MÉTODOS LABORATORIAIS
UTILIZANDO ANTICORPOS
1- INTRODUÇÃO
POR QUE UTILIZAR ANTICORPOS?
QUAIS AS CARACTERÍSTICAS BÁSICAS E
FUNDAMENTOS DOS ENSAIOS QUE
UTILIZAM ANTICORPOS?
1- INTRODUÇÃO
1.1- Principais características das Respostas Imunes
Adquiridas:
-Especificidade
-Diversidade
-Memória
-Especialização
-Autolimitação
-Não reatividade ao próprio
1- INTRODUÇÃO
1.1- Principais características das Respostas Imunes
Adquiridas:
-Especificidade – conferida por duas moléculas
principais:
- TCR – presente na membrana de linfócitos;
- Anticorpos – produzidos por linfócitos B,
presentes na membrana de linfócitos B e na forma
secretada, solubilizados em diversos fluidos corporais.
1- INTRODUÇÃO
1.2- Principais isotipos de anticorpos
-IgM
-IgG
-IgA
-IgE
-IgD
1- INTRODUÇÃO
1.2- Principais isotipos de anticorpos:
-IgM
-IgG – encontrado em maior concentração no soro, de
obtenção mais fácil, sofre maturação de afinidade
-IgA
-IgE
-IgD
1- INTRODUÇÃO
1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam
Anticorpos:
-Especificidade: Característica que indica que o teste em
questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo
desejado.
-Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência
de resultados falsos-positivos, MENOR a ocorrência de
reações cruzadas.
- Dependente do tipo de anticorpo e antígeno empregado
no teste, e do sistema de detecção da interação Ag-Ac.
1- INTRODUÇÃO
1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam
Anticorpos:
-Sensibilidade: Característica inerente ao método
estreitamente relacionada com a quantidade mínima de
antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada
-Estreitamente ligada ao sistema de amplificação e
detecção da interação Ag-Ac.
-Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes,
quimioluminescentes.
1- INTRODUÇÃO
1.4- Fatores a serem analisados na escolha do método:
-Sensibilidade;
-Especificidade (confiabilidade de resultados);
-Custo;
-Disponibilidade de material;
-Segurança;
-Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser
detectado e espécie animal a ser analisada;
-Tempo de realização do método.
1- INTRODUÇÃO
1.5 – Aplicações dos métodos:
- Identificação e/ou quantificação de moléculas
específicas em fluidos biológicos;
-Purificação de proteínas;
-Diagnóstico de doenças auto-imunes, infecciosas e
hipersensibilidades;
-Identificação de genes e seus produtos;
-Localização de moléculas específicas em células e
tecidos.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
HISTÓRICO
CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PRINCIPAIS
MÉTODOS LABORATORIAIS QUE EMPREGAM
ANTICORPOS
VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS
de
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.1 - Imunoaglutinação/Imunoprecipitação: Primeiros
testes a serem desenvolvidos:
- Realizados em meio líquido;
- Exigem alta quantidade de Ac/Ag para sua realização
– Baixa Especificidade;
- Não possuem metodologias eficazes para a detecção
da interação Ag/Ac – Baixa Sensibilidade.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.2- Imunodifusão: Interação Ag/Ac realizada em meio
sólido (gél de ágar).
- Diversos tipos:
- Imunodifusão Radial Simples - Ag ou Ac imobilizado no
gel – Migração do Ag ou Ac da solução teste no gel, até
atingir região de concentração equivalente;
- Imunodifusão Dupla e Outcherlony – Ambos Ag e Ac
migram no gel, formação de banda na região de
equivalência.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.2- Imunodifusão: Memória
-Não reatividade ao próprio
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.2- Imunodifusão:
-Vantagens – Método de fácil execução, tempo curto de
realização, baixo custo, não necessita de aparato sofisticado
-Desvantagens – Baixa sensibilidade, especificidade, difícil
preservação do gel, não aplicável a alguns isotipos de
imunoglobulinas.
-- Pouco utilizado atualmente como ferramenta de
imunodiagnóstico. Empregado como controle em produção de
policlonais.
-Não reatividade ao próprio
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.3- Hemoaglutinação – Utiliza hemácias sensibilizadas com
Ags na membrana, que formam complexos de alto peso
molecular quando incubadas com Acs específicos para os
antígenos.
- Permite maior diluição da solução teste que a Imunodifusão.
Forma complexos mais pesados, que precipitam com maior
velocidade e facilidade: Melhoria da detecção da interação
entre Ag-Ac;
- Variações no método: Inibição da Hemoaglutinação.
