Pergunta 1
Parte A
Você está estudando um receptor chamado Receptor do Fator de Tamanho ou SF-R em um
eucariota haplóide. Abaixo encontra-se um diagrama esquemático da proteína SF-R:
A fim de ser localizado na membrana plasmática, o SF-R deve primeiro passar por várias
etapas dentro da célula.
a) Desenhe uma configuração do SF-R na forma como ele iria aparecer na vesícula de
transporte (após deixar o RER) e na membrana plasmática abaixo. Não se esqueça de rotular
os domínios apropriados e as terminações N e C da proteína.
8 PONTOS
b) A Partícula de Reconhecimento de Sinal (SRP) direciona o peptídeo nascente SF-R para ...
(circule uma).
Complexo de Golgi
2 PONTOS
Retículo Endoplasmático
Núcleo
Lisossoma
1
Nome ______________________________
Pergunta 1 (cont.)
Parte B
O SF-R foi identificado como um receptor da tirosina-quinase. Quando o ligando SF se liga a
SF-R, uma cascata de transdução de sinal é ativada. A sinalização através de SF-R leva a uma
expressão de proteínas necessária para um tamanho normal de célula. Se a sinalização através
de SF-R sofre ruptura, o tamanho da célula é menor.
Para estudar os domínios da proteína SF-R com mais detalhes, você isola três mutantes SF-R.
Você cultiva cada um dos mutantes na presença de SF e mede duas propriedades: a
localização SF-R e o tamanho da célula.
c) Indique onde cada uma das mutações em SF-R, [(S), (L), (T), (K), descritas abaixo], seria
consistente com os fenótipos observados relacionados para os mutantes no gráfico a seguir.
(S) deleção de domínio de seqüência de sinal apenas
(L) deleção de domínio de ligação a ligando apenas
(T) deleção de domínio transmembrana apenas
(K) deleção de domínio quinase apenas
12 PONTOS
Fenótipos
Linhagem
Localização SF-R
Tamanho da Célula Mutação(ões) Possível(is)
Tipo Selvagem
membrana plasmática
normal
nenhuma
Mutante 1
membrana plasmática
pequeno
L, K
Mutante 2
citoplasma
pequeno
S
Mutante 3
fora da célula / secretado
pequeno
T
2
Pergunta 1, Parte B (cont.)
A figura a seguir representa a cascata de sinalização na célula que leva à expressão de genes
que determinam o tamanho da célula.
d) Se você acidionar uma forma de SF que se liga irreversivelmente a SF-R a células de tipo
selvagem, que efeito isso terá na trajetória de sinalização abaixo do SF-R?
(Circule uma das seguintes alternativas).
3 PONTOS
Nenhum Efeito
Sempre Ativa
Sempre Inativa
e) Você isola DNA de outra linhagem mutante e determina a seqüência de seu gene SF-R.
Você descobre que há mutações que mudam os dois aminoácidos tirosina (Y) no domínio
plasmático para alanina (você pode assumir que essas mutações não afetam a dobra ou a
localização do SF-R). Que efeito isso terá na trajetória de sinalização abaixo do SF-R?
Nenhum Efeito
Sempre Ativa
Sempre Inativa
3
Nome ___________________________
Pergunta 2
Interessado em descobrir por que os Red Sox apresentam uma performance tão insatisfatória,
você analisa amostras de sangue de jogadores atuais do Red Sox. Você descobre uma proteína
única, à qual dá o nome de “YysSk”, encontrada apenas nos jogadores do Red Sox, que pode
explicar sua performance decepcionante. A caracterização completa dessa proteína iria exigir
a retirada de litros de sangue dos jogadores (o que dificilmente iria melhorar sua
performance), então você decide expressar a proteína YysSk nas bactérias.
Você faz a triagem de uma biblioteca de cDNA e identifica um clone positivo ao qual dá o
nome de pYS. Você conhece a seqüência do plasmídeo de DNA adjacente ao inserto de
cDNA (mostrado abaixo).
