UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MATO GROSSO DO SUL
UNIDADE UNIVERSITÁRIA DE AQUIDAUANA
PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
COMPATIBILIDADE ENTRE A INOCULAÇÃO DE
Rhizobium tropici E A APLICAÇÃO DE FUNGICIDAS,
COBALTO E MOLIBDÊNIO EM SEMENTES DE
FEIJOEIRO
Maurício Rocha Kintschev
Aquidauana – MS
Abril/2013
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MATO GROSSO DO SUL
UNIDADE UNIVERSITÁRIA DE AQUIDAUANA
PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
COMPATIBILIDADE ENTRE A INOCULAÇÃO DE
Rhizobium tropici E A APLICAÇÃO DE FUNGICIDAS,
COBALTO E MOLIBDÊNIO EM SEMENTES DE
FEIJOEIRO
Acadêmico: Maurício Rocha Kintschev
Orientador: Dr. Fábio Martins Mercante
“Dissertação apresentada ao programa de
pós-graduação em Agronomia, área de
concentração em Produção Vegetal da
Universidade Estadual de Mato Grosso do
Sul, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Agronomia
(Produção Vegetal)”.
Aquidauana – MS
Abril/2013
K64c Kintschev, Maurício Rocha
Compatibilidade entre a inoculação de Rhizobium tropici e a
aplicação de fungicidas, cobaldo e molibdênio em sementes de
feijoeiro/Maurício Rocha Kintschev. Aquidauana, MS: UEMS,
2013.
62p.; 30cm.
Dissertação (Mestrado) – Agronomia – Universidade
Estadual do Mato Grosso do Sul, 2013.
Orientador: Prof. Dr. Fábio Martins Mercante.
1.Fixação biológica de nitrogênio 2. Princípio ativo 3.
Micronutrientes I. Título.
CDD 20.ed. 631.8
EPÍGRAFE
“Entrega o teu caminho ao senhor, confie nele, e ele tudo fará.”
Salmos 37:5
DEDICATÓRIA
Dedico
Aos meus pais, Aparecida Shirley Rocha Kintschev e
Mauro Kintschev, pela educação, apoio, incentivo e
amor incondicional durante toda minha vida.
À minha Irmã, Marília Rocha Kintschev, pelo
carinho.
À minha namorada Danieli Nogueira da Silva, pelo
amor, companheirismo e incentivo durante este ano.
Aos meus avôs José de Souza Rocha e João Kintschev
Filho, pelo exemplo de vida.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul – UEMS, pela oportunidade da
realização do curso de graduação e pós-graduação em Agronomia.
À Fundação de Desenvolvimento de Ensino, Ciência e Tecnologia do Estado de
Mato Grosso do Sul – FUNDECT, pela concessão da bolsa de estudos.
Ao Prof. Dr. Fábio Martins Mercante, pela amizade, paciência, conselhos,
sugestões bibliográficas, conhecimento compartilhado e dedicação na orientação deste
trabalho.
À Embrapa Agropecuária Oeste – CPAO, por disponibilizar todo o apoio
necessário para a condução dos experimentos, e, em especial, à equipe do Laboratório
de Microbiologia do Solo, pelo auxílio na realização das análises.
Ao Gabriel José Carneiro por todo apoio.
A todos os professores e funcionários do curso de pós-graduação em Agronomia
da UEMS, pela oportunidade de convívio e pelos ensinamentos.
Aos colegas do curso de Mestrado, por todo apoio, auxílio, amizade e
companheirismo durante esta jornada.
À Thays Nogueira da Silva e família, por todo apoio, auxílio e companheirismo
durante esta jornada.
A todos os meus amigos, simplesmente por existirem.
A todos aqueles que, de forma direta e indireta, contribuíram para a realização
deste trabalho.
SUMÁRIO
PÁG
RESUMO .....................................................................................................................ix
CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS
1 Introdução. ................................................................................................................. 1
2 Objetivo Geral. ........................................................................................................... 3
2 Objetivos Específicos. ................................................................................................ 3
4 Revisão de literatura ................................................................................................... 4
4.1 A cultura do feijoeiro no Brasil ................................................................................ 4
4.2 Fixação biológica de nitrogênio em feijoeiro............................................................ 5
4.2.1 Fatores limitantes (bióticos e abióticos). ............................................................... 8
4.3 Tratamento de sementes de feijoeiro com fungicidas. ............................................ 11
5 Referências. .............................................................................................................. 13
CAPÍTULO 2 - COMPATIBILIDADE ENTRE A INOCULAÇÃO DE Rhizobium
tropici E FUNGICIDAS APLICADOS EM SEMENTES DE FEIJOEIRO-COMUM
Resumo ........................................................................................................................ix
1 Introdução. ............................................................................................................... 24
2 Material e Métodos. .................................................................................................. 26
3 Resultados e Discussão. ............................................................................................ 30
4 Conclusões ............................................................................................................... 41
5 Referências ............................................................................................................... 42
CAPÍTULO
3
-
APLICAÇÃO
DE
MICRONUTRIENTES
COBALTO
E
MOLIBDÊNIO EM SEMENTES DE FEIJOEIRO E SEUS EFEITOS NA
SOBREVIVÊNCIA DE RIZÓBIOS E NA NODULAÇÃO DAS PLANTAS
Resumo ........................................................................................................................ix
1 Introdução. ............................................................................................................... 49
2 Material e Métodos. .................................................................................................. 51
3 Resultados e Discussão. ............................................................................................ 53
4 Conclusões ............................................................................................................... 59
5 Referências ............................................................................................................... 59
RESUMO
O presente trabalho está focado no estudo da compatibilidade entre a inoculação de
Rhizobium tropici e a aplicação de fungicidas, cobalto e molibdênio em sementes de
feijoeiro. Frente a isto, foram realizados experimentos em laboratório, sob condições de
casa de vegetação e no campo experimental da Embrapa Agropecuária Oeste, em
Dourados, MS, em um Latossolo Vermelho distroférrico típico. Em dois ensaios
conduzidos em substrato esterilizado, sob condições de casa de vegetação, e um ensaio
no campo experimental, foram avaliados os efeitos do tratamento de sementes de
feijoeiro com diferentes fungicidas na sobrevivência de estirpes de R. tropici (SEMIA
4077 + SEMIA 4080), na nodulação (número e matéria seca de nódulos), matéria seca e
teores de nitrogênio total da parte aérea, e na produtividade da cultura. Os resultados
demonstraram que a sobrevivência das estirpes de R. tropici inoculadas nas sementes de
feijoeiro foi afetada pela aplicação dos fungicidas. A sobrevivência dos rizóbios foi
avaliada, utilizando-se dois métodos baseados no número mais provável-NMP: (1)
Diluição e contagem direta em placas (método de espalhamento) e (2) Diluição e
infecção em plantas (processo indireto). Em outro ensaio conduzido sob condições de
casa de vegetação, utilizando substrato esterilizado, avaliou-se o efeito da aplicação de
micronutrientes (cobalto e molibdênio) em semente de feijoeiro e seus efeitos sobre a
sobrevivência dos rizóbios, nodulação (número e matéria seca de nódulos), matéria seca
da parte aérea e teores de nitrogênio total da parte aérea. Os resultados demonstraram
que a sobrevivência das estirpes de rizóbios inoculados foi prejudicada pela aplicação
dos fungicidas e pela adição de Co e Mo nas sementes de feijoeiro. Nas duas frentes de
estudo, houve redução significativa na nodulação das plantas de feijoeiro.
Palavras-Chave: fixação biológica de nitrogênio, princípio ativo, micronutrientes.
1
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1 Introdução
A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) fornece um dos alimentos
básicos da população brasileira, constituindo-se numa das principais fontes de proteína
na dieta alimentar dos estratos sociais economicamente menos favorecidos (BORÉM &
CARNEIRO, 2006). O feijão está presente na maioria dos sistemas de produção no
Brasil, sendo utilizado por diversas categorias de agricultores, desde a agricultura de
subsistência, com escasso ou sem nenhum uso de tecnologia, até o grande empresário
agrícola, com utilização da mais moderna tecnologia de produção (MELO et al., 2007).
Considerando que o nitrogênio é um dos nutrientes requeridos em maiores
quantidades pelo feijoeiro e os solos tropicais são, em geral, pobres neste nutriente, o
seu suprimento adequado torna-se de fundamental importância para a obtenção de
maiores rendimentos nesta cultura (MALAVOLTA, 1989). Neste contexto, a fixação
biológica de nitrogênio (FBN) representa uma alternativa viável, que pode substituir,
total ou parcialmente, a adubação nitrogenada, resultando em benefícios para a
produtividade da cultura (BELLAVER & FAGUNDES, 2009). Tem sido verificado que
o fornecimento de nitrogênio através do processo de FBN pode aumentar
consideravelmente a produtividade média nacional de feijoeiro, sem o uso de adubos
nitrogenados, alcançando patamares de produtividade acima de 2.500 kg ha -1
(HUNGRIA et al., 2000; PELEGRIN et al., 2009). Além disso, a FBN influencia
positivamente a qualidade do solo, por evitar todos os problemas relacionados à
poluição causada pelos adubos nitrogenados (HUNGRIA et al., 1997).
Contudo, diversos fatores podem afetar a associação simbiótica rizóbiofeijoeiro, como a acidez do solo, pH baixo, concentrações elevadas de Al tóxico e
temperaturas elevadas (MARTÍNEZ-ROMERO et al., 1991; MERCANTE, 1993). Do
mesmo modo, a aplicação de fungicidas e de micronutrientes (cobalto e molibdênio)
diretamente nas sementes junto ao inoculante pode afetar drasticamente a sobrevivência
das bactérias fixadoras de N2, a nodulação das plantas, a eficiência simbiótica e,
consequentemente, os rendimentos de grãos da cultura (EMBRAPA, 2010).
O tratamento de sementes com fungicidas é uma técnica para evitar a
incidência de doenças que afetam o feijoeiro, sendo uma das medidas mais simples, de
custo relativamente baixo e que pode resultar em reflexos altamente positivos para o
2
aumento da produtividade da cultura (SARTORATO & RAVA, 1994; BARROS, et al.,
2001). Porém, para que a utilização dos fungicidas quando aplicados nas sementes de
feijoeiro junto com o inoculante seja eficiente faz-se necessária a compatibilização
destas práticas, uma vez que muito destes produtos são prejudiciais a sobrevivência do
rizóbio, a nodulação e a FBN (MERCANTE et al., 1992). Segundo De-Polli et al.
(1986), de modo geral, os fungicidas são os produtos que mais frequentemente
apresentam problemas de compatibilidade com a inoculação com bactérias fixadoras de
nitrogênio, seguidos dos herbicidas e inseticidas. Resultados experimentais obtidos por
Araújo & Araújo (2006) demonstraram que a sobrevivência do rizóbio inoculado nas
sementes de feijoeiro foi prejudicada pela aplicação de fungicidas e, consequentemente,
a nodulação foi reduzida. O mesmo foi constatado por Ramos & Ribeiro Jr. (1993), que
observaram, 24 horas após a inoculação do rizóbio nas sementes de feijoeiro, efeitos
deletérios de todos os fungicidas avaliados sobre a sobrevivência do rizóbio, em
comparação com o controle sem fungicida.
Do mesmo modo, os micronutrientes Cobalto (Co) e Molibdênio (Mo) têm
importante papel no processo de FBN.
O molibdênio é um dos componentes da
nitrogenase, que é a enzima capaz de reduzir o N2 para amônia, e o cobalto é um dos
constituintes da coenzima cobamida, catalizadora das reações bioquímicas de
Rhizobium e Bradyrhizobium (CAMPO & LANTMANN, 1998). O cobalto também
influencia a absorção de nitrogênio por via biológica porque faz parte da estrutura das
vitaminas B12, necessárias à síntese de leghemoglobina, que determina a atividade dos
nódulos (MENGEL & KIRKBY, 2001). No entanto, vários problemas têm sido
detectados com a aplicação diretamente nas sementes de produtos contendo Co e Mo
junto com o inoculante, devido a formulações salinas ou com pH baixo, afetando
drasticamente a sobrevivência da bactéria, a nodulação e a eficiência do processo de
FBN (MERCANTE et al., 2011; HUNGRIA et al., 2007).
Com a utilização de inoculantes microbianos juntamente com a adoção do
tratamento de sementes de feijoeiro com fungicidas e a aplicação de Co e Mo, torna-se
indispensável à avaliação da compatibilidade destas práticas, de modo a garantir os
patamares mais elevados de FBN, sanidade das sementes e produtividade mais elevada
do feijoeiro.
3
2 Objetivo Geral
Os estudos visam otimizar a FBN na cultura do feijoeiro, através da
compatibilidade da inoculação com a aplicação de fungicidas, cobalto e molibdênio nas
sementes, com o objetivo de reduzir os custos de produção e o impacto dos fertilizantes
nitrogenados ao meio ambiente.
3 Objetivos Específicos
1- Avaliar a compatibilidade entre a inoculação de Rhizobium tropici e os
fungicidas recomendados para o tratamento de sementes, seus efeitos na sobrevivência
das bactérias fixadoras de N2, na nodulação das plantas e na produtividade de feijoeiro.
2- Avaliar o efeito da aplicação dos micronutrientes cobalto e molibdênio em
sementes de feijoeiro sobre a sobrevivência dos rizóbios, nodulação e fixação biológica
do nitrogênio na cultura do feijoeiro.
4
4 Revisão de literatura
4.1 A cultura do feijoeiro no Brasil
A cultura do feijoeiro é originária das Américas, com centros de origem e
domesticação na Mesoamérica (México-Guatemala) e na zona Leste dos Andes. Seu
cultivo foi traçado há mais de 7000 anos entre os nativos do Peru, sugerindo seleção da
espécie para agricultura (GEPTS, 1988, 1990; DEBOUCHE & THOME, 1989). No
entanto, as formas silvestres, sejam da América do Sul ou do México, apresentam alta
compatibilidade com as variedades modernas de Phaseolus vulgaris L. (VIEIRA, 1983).
O gênero Phaseolus contém mais de uma centena de espécies, mas apenas P.
vulgaris L., P. coccineus L., P. acutifolius Gray var. latifolius freeman e P. lunatus var.
lunatus são cultivadas comercialmente (ZIMMERMANN & TEIXEIRA, 1988). Hoje, o
feijoeiro comum, P. vulgaris L., é a espécie de maior importância econômica,
contribuindo com cerca de 95% da produção mundial de Phaseolus (MARIOT, 1989).
O feijão (P. vulgaris L.) é a leguminosa mais importante para o consumo humano,
principalmente nos países em desenvolvimento (FAGERIA, 2002). É cultivado
principalmente em climas tropical e subtropical. Em escala mundial, a maior produção
está nas Américas do Sul e Central, no Caribe, na Ásia e na África (FAGERIA, 1989).
O Brasil é o maior produtor e consumidor mundial de feijão (P. vulgaris L.),
com uma produção total estimada em 2,97 milhões de toneladas para a safra 2011/12
(CONAB, 2012). O brasileiro consome em média 16,5 quilos de feijão ao ano (MAPA,
2012). Portanto, esta leguminosa é uma das culturas de elevada relevância
socioeconômica para o Brasil, sendo cultivada em praticamente todos os Estados
brasileiros, com maior ou menor expressão de área colhida e com os mais variados
níveis tecnológicos e sistemas de produção (BORÉM & CARNEIRO, 2006). Por
conseguinte, os principais Estados produtores de feijão comum são Paraná, Minas
Gerais, São Paulo, Goiás e Bahia, os quais respondem por mais de 65% da produção
nacional (RICHETTI et al., 2011).
Segundo a Conab (2012), o total de área cultivada com feijão no Brasil na safra
2011/12 deve ficar em 3,4 milhões de hectares, e a produtividade média da safra
nacional está projetada em 873 kg/ha.
O feijoeiro é cultivado em três épocas, a primeira, conhecida como safra das
águas, é assim chamada porque o plantio e a colheita são beneficiados pelo alto índice
5
de chuvas, e o plantio na região Centro-Sul vai de agosto a dezembro e no Nordeste, de
outubro a fevereiro; a segunda safra é chamada de safra da seca, feita no período com o
menor índice de chuva no país e o plantio acontece de dezembro a março; já a terceira,
denominada safra irrigada, é assim conhecida por se referir à colheita do feijão irrigado,
que têm a concentração do plantio na região Centro-Sul, de abril a junho (MAPA,
2012).
Entre as tecnologias empregadas na cultura do feijoeiro a aplicação de produtos
vias sementes ou foliar tem se tornado uma prática agrícola rotineira, destacando-se o
uso de fungicidas, inseticidas, antibióticos, micronutrientes, dentre outros. Muito
embora, as finalidades destes produtos sejam as mais diversas, de modo geral, os
objetivos são de proporcionar algum nível de melhoria na cultura, tanto em relação à
produção, como no desenvolvimento vegetativo das plantas (DELAVALE et al., 1999).
O feijoeiro apresenta características que o fazem um material de alta qualidade
nos estudos de controle do desenvolvimento vegetal e da absorção de nutrientes. Devido
a sua relevância, têm sido realizados numerosos estudos visando seus aspectos culturais,
melhoramento genético, tratamento com defensivos e outros.
4.2 Fixação biológica de nitrogênio em feijoeiro
O feijoeiro, assim como outras leguminosas, apresenta a vantagem de poder
beneficiar-se da associação com bactérias do gênero Rhizobium, sendo capaz de formar
uma estrutura especializada (nódulo) nas raízes, onde as bactérias captam o nitrogênio
atmosférico (N2), que também ocupa os espaços porosos do solo e que, após a sua
redução em amônia (NH3), intermediado pela enzima dinitrogenase, poderá então ser
utilizado pela planta (MERCANTE et al., 1992). Em troca, a planta fornece à bactéria
energia obtida através da fotossíntese. Assim, forma-se uma perfeita associação, sendo
planta e bactéria mutuamente favorecidas.
As bactérias diazotróficas capazes de se associarem simbioticamente com
plantas da família Leguminosae são chamadas, popularmente, de “rizóbios”.
Inicialmente, os rizóbios foram classificados em uma única família, a Rhizobiaceae.
Posteriormente, os rizóbios foram subdivididos nas famílias Rhizobiaceae (gêneros
Rhizobium,
Sinorhizobium),
Mesorhizobium],
Phillobacteriaceae
Bradyrhizobiaceae
[Allorhizobium
(Bradyrhizobium)
e
(=Rhizobium),
Hiphomicrobiaceae
(Azorhizobium), todos na ordem Rhizobiales que, por sua vez, pertence à classe alfa(α)-
6
Proteobacteria, com mais de 50 espécies descritas (GARRITY & HOLT, 2001;
WILLEMS, 2006). Posteriormente, outras α-proteobactérias pertencentes a gêneros
nunca descritos anteriormente foram isoladas de nódulos de leguminosas, incluindo
estirpes dos gêneros Methylobacterium, Devosia, Ochrobactrum e Phyllobacterium
(MENNA et al., 2006; RIBEIRO et al., 2009; WILLEMS, 2006). Quanto às bactérias
pertencentes à espécie Blastobacter denitrificans, foi sugerida a sua reclassificação
como Bradyrhizobium denitrificans. Finalmente, outra descoberta surgiu com a
descrição de membros da classe beta(β)-Proteobacteria, que também poderiam nodular
e fixar N2 com leguminosas, e essas bactérias passaram a ser conhecidas como “βrizóbios”. Dentre essas bactérias estão estirpes dos gêneros Burkholderia e Cupriavidus
(neste último caso, previamente classificados nos gêneros Ralstonia e Wautersia)
(MOULIN et al., 2001; WILLEMS, 2006).
Logo, a taxonomia do rizóbio de feijoeiro apresentou uma grande evolução nos
últimos anos, sendo que atualmente pelo menos seis espécies distintas são reconhecidas
como simbiontes desta planta, Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli (JORDAN,
1984); R. tropici (MARTÍNEZ-ROMERO et al., 1991); R. etli (SEGOVIA et al., 1993);
R. gallicum, R. giardinii e R. leucaenae.
Com o estudo de isolados de bactérias fixadoras de N 2 e o avanço nas técnicas
de biologia molecular, em um curto período de tempo foi constatado que as bactérias
que nodulavam o feijoeiro apresentavam, claramente, características fisiológicas e
genéticas distintas (HUNGRIA et al., 1997). A partir de 1985, foi publicada uma série
de estudos sobre simbiontes de feijoeiro isolados nas Américas, incluindo os
provenientes das regiões do Cerrado brasileiro, resultando na descrição da espécie
Rhizobium tropici (MARTÍNEZ-ROMERO et al., 1991). Todavia, estirpes desta espécie
são capazes de nodular o feijoeiro, a leucena e diversas outras leguminosas,
apresentando maior estabilidade nas suas características culturais e de nodulação após
prolongados períodos de estocagem, além de demonstrarem boa adaptação a solos
ácidos e maior tolerância a temperaturas elevadas (STRALIOTTO et al., 2002).
Segundo Mercante & Franco (2000), a associação simbiótica entre estirpes de
rizóbio e espécies de leguminosas, como o feijoeiro, resulta de um processo complexo,
que envolve a expressão de genes simbióticos de ambos os parceiros, para então formar
estruturas altamente especializadas, os nódulos radiculares. Nos estádios iniciais de
formação dos nódulos radiculares, a espécie hospedeira libera sinais na sua rizosfera,
como compostos fenólicos (exsudatos), e outras substâncias liberadas pelas sementes
7
e/ou raízes das plantas, que são percebidos pela bactéria, desencadeando a expressão
coordenada de uma série de genes da nodulação (MARTÍNEZ et al., 1990;
MERCANTE et al., 2002).
Entretanto, o tipo de nódulo, sua ontogenia, morfologia, anatomia e tipo de
desenvolvimento é característico de cada hospedeira, como pode ser observada, a
espécie R. tropici forma nódulos arredondados em feijoeiro e alongados, na forma de
dedos, em leucena (Leucaena leucocephala) (STRALIOTTO et al., 2002). Ainda para
este mesmo autor, no interior destes nódulos, localiza-se o sítio de atividade da
nitrogenase, que utiliza os produtos da fotossíntese da planta hospedeira como fonte de
energia; sua coloração interna rósea indica que o processo de fixação biológica está
ocorrendo plenamente, devendo-se tal coloração à presença de um composto chamado
de leghemoglobina, responsável pelo transporte do oxigênio necessário para a atividade
respiratória do rizóbio.
Entre os fatores mais limitantes da produtividade da cultura do feijoeiro,
destaca-se a baixa fertilidade dos solos tropicais, que limitam a nutrição das plantas
(SUHET et al., 1986; ARAUJO, 1994). Considerando que o nitrogênio é um dos
nutrientes requeridos em maiores quantidades pelo feijoeiro, propiciando bom
desenvolvimento e maior produtividade de grãos, e os solos tropicais são, em geral,
pobres neste nutriente, o seu suprimento adequado torna-se de fundamental importância
para a obtenção de maiores rendimentos nesta cultura.
As principais fontes de fornecimento de N à cultura são os fertilizantes
nitrogenados e o processo de fixação biológica de nitrogênio atmosférico. Neste
contexto, tem sido verificado que a aplicação de adubo mineral nitrogenado nos solos
tropicais tem resultado, muitas vezes, em baixa frequência de resposta pela cultura do
feijoeiro (VIEIRA, 1998). Experimentos conduzidos por Souza et al. (2011),
demonstraram pequena resposta ou a ausência desta à adubação mineral nitrogenada,
quanto à produtividade de grãos de feijoeiro. O mesmo resultado foi verificado por
Crusciol et al. (2003), mostrando que o fornecimento da maior dose de N mineral (25 kg
ha-1), na semeadura causou o aumento dos componentes da produção, mas sem
proporcionar a elevação da produtividade. No entanto, resultados experimentais obtidos
por Araújo et al. (2007) demonstraram que a adição de nitrogênio na forma mineral tem
a mesma capacidade de resposta da planta, quando comparado com a inoculação das
estirpes de Rhizobium tropici nas sementes de feijoeiro.
8
Esta falta de resposta à adubação nitrogenada tem sido atribuída à sua baixa
eficiência de utilização (inferior a 50%) pelas plantas, decorrente das perdas por
lixiviação, volatilização e desnitrificação (DUQUE et al., 1985; HUNGRIA et al.,
2007). Além disso, deve-se considerar o elevado custo econômico dos adubos
nitrogenados e os problemas ambientais que podem ocorrer com estas perdas, como o
acúmulo de formas nitrogenadas, particularmente nitrato (NO-3), nas águas de rios,
lagos e aquíferos subterrâneos, atingindo níveis tóxicos aos peixes e ao homem, e a
degradação da camada de ozônio, agravando o efeito estufa, pela liberação de formas
gasosas, como N2O (óxido nitroso) e NO (óxido nítrico).
Por outro lado, o feijoeiro, a exemplo de outras leguminosas, apresenta a
propriedade de fixar o nitrogênio da atmosfera quando em simbiose com bactérias do
gênero Rhizobium, sendo esta uma tecnologia barata e muito eficiente. Estudos
realizados por Hungria et al. (2000) e Pelegrin et al. (2009) demonstraram que o
fornecimento de nitrogênio através do processo de fixação biológica de N2 pode
aumentar a produtividade média nacional de feijoeiro sem o uso de adubos
nitrogenados, alcançando patamares de produtividade acima de 2.500 kg ha -1. De
acordo com Mercante et al. (1992), o feijoeiro, quando bem nodulado e em condições
favoráveis, pode apresentar taxas de fixação biológica superiores a 40 kg N/ha. Desta
forma, o fornecimento de nitrogênio via simbiose seria suficiente para duplicar a
produtividade média nacional. Além disso, a fixação biológica de N 2 influencia
positivamente a qualidade do solo, por evitar todos os problemas relacionados à
poluição causada pelos adubos nitrogenados (HUNGRIA et al., 1997).
4.2.1 Fatores limitantes (bióticos e abióticos)
Existem diversos fatores bióticos e abióticos que podem limitar a simbiose
entre estirpes de rizóbio e o feijoeiro. Com relação aos fatores bióticos, estão incluídos
o tipo de inóculo e a via de inoculação (BROCKWELL et al., 1988), a seleção de
cultivares apropriados que influencia decisivamente sobre as entradas de nitrogênio nos
sistemas agrícolas (WANI et al., 1995), o controle de patógenos e enfermidades que
afetam o vigor da planta e o seu potencial de crescimento (JOHNSTONE &
BARBETTI,
1987),
competitividade,
sobrevivência
antagonistas, entre outros (SINGH et al., 1995).
saprofítica,
presença
de
9
A presença de uma grande diversidade de antagonistas, bacteriófagos,
predadores de nódulos e, principalmente, alta densidade populacional e competitividade
de rizóbios nativos, constitui uma verdadeira barreira no estabelecimento da inoculação,
uma vez que competem pela ocupação dos sítios de infecção nas raízes das plantas
hospedeiras (FRANCO & NEVES, 1992). Desta forma, quanto maior a população
nativa de rizóbio no solo, mais difícil é a introdução com sucesso da estirpe inoculante
(MELO, 2009).
