MARIA SOCORRO GRANGEIRO
BIOPROSPECÇÃO DE AÇÃO ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES EM CULTURAS
DE CÉLULAS GLIAIS TRATADAS COM CATECOL
Feira de Santana, BA
2009
MARIA SOCORRO GRANGEIRO
BIOPROSPECÇÃO DE AÇÃO ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES EM CULTURAS
DE CÉLULAS GLIAIS TRATADAS COM CATECOL
Trabalho de pesquisa apresentado ao Programa
de Pós-graduação em Biotecnologia, da
Universidade Estadual de Feira de Santana como
parte dos requisitos necessários para obtenção do
título de Mestre em Biotecnologia.
Orientadora: Dra. Sílvia Lima Costa
Co-Orientador: Dr. Ramon dos Santos El-Bachá.
Feira de Santana
2009
2
RESUMO
Foi observado que catecol é tóxico para células de glioblastoma da linhagem GL-15 e
mostrou valores de IC50 : 2368µM e 252µM após 24 h e 72 h, respectivamente. O flavonóide
rutina teve um efeito citotóxico com valores de IC50: 622µM e 284µM, após 24 h e 72 h, de
tratamento respectivamente. O flavonóide quercetina em concentrações até seu limite de
solubilidade (100µM) e ácido ascórbico (AA) nas concentrações de 20 a 3000µM, não
mostraram toxicidade para células GL-15. Os flavonóides rutina e quercetina não protegeram
células GL-15 da citotoxicidade induzida pelo catecol e além disso induziram um aumento de
morte celular e formação de quinonas quando adotados em concentrações sub-tóxicas (0,6100µM) em células GL-15 submetidas ao dano oxidativo induzido pelo catecol. Por outro
lado, AA, em concentrações de 600 a 3000µM, protegeu células GL-15 do dano oxidativo
induzido pelo catecol, sugerindo atividade antioxidante. Nessas concentrações foi observada
redução total da formação de quinonas. Esses resultados mostram que os flavonóides rutina e
quercetina não apresentaram atividade antioxidante contra a toxicidade induzida pelo catecol
em células GL-15 e AA reverteu totalmente o dano celular induzido pelo catecol.
Palavras-chaves: antioxidantes, catecol, citotoxicidade, flavonóides e glioblastoma.
3
ABSTRACT
It was observed that catechol is toxic to GL-15 cells and showed IC50 values of 2368µM and
252µM after 24 h and 72 h, respectively. The flavonoid rutin had a cytotoxic with IC50 values
of 622µM and 284µM, after 24 h and 72 h, respectively. The flavonoid quercetin at
concentrations up to its limit of solubility (0.6-100µM) and ascorbic acid (AA) (20- 3000µM),
do not showed toxicity for GL-15 cells. The flavonoids rutin and quercetin didn’t protect the
GL-15 cells to catechol induced toxicity. Moreover they induced an increase in cell death and
quinone formation when adopted at sub-toxic concentrations (0.6-100µM) in GL-15 cells
subject to oxidative damage induced by catechol. On the other hand the ascorbic acid showed
a protective antioxidant activity in cell cultures subject to oxidative damage induced by
catechol. At concentrations of (20-300µM) ascorbic acid partially protected GL-15 cells from
cytotoxic damage induced by catechol, however at (600-3000µM) AA reduced totally the
formation of reactive quinones and protected cells from catechol toxicity. These results show
that the flavonoids rutin and quercetin not have antioxidant activity against the toxicity
induced by catechol in gliais cells, moreover, AA reversed completely the cellular damage
induced by catechol.
Key words: catechol, antioxidants, ascorbic acid, rutin, quercetin, and glia.
4
SUMARIO
1. INTRODUÇÃO
07
2. REVISÃO DE LITERATURA
08
2.1. TOXICIDADE DO BENZENO E SEU METABÓLITO CATECOL
08
2.2. O ESTRESSE OXIDATIVO (EO)
11
2.3. SISTEMAS ANTIOXIDANTES
12
2.4. PROPRIEDADES BIOLÓGICAS E POTENCIAL ANTIOXIDANTE DA
14
VITAMINA C
2.5. FLAVONÓIDES
15
2.5.1. Metabolismo e toxicidade de flavonóides
16
2.5.2. Potencial antioxidante de flavonóides
18
2.6. BREVE SUMARIO DE ASPECTOS FUNCIONAIS E PLASTICIDADE
DE CÉLULAS DO SNC
21
2.6.1. Culturas de células do SNC como modelos de estudos farmacológicos e
toxicológicos
22
3. ARTIGO CIENTIFICO: EFFECTS OF FLAVONOIDS AND VITAMIN C ON
OXIDATIVE DAMAGE INDUCED BY CATECHOL IN GLIOBLASTOMA
CELLS. [EFEITO DE FLAVONOIDES E VITAMINA C NO DANO OXIDATIVO
INDUZIDO PELO CATECOL EM CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA]
24
3.1. INTRODUCTION
25
3.2. MATERIALS AND METHODS
27
3.2.1- Glial cell cultures
27
3.2.2- Drugs and treatments
27
3.2.3- Test of cell viability
28
3.2.4- - Test of antioxidant activity of flavonoids rutin, quercetin and ascorbic
acid in cell cultures treated with catechol.
28
3.2.5- Quinone formation
29
5
3.2.6- Statistical analysis of results
29
3.3. RESULTS
30
3.3.1. Cytoxicity of catechol, rutin, quercetin and ascorbic acid (AA)
30
3.3.2. Protective activity against cytotoxicity induced by catechol
31
3.3.3 Morphological analysis
32
3.4. DISCUSSION
37
3.4. REFERENCES
40
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
44
5. REFERÊNCIAS
46
ANEXO I: PRODUÇÃO CIENTÍFICA DA AUTORA
64
6
1 INTRODUÇÃO
A exposição de trabalhadores e de pessoas residentes em áreