCCI, M. C. Biological and therapeutic properties
of chemical propolis constituents. Química Nova. n. 19,
p. 529-336, 1996
0.3
*
0.2
*
0.1
0.0
LPS
6
60
GHISALBERTI, E.L. Propolis; A review. Bee World,
v.60, p.59-84, 1979.
Gold Analisa: O Laboratório Clínico na Avaliação da
Função Renal. Disponível em: <http://www.goldanalisa.
com.br/publicacoes/Funcao_renal.pdf>. Acesso em: 15
dez. 2008.
x
600
Base
Red propolis
Treatment (mg/mL)
MTT in RAW 264.7
120
Cell viability (%)
Chemetrics: Métodos Analíticos. Disponível em: <http://
www.precisionlabs.com.br/dwn/metodologia_kits_
chemetrics.pdf>. Acesso em: 15 dez. 2008.
0 .4
MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth
and survival: application toproliferation and cytotoxicity
assays. J Immunol Methods. 1983 Dec 16;65(1-2):55-63.
PAULINO, N. et al. Bulgarian Propolis Induces Analgesic
and Anti-inflammatory Effects in Mice and Inhibits In
Vitro Contraction of Airway Smooth Muscle. Journal of
Pharmacological Sciences v. 93, p. 307 – 313, 2003.
BANKOVA, Vassya S.; CASTRO Solange L.; MARCUCCI
Maria C. Propolis: recent advances in chemistry and plant
origin. Apidologie v.31, p.3–15, 2000
80
40
0
LPS
6
60
600
Base
Red Propolis
Treatment (mg/mL)
--