Em condições de clima tropical, os principais fatores abióticos que afetam a
FBN são: acidez do solo, toxidez de alumínio, salinidade e baixa fertilidade do solo,
disponibilidade de N mineral, deficiência de nutrientes, altas temperaturas no solo,
luminosidade e baixa precipitação pluviométrica (HUNGRIA & VARGAS, 2000),
metais pesados (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006), tipo de solo, textura e composição
(BENIZRI et al., 2001).
O solo com temperatura elevada tem, frequentemente, representado um dos
principais fatores climáticos limitantes à FBN em regiões tropicais, uma vez que afetam
praticamente todas as etapas de crescimento do rizóbio e das plantas hospedeiras, sendo
os efeitos ainda mais drásticos na simbiose (HUNGRIA & VARGAS, 2000). Desta
forma, os solos tropicais atingem, temperaturas médias superiores a 40 °C nas camadas
mais superficiais, podendo chegar a 60 °C (DENNET, 1984). Considera-se que, para o
feijoeiro nodulado, os limites de tolerância térmica se situam entre 28 °C e 33 °C
(HUNGRIA & FRANCO, 1993).
A região dos Cerrados apresenta uma boa precipitação anual, mas a
distribuição não é uniforme, existindo um período seco que oscila entre cinco e seis
meses do ano, e como as leguminosas noduladas são bastante sensíveis, pode
representar um fator limitante à simbiose (HUNGRIA & VARGAS, 1997). De acordo
com estes autores, a deficiência hídrica afeta os estágios de infecção das raízes através
da ausência de pelos radiculares normais, e diversas outras etapas da formação e
desenvolvimento dos nódulos.
Os solos da região dos cerrados são caracterizados pela acidez elevada e o
quadro característico resultante, com toxicidade por certos elementos e deficiência de
diversos nutrientes, e como o processo de FBN resulta em excreção de H +, os problemas
relacionados à acidez podem ser agravados na rizosfera das leguminosas noduladas
(MUNNS & FRANCO, 1982; BORDELEAU & PRÉVOST, 1994; RAVEN et al.,
1990). A acidez, além de prejudicar o crescimento da planta, afeta o rizóbio em termos
10
de sobrevivência, taxa de crescimento, morfologia, perda da infectividade e da
eficiência simbiótica (HUNGRIA & VARGAS, 1997).
O fósforo (P), presente em baixo teor na maioria dos solos do cerrado,
potencializa a FBN por estimular o crescimento de plantas hospedeiras, além de
influenciar diretamente a formação do rizóbio e dos nódulos. Como a FBN é um
processo que demanda uma grande quantidade de energia e como o P tem um papel
chave no metabolismo energético das células, sua deficiência tem um papel negativo no
status energético dos nódulos (CHAUDHARY & FUJITA, 1998).
 Fatores nutricionais (Micronutrientes) – Cobalto e molibdênio
O aumento na produtividade, por consequência, a diminuição do custo no que
se refere ao uso de micronutrientes nos últimos anos, tem motivado produtores a utilizar
micronutrientes como cobalto (Co) e molibdênio (Mo), pela sua influência na nutrição
de plantas (EMBRAPA, 2006; GUERRA et al., 2006).
Visto que, o molibdênio é um micronutriente que desempenha papel
fundamental na nutrição das plantas, sendo transportado pelo xilema das plantas, e
absorvido como molibdato (Mo O4-2). A maioria das plantas não necessita de grandes
quantidades de Mo, portanto, com relação aos outros micronutrientes, o Mo é tolerado
em altas concentrações nas plantas (FONSECA, 2006). O Mo tem importante papel no
processo de fixação biológica de N2, devido a sua função estar relacionada com o
metabolismo do nitrogênio, fazendo parte de duas metaloenzimas: a nitrogenase, que
participa na fixação simbiótica do nitrogênio e a redutase do nitrato, que atua na
redução do nitrato à amônia na planta (ARAÚJO et al., 2008). Da mesma forma, o
cobalto é necessário para a síntese da cobalamina (Vitamina B12), que participa dos
passos metabólicos para a formação da leghemoglobina e regula sua concentração nos
nódulos, impedindo a inativação da enzima nitrogenase (MENGEL & KIRKBY, 2001).
Contudo, a importância do Co e Mo aumentam a capacidade do feijoeiro, de estabelecer
simbiose com microrganismos fixadores de N2 pertencentes à família Rhizobiaceae.
Resultados experimentais obtidos por Barbosa filho et al. (1979) demonstraram
que a aplicação de Mo, isolado ou em combinação com outros nutrientes, tem
aumentado a produção, o número de nódulos e os teores de N em feijoeiro. De acordo
com Oliveira et al. (1996), o Co é indispensável à produção do feijoeiro quando a
necessidade em nitrogênio está sendo suprida através da associação simbiótica feijoeiro-
11
bactéria, já que esta depende do Co para seus mecanismos de fixação. Há evidências de
respostas positivas da aplicação de cobalto na fixação biológica do N 2 e na
produtividade da soja quando a planta está bem suprida de molibdênio (CAMPO &
HUNGRIA, 2002).
Meschede et al. (2004) consideram a adubação com Co e Mo importantes para
a fixação biológica do N2, mostrando que a partir do momento que foram adicionados
estes micronutrientes na semente a planta de soja apresentou grãos com maior teor de
proteína. Entretanto, estes autores salientam que deve-se ter cautela na aplicação de
molibdênio na semente, principalmente na forma de molibdato (MoO), o qual tende a
reduzir a sobrevivência do rizóbio.
A aplicação direta nas sementes de produtos contendo Co e Mo, devido a
formulações salinas, ou com pH baixo, podem afetar drasticamente a sobrevivência da
bactéria, a nodulação e a eficiência do processo de fixação biológica de nitrogênio
(MERCANTE et al., 2011; EMBRAPA, 2010). Os resultados experimentais obtidos por
Hungria et al. (2007) demonstraram, na cultura da soja, que a aplicação de CoMo nas
sementes, por se tratar de formulações salinas ou com pH baixo, afeta drasticamente a
sobrevivência da bactéria, a nodulação e a fixação biológica de N2.
4.3 Tratamento de sementes de feijoeiro com fungicidas
O feijoeiro comum pode sofrer o ataque de doenças, ocasionando perdas na
produção antes e após a colheita (YOKOYAMA, 1998). Isso se deve, em parte, pelo
fato do feijoeiro ser suscetível a vários organismos fitopatogênicos, responsáveis por
perdas significativas nas lavouras, chegando a inviabilizar a cultura em determinadas
regiões e épocas de plantio (MELO et al., 2005). Cerca de 60 doenças atacam a cultura
do feijão, sendo 31 causadas por fungos (DALLA-PRIA et al., 1999).
Desta forma, o tratamento de sementes com fungicidas é uma técnica para
evitar a incidência de doenças que afetam o feijoeiro, que consiste em uma das medidas
mais simples, de custo relativamente baixo e que pode resultar em reflexos altamente
positivos pelo aumento da produtividade da cultura (SARTORATO & RAVA, 1994;
BARROS, et al., 2001). No entanto, para que o tratamento de sementes seja bem
sucedido é necessário que ele seja baseado em informações sobre o produto, no que se
refere a espectro de ação, toxicologia, efeitos fitotóxicos e compatibilidade com outros
produtos (TOLEDO & MARCOS FILHO, 1977).
12
Para que a utilização dos fungicidas aplicados nas sementes de feijoeiro junto
com o inoculante seja eficiente, faz-se necessário a compatibilidade destas práticas, uma
vez que muito destes produtos são prejudiciais a sobrevivência do rizóbio, nodulação e
fixação biológica de nitrogênio (MERCANTE et al., 1992). Desta forma, com a
aplicação de fungicidas nas sementes de feijoeiro, os rizóbios presentes no inoculante
são colocados em contato com estes produtos que podem ser prejudiais à sobrevivência
do rizóbio, afetando a nodulação e a fixação biológica de nitrogênio (OLIVEIRA et al.,
1999). Segundo De-Polli et al. (1986), de modo geral, os fungicidas são os que mais
frequentemente apresentam problemas de compatibilidade com a inoculação, seguidos
dos herbicidas e inseticidas. Resultados experimentais obtidos por Araújo & Araújo
(2006) demonstraram que a sobrevivência do rizóbio inoculado nas sementes de
feijoeiro foi prejudicada pela aplicação de fungicidas, e consequentemente, a nodulação
foi reduzida. O mesmo foi constatado por Ramos & Ribeiro Jr. (1993), que observaram,
24 horas após a inoculação do rizóbio nas sementes de feijoeiro, efeitos deletérios de
todos os fungicidas avaliados sobre a sobrevivência do rizóbio, em comparação com o
controle sem fungicida.
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23
CAPÍTULO 2 – COMPATIBILIDADE ENTRE A INOCULAÇÃO DE Rhizobium
tropici E FUNGICIDAS APLICADOS EM SEMENTES DE FEIJOEIROCOMUM
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do tratamento de sementes de
feijoeiro com diferentes fungicidas na sobrevivência de estirpes de R. tropici (SEMIA
4077 + SEMIA 4080), na nodulação das plantas e na produtividade da cultura. Foram
conduzidos dois ensaios em substrato esterilizado, sob condições de casa de vegetação e
um ensaio no campo experimental da Embrapa Agropecuária Oeste, em Dourados, MS,
num Latossolo Vermelho distroférrico típico. Os fungicidas (princípios ativos)
utilizados nos ensaios foram: (1) carbendazim + thiram (Produto A); (2) carbendazim +
thiram (Produto B); (3) carboxin + thiram; (4) fludioxonil + metalaxyl-M; (5)
fludioxonil + metalaxyl-M + thiabendazole; (6) fluazinam + tiofanato metílico; (7)
fipronil + tiofanato metílico + piraclostrobina; (8) clorotalonil + tiofanato metílico. A
sobrevivência das estirpes de R. tropici inoculadas nas sementes de feijoeiro foi afetada
pela aplicação dos fungicidas, principalmente por aqueles com modo de ação de
contato. Observou-se ainda, com a aplicação dos fungicidas, redução na nodulação das
plantas de feijoeiro, especialmente da massa nodular, tanto nos ensaios conduzidos em
substrato esterilizado, sob condições de casa de vegetação, quanto no experimento a
campo, onde também observou-se redução na produtividade do feijoeiro pela aplicação
da maioria dos fungicidas avaliados. Os fungicidas que mais afetaram o rendimento de
grãos foram carbendazim + thiram (Produto B) e carboxin + thiram. Os produtos
fipronil + tiofanato metílico + piraclostrobina, fludioxonil + metalaxyl-M +
thiabendazole e fludioxonil + metalaxyl-M não afetaram a produtividade da cultura,
embora a massa seca de nódulos tenha sido reduzida em todos os ensaios.
Palavras-chave: fixação biológica de nitrogênio, nodulação, princípio ativo.
24
1 Introdução
O feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma leguminosa cultivada em
todas as regiões brasileiras e, na safra 2011/12, obteve rendimento médio de 894 kg ha 1
. No Estado de Mato Grosso do Sul, nesta mesma safra, o rendimento médio foi de
1.262 kg ha-1 (CONAB, 2012). A sua grande importância social e econômica no País é
evidenciada por representar a principal fonte proteica na dieta alimentar da população
mais pobre e pelo contingente de pequenos agricultores envolvidos na sua produção,
geralmente, utilizando baixo nível tecnológico. Contudo, nas últimas décadas, tem sido
verificado um crescente interesse de produtores de outros segmentos do agronegócio
que adotam níveis tecnológicos mais elevados, incluindo a irrigação e a colheita
mecanizada (YOKOYAMA, 2002).
Entre os fatores mais limitantes da produtividade da cultura do feijoeiro,
destaca-se a baixa fertilidade dos solos tropicais, que limita a nutrição das plantas
(SUHET et al., 1986; ARAUJO, 1994). Considerando que o nitrogênio é um dos
nutrientes requeridos em maiores quantidades pelo feijoeiro e os solos tropicais são, em
geral, pobres neste nutriente, o seu suprimento adequado torna-se de fundamental
importância para a obtenção de maiores rendimentos nesta cultura. Tem sido verificado
que os teores máximos de nitrogênio nos solos tropicais estão em torno de 0,3%, sendo
rapidamente esgotado após poucos ciclos de cultivo, caso não haja reposição
(STRALIOTTO et al., 2002).
