UBA1- BQ
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Sumário:
•Princípios básicos: velocidade de reacção
•Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
- Concentração de enzima
-Concentração de substrato
-equação de Michaelis-Menten
-Determinação dos parâmetros cinéticos: equação de Lineweaver-Burk
- pH
-Temperatura
•As Enzimas no Diagnóstico Clínico
-As isoenzimas e as doenças do coração
-diagnóstico do enfarte do miocárdio
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Princípios básicos: velocidade de reacção
A velocidade da reacção enzimática (V): é medida pela quantidade de produto
(ou produtos) formado por unidade de tempo.
•Velocidade inicial
•Velocidade num
instante t1
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Princípios básicos: velocidade de reacção
A velocidade é mais elevada no início e vai decrescendo com o tempo. Isto
acontece essencialmente porque:
P
reacção
mais lenta
vo
E
S
P
(i) com o aumento de [P], começa a dar-se
também a reacção inversa, P → S
(ii) [S] vai decrescendo ao longo do tempo
de reacção, o que também diminui a
velocidade da reacção directa S → P.
(iii) se a reacção for muito prolongada,
começa a haver desnaturação da molécula
enzimática.
reacção inicial
(mais elevada)
Tempo (t)
Para evitar estes problemas, utiliza-se sempre a velocidade inicial (vo), uma vez
que se estará então a contabilizar apenas S → P, com [S] conhecida e [P] = 0:
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
A- Concentração de Enzima
•Traçando um gráfico com as velocidades
obtidas nestas experiências, em função das
concentrações de enzima, verificamos que a
variação é linear
[E]
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
B- Concentração de substrato
•A relação entre a concentração de substrato
e as velocidades iniciais obtidas é hiperbólica.
V0
[S]
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
B- Concentração de substrato
•KM = concentração de S para a qual a velocidade da reacção é metade da
velocidade máxima (Vmax) ( metade de todos os locais activos estão ocupados)
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e Vmax)
•A equação que traduz o comportamento da curva de vo em função de [S] (curva de
Michaelis-Menten) é a equação de Michaelis-Menten:
Permite, após determinação experimental
das variações de v em função de [S], obter o
valor de Vmax e calcular KM
S1: maior afinidade
S2: menor afinidade
KM1
... KM é uma medida da afinidade da enzima
para o substrato (= 1/KM)
(KM elevado → afinidade baixa)
KM2
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e Vmax)
Devido às dificuldades de cálculo de KM através da equação de Michaelis -Menten,
procurou-se obter uma representação linear da relação entre V0 e S que pudesse ser
traduzida por uma recta...
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e Vmax)
Exemplo
velocidades iniciais de reacção da fosfatase
ácida a várias concentrações de glicerol, [S].
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e Vmax)
Como medir a eficiência de uma enzima em dadas condições???
Kcat=Vmax/Et
...usando a razão Kcat/KM (Kcat –velocidade de catálise máxima)
(Máxima)
Perfeição enzimática
Algumas enzimas aproximam-se destes valores...
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e Vmax)
Estas enzimas são limitadas apenas pela velocidade com que encontram o
substrato em solução
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
C- Efeito do pH
Os pH extremos modificam irremediavelmente a estrutura das enzimas, quer
devido a desnaturação, quer devido a alterações na ligação entre apoenzima e
coenzima
As enzimas
podem
apresentar
dois tipos de
curva de
actividade em
função do pH
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
C- Efeito do pH
possível efeito duma alteração de pH ao nível do centro activo de um enzima:
A. pH óptimo
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B. pH inferior ao óptimo (maior [H+])
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
C- Efeito do pH
Nem todas as enzimas têm o mesmo pH. Por exemplo, a pepsina, que hidrolisa
proteínas a péptidos no estômago, extremamente ácido, e a tripsina, que hidrolisa
péptidos a aminoácidos nas condições alcalinas do duodeno, têm óptimos de pH
adaptados ao seu ambiente
Em laboratório, quando estudamos a
actividade de um enzima, temos que ter
o cuidado de incluir um sistema tampão
no meio de ensaio, de modo a
estabilizar o pH;
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Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática:
C- Efeito da temperatura
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As Enzimas no Diagnóstico Clínico:
•Libertadas para o plasma por células especificas (pequeno nº)
(o figado liberta zimogénios envolvidos na coagulação)
Enzimas plasmáticas:
•Libertadas para o plasma durante o “turnover” celular (grande nº)
(s seus níveis mantêm-se extremamente constantes e em equilibrio)
Deste modo, determinando as variações da actividade enzimática no plasma sanguíneo,
podem-se diagnosticar doenças
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As Enzimas no Diagnóstico Clínico:
Algumas enzimas apresentam apenas
actividade elevada em órgãos
específicos
O aumento dos níveis plasmáticos
dessas enzimas reflecte danos nesses
tecidos
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As Enzimas no Diagnóstico Clínico:
•As isoenzimas e as doenças do coração
… têm a mesma função
mas pequenas diferenças
em aminoácidos
Podem ser separadas por
electroforese
•O padrão de isoenzimas plasmáticas pode servir para
detectar o local da lesão
LDH e CK
Especialmente úteis quando o electrocardiograma é
difícil de interpretar (episódios anteriores de doenças
cardíacas)
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As Enzimas no Diagnóstico Clínico:
•As isoenzimas e as doenças do coração: diagnóstico do enfarte do miocárdio.
•O miocárdio é o único tecido que possui + de 5% de
CK2 (MB) → presença MB = enfarte do Miocárdio
•CK2 (MB) → Pico de actividade às 24 h
•LDH → Pico de actividade das 36 às 40 h
•Importante no diagnóstico em pessoas que dão
entrada após 48 h o enfarte do miocárdio
•A presença de níveis elevados de CK3 (MM) é
indicativa de danos musculares do miocárdio.
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