Enzimas de
Restrição
Tópicos a abordar
Diferentes tipos de enzimas de restrição (tipo I, II, III)
Enzimas do tipo II e sequências de reconhecimento (4,
6, 8 nts)
Izosquizômeros e enzimas compatíveis
Hidrólises múltiplas
Aplicações em engenharia genética
Mapas de Restrição
Nota Histórica
1970 1978
1950 1956
1940
1953
1966
1972
2006
~1940
Experiências
com bacteriófagos
1972 – Primeiras
experiências
com DNA recombinante
(Berg & Boyer)
~1950
Diferenteseeficácias
de infecções
parte dos
1978 ––Isolamento
caracterização
de mais por
de 200
bacteriófagos.
Variações entre estirpes bacterianas.
enzimas de restrição
1953 Prémio
– Estrutura
do–DNA
(Watson
Crick)e D. Nathans
Nobel
W. Arber,
H. Smith
1956 – Isolamento da DNA polimerase (Kornberg)
1966 – Isolamento da DNA ligase (Weiss & Richardson)
1970 – Purifica-se a primeira enzimainde
restrição tipo II: o
educar.sc.usp.br
Hind II (Smith & Wilcox)
Enzimas de restrição
Proteínas que reconhecem e clivam o DNA em pontos
específicos, geralmente em sequências de 4, 6 e 8
bases - palíndromas
in educar.sc.usp.br
Enzimas de restrição
Enzimas produzidas por bactérias para restringir a proliferação de
vírus invasores
Diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequências de
bases de DNA
Ajuda
a
detectar
a
presença
de
diferentes
formas
determinados genes
in 1fiuA-1crf_-active
de
Nomenclatura
As enzimas de restrição são chamadas de acordo com a
bactéria que a produziu
Exemplo: EcoR I
Ordem de
descoberta
Género
Estirpe
Escherichia
Espécie
coli RY 13
1º enzima a ser
descoberta nesta
bactéria
Sistemas de Restrição - Modificação
Mecanismo de defesa presente quando da entrada de DNA fágico
na célula
Combinação de enzimas de restrição com metilases
 hidrólise do DNA “estranho”
 protecção do DNA celular relativamente as enzimas de
restrição através da adição de grupos metil às bases A ou C
DNA metilase possui a mesma sequência de reconhecimento que
os enzimas de restrição
Existem raras exceções em que a metilação pode provocar a
activação do enzima de restrição
Sequências de reconhecimento
Não ambíguas
 Exemplo:
BamHI - só reconhece a sequência GGATCC
CCTAGG
Ambíguas
 Exemplo:
HInf I - reconhece sequências de 5bp começadas
por GA e que terminem em TC
Tipos de enzimas de restrição
Classificação baseada em:
Composição da sequência nucleotídica
Posição de clivagem
Sequência de reconhecimento
Co-fatores envolvidos
Estrutura da enzima em causa
in Lenhinger Principles of Biochemistry
Tipos de enzimas de restrição
Tipo I
3 subunidades:
 1 subunidade de restrição (“R”)
 1 subunidade de metilação (“M”)
 1 subunidade de reconhecimento (“S”)
Sequência de reconhecimento é assimétrica
Local de hidrólise não é específico e ocorre a mais de 1000 bp de distância
Hidrólise é sempre num local diferente e necessita de ATP
Impede o seu uso em engenheira genética
Tipo III
2 subunidades:
 1 subunidade de restrição (“R”)
 1 subunidade de metilação e reconhecimento (“MS”)
Sequência de reconhecimento é assimétrica (5-7 bp)
Dupla cadeia de DNA hemimetilada
Local de hidrólise a mais de 24-26 bp de distância
Hidrólise é sempre num local diferente e necessita de ATP
Impede o seu uso em engenheira genética
Tipo II
Duas enzimas:
 1 enzima de restrição (Endonuclease)
 1 enzima de metilação (Metilase)
Estrutura com 4 folhas β e 1 hélice α
Sequência de reconhecimento é palindrómica 4-8nts
Hidrólise ocorre dentro ou nas extremidades da sequência
reconhecida
Não necessita de ATP, apenas Mg2+
Importantes na recombinação genética e na elaboração
de mapas de restrição (especificidade de corte)
Izosquizômeros
Diferentes enzimas de restrição que possuem a
mesma sequência de reconhecimento
Diferem nas condições ótimas de reação, na
estabilidade
Exemplo:
Enzimas de
restrição
Sequência de
reconhecimento
SacI
GAGCTC
CTCGAG
SstI
GAGCTC
CTCGAG
Enzimas compatíveis
DNA recombinado com sequência híbrida
Sobreposição parcial de sequências de reconhecimento
Produzem extremidades protuberantes compatíveis
Exemplo:
Enzimas de
restrição
Sequência de
reconhecimento
BamHI
GGATCC
CCTAGG
BglII
AGATCT
TCTAGA
Factores que influenciam a atividade das
enzimas de restrição:
Composição do tampão
 Diferem na força iónica (concentração de sal)
 Diferem no catião principal (Na+ ou K+)
 Solução: Manter o pH da reacção (geralmente em 8.0)
Temperatura de incubação
 A maioria das enzimas cliva melhor a 37ºC