As principais fontes de fornecimento de N à cultura são os fertilizantes
nitrogenados e o processo de fixação biológica de nitrogênio atmosférico (FBN), por
meio da simbiose do feijoeiro com bactérias do grupo dos rizóbios. Neste contexto, tem
sido verificado que a aplicação de adubo mineral nitrogenado nos solos tropicais tem
resultado, muitas vezes, em baixa frequência de resposta pela cultura do feijoeiro
(VIEIRA, 1998). Esta falta de resposta à adubação nitrogenada tem sido atribuída à sua
baixa eficiência de utilização (inferior a 50%) pelas plantas, decorrente das perdas por
lixiviação, volatilização e desnitrificação (DUQUE et al., 1985, HUNGRIA et al.,
2007). Além disso, deve-se considerar o elevado custo econômico dos adubos
nitrogenados e os problemas ambientais que podem ocorrer com estas perdas, como o
acúmulo de formas nitrogenadas, particularmente nitrato (NO-3), nas águas de rios,
lagos e aquíferos subterrâneos, atingindo níveis tóxicos aos peixes e ao homem, e a
25
degradação da camada de ozônio, agravando o efeito estufa, pela liberação de formas
gasosas, como N2O (óxido nitroso) e NO (óxido nítrico).
Por outro lado, tem sido verificado que o fornecimento de nitrogênio, por meio
do processo de FBN, pode aumentar a produtividade média nacional de feijoeiro sem o
uso de adubos nitrogenados, alcançando patamares de produtividade acima de 2.500 kg
ha-1 (HUNGRIA et al., 2000, PELEGRIN et al., 2009). Além disso, a FBN influencia
positivamente a qualidade do solo, por evitar todos os problemas relacionados à
poluição causada pelos adubos nitrogenados (HUNGRIA et al., 1997). Entretanto,
diversos fatores podem limitar a simbiose entre estirpes de rizóbio e o feijoeiro,
destacando-se a acidez do solo, pH baixo, concentrações elevadas de Al tóxico e
temperaturas elevadas (MARTÍNEZ-ROMERO et al., 1991, MERCANTE, 1993).
Dentre os outros fatores limitantes à produção do feijoeiro, as doenças
contribuem com uma parcela significativa para o insucesso da cultura, diminuindo o
rendimento e depreciando a qualidade do produto (GOULART, 1988; SARTORATO,
1988). A maioria das doenças de importância econômica que ocorre no feijoeiro é
causada por patógenos que são transmitidos pelas sementes (NEERGAARD, 1977,
RICHARDSON, 1979, GOULART, 1992). Isso implica na introdução de doenças em
áreas novas ou mesmo a reintrodução em áreas cultivadas nas quais a doença já tenha
ocorrido e, em função da adoção de práticas eficientes de controle, como, por exemplo,
a rotação de culturas, ficaram livres da mesma. A maneira mais econômica e eficaz de
controlar estes fungos transmitidos pelas sementes, bem como os de solo, é por meio do
tratamento das sementes de feijoeiro com fungicidas (CANTERI et al., 1999,
MACHADO et al., 2002, GOULART, 1992). Dentre patógenos alvo do tratamento de
sementes com fungicidas, destacam-se Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum,
Fusarium spp., Aspergillus flavus e Colletotrichum lindemuthianum (GOULART,
1992).
Contudo, tem sido mencionado que a aplicação de determinados fungicidas no
tratamento de sementes de leguminosas, como feijoeiro (ARAÚJO & ARAÚJO, 2006),
soja (CAMPO et al., 2009) e alfafa (OLIVEIRA et al., 1999), podem ocasionar uma
redução na população de bactérias diazotróficas utilizadas nos inoculantes microbianos.
Resultados experimentais obtidos por Araújo & Araújo (2006) demonstraram que a
sobrevivência do rizóbio inoculado nas sementes de feijoeiro foi prejudicada pela
aplicação de fungicidas (Benlate, Captan, Vitavax, Rhodiauran, Terraclor e VitavaxThiram), e consequentemente, a nodulação das plantas foi reduzida. O mesmo foi
26
constatado por Ramos & Ribeiro Jr. (1993), que observaram, duas horas após o contato
com os fungicidas, as estirpes CIAT 652 e CPAC 1135 de rizóbio tiveram uma
significativa redução no número de células do que o tratamento sem fungicida. Nestes
estudos, os fungicidas Benlate (benomil) e Banrot (etridiazol, tiofanato-metil) tiveram
os maiores efeitos na sobrevivência das estirpes de rizóbio.
Contudo, os efeitos de toxicidade dos fungicidas são variáveis, dependendo do
produto e da estirpe de rizóbio inoculada, tornando-se indispensável a avaliação da
compatibilidade dos fungicidas atualmente recomendados comercialmente para
tratamento de sementes e das estirpes de rizóbio recomendadas para inoculação, de
modo a garantir os patamares mais elevados de FBN, a sanidade das semente e,
consequentemente, incrementos na produtividade de grãos do feijoeiro.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a compatibilidade entre a inoculação de
estirpes de R. tropici e os fungicidas recomendados para o tratamento de sementes de
feijoeiro, seus efeitos na sobrevivência do rizóbio, na nodulação e na produtividade da
cultura.
2 Material e Métodos
Os estudos foram conduzidos em laboratório, sob condições controladas de
casa de vegetação e no campo experimental da Embrapa Agropecuária Oeste, em
Dourados, MS.
Em todos os ensaios, utilizaram-se sementes de feijoeiro (Phaseolus
vulgaris L.), cultivar Pérola, pertencente ao grupo comercial Carioca, com ciclo de 90 a 100
dias, de porte semi-ereto.
Foi utilizado inoculante turfoso contendo a mistura das estirpes
SEMIA 4077 (= CIAT 899) e SEMIA 4080 (= PRF 81) de Rhizobium tropici,
recomendadas comercialmente no Brasil. O inoculante foi produzido na Embrapa
Cerrados, na concentração de 6x109 células g-1 de inoculante turfoso, sendo aplicado na
dose de 1 kg 50 kg-1 de sementes, utilizando como adesivo, solução açucarada, a 10%.
A inoculação dos rizóbios nas sementes foi realizada após a aplicação dos fungicidas,
conforme a recomendação técnica.
Os fungicidas utilizados nos ensaios correspondem aos seguintes princípios
ativos: 1) carbendazim + thiram (produto A); 2) carbendazim +thiram (produto B); 3)
carboxin + thiram; 4) fludioxonil + metalaxyl-M; 5) fludioxonil + metalaxyl-M +
thiabendazole; 6) fluazinam + tiofanato metílico; 7) fipronil + tiofanato metílico +
27
piraclostrobina; 8) clorotalonil + tiofanato metílico. As doses dos produtos utilizados e
os respectivos ingredientes ativos estão relacionados na Tabela 1.
Três tratamentos adicionais foram incluídos nas avaliações, para comparação,
sendo um com a mistura das estirpes SEMIA 4077 (= CIAT 899) e SEMIA 4080 (=
PRF 81) de R. tropici e dois sem adição de inoculante (com e sem adubação mineral
nitrogenada).
Tabela 1. Doses dos produtos utilizados, respectivos ingredientes ativos e modo de
ação dos fungicidas.
Nome comum
1
2
3
4
5
6
7
8
Dose (mL/50kg
de sementes)
Carbendazim +
Thiram (Produto A)
Carbendazim +
Thiram (Produto B)
Carboxin + Thiram
Fludioxonil +
Metalaxyl-M
Fludioxonil +
Metalaxyl-M +
Thiabendazole
Fluazinam +
Tiofanato metílico
Fipronil +
Tiofanato metílico +
Piraclostrobina
Clorotalonil +
Tiofanato metílico
Ingrediente
ativo (g)
Modo de ação
200
15 + 35
Contato/ sistêmico
200
15 + 35
Contato/ sistêmico
250
20 + 20
Contato/ sistêmico
100
2,5 + 1
Contato/ sistêmico
100
2,5 + 2 + 15
Contato/ sistêmico
180
5,25 + 35
Contato/ sistêmico
200
25 + 22,5 + 2,5
Contato/ sistêmico
300
50 + 20
Contato/ sistêmico
Sobrevivência de rizóbios em sementes de feijoeiro
As avaliações da estimativa do número de células de rizóbio nas sementes de
feijoeiro tratadas com os fungicidas e inoculadas com a mistura das estirpes SEMIA
4077 e SEMIA 4080 foram realizadas pelo método do número mais provável-NMP,
diluição e infecção em plantas (processo indireto), utilizando-se a tabela adaptada de
Andrade & Hamakawa (1994).
Inicialmente, retirou-se uma amostra de 10 g das sementes de feijoeiro,
previamente tratadas com os diferentes fungicidas (Tabela 1), e inoculadas com a
mistura das estirpes SEMIA 4077 + SEMIA 4080. Em seguida, as sementes foram
colocadas em erlenmeyers contendo 90 mL de água destilada esterilizada, sendo
28
adicionados 300 μL de Tween 80, sob agitação (200 rpm), por 30 minutos. Após a
agitação, foram realizadas diluições decimais, sendo utilizadas as concentrações 10-3,
10-4 e 10-5 nas avaliações realizadas em casa de vegetação. Neste ensaio, foram
utilizados vasos de 500 mL contendo substrato (areia + vermiculita, 1:1 - v:v)
esterilizado, onde cada semente de feijoeiro recebeu a inoculação com 0,5 mL das
mesmas diluições utilizadas na contagem de células (10 -3, 10-4 e 10-5). Inicialmente,
foram utilizadas quatro sementes por vaso e, aos 15 dias após a emergência das plantas,
realizou-se o desbaste, deixando-se duas plantas em cada vaso. As avaliações de
presença e ausência de nódulos nas plantas inoculadas foram realizadas aos 21 dias após
a semeadura, e cada planta foi referida como positiva (sucesso), com ocorrência de um
ou mais nódulos, e negativa (insucesso), quando nenhum nódulo foi formado. A partir
dos resultados positivos ou negativos em cada uma das diluições das suspensões
inoculadas, foi estimado, na acepção matemática, o número de células viáveis de rizóbio
na amostra (HUNGRIA & ARAÚJO, 1994). Esses valores foram encontrados na tabela
adaptada de Andrade e Hamakawa (1994). O delineamento experimental utilizado foi
em blocos casualizados, com três repetições para cada diluição.
Ensaios em casa de vegetação
Foram conduzidos dois ensaios sob condições controladas de casa de
vegetação, sendo utilizados vasos de Leonard (VINCENT, 1970) e vasos de 500 mL,
contendo substrato (areia + vermiculita, 1:1 – v:v) esterilizado, onde foram semeadas
quatro sementes de feijoeiro, cv. Pérola, por vaso. Aos 15 dias após a emergência das
plantas, foi realizado o desbaste, deixando-se duas plantas por vaso.
As sementes foram previamente tratadas com diferentes fungicidas (Tabela 1) e
inoculadas com rizóbio (CIAT 899 e PRF 81). Nos tratamentos utilizados como
controle (testemunhas absoluta e nitrogenada, com aplicação de 20 mg de N planta -1
semanalmente), sem aplicação de fungicidas e inoculante, as sementes foram
previamente esterilizadas superficialmente, sendo tratadas com álcool absoluto por 30
segundos e, em seguida, imersas em hipoclorito de sódio (10%), por 3 minutos, e
lavadas dez vezes com água destilada esterilizada (VINCENT, 1970).
Durante o período de crescimento, as plantas foram supridas com solução
nutritiva sem nitrogênio (NORRIS & T`MANNETJE, 1964).
A coleta das plantas foi realizada aos 45 dias após a emergência das plantas
(DAE), separando-se a parte aérea do sistema radicular. Foram realizadas as seguintes
29
avaliações: número de nódulos, matéria seca de nódulos e da parte aérea, com secagem
em estufa à 60°C, até atingirem peso constante, além do teores de nitrogênio total da
parte aérea, determinados pelo método de Kjeldahl (semi-micro), segundo Malavolta et
al. (1997).
Em ambos ensaios, o delineamento experimental utilizado foi em blocos
casualizados, com cinco repetições. Os dados coletados foram submetidos à análise de
variância, a 5% de probabilidade (P < 0,05) e, quando significativas, as médias foram
comparadas pelo teste de Tukey (P < 0,01). Essas análises foram realizadas com o
auxílio do aplicativo estatístico ASSISTAT (SILVA & AZEVEDO, 2002).
Ensaio conduzido à campo
O experimento foi conduzido no campo experimental da Embrapa
Agropecuária Oeste, em Dourados, MS, num Latossolo Vermelho distroférrico típico,
localizado na latitude 22º14` S e longitude de 54º49` W, com altitude de 450 m, no
período de março a junho de 2012. O clima da região é classificado como Cwa,
mesotérmico úmido, com verão quente e inverno seco (AMARAL et al., 2000). A
análise química do solo mostrou os seguintes valores: pH
(CaCl2)
= 5,3; M.O. = 31,45 g
kg-1; P-mehlich = 25,9 mg dm-3 ; K+ = 0,65 cmolc dm-3 ; Ca++ = 5,1 cmolc dm-3 ; Mg++ =
1,8 cmolc dm-3; H+Al = 4,9 cmolc dm-3 ; CTC = 12,5 cmolc dm-3 e os micronutrientes
Fe = 24,9 mg dm-3; Cu = 11,2 mg dm-3; Mn = 53,0 mg dm-3; e Zn = 2,2 mg dm-3.
O ensaio consistiu dos mesmos tratamentos utilizados nos ensaios em casa de
vegetação, sendo realizadas avaliações da nodulação (número e matéria seca de
nódulos), matéria seca da parte aérea, teores de nitrogênio total da parte aérea e
rendimento de grãos do feijoeiro. Para a avaliação de produtividade, os grãos colhidos
na área útil de cada parcela foram beneficiados e a umidade corrigida para 13%. Os
demais parâmetros foram avaliados conforme descrito nos ensaios realizados em casa
de vegetação.