A fim de determinar a seqüência desse inserto, você usa os seguintes primers.
Primer 1: 5’ TCAGTC 3’
Primer 2: 5’ CGGCGC 3’
a) Qual dos seguintes itens seria uma seqüência válida para o filamento superior de seu
inserto de cDNA, conforme determinado nos géis seqüenciadores acima? Circule um.
4 PONTOS
4
Pergunta 2 (cont.)
Agora, você deseja expressar essa proteína em bactérias. O clone cDNA, pYS, que você
isolou é apresentado abaixo. Esse plasmídeo atua como um promotor bacteriano, então você
planeja clonar o gene YysSk em pUC19, que possui um promotor bacteriano em si (ver
abaixo).
Você digere pYS e pUC19 com Bg1II, executa as reações em gel de agarose juntamente com
os plasmídeos não-digeridos (não-cortados). Depois de fazer a coloração para DNA, você vê a
imagem abaixo.
b) Quais fragmentos você purificaria para misturar para ligação? Circule os fragmentos
corretos no gel acima.
4 PONTOS
c) Você transforma células com sua mistura de ligação. O que você deve acrescentar ao meio
em placa de Petri para isolar somente bactérias que tomaram um plasmídeo?
3 PONTOS
AMPICILINA
5
Nome _________________________________
Pergunta 2 (cont.)
Você pega três colônias (X, Y e Z), isola o DNA de seu plasmídeo e realiza uma análise de
restrição. O gel tingido é apresentado abaixo.
d) Indique o plasmídeo contido em cada colônia. Escolha entre os plasmídeos mostrados ao
fim desta página (p1, p2 ou p3).
5 PONTOS
Colônia X contém
p1
Colônia Y contém
p3
Colônia Z contém
p2
e) Qual dos plasmídeos abaixo você conseguiu encontrar por “clonagem por hibridização”
usando o DNA YksSk como sonda?
2 PONTOS
p1 e p3
f) Qual plasmídeo você usaria para purificar a proteína YksSk?
3 PONTOS
p3
6
Pergunta 2 (cont.)
Para fins de purificação de proteína, você gostaria de adicionar quatro histidinas à terminação
N de YksSk, já que essas histidinas se ligam fortemente ao níquel, permitindo a você separar
YksSk de proteínas bacterianas.
g) Dadas as seguintes terminações de código no gene YksSk, quais dois primers PCR você
escolheria para amplificar o gene YksSk e adicionar quatro histidinas na terminação N de
YksSk? (Obs.: O códon para histidina é CAU).
Gene YksSk
5’ ATG CGG ATA CGT …..… CGG CTT CCC TAA 3’
3’ TAC GCC TAT GCA …..… GCC GAA GGG ATT 5’
6 PONTOS
Circule um primer de cada coluna para amplificação PCR.
h) Você escolhe seus primers e os adiciona a seu tubo PCR, assim como um modelo de DNA
YksSk e polimerase Taq. Você programa sua máquina de PCR para realizar 30 seqüências de
amplificação. Após executar sua reação em gel de agarose e tingir o gel para DNA, você vê...
nada! Seu parceiro de laboratório, que viu você fazer tudo isso, dá uma risadinha e aponta seu
grande erro. Qual foi ele?
3 pontos
Você se esqueceu de adicionar nucleotídeos.
7
Nome __________________________________
Pergunta 3
O gene lacZ codifica a enzima β-galactosidase, que metaboliza a lactose em E. coli. O óperon
lac em E. coli é transcricionalmente regulado pela proteína repressora Lac I, cuja ação é
inibida pela ligação da lactose. A região cromossômica do óperon é mostrada abaixo.
PI
lacI
PIAC
O
lacZ
é o promotor para o gene lacI
codifica a proteína repressora
é a seqüência promotora para lacZ
é a seqüência operadora
codifica β-galactosidase, a enzima que quebra a lactose
Os mutantes a seguir são feitos e examinados por seus níveis de β-galactosidase na presença e
ausência de lactose.