 Excepções: Bactérias termofílicas – clivam melhor entre 50 a 60ºC
Enzimas com tempo de meia vida pequeno a 37ºC, recomenda-se a
incubação a 20ºC
Influência da metilação no DNA
 Existe algumas endonucleases de restrição que não clivam DNA metilado
Digestão com múltiplas enzimas
Hidrólise Enzimática
As endonucleases de restrição do tipo II ligam-se
ao sulco maior da forma b-DNA
Dois tipos de ligação: não específica e específica
 A ligação não específica permite à enzima ‘deslizar’ pela
cadeia ligada apenas ao ‘backbone’ da molécula de DNA
 A ligação específica leva à alteração da dupla hélice de
DNA, para aproximar melhor as bases dos centros
catalíticos
 A metilação de uma base impede a ligação específica e a
formação do complexo
Hidrólise Enzimática
A hidrólise dá-se ao
nível das ligações
fosfodiéster
Mg2+ é um cofator
essencial, mas pode
ser substituído por
certos cátions
divalentes, como Mn2+
Produtos da hidrólise
resultam em
extremidades 3’-OH e
5’-P
5’
3’
5’
3’
Hidrólise Enzimática
A cadeia de DNA pode ser hidrolisada para dar
origem a pontas cegas (“blunt ends”) ou pontas
coesivas (“sticky ends”)
Duas cadeias com pontas cegas podem ser unidas
por uma DNA-ligase, mesmo sendo de origens
diferentes
Uma cadeia com pontas coesivas liga-se com maior
facilidade
a
cadeias
com
sequências
complementares
Hidrólise Enzimática
Extremidade cega (blunt ends)
 Clivam as duas cadeias de DNA em
ligações fosfodiéster opostas
Extremidade coesiva (sticky ends)
 Clivagem assimétrica
DNA
nas cadeias de
 Pequeno número de nucleotídeos em
cadeia simples, capazes de se associar
por ligações de hidrogénio, com outra
cadeia simples em que a sequência de
bases
seja
complementar
desta
(annealing)
Hidrólise Enzimática
A hidrólise enzimática pode ser simples ou múltipla dependendo do
número de enzimas utilizadas na obtenção de fragmentos de DNA
 Hidrólise simples:
 Digestão do DNA com uma única enzima de restrição
 Determinação relativa das orientações dos fragmentos
no DNA linear
 Hidrólise múltipla:
 DNA hidrolisado por mais que uma enzima de restrição
 Determinação das posições dos fragmentos no DNA,
produzidos pelas enzimas, com a ajuda da eletroforese
Aplicações em Engenharia Genética
O termo “engenharia genética” inclui:
 métodos para a formação de combinações novas do material
genético
 introdução e replicação do DNA recombinante numa bactéria para
amplificar o gene
Clonagem de Genes
Análise molecular da estrutura do cromossomo e do genoma
(mapeamento, o grau de metilação)
Caracterização fenotípica (manifestos ou latentes) de defeitos
genéticos hereditários ao nível do DNA (RFLPs)
Relacionamentos filogenéticos pela comparação de locais
selecionados da restrição em genes essenciais.
Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP)
Marcador de DNA
Mutações em 2 alelos específicos de cada individuo em locais
de restrição – polimorfismo:
 sequências diferentes de restrição
 diferentes tamanhos de fragmentos
Muitas doenças humanas prejudiciais ou fatais caem nesta categoria
Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP)
Testes padrões do DNA de
pessoas saudáveis (controlo)
Testes padrões do DNA
das pessoas com doença
Banda igual
Banda igual
Banda comum em
pessoas com doença
Banda comum em
pessoas saudáveis
A existência de RFLPs fornece a base para estabelecer relacionamentos
inequívocos de paternidade
Mapas de Restrição
É uma compilação do número, da ordem e da distância entre
locais do corte do enzima de restrição ao longo de um segmento
clonado do DNA
 As unidades do mapa são expressadas em pares de bases ou
para distâncias mais longas em pares de kilobases
 O DNA encontra-se, geralmente, dentro de um vector bem caracterizado
do plasmídeo ou do bacteriófago, onde a sequência é conhecida
Normalmente, o mapeamento é a primeira etapa para caracterizar
um DNA desconhecido e um pré-requisito a manipulá-lo para
outras finalidades.
Elaboração de Mapas de Restrição
Existem dois métodos para elaborar um mapa de restrição:
 mapeamento utilizando digestões múltiplas
 mapeamento utilizando digestões parciais
Construção de mapas de restrição com hidrólises múltiplas:
 Hidrólise do DNA:
 separadamente com hidrólises simples
 e com pares de enzima
 Aplicar uma electroforese em gel para os fragmentos obtidos
(Permite a separação dos fragmentos gerados de diferentes tamanhos!!!)