Cada parcela experimental foi constituída por quatro linhas com quatro metros de
comprimento, espaçadas com 0,50 m,
perfazendo 8 m2 (2 m x 4 m) de área total,
ajustando a população final para 15 plantas/ metro. A área útil da parcela foi constituída
pelas duas linhas centrais, descartando 0,50 m de cada extremidade.
A adubação básica de
plantio constou da aplicação de 300 kg ha -1 da formulação 00-18-18 (N-P-K). A
adubação nitrogenada nas parcelas correspondentes ao controle nitrogenado foi de 80 kg
ha-1, sendo 50% aplicados na semeadura e 50% em cobertura, aos 38 DAE.
A
30
semeadura foi realizada no dia 13/03/2012, manualmente, e a avaliação da nodulação
foi efetuada aos 38 DAE.
O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso, com cinco
repetições. Os dados coletados foram submetidos à análise de variância, a 5% de
probabilidade, e, quando significativas, as médias foram comparadas pelo teste de
Tukey, ao nível de 1% de probabilidade. Essas análises foram realizadas com o auxílio
do aplicativo estatístico ASSISTAT (SILVA & AZEVEDO, 2002).
3 Resultados e Discussão
Sobrevivência de rizóbios em sementes de feijoeiro
Os resultados de infectividade dos rizóbios inoculados em plantas de feijoeiro,
utilizando-se as diluições 10-3, 10-4 e 10-5, demonstraram que os fungicidas avaliados
afetaram a sobrevivência das bactérias fixadoras de nitrogênio até a diluição 10 -5, uma
vez que a concentração de células de R. tropici mL-1 diminuíram em comparação ao
tratamento com a inoculação padrão (IP), sem uso de fungicida.
Os fungicidas contendo os princípios ativos fipronil + tiofanato metílico +
piraclostrobina e clorotalonil + tiofanato metílico foram os que menos afetaram a
sobrevivência dos rizóbios, propiciando uma concentração de células maior que os
demais tratamentos que receberam aplicação de fungicidas (Tabela 2). Por outro lado, o
tratamento com aplicação do fungicida com os princípios ativos fluazinam + tiofanato
metílico foi o mais prejudicial à sobrevivência das bactérias inoculadas nas sementes,
proporcionando a maior redução no número de células, em comparação aos demais
tratamentos com fungicidas (Tabela 2). Contudo, salienta-se que os fungicidas com os
princípios ativos de contato, quando em maior proporção que os sistêmicos, foram os
que propiciaram a maior redução de células de R. tropici quando aplicados nas
sementes; a exceção foi verificada com a aplicação do fungicida com os princípios
ativos fluazinam + tiofanato metílico, que possui um modo de ação predominantemente
sistêmico, e foi o produto mais prejudicial à sobrevivência das bactérias inoculadas
(Tabela 2).
Deve-se destacar ainda que dois produtos comerciais com os mesmos
princípios ativos (carbendazim + thiram) afetaram, em intensidade diferente, a
sobrevivência das bactérias nas sementes de feijoeiro, indicando que o efeito de
31
fitotoxicidade pode não estar relacionado exclusivamente aos princípios ativos dos
fungicidas, mas a algum componente do veículo do produto.
Estudos realizados por Araújo & Araújo (2006), em laboratório, utilizando o
método de diluição e contagem direta em placas (método de espalhamento),
demonstraram que a sobrevivência da estirpe CIAT 899 de R. tropici inoculada foi
afetada negativamente por todos os fungicidas utilizados no tratamento das sementes,
sendo que os fungicidas mais prejudiciais ao rizóbio inoculado nas sementes foram
carboxin + thiram e benomyl. Ramos & Ribeiro Jr. (1993) verificaram que os fungicidas
Benlate (benomil) e Banrot (truban) tiveram os maiores efeitos na sobrevivência das
estirpes de rizóbio inoculadas em sementes de feijoeiro. Resultados obtidos por
Mercante et al. (2007) demonstraram que a sobrevivência das estirpes SEMIA 5079 e
SEMIA 5080 de Bradyrhizobium japonicum, inoculadas em sementes de soja, foi
afetada negativamente pela aplicação dos fungicidas carboxin + thiram, carbendazin +
thiram (Produto A), carbendazin + thiram (Produto B), fludioxonil + metalaxyl-M, após
48 horas de contato com o inoculante. Estudos realizados por Campo et al. (2009), com
a cultura da soja, demonstraram, em condições laboratoriais, que os fungicidas podem
causar até 62% de mortalidade das bactérias inoculadas, duas horas após o tratamento
das sementes, atingindo 95% após 24 horas.
Tabela 2. Efeito da aplicação de fungicidas sobre a nodulação em sementes de feijoeiro,
realizado em condições de casa de vegetação, utilizando-se estirpes de R. tropici em três
concentrações distintas (10-3, 10-4 e 10-5), por meio do método de diluição e infecção em
plantas (processo indireto).
Tratamentos
Carbendazim + Thiram (Produto A) + IP*
Carbendazim +Thiram (Produto B) + IP
Carboxin + Thiram + IP
Fludioxonil + Metalaxyl-M + IP
Fludioxonil + Metalaxyl-M + Thiabendazole + IP
Fluazinam + Tiofanato metílico + IP
Fipronil + Tiofanato metílico + Piraclostrobina + IP
Clorotalonil + Tiofanato metílico + IP
IP
Controle sem N
Controle com N
Fator
NMP
0,620
1,568
1,118
1,098
2,046
0,357
4,272
4,272
9,324
-
N° de células de
R. tropici mL-1
0,77 x 105
1,72 x 105
1,07 x 105
1,09 x 105
2,13 x 105
0,25 x 105
4,27 x 105
4,27 x 105
4,83 x 105
0
0
*IP= inoculação padrão. Inoculante turfoso, contendo 109 células de R. tropici/g de inoculante, aplicado
na dose de 1 kg 50 kg-1 de sementes, utilizando solução açucarada a 10% como adesivo.
NMP= número mais provável.
32
Ensaios conduzidos em casa de vegetação
No primeiro experimento em casa de vegetação, conduzido em vasos de
Leonard, os resultados mostraram que todos os fungicidas utilizados no tratamento de
sementes de feijoeiro associado à inoculação das estirpes R. tropici diferiram
significativamente do tratamento onde houve apenas a inoculação, promovendo uma
redução na nodulação (número e matéria seca de nódulos). As reduções ocasionadas
pela utilização dos fungicidas no tratamento de sementes chegaram a 45%, para o
número de nódulos, quando as plantas de feijoeiro foram tratadas com carbendazim +
thiram (Produto A). Já o tratamento com o fungicida carboxin + thiram chegou a reduzir
em 46% a produção de matéria seca de nódulos (Tabela 3). Costa et al. (2006),
avaliando a sobrevivência de Bradyrhizobium japonicum em sementes de soja tratadas
com fungicidas, verificou uma redução no número de nódulos de 48%, quando as
sementes foram tratadas com o fungicida carbendazin + thiram (Produto A) em plantas
de soja, em comparação com as plantas apenas inoculadas. Do mesmo modo, resultados
obtidos por Campo & Hungria (2000), em experimento conduzido a campo, mostraram
que dentre os fungicidas avaliados na cultura da soja, os menos tóxicos foram carboxin
+ thiram e difenoconazole + thiram, causando reduções de 39 e 43% no número e
matéria seca de nódulos, respectivamente.
Os fungicidas com os princípios ativos carbendazim + thiram (produtos A e B),
carboxim + thiram e fludioxonil + metalaxyl-M + thiabendazole foram os que mais
afetaram a produção de matéria seca da parte aérea, com reduções que variaram de 29%
a 39%. Os fungicidas com os demais princípios ativos mostraram-se similares (p<0,01)
ao tratamento que recebeu apenas a inoculação com rizóbio (Tabela 3).
De modo geral, todos os fungicidas ocasionaram redução nos teores de N total
da parte aérea das plantas de feijoeiro, variando entre 1% e 27%. As exceções foram
verificadas com os fungicidas carbendazim + thiram (Produto B) e carboxin + thiram,
que apresentaram teores de N total da parte aérea similares (p<0,01) aos verificados nas
plantas que receberam apenas a inoculação de rizóbio, sem o tratamento de fungicidas
nas sementes (Tabela 3). Os resultados foram similares aos encontrados por Cattelan et
al. (1995), que avaliaram em cultura da soja, sob condições de casa de vegetação, os
efeitos dos fungicidas carboxin + thiram e thiram + thiabendazole, sobre estirpes de
Bradyrhizobium, e não observaram redução no número de nódulos, matéria seca de
nódulos (nodulação) e teor de N, quando comparados ao inoculante padrão. Estes
resultados contrastam com aqueles obtidos por Bigaton et al. (2006), na cultura da soja,
33
em experimento conduzido em casa de vegetação, que observou diferença significativa
entre os tratamentos com inoculante padrão e carboxin + thiram + IP, quando
comparados ao tratamento carbendazin + thiram + IP (Produto B), que apresentou maior
teor de N. Do mesmo modo, Campo et al. (2009) observaram que, sob condições de
casa de vegetação, a nodulação e o N total acumulado na parte aérea da soja no estádio
R2 foram reduzidos em 27 e 19%, respectivamente.
34
TABELA 3. Efeito da inoculação e do tratamento de sementes de feijoeiro (cultivar Pérola) com fungicidas, sobre o número de nódulos, matéria
seca de nódulos, matéria seca da parte aérea e nitrogênio total da parte aérea das plantas, em ensaio conduzido em casa de vegetação (vasos de
Leonard).
Tratamentos
Número de nódulos
Matéria seca de nódulos
Matéria seca da
parte aérea
Nitrogênio
total
(n° planta-1)
248 a
Redução (%)
0
(mg planta-1)
484 a
Redução (%)
0
(g planta-1)
2,62 a
Redução (%)
0
(g kg-1)
39,3 ab
Carbendazim +
Thiram (Produto A) + IP
137 d
45
303 cde
37
1,86 b
29
34,0 d
Carbendazim +
Thiram (Produto B) + IP
199 bc
20
376 bc
21
1,61 b
39
38,1 b
Carboxin + Thiram + IP
185 bc
25
263 e
46
1,87 b
29
38,9 b
1
27
10
IP*
Fludioxonil + Metalaxyl-M + IP
188 bc
24
365 bcd
23
2,52 a
4
28,8 e
Fludioxonil + Metalaxyl-M +
Thiabendazole + IP
200 bc
19
303 cde
37
1,71 b
35
35,3 c
Fluazinam + Tiofanato
metílico + IP
173 c
30
296 de
37
2,77 a
-
35,4 c
Fipronil + Tiofanato metílico +
Piraclostrobina + IP
207 b
16
390 b
19
2,77 a
-
33,3 d
Clorotalonil + Tiofanato
metílico + IP
196 bc
21
393 b
19
2,86 a
-
33,8 d
Controle sem N
Controle com N
0e
0e
-
0,30 f
0,62 f
-
0,44 c
2,69 a
83
-
22,2 f
40,1 a
Redução (%)
0
13
3
10
15
14
43
-
C.V. (%)
8
12
11
2
Médias seguidas por letras distintas, na coluna, diferem entre si pelo teste de Tukey, a 1% de probabilidade.
*IP= inoculação padrão. Inoculante turfoso, aplicado na dose de 1 kg 50 kg -1 de sementes, com solução açucarada a 10% como adesivo, e contendo 10 9 células de rizóbio g-1
de inoculante.
35
No segundo experimento conduzido sob condições controladas de casa de
vegetação, utilizando-se vasos com substrato (areia e vermiculita) esterilizado,
verificou-se que todos os tratamentos de sementes com fungicidas afetaram
significativamente (p<0,01) o número e matéria seca de nódulos, em comparação com
as plantas do feijoeiro apenas inoculadas com a mistura das estirpes de R. tropici. A
redução no número de nódulos variou de 16% (fludioxonil + metalaxyl-M) até 50%
(carbendazim + thiram - Produto B), quando comparadas com as plantas somente
inoculadas (Tabela 4). Quanto à produção de matéria seca de nódulos, a redução variou
de 15 a 40%, pela aplicação dos fungicidas com fludioxonil + metalaxyl-M e
carbendazim + thiram (Produto B), respectivamente. Resultados similares foram
observados por Mercante et al. (2010), onde o número e matéria seca de nódulos
reduziram entre 77% e 96% com a aplicação dos fungicidas captan, carbendazim +
thiram, thiram e carboxim + thiram.
Quanto à produção de matéria seca da parte aérea das plantas, verificou-se um
incremento pela aplicação dos fungicidas fludioxonil + metalaxyl-M e fludioxonil +
metalaxyl-M + thiabendazole, quando comparado ao tratamento que recebeu apenas a
inoculação de rizóbio, sem aplicação de fungicidas (Tabela 4). Os fungicidas carboxim
+ thiram e fluazinam + tiofanato metílico afetaram significativamente a produção de
matéria seca da parte aérea do feijoeiro, enquanto os demais produtos foram similares (P
< 0,01) à aplicação do inoculante, isento de fungicidas (Tabela 4). Experimentos
conduzidos por Balardin et al. (2011), demonstraram que o efeito do tratamento de
sementes favoreceu o crescimento radicular, influenciando a absorção de água,
nutrientes e minimizando a redução de área foliar. Além disso, diversos trabalhos têm
demonstrado a influência das estrobilurinas, neste caso a piraclostrobina, na melhoria do
crescimento vegetal. Resultados obtidos por Balardin et al. (2011), demonstraram que o
crescimento da parte aérea foi aumentado pelo tratamento de sementes com
piraclostrobina + tiofanato metílico + fipronil.
