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V Mostra de
Pesquisa da PósGraduação
Avaliação da Neurodiferenciação de Células-Tronco
Mesenquimais de Medula Óssea Através da Transcrição de
mRNA.
Daniel Rodrigo Marinowic1,2, Ricardo Zalewsky1, Denise Cantarelli Machado1,2, Jaderson Costa da
Costa1,2 (orientador).
1
Instituto de Pesquisas Biomédicas (IPB), 2 Instituto do Cérebro (InsCer)
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Introdução
As células-tronco mesenquimais constituem uma população de células precursoras
multipotentes que auxiliam na hematopoiese e podem diferenciar-se em vários tipos celulares
como condrócitos, osteócitos, adipócitos e miócitos1. Além desses tipos celulares, tem sido
demonstrado que as células-tronco mesenquimais têm capacidade de diferenciar-se em
neurônios e astrócitos2. Cha e colaboradores (2009)3 submeteram células multipotentes à
cultura sob indução à neurodiferenciação, obtendo após 30 dias, células com características
morfológicas e expressão de proteínas específicas. Essas células multipotentes também in
vivo podem se diferenciar em neurônios e glias4 e apresentam potencial terapêutico para
reparar as lesões do sistema nervoso central3.
O objetivo deste trabalho é estabelecer um protocolo de neurodiferenciação de célulastronco mesenquimais para obtenção de uma linhagem neural avaliando a transcrição de
mRNAs em diferentes períodos da neurodiferenciação.
Metodologia
O sangue de medula óssea foi obtido de um paciente no Hospital São Lucas da
PUCRS após aprovação pelo comitê de ética em pesquisa da PUCRS e assinatura do termo de
consentimento livre e esclarecido. A fração mononuclear foi separada em um gradiente de
densidade gerado por centrifugação sobre histopaque 1,077g/L (Sigma-Aldrich). A fração
mononuclear foi colocada em cultura em meio DMEM (LGC) suplementado com soro fetal
bovino (LGC) e antibióticos. A cultura foi mantida em estufa sob condições de 5% CO2 e
37°C até a obtenção das células-tronco mesenquimais (fase 1). Foi adicionado ao meio βmercaptoetanol e as células foram cultivadas por um período de cinco dias (fase 2). A seguir,
as células foram cultivadas em meio DMEM/F12 (Invitrogen) suplementado com HEPES
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(Sigma-Aldrich) e bicarbonato de sódio (Sigma-Aldrich), por um período de cinco dias (fase
3). Por fim, as células foram então cultivadas em meio neurogênico suplementado com
neurotrofinas por um período final de 5 dias (fase 4). Em cada fase da cultura foi realizada a
extração de RNA utilizando o kit de extração de RNA total (Promega). A síntese de cDNA foi
realizada utilizando o kit SuperScript (Gibco). Para avaliação da transcrição de mRNA foram
utilizados primers específicos de células pluripotentes (SOX2), de células em processo de
neurodiferenciação (ASCL1, NEUROD6 e MAP1), neurônios maduros (NFL e STX1A) e
células gliais (GFAP).
Resultados e Discussão
Todas as fases da cultura de neurodiferenciação apresentaram positividade para o
marcador
de
pluripotência
SOX2,
indicando
que
mesmo
nas
fases
finais
da
neurodiferenciação as células continuam expressando um marcador de célula indiferenciada.
Os transcritos, ASCL1 e MAP1, começaram a ser expressos a partir da fase 2 e mantiveram
sua positividade até a última etapa do processo de neurodiferenciação, esses marcadores estão
associados aos processos de neurodiferenciação, incluindo neurônios maduros5. A expressão
de NEUROD6 foi observada a partir da fase 3 e estava ausente na última fase, corroborando
com os dados descritos na literatura que sugerem que o mesmo é expresso durante o processo
de diferenciação neurogênica sendo negativo em células neurais maduras6. O marcador de
neurônios maduros, NFL estava presente a partir da fase 3 até o final da neurodiferenciação.
O transcrito de STX1A, característico de células neurais maduras e funcionais foi positivo a
partir da fase 2 e manteve-se positivo até o final da diferenciação. A presença de STX1A pode
estar relacionada com a funcionalidade das células neurais, pois a proteína sintetizada a partir
do seu transcrito está envolvida na fusão da vesícula sináptica com a membrana do botão
sináptico7. O transcrito que caracteriza células gliais, GFAP, foi expresso somente na fase
final da neurodiferenciação (fase 4). Na tabela 1 estão apresentados os marcadores e os
períodos da neurodiferenciação em que os mesmos foram expressos.
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Tabela I – Marcadores expressos nas diferentes etapas da neurodiferenciação
FASE 1
FASE 2
FASE 3
FASE 4
SOX2
+
+
+
+
NEUROD6
-
-
+
-
ASCL1
-
+
+
+
MAP1
-
+
+
+
NFL
-
-
+
+
STX1A
-
+
+
+
GFAP
-
-
-
+
Fase 1: DMEM; Fase2: DMEM+suplementação; Fase 3: DMEM/F12+suplementação; Fase 4: Neurobasal+suplemetação.
Conclusão
A avaliação da transcrição de mRNAs de diferentes proteínas específicas do processo
de diferenciação neurogênica e de células neurais maduras, indicam que os meios de
neurodiferenciação e as condições de cultura aqui utilizados podem ser uma nova alternativa
em terapia celular direcionada para as patologias do sistema nervoso central, otimizando os
resultados já obtidos em terapias que empregam células-tronco indiferenciadas em modelos
experimentais.
Referências
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