Elaboração de Mapas de Restrição
0.8 0.4
0.8 1.2
HindIII SalI
10.0
8.0
5.8
7.0
Modelo I
7.0
6.2
5.8
5.8
5.0
0.8
2.5
5.0
1.2
1.2
1.0
0.5
0.8
0.8
0.4
0.8
HindIII
Modelo II
5.8
SalI
7.0
Mapas de Restrição
Digestão Parcial com marcação radioativa (32P) dos extremos
do DNA
Fragmento de DNA marcado num dos extremos com um radioisótopo
Pode ser parcialmente digerido com enzimas de restrição produzindo
fragmentos marcados de tamanhos diferentes mas que revelam
directamente onde são os locais de clivagem
Digestão parcial surge em condições não ótimas para que ocorram
um número limitado de hidrólises:
 período de incubação pequeno
 incubação a baixas temperaturas
Elaboração de Mapas de Restrição
Enzimas
Nº de fragmentos
Tamanho / kd
XbaI
2
24.0, 24.5
XhoI
2
15.0, 33.5
KpnI
3
1.5, 17.0, 30.0
XbaI + XhoI
3
9.0, 15.0, 24.5
XbaI + KpnI
4
1.5, 6.0, 17.0, 24.0
É linear
Nº de sítios restrições de:
 XbaI – 1
Tamanho do fragmento: 48.5 kd
 XhoI – 1
 KpnI – 2
Elaboração de Mapas de Restrição
XhoI XhoI
9.015.0 24.0
15.09.0
XbaI
24.0, 24.5
XhoI
15.0, 33.5
XbaI + XhoI
9.0, 15.0, 24.5
XbaI
24.5
48.5
Todos os locais de restrição do KpnI caem no fragmento da XbaI 24.5 kb,
uma vez que o fragmento 24.0 kb continua intacto após a digestão dupla do
XbaI-KpnI
A ordem dos fragmentos do KpnI só pode ser determinado pela digestão
parcial
Elaboração de Mapas de Restrição
Enzima
Tamanho / kd
KpnI – digestão parcial
1.5, 17.0, 18.5, 30.0, 31.5, 48.5
XbaI + KpnI
1.5, 6.0, 17.0, 24.0
Os fragmentos 1.5, 17.0 e 30.0kd são produtos da digestão completa
Os fragmentos 18.5 e 31.5kd são produtos da digestão parcial
XhoI
15.0
KpnI
KpnI’s
XbaI
9.0
6.0
1.524.5
17.0
18.5
17.0
1.5 48.5
Elaboração de Mapas de Restrição
EcoRI
BamHI
HindIII
HaeII
12.0
12.0
12.0
6.0
4.0
2.0
EcoRI
+
HaeII
BamHI
+
HaeII
HindIII
+
HaeII
EcoRI
+
HindIII
EcoRI
+
BamHI
BamHI
+
HindIII
5.0
4.0
2.0
1.0
6.0
4.0
1.5
0.5
6.0
2.5
2.0
1.5
6.5
5.5
10.5
1.5
8.0
4.0
BamHI HaeII (0/12.0)
(11.5)
EcoRI
(1.0)
É circular
HaeII
(10.0)
Tamanho: 12.0kd
12.0kd
HindIII
(7.5)
HaeII (6.0)
Elaboração de Mapas de Restrição
Elaboração de Mapas de Restrição
Elaboração de Mapas de Restrição
RAPD: randomly amplified
polymorphic DNA
Size sorted
RAPD: randomly amplified
polymorphic DNA
B
AFLP: amplified fragment
length polymorphism
Digestão do DNA com
2 enzimas
Ligação de
adaptadores nos
finais dos fragmentos
PCR com primers
adaptadores dos
fragmentos
AFLP
VNTR: variable number
tandem repeats
• Regiões não codificadoras
• Muitas cópias de uma mesma
sequência no genoma
• Alta taxa de variação entre indivíduos
no número de cópias
Microssatélites
• VNTRs mais utilizados
• Repetições de 2, 3, ou 4 pares de bases
• Próximo de 100 cópias aleatórias de cada
• Altamente variável
• Muitos loci diferentes de microssatélites (1000s)
em diferentes espécies
Microssatélites
Microssatélites
Bibliografia
 Brown, T.A. (1998) Gene Cloning an introduction 3rd ed., Santley Thorner (Publishers)
ltd, Manchester, UK
 Kulg; Cunnings (1997) Concepts of Genetics 5th ed., Internacional edition, Prentice Hall,
USA
 Watson, James D. (1992) Molecular Biology of the Gene 3rd ed., Benjamin/Lumming,
Harvard University and Cold spring Haba laboratory
 Lewin, Benjamin (1997) Genes VI Oxford University Press, Oxford, New York
 Gerhartz Wolfgang (1990) Enzymes in Industry – Production and Applications VCH,
New York