Os teores de N total da parte aérea dos feijoeiros não foram afetados pelo uso
dos diferentes fungicidas no tratamento das sementes. Os teores de N da parte aérea
mais elevados foram verificados no tratamento com N mineral, sem aplicação de
fungicidas, não diferindo, contudo, da maioria dos tratamentos com aplicação de
fungicidas e do tratamento onde houve somente a inoculação com rizóbio (Tabela 4).
36
TABELA 4. Efeito da inoculação e do tratamento de sementes de feijoeiro (cultivar Pérola) com fungicidas, sobre o número de nódulos, matéria
seca de nódulos, matéria seca da parte aérea e nitrogênio total da parte aérea das plantas, em ensaio conduzido em casa de vegetação (vasos de
500 mL).
(n° planta-1)
Redução (%)
(mg planta-1)
Redução (%)
Matéria seca
da
parte aérea
(g planta-1)
IP
150 a
0
203 a
0
1,72 bcd
Carbendazim +
Thiram (Produto A) + IP
96 cde
36
153 bc
25
1,65 de
Carbendazim +
Thiram (Produto B) + IP
75 e
50
118 e
40
1,67 cde
Carboxin + Thiram + IP
114 bc
24
159 bc
20
1,62 e
6
30,9 ab
2
Fludioxonil + Metalaxyl-M + IP
126 b
16
170 b
15
1,85 a
-
27,9 ab
11
Fludioxonil + Metalaxyl-M +
Thiabendazole + IP
82 de
45
145 cd
25
1,85 a
Fluazinam + Tiofanato
metílico + IP
104 bcd
31
128 de
35
1,59 e
Fipronil + Tiofanato metílico +
Piraclostrobin + IP
117 bc
22
155 bc
20
1,80 ab
Clorotalonil + Tiofanato
metílico + IP
114 bc
24
162 bc
20
1,75 abc
Controle sem N
0f
-
0f
-
1,34 f
22
25,6 b
18
Controle com N
0f
-
0f
-
1,82 ab
-
34,3 a
-
C.V. (%)
12
Tratamentos
Número de nódulos
Matéria seca de nódulos
Nitrogênio
total
Redução (%)
(g kg-1)
Redução (%)
0
31,3 ab
0
4
32,0 ab
3
3
30,5 ab
-
14
26,88 ab
8
32,2 ab
-
6
29,3 ab
-
7
2
22
24,4 b
8
Médias seguidas por letras distintas, na coluna, diferem entre si pelo teste de Tukey, a 1% de probabilidade.
*IP= inoculação padrão. Inoculante turfoso, aplicado na dose de 1 kg 50 kg -1 de sementes, com solução açucarada a 10% como adesivo, e contendo 10 9 células de rizóbio g-1
de inoculante.
37
Ensaio conduzido à campo
De modo geral, verificou-se um efeito prejudicial dos fungicidas na nodulação
(massa seca de nódulos) das plantas de feijoeiro, embora numericamente não tenha sido
detectada diferença (p<0,01) em relação ao tratamento que recebeu inoculação com
rizóbios, sem aplicação de fungicida, exceto para a aplicação de fipronil + tiofanato
metílico + piraclostrobina. A redução do número de nódulos variou de 21% (fluazinam
+ tiofanato metílico) a 57% (fipronil + tiofanato metílico + piraclostrobina + IP), em
comparação com as plantas apenas inoculadas com as estirpes de R. tropici, sem
tratamento prévio das sementes com fungicidas (Tabela 5). Quanto à produção da
matéria seca de nódulos, os tratamentos com aplicação dos fungicidas carboxin + thiram
e fludioxonil + metalaxyl-M promoveram as reduções mais expressivas (83,6 e 84%,
respectivamente), quando comparado com as plantas de feijoeiro apenas inoculadas com
os rizóbios. Resultados experimentais obtidos por Araújo & Araújo (2006), em
condições controladas de casa de vegetação, demonstraram que, nos tratamentos com a
utilização de thiram, houve uma diminuição no número e na matéria seca de nódulos,
enquanto os tratamentos com carboxin + thiram também apresentaram uma diminuição
na matéria seca de nódulos, quando comparados ao tratamento somente com a
inoculação de estirpes de R. tropici. Em estudos conduzidos a campo com a cultura da
soja, Campo et al. (2009) verificaram que, em geral, todos os fungicidas testados
(contato e/ou sistêmico) apresentaram algum grau de toxicidade para as bactérias
inoculadas nodulantes da soja, refletindo numa redução da nodulação, quando
comparado com o tratamento onde as sementes foram apenas inoculadas. Contudo, estes
autores observaram que os efeitos são mais drásticos em áreas de primeiro cultivo de
soja. Em outros estudos, foi observado que a inoculação de estirpes de Bradrhizobium
japonicum, quando realizada em aplicação no sulco de semeadura, minimizou os efeitos
negativos na nodulação da soja e na produtividade da cultura pelo tratamento das
sementes com os fungicidas (CAMPO et al., 2010).
A produção de matéria seca da parte aérea foi afetada negativamente com a
aplicação dos fungicidas carbendazim + thiram (Produto B), fludioxonil + metalaxyl-M
+ thiabendazole, fluazinam + tiofanato metílico, fipronil + tiofanato metílico +
piraclostrobina e clorotalonil + tiofanato metílico, associado a aplicação do inoculante,
quando comparada com o tratamento que recebeu apenas a inoculação das estirpes de R.
tropici. Estudos realizados por Araújo et al. (2007), em condições de campo, mostraram
que não houve alteração significativa na produção de matéria seca da parte aérea das
38
plantas de feijoeiro, comparando as plantas tratadas com carbendazin + IP e aquelas
somente inoculadas com rizóbio.
Os teores de N na parte aérea das plantas situaram-se entre 38 e 45 g kg -1 ,
sendo estes valores considerados satisfatórios para o desempenho da cultura do feijoeiro
(OLIVEIRA et al., 1988). No presente estudo, verificou-se que o tratamento
correspondente à adubação mineral nitrogenada promoveu teores similares (p<0,01) de
N total na parte aérea, quando comparado com as plantas que receberam apenas a
inoculação (Tabela 5). Araújo et al. (2007) verificaram que a inoculação de sementes
tem a mesma capacidade de incorporação de nitrogênio às plantas, quando comparado à
adição de nitrogênio na forma mineral. Os fungicidas com os princípios ativos carboxin
+ thiram, fludioxonil + Metalaxyl-M, fipronil + tiofanato metílico + piraclostrobina e
clorotalonil + tiofanato metílico foram os que mais reduziram o acúmulo de N na parte
aérea das plantas de feijoeiro (Tabela 5).
A maioria dos fungicidas avaliados afetaram a produtividade da cultura do
feijoeiro. Contudo, os tratamentos com aplicação dos fungicidas com os princípios
ativos fipronil + tiofanato metílico + piraciostrobina, fludioxonil + metalaxyl-M +
thiabendazole e fludioxonil + metalaxyl-M proporcionaram rendimentos de grãos
similares (p<0,01) ao tratamento que recebeu apenas a inoculação padrão com rizóbio
(Tabela 5). O rendimento de grãos pela utilização do tratamento com fipronil +
tiofanato metílico + piraclostrobina + IP foi superior aos demais tratamentos com
aplicação de fungicidas.
Os tratamentos com a aplicação de carbendazim + thiram (Produto B) e
carboxin + thiram apresentaram menor produtividade, obtendo uma redução de 18,4% e
26,2% respectivamente, em comparação ao tratamento somente inoculado com rizóbio.
Revellin et al. (1993), verificaram, em cultivo a campo de soja, que, embora a aplicação
de carboxin + thiram + IP tenha reduzido significativamente o número e matéria seca de
nódulos em relação a inoculação padrão, a produtividade da cultura não foi afetada.
Estudos realizados por Balardin et al. (2011) mostraram que a utilização de
piraclostrobina no tratamento de sementes de soja, propiciou aumento significativo na
matéria seca de raízes e matéria seca da parte aérea das plantas. Estes autores
verificaram que as plantas oriundas de sementes tratadas com fipronil + tiofanato
metílico + piraclostrobina tiveram aumento no conteúdo de clorofila. Estas melhorias na
fisiologia das plantas, proporcionadas pela utilização de piraclostrobina + fipronil +
tiofanato metílico podem determinar melhorias nas condições da planta em expressar
39
maior capacidade produtiva. Neste contexto, Fagan et al. (2010) conduziram estudos à
campo e verificaram que a aplicação de piraclostrobina ocasionou incremento na taxa
fotossintética e as plantas tratadas com estrobilurina tiveram um acréscimo de 7 e 8% na
massa de mil grãos e de 1080 e 468 kg ha-1 na produtividade, quando comparado à
testemunha sem aplicação e o tratamento com triazol (tebuconazol), respectivamente.
Neste mesmo estudo, os resultados indicaram que a piraclostrobina (estrobilurina)
afetou a taxa de assimilação de carbono e de nitrogênio na cultura da soja, o que refletiu
na produtividade de grãos.
Contudo, deve-se salientar que os problemas fitossanitários estão entre os
principais problemas que limitam a produtividade da cultura do feijoeiro, uma vez que
as perdas anuais de produção são geralmente significativas (POSSE et al., 2010). Neste
contexto, a adoção de medidas apropriadas para o controle de doenças, como a
utilização de sementes certificadas e de cultivares resistentes, consiste na forma mais
eficaz e econômica para evitar a maioria das doenças. Considerando que a maioria dos
fungicidas avaliados no presente estudo apresentou, em algum grau de intensidade, um
efeito de toxicidade sobre os rizóbios inoculados nas sementes, conduzindo a perdas no
rendimento de grãos da cultura, a importância de tais medidas tornam-se ainda mais
relevantes.
40
TABELA 5. Efeito da inoculação e do tratamento de sementes de feijoeiro (cultivar Pérola) com fungicidas, sobre o número de nódulos, matéria
seca de nódulos, matéria seca da parte aérea, nitrogênio total da parte aérea das plantas e produtividade, em ensaio conduzido à campo.
Dourados, março – junho, 2012.
Tratamentos
Número de
nódulos
IP
(n° planta-1)
24 a
Matéria seca
de
nódulos
(mg planta-1)
22,0 a
Matéria seca
da
parte aérea
(g planta-1)
3,4 bc
Carbendazim +
Thiram (Produto A) + IP
12 abc
5,5 d
3,6 b
42 bc
945 c
Carbendazim +
Thiram (Produto B) + IP
13 abc
9,2 c
2,2 e
43 abc
854 d
Carboxin + Thiram + IP
Fludioxonil + Metalaxyl-M + IP
13 abc
12 abc
3,6 de
3,5 de
3,6 b
3,5 b
39 de
39 de
841 d
1095 b
Fludioxonil + Metalaxyl-M +
Thiabendazole + IP
15 ab
13,1 b
2,8 d
43 abc
1161 ab
Fluazinam + Tiofanato
metílico + IP
19 ab
13,6 b
2,7 d
42 bc
998 c
Fipronil + Tiofanato metílico +
Piraclostrobina + IP
10 bc
8,9 c
3,1 cd
41 cd
1247 a
Clorotalonil + Tiofanato
metílico + IP
14 abc
15,5 b
2,3 e
38 e
958 c
Controle sem N
Controle com N
3c
2c
1,9 e
1,2 e
2,8 d
5,3 a
41 cde
45 a
837 d
818 b
C.V. (%)
47
13
5
2
4
Nitrogênio
total
Produtividade
(g kg-1)
43 ab
(kg ha-1)
1159 ab
Médias seguidas por letras distintas, na coluna, diferem entre si pelo teste de Tukey, a 1% de probabilidade.
*IP= inoculação padrão. Inoculante turfoso, aplicado na dose de 1 kg 50 kg -1 de sementes, com solução açucarada a 10% como adesivo, e
contendo 109 células de Rhizobium g-1 de inoculante.
41
4 Conclusões
1- A sobrevivência das estirpes de R. tropici inoculadas nas sementes de feijoeiro foi
afetada pela aplicação dos fungicidas avaliados, principalmente pelos produtos com
modo de ação por contato.
2- De modo geral, a aplicação de fungicidas ocasionou uma redução na nodulação das
plantas de feijoeiro, especialmente na massa nodular, tanto nos ensaios conduzidos em
substrato esterilizado, sob condições de casa de vegetação, quanto no experimento a
campo, onde também observou-se uma redução na produtividade da cultura pela
aplicação da maioria dos fungicidas avaliados.
3- A aplicação dos fungicidas contendo os princípios ativos fipronil + tiofanato metílico
+ piraclostrobina, fludioxonil + metalaxyl-M + thiabendazole e fludioxonil + metalaxylM não afetaram a produtividade do feijoeiro, embora tenha afetado a nodulação
(matéria seca de nódulos) das plantas. Por outro lado, os fungicidas que mais afetaram o
rendimento de grãos da cultura foram carbendazim + thiram (Produto B) e carboxin +
thiram.
42
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48
CAPÍTULO 3 – APLICAÇÃO DOS MICRONUTRIENTES COBALTO E
MOLIBDÊNIO EM SEMENTES DE FEIJOEIRO E SEUS EFEITOS NA
SOBREVIVÊNCIA DE RIZÓBIOS E NA NODULAÇÃO DAS PLANTAS
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da aplicação dos micronutrientes Co e
Mo em semente de feijoeiro sobre a sobrevivência dos rizóbios, nodulação e fixação
biológica do nitrogênio na cultura do feijoeiro. Foram conduzidos ensaios em
laboratório, utilizando-se dois métodos baseados no número mais provável-NMP: (1)
Diluição e contagem direta em placas (método de espalhamento) e (2) Diluição e
infecção em plantas (processo indireto). Em outro ensaio conduzido sob condições de
casa de vegetação, utilizando-se substrato esterilizado, foram avaliados os efeitos da
aplicação dos micronutrientes Co e Mo sobre a sobrevivência dos rizóbios, nodulação
(número e matéria seca de nódulos), matéria seca da parte aérea e teores de nitrogênio
total da parte aérea. Os tratamentos utilizados nos ensaios correspondem aos seguintes
inoculantes: (1) CIAT 899 + PRF 81 Inoculante turfoso (IT); (2) CIAT 899 + PRF 81
Inoculante líquido (IL); (3) CPAO 12.5L2 Inoculante líquido (IL); (4) CPAO 2.11L
Inoculante líquido (IL). Todos os tratamentos foram avaliados com e sem adição de
cobalto e molibdênio (CoMo) nas sementes. A sobrevivência das estirpes e isolados de
rizóbios inoculados foi prejudicada pela aplicação de CoMo nas sementes de feijoeiro,
exceto o tratamento CIAT 899 + PRF 81 (IT) através do método de diluição e infecção
em plantas (processo indireto). Observou-se ainda, que a aplicação de CoMo nas
sementes de feijoeiro associado a inoculação dos rizóbios, reduziu o número e a matéria
seca de nódulos, bem como o nitrogênio da parte aérea das plantas.
Palavras-chave: fixação biológica de nitrogênio, inoculantes, compatibilidade.
49
1 Introdução
A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) no Brasil está presente na
maioria dos sistemas de produção e em todas as regiões brasileiras, sendo cultivada por
pequenos e grandes produtores, revestindo-se de grande importância econômica e social
(STRALIOTTO et al., 2002). Na safra 2011/2012, o Brasil apresentou a maior produção
mundial de feijão, alcançando 2,9 milhões de toneladas (CONAB, 2012). A
produtividade média nacional foi de 894 kg ha -1 nesta safra, enquanto que no Estado de
Mato Grosso do Sul, a produtividade média foi de 1.262 kg ha -1 (CONAB, 2012).
De modo geral, a cultura do feijoeiro apresenta baixa produtividade média, o
que é atribuído, entre outros fatores, à baixa disponibilidade de nutrientes no solo,
principalmente, de nitrogênio. Considerando que o N é um dos nutrientes requeridos em
maiores quantidades pelo feijoeiro e os solos tropicais são, em geral, pobres neste
nutriente, o seu suprimento adequado torna-se de fundamental importância para a
obtenção de maiores rendimentos nesta cultura (MALAVOLTA, 1989). Entretanto, os
solos da maioria das áreas produtoras de feijão, tal como os solos da região de Cerrados,
são caracterizados pela deficiência de diversos nutrientes, podendo ser um fator crítico
ao desempenho simbiótico das leguminosas e à sua produtividade (MUNNS &
FRANCO, 1982).
As principais formas de fornecimento de N à cultura são os fertilizantes
nitrogenados e o processo de fixação biológica de nitrogênio atmosférico (FBN),
através da simbiose do feijoeiro com bactérias do grupo dos rizóbios. No entanto, a
aplicação de N mineral nos solos tropicais pode apresentar, às vezes, baixa frequência
de resposta, com o aproveitamento do adubo nitrogenado normalmente inferior a 50%,
devido às perdas de N por lixiviação, volatilização e desnitrificação (SORATTO et al.,
2003). O N perdido nesse processo é altamente poluente e, uma vez carreado para o
lençol freático, provoca a contaminação dos aquíferos subterrâneos, rios e lagos.
Todavia, a adubação com N mineral tem gerado um maior custo de produção e
questionamentos sobre qual a melhor fonte nutricional (BARBOSA FILHO, 2005).
Por outro lado, o processo de FBN, como forma de suplementar o requerimento
de nitrogênio pelo feijoeiro, pode aumentar a produtividade média nacional, sem o uso
de adubos nitrogenados, alcançando patamares de produtividade acima de 2.500 kg ha -1,
sendo um importante fator para a redução dos custos de produção (HUNGRIA et al.,
2000; PELEGRIN et al., 2009). Além disso, a FBN influencia positivamente a
50
qualidade do solo, por evitar todos os problemas relacionados à poluição causada pelos
adubos nitrogenados (HUNGRIA et al., 1997).
No entanto, diversos fatores podem limitar a simbiose entre estirpes de rizóbio
e o feijoeiro, destacando-se a acidez do solo, pH baixo, concentrações elevadas de Al
tóxico e temperaturas elevadas (MARTINEZ-ROMERO et al., 1991; MERCANTE,
1993). Do mesmo modo, outros fatores prejudiciais têm sido detectados, como a
aplicação diretamente nas sementes de produtos contendo cobalto e molibdênio, devido
a formulações salinas, ou com pH baixo, podendo afetar drasticamente a sobrevivência
da bactéria, a nodulação e a eficiência do processo de FBN (MERCANTE et al., 2011;
EMBRAPA, 2010). Os resultados experimentais obtidos por Hungria et al. (2007)
demonstraram, na cultura da soja, que a aplicação de Co e Mo nas sementes, por se
tratar de formulações salinas ou com pH baixo, pode afetar drasticamente a
sobrevivência da bactéria, a nodulação e a fixação biológica de N 2.
Contudo, deve-se considerar a importância do Co e Mo para a nutrição das
plantas. O molibdênio é um micronutriente que desempenha papel fundamental na
nutrição das plantas, devido sua função estar relacionada com o metabolismo do
nitrogênio e fazendo parte de duas metaloenzimas: a nitrogenase, que participa na
fixação simbiótica do nitrogênio e a redutase do nitrato, que atua na redução do nitrato à
amônia na planta (ARAÚJO et al., 2008). Da mesma forma, o cobalto tem importância
no processo de FBN, sendo necessário para a síntese da cobalamina (Vitamina B12),
que participa dos passos metabólicos para a formação da leghemoglobina, e regula sua
concentração nos nódulos, impedindo a inativação da enzima nitrogenase (MENGEL &
KIRKBY, 2001).
Considerando a utilização de inoculantes microbianos, juntamente com a
adoção da aplicação dos micronutrientes Co e Mo nas sementes de feijoeiro, torna-se
indispensável à avaliação da compatibilidade destas práticas, de modo a garantir os
patamares mais elevados de FBN e incrementos na produtividade do feijoeiro. Assim, o
objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da aplicação dos micronutrientes
cobalto e molibdênio em semente de feijoeiro sobre a sobrevivência do rizóbio, a
nodulação e crescimento das plantas.
51
2 Material e Métodos
Os estudos foram conduzidos em laboratório e sob condições controladas de
casa de vegetação.
Em todos os ensaios, utilizou-se a cultivar Pérola, do grupo comercial
Carioca, com ciclo de 90 a 100 dias, de porte semi-ereto.
Foram avaliados os isolados de rizóbio pertencentes à Coleção de Culturas de
Microrganismos Multifuncionais da Embrapa Agropecuária Oeste: CPAO 12.5L2 e
CPAO 2.11L, para a produção dos inoculantes líquidos, contendo 109 células viáveis
mL-1, sendo aplicado na dose de 6mL kg-1 de semente. A mistura das estirpes CIAT 899
(=SEMIA 4077) e PRF 81 (=SEMIA 4080) de Rhizobium tropici, recomendadas para a
produção comercial de inoculantes no Brasil, foi utilizada em veículos líquido e turfoso
(produzido na Embrapa Cerrados), com a concentração de células de 6x109 células de
Rhizobium g-1 de inoculante e 6x109 células mL-1 respectivamente. Antes da aplicação
do inoculante turfoso foi adicionada solução açucarada, a 10% (p:v), visando à melhoria
de sua aderência às sementes.
Os tratamentos utilizados nos ensaios correspondem aos seguintes inoculantes:
(1) CIAT 899 + PRF 81 produto turfoso (IT); (2) CIAT 899 + PRF 81 - Inoculante
líquido (IL); (3) CPAO 12.5L2 - Inoculante líquido (IL); (4) CPAO 2.11L - Inoculante
líquido (IL). Adicionaram-se, ainda, dois tratamentos sem adição de inoculante (com e
sem adubação mineral nitrogenada) nos ensaios conduzidos em condições controladas
de casa de vegetação. Todos os tratamentos foram avaliados com e sem adição de
cobalto e molibdênio (CoMo) nas sementes, utilizando-se um produto comercial, na
dose de 200mL 100 kg -1 de sementes.
Sobrevivência de rizóbios em sementes de feijoeiro
As avaliações de estimativa do número de células de rizóbio em sementes de
feijoeiro com a aplicação de CoMo e inoculadas com os rizóbios CIAT 899 e PRF 81,
CPAO 12.5L2 e CPAO 2.11L foram realizadas por dois métodos baseados no número
mais provável-NMP: (1) Diluição e contagem direta em placas (método de
espalhamento) e (2) Diluição e infecção em plantas (processo indireto), utilizando-se a
tabela adaptada de Andrade & Hamakawa (1994).
No método do NMP por espalhamento, a sobrevivência dos rizóbios foi
avaliada em dois momentos distintos: 0 (zero) e 24 horas após a aplicação dos
inoculantes microbianos nas sementes de feijoeiro tratadas ou não com CoMo.
52
Inicialmente, retirou-se uma amostra de 10 g das sementes de feijoeiro, previamente
tratadas com CoMo, e inoculadas com as diferentes estirpes de rizóbio. Em seguida, as
sementes foram colocadas em erlenmeyers contendo 90 mL de água destilada
esterilizada, sendo adicionados 300 μL de Tween 80. Após a agitação, foram realizadas
três diluições sucessivas, sendo a contagem das bactérias avaliada nas concentrações 10 3
, 10-4 e 10-5, em placas contendo meio de cultura agar-levedura-manitol-YMA
(VINCENT, 1970). As placas com as diluições foram incubadas em estufa a 28°C, pelo
período de três dias. A contagem das bactérias foi efetuada nas placas que apresentaram
de 30 a 300 UFC (unidades formadoras de colônias).
No teste de infectividade dos rizóbios em feijoeiro, foram utilizadas as três
diluições (10-3, 10-4 e 10-5) para inoculação no ensaio em casa de vegetação, preparado
com vasos de 500 mL contendo substrato (areia + vermiculita, 1:1 - v:v) esterilizado.
Foram utilizadas quatro sementes por vaso, sendo cada uma inoculada com 0,5 mL das
diluições 10-3, 10-4 e 10-5. Aos 15 dias após a emergência das plantas, foi realizado o
desbaste, deixando-se duas plantas por vaso. As avaliações de presença e ausência de
nódulos nas plantas inoculadas foram realizadas aos 21 dias após a semeadura, e cada
planta foi referida como positiva (sucesso), quando existentes um ou mais nódulos, e
negativa (insucesso), quando nenhum nódulo havia sido formado.
A partir dos resultados positivos ou negativos em cada uma das diluições das
suspensões inoculadas foi estimado, na acepção matemática, o número de células
viáveis de rizóbio na amostra (HUNGRIA & ARAUJO, 1994). Esses valores foram
encontrados na tabela adaptada de Andrade e Hamakawa (1994).
Ensaios conduzidos em casa de vegetação
No ensaio sob condições controladas de casa de vegetação, utilizaram-se vasos
de Leonard contendo substrato (areia + vermiculita, 1:1 – v:v) esterilizado, onde foram
semeadas quatro sementes de feijoeiro, cv. Pérola, por vaso. Aos 15 dias após a
emergência das plantas foi realizado o desbaste, deixando-se duas plantas por vaso.
As sementes foram previamente tratadas com CoMo conforme a recomendação
descrita anteriormente, e inoculadas com os diferentes rizóbios. No tratamento controle,
em que as sementes não receberam a aplicação de CoMo e inoculante, as sementes
foram previamente esterilizadas superficialmente, sendo tratadas com álcool absoluto
por 30 segundos, em seguida, imersas em hipoclorito de sódio (10%), por 3 minutos, e
lavadas dez vezes com água destilada esterilizada (VINCENT, 1970).
53
Durante o período de crescimento, as plantas foram supridas com solução
nutritiva sem nitrogênio (NORRIS; T`MANNETJE, 1964, modificada).
A coleta das plantas foi realizada aos 45 dias após a emergência das plantas
(DAE), separando-se a parte aérea do sistema radicular. A parte aérea foi acondicionada
em sacos de papel e levada para a secagem em estufa à 60°C. Os nódulos foram
destacados das raízes para posterior contagem.
Foram realizadas as seguintes avaliações: número de nódulos, matéria seca de
nódulos (secagem em estufa à 60°C, até atingirem peso constante), matéria seca da parte
aérea (secagem em estufa à 60°C, até atingirem peso constante) e teor de nitrogênio
total da parte aérea. Na determinação do nitrogênio total da parte aérea, foi utilizado o
método de Kjeldahl (semi-micro), segundo Malavolta et al. (1997).
O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso, num esquema
fatorial 6 x 2, com seis repetições. Os dados coletados foram submetidos à análise de
variância, a 5% de probabilidade (P < 0,05) e, quando significativas, as médias foram
comparadas pelo teste de Tukey (P < 0,01), ao nível de 1% de probabilidade. Essas
análises foram realizadas através do programa estatístico ASSISTAT (SILVA &
AZEVEDO, 2002).
3 Resultados e Discussão
Sobrevivência de rizóbios em sementes de feijoeiro
Os resultados das avaliações de sobrevivência “in vitro” das estirpes CIAT 899
+ PRF 81 (IT) e CIAT 899 + PRF 81 (IL) de R. tropici e os isolados CPAO 12.5 L2 (IL)
e CPAO 2.11 L (IL), com e sem a aplicação de CoMo estão apresentados na Tabela 1.
Pode-se observar que, no primeiro momento (0 hora) após a inoculação dos rizóbios, os
tratamentos CIAT 899 + PRF 81 (IT) e CPAO 12.5 L2 (IL) com a adição de CoMo
obtiveram menor número de células dos rizóbios, quando comparados aos mesmos
tratamentos sem adição de CoMo. Resultados semelhantes foram observados por Albino
& Campo (2001), na cultura da soja, onde demonstraram que a adição de Mo na
semente antes da inoculação reduziu o número de células viáveis de Bradyrhizobium,
em relação ao tratamento somente inoculado, confirmando, assim, que este
micronutriente aplicado na semente afeta a sobrevivência do rizóbio. Experimentos
conduzidos por Tong & Sadowsky (1994) demonstraram que doses altas de Mo afetam
a sobrevivência de estirpes de Bradyrhizobium, podendo diminuir o número de células,
54
prejudicando a nodulação e a FBN, refletindo negativamente na produtividade. Silva et
al. (2011) relataram que a aplicação de CoMo nas sementes de soja poderá, em função
de pH, da salinidade e da ação bactericida para os rizóbios de alguns produtos, reduzir a
sobrevivência da bactéria.
No período seguinte de contato dos inoculantes microbianos com o CoMo (24
horas), verificou-se que nas sementes de feijoeiro tratadas com CoMo o número de
células diminui com o aumento do tempo de contato com todas as estirpes inoculadas.
Ainda neste mesmo período, pode-se observar que os tratamentos CIAT 899 + PRF 81
(IT) e CPAO 12.5 L2 (IL) com a adição de CoMo obtiveram novamente o menor
número de células, quando comparados com sementes sem a adição de CoMo.
Com CoMo
Sem CoMo
Tabela 1. Quantificação de células de rizóbio em sementes de feijoeiro, com e sem
aplicação de cobalto e molibdênio (CoMo), em dois momentos: logo após a aplicação
de CoMo e 24 horas depois, utilizando-se o método de diluição e contagem direta em
placas (método de espalhamento).
Tratamentos
CIAT 899 + PRF 81 (IT)*
0 hora
4,03 x 106
24 horas
5,5 x 105
CIAT 899 + PRF 81 (IL)*
3,06 x 106
3 x 105
CPAO 12.5 L2 (IL)
3,16 x 106
4,03 x 105
CPAO 2.11 L (IL)
3,46 x 106
3 x 105
CIAT 899 + PRF 81 (IT)
3 x 106
4 x 105
CIAT 899 + PRF 81 (IL)
3,2 x 106
3 x 105
CPAO 12.5 L2 (IL)
3 x 106
3 x 105
CPAO 2.11 L (IL)
3,7 x 106
3 x 105
*(IT)= Inoculante turfoso, aplicado na dose de 1 kg 50 kg-1 de sementes. *(IL)= Inoculante líquido,
aplicado a dose 6mL kg-1 de semente. Foi utilizada como adesivo, solução açucarada, a 10%, nos
tratamentos com inoculante turfoso.
Entretanto, os resultados de infectividade das estirpes CIAT 899 e PRF 81 (IL)
e dos isolados CPAO 12.5 L2 (IL) e CPAO 2.11 L (IL), inoculados em plantas de
feijoeiro, utilizando-se as diluições 10 -3, 10-4 e 10-5, demonstraram que, quando houve a
adição dos micronutrientes CoMo associados as bactérias fixadoras de nitrogênio, a
sobrevivência dos rizóbios foi afetada mesmo na diluição 10-5, uma vez que a
concentração de células de rizóbios mL-1 diminuíram em comparação aos tratamentos
somente com a inoculação das bactérias, ou seja, sem aplicação de CoMo.
55
Contudo, o tratamento com as estirpes CIAT 899 + PRF 81 (IT) com aplicação
de CoMo, não apresentou diminuição na concentração de células de rizóbios mL-1,
quando comparou-se o mesmo tratamento sem adição de CoMo. Hungria et al. (2001)
relataram que o inoculante à base de turfa é o veículo que mais auxilia na sobrevivência
do rizóbio, visto que a turfa oferece uma boa proteção em condições de estresses
hídrico, temperaturas elevadas, pH e salinidade, que podem ocorrer durante a
semeadura.
Dentre os tratamentos com a aplicação de CoMo, o tratamento com as estirpes
CIAT 899 + PRF 81 (IT) apresentou maior concentração de células de rizóbios. Já o
tratamento CPAO 2.11 L (IL) obteve menor concentração de células em comparação
aos demais tratamentos com adição de CoMo (Tabela 2).
Com CoMo
Sem CoMo
Tabela 2. Efeito da aplicação de CoMo sobre a nodulação em sementes de feijoeiro,
realizado em condições de casa de vegetação, utilizando-se rizóbios selecionados em
três concentrações distintas (10-3, 10-4 e 10-5), através do método de diluição e infecção
em plantas (processo indireto).
N° de células de
Tratamentos
Fator NMP
rizóbios mL-1
CIAT 899 + PRF 81 (IT)*
2,106
2,10 x 10-5
CIAT 899 + PRF 81 (IL)*
109,849
109,84 x 10-5
CPAO 12.5 L2 (IL)
23,97
23,97 x 10-5
CPAO 2.11 L (IL)
2,758
2,75 x 10-5
Controle sem N
0
Controle com N
0
CIAT 899 + PRF 81 (IT)
29,17
29,17 x 10-5
CIAT 899 + PRF 81 (IL)
1,469
1,46 x 10-5
CPAO 12.5 L2 (IL)
7,488
7,48 x 10-5
CPAO 2.11 L (IL)
0,357
0,35 x 10-5
Controle sem N
0
Controle com N
0
*(IT)= Inoculante turfoso, aplicado na dose de 1 kg 50 kg-1 de sementes. *(IL)= Inoculante líquido,
aplicado a dose 6mL kg-1 de semente. Foi utilizada, como adesivo, solução açucarada, a 10%, nos
tratamentos com inoculante turfoso.
Ensaios conduzidos em casa de vegetação
No experimento em casa de vegetação, conduzido em vasos de Leonard, os
resultados mostraram que todos os tratamentos com a aplicação de CoMo em sementes
de feijoeiro associado à inoculação de diferentes rizóbios, diferiram significativamente
dos tratamentos sem CoMo, ou seja, somente com a inoculação dos rizóbios,
promovendo uma redução no número e matéria seca de nódulos (Tabela 3). As reduções
56
ocasionadas pela utilização dos micronutrientes CoMo no tratamento de sementes
chegaram a 20,2% e 16,5%, respectivamente, para o número e matéria seca de nódulos,
quando as plantas de feijoeiro foram tratadas com CoMo associado as estirpes CIAT
899 + PRF 81 (IT). Experimentos conduzidos em casa de vegetação por Albino &
Campo (2001), demonstraram que a aplicação de Mo nas sementes de soja, em virtude
de seu contato com o inoculante, reduziu a nodulação e a fixação biológica de N 2.
Resultados obtidos por Campo & Lantmann (1998) demonstraram que a aplicação de
Co (0,75 g ha-1) nas sementes de soja, de forma isolada ou junto com o molibdênio,
afetou a nodulação. Resultados semelhantes foram obtidos por Marcondes & Caires
(2005), onde a aplicação de molibdênio e cobalto na semente de soja cultivada em solo
com pH (CaCl2 0,01 mol L-1) 5,2 não influenciou na nodulação das planta. Porém, nas
avaliações realizadas por Dourado Neto et al. (2012), referentes à nodulação de plantas,
observou-se resposta positiva da aplicação de cobalto e molibdênio, evidenciando-se um
incremento no número de nódulos.
Dentre os tratamentos com a aplicação de CoMo, os tratamentos CIAT 899 +
PRF 81 (IL) e CPAO 2.11L (IL) apresentaram significativamente maior número de
nódulos. Já para a matéria seca de nódulos, os tratamentos CIAT 899 + PRF 81 (IT) e
CPAO 2.11L (IL) com CoMo demonstraram maiores pesos (Tabela 3).
Os tratamentos CIAT 899 + PRF 81 (IT), CIAT 899 + PRF 81 (IL) e CPAO
2.11L (IL) com a utilização de CoMo, apresentaram redução a produção de matéria seca
da parte aérea, quando comparado aos tratamentos sem a aplicação de CoMo. No
entanto, os tratamentos CIAT 899 + PRF 81 (IT), Controle sem N e Controle com N
apresentaram valores iguais de matéria seca da parte aérea, quando compados aos
mesmos tratamentos, sem a aplicação de CoMo. Leite et al. (2009), em experimento
realizado a campo com doses de Mo (0; 30; 60; 90 e 120 g ha -1), aplicadas em sementes
feijoeiro, observaram que não houve efeito significativo do molibdênio sobre a matéria
seca da parte aérea. Resultados obtidos por Dourado Neto et al. (2012) demonstraram
que a matéria seca da parte aérea foi menor quando realizou-se aplicação de CoMo em
sementes de soja, em relação aos tratamento sem aplicação em estágio V4.
Portanto, todos os tratamentos com CoMo, exceto os controles, apresentaram
menores teores de Nitrogênio da parte aérea, quando comparados aos tratamentos sem
adição de CoMo. Resultados encontrados por Campo e Lantmann (1998) evidenciam
que a aplicação de CoMo nas sementes de soja não melhorou a absorção de nitrogênio
pela cultura. Experimentos conduzidos por Marcondes & Caires (2005), na cultura da
57
soja, mostraram que a aplicação de molibdênio nas sementes não influenciou a
concentração de nitrogênio nas folhas de soja. Porém, Ahmed & Evans (1960)
obtiveram efeito positivo da adição de cobalto na nodulação e na absorção de nitrogênio
pela soja cultivada em solução nutritiva.
58
TABELA 3. Efeito da inoculação com diferentes rizóbios e da aplicação de CoMo em sementes de feijoeiro (cultivar Pérola), sobre o número de
nódulos, matéria seca de nódulos, matéria seca da parte aérea e nitrogênio total da parte aérea num experimento conduzido em casa de vegetação
(vasos de Leonard).
Sem CoMo
Tratamentos
Matéria seca
de
nódulos
Matéria seca
da
parte aérea
Nitrogênio
Total
CIAT 899 + PRF 81 (IT)*
(n° planta-1)
208 cA
Redução (%)
0
(mg planta-1)
608,3 bA
Redução (%)
0
(g planta-1)
3,6 aA
(g kg-1)
26 bA
CIAT 899 + PRF 81 (IL)*
CPAO 12.5L2 (IL)
255 aA
179 dA
0
0
530,0 cA
600,0 bA
0
0
2,9 cA
3,5 aA
27 bA
31 aA
CPAO 2.11L (IL)
Controle sem N
242 bA
0 eA
0
-
624,5 aA
0 dA
0
-
3,2 bA
0,5 dA
30 aA
16 cA
Controle com N
Com CoMo
Número de nódulos
0 eA
-
0 dA
-
2,9 cA
30 aB
CIAT 899 + PRF 81 (IT)
166 bB
20,2
580,0 aB
16,5
3,3 aB
22 cB
CIAT 899 + PRF 81 (IL)
210 aB
17,6
457,5 cB
13,6
2,9 bA
23 cB
CPAO 12.5L2 (IL)
168 bB
6
560,0 bB
6,6
3,4 aB
27 bB
CPAO 2.11L (IL)
200 aB
17,3
587,5 aB
6
2,9 bB
25 bB
0 cA
-
0 dA
-
0,5 cA
16 dA
Controle sem N
Controle com N
0 cA
0 dA
2,9 bA
34 dA
*(IT)= Inoculante turfoso, aplicado na dose de 1 kg 50 kg-1 de sementes, contendo 6x109 células de Rhizobium g-1 de inoculante. *(IL)=
Inoculante líquido, aplicado a dose de 6mL kg-1 de semente, contendo 6x109 células de Rhizobium mL-1 de inoculante. Utilizou-se como
adesivo solução açucarada, a 10%. Médias seguidas por letras maiúsculas diferem estatisticamente entre os tratamentos com e sem
CoMo, e as letras minúsculas diferem estatisticamente dentro dos tratamentos com e sem CoMo. Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível
de 1% de probabilidade.
59
4 Conclusões
1- A sobrevivência das estirpes e isolados de rizóbios inoculados foi prejudicada pela
aplicação de CoMo nas sementes de feijoeiro, exceto o tratamento CIAT 899 + PRF 81
(IT).
2- A aplicação de CoMo nas sementes de feijoeiro associado a inoculação dos rizóbios,
reduziu o número e a matéria seca de nódulos, bem como o nitrogênio da parte aérea das
plantas.
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