-Não reatividade ao próprio
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.3- Hemoaglutinação:
-Memória
-Não reatividade ao próprio
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.3- Hemoaglutinação:
- Vantagens: Método simples, de fácil execução, baixo
custo, rápido;
- Desvantagens: Baixa sensibilidade e especificidade,
devido a mal armazenamento das hemácias, pode-se
obter resultados falso-negativos.
-Memória
-Não reatividade ao próprio
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.4- Fixação do Complemento: Variação da técnica de
Hemoaglutinação, onde utiliza-se a capacidade citolíca
do Sistema de Complemento para amplificar a detecção
da interação Ag/Ac.
-Variações da técnica: Inibição da Fixação do
Complemento.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.4- Fixação do Complemento:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.4- Fixação do Complemento:
-Vantagens: Maior sensibilidade do que a
Hemoaglutinação, rápida execução, baixo custo;
-Desvantagens: Devido a problemas na preservação do
Complemento, e na sua estabilidade, problemas de falso
negativos podem ocorrer.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) –
Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de polímero
de carbono, e anticorpo conjugado a uma enzima, a qual,
após agir sobre seu substrato em presença de substância
cromógena, amplificará a detecção da interação Ag/Ac
através da formação de cor;
-Variações da Técnica: ELISA Quimioluminescente, ELISA
Fluorescente, ELISA Radioativo
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.5- ELISA:
Competição
Sanduíche
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.5.1- ELISA Indireto:
ELISA “SANDWICH”
Antígeno a ser dosado
Outros componentes do soro
Anticorpo primário
Anticorpo conjugado
TMB
Enzima Peroxidase
ELISA DE COMPETIÇÃO
Antígeno a ser dosado
Outros componentes do soro
Anticorpo primário
Antígeno biotinilado
TMB
ST-AV- Peroxidase
ELISA DE CAPTURA
Anticorpo anti-IgM
IgM a ser detectada
IgM inespecífica
Antígeno biotinilado
TMB
ST-AV- Peroxidase
ELISA INDIRETA
Antígeno purificado
IgM a ser detectada
Anticorpo conjugado
IgM inespecífica
TMB
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.5.2- Quantificação de Ag/Ac em ELISA:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.5- ELISA:
- Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto
grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo
a médio.
- Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas
variações de pipetagem e tempo de incubação podem
ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não
se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de
competição muito susceptível a erros de manipulação.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: Utilizados
para detecção e localização de antígenos em células e
tecidos e para detecção de anticorpos específicos em
fluidos biológicos.
- Métodos de alta especificidade e alta especificidade
- Utilização de anticorpos conjugados com substâncias
fluorescentes (FITC, FAC) na IFA, e de anticorpos
conjugados com enzimas (Imunohistoquímica).
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:
- Vantagens: Alta especificidade e sensibilidade; possibilidade
de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização,
bem como do tráfico intracelular.
-- Desvantagens: “variação individual” na leitura de
resultados de IFA; alto custo de microscópio de fluorescência;
técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para
Imunohistoquímica nem sempre disponíveis.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.7- Western-Blot: Associação de técnica de Eletroforese em
Gel de SDS-PAGE com técnicas imunológicas
- Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com
peso molecular definido
- Identificação de anticorpos que reconhecem determinado
antígeno em solução contendo diversos antígenos
- Permite a realização de cinética de expressão de proteínas
celulares.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.7- Western-Blot:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.7- Western-Blot:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS
LABORATORIAIS
2.7- Western-Blot:
- Vantagens: alta sensibilidade e especificidade;
reconhecimento de antígenos individuais em um extrato;
realização de perfil de reconhecimento de antígenos e
determinação de proteínas imunodominantes;
- Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo
e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do
sistema de revelação, pode-se ter problemas de
segurança.
3- BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
- Imunologia Celular e Molecular. Abbul K. Abbas & Andrew H. Lichtman.
Quinta Edição, Elsevier Editora
- Imunologia Médica. Abba I. Terr, Daniel P. Sittes & Tristam. Décima Edição.
Guanabara Koogan Editora.
- Imunologia Veterinária. Ian R. Tizard. Quinta Edição. Roca Editora.
- Imunologia. David Male, Ivan Roitt & Jonathan Brostoff. Sexta Edição.
Manole Editora.
- Imunobiologia: O Sistema Imune na Saúde e na Doença. Charles Janeway,
Paul Travers & Mark Walport & J. Donald Capra. Quinta Edição. Artmed
Editora.
-Immunodiagnostics, A Practical Approach. Ray Edwards. Oxford University
Press.
-Antibodies, A Laboratory Manual. Ed Harlow & David Lane. Cold Spring
Harbor Laboratory Press.