“+”
“-““OC”
significa tipo selvagem
significa uma mutação que reduz a função
significa um operador que confere expressão constitutiva de lacZ
a) Indique o nível de β-galactosidase para cada genótipo, usando os termos ALTO ou
BAIXO.
6 PONTOS
genótipo
I+ Plac+ O+ Z+
I- Plac+ O+ Z+
I+ Plac+ Oc Z+
I+ Plac- O+ Z+
- lactose
baixo
alto
alto
baixo
+ lactose
alto
alto
alto
baixo
b) Preencha a tabela para os seguintes diplóides baterianos.
8 pontos
Plasmídeo F’
Cromossomo
I+ Plac+ O+ Z+
I+ Plac+ O+ Z+
I+ Plac+ O+ Z+
I+ Plac+ O+ Z+
I+ Plac+ O+ Z+
I+ Plac+ O+ Z+
I+ Plac+ O+ Z+
I+ Plac+ O+ Z+
I+ Plac+ O+ Z+
I+ Plac+ O+ Z+
1.
2.
3.
4.
5.
- lactose
+ lactose
baixo
alto
alto
alto
baixo
alto
baixo
baixo
baixo
alto
c) Circule os componentes na lista abaixo que atuam APENAS em cis.
lacI
Plac
O
lacZ
8
Pergunta 4
O gráfico a seguir ilustra uma ação potencial medida em um único ponto ao longo de um
axônio. Quatro pontos são realçados ao longo da curva, ã, ~, ♥, ö.
a) Na tabela abaixo, identifique qual íon (Na+, K+, Ca++, Cl-) está passando pelo maior fluxo
líquido através da membrana nos pontos indicados e afirme a direção em que o íon está se
movendo (para o interior ou exterior da célula).
6 pontos
Ponto
~
♥
Íon
Na+
Direção (dentro/fora)
dentro
K+
fora
b) O potencial de membrana é de 70 mV nos pontos ã e ö no gráfico acima. Qual dos
canais iônicos ativados por voltagem é fechado no ponto ã, mas aberto no ponto ö?
3 pontos
canal k+ ativado por voltagem
c) O que determina o fechamento do canal ativado por voltagem que é aberto no ponto ~?
3 pontos
TEMPO
d) Há pelo menos três estados em que existem canais Na+ dependentes de voltagem. No ponto
♥ do gráfico acima, a maioria dos canais Na+ dependentes de voltagem estaria em que
estado? Circule a melhor resposta.
3 pontos
Aberto
Fechado
Inativado
9
Nome _________________________
Pergunta 4 (cont.)
Dois neurônios pré-sinápticos diferentes, neurônio 1 e neurônio 2, fazem sinapse para a célula
W, conforme mostrado abaixo. Quando o neurônio 1 é estimulado, a membrana da célula W é
localmente despolarizada. Quando o neurônio 2 é estimulado, a membrana da célula W é
localmente despolarizada exatamente na mesma extensão que a observada com o neurônio 1.
e) Circule a única afirmação verdadeira abaixo.
3 pontos
•
Se a estimulação é igual, o neurônio 1 apresenta mais probabilidade de resultar em uma
ação potencial na célula W que o neurônio 2.
•
Se a estimulação é igual, o neurônio 2 apresenta mais probabilidade de resultar em uma
ação potencial na célula W que o neurônio 1.
•
Se a estimulação é igual, o neurônio 1 e o neurônio 2 apresentam a mesma probabilidade
de resultar em uma ação potencial na célula W.
f) Se você fosse exposto a uma toxina que bloqueasse de forma irreversível os canais de Ca++
ativados por voltagem, indique se as afirmações a seguir seriam VERDADEIRAS ou
FALSAS.
6 pontos
V
F
A sinapsina amarra as vesículas secretórias.
V
F
Seus músculos terminam em uma contração rígida.
V
F
As vesículas secretórias preenchidas com neurotransmissores iriam se fundir
com a membrana plasmática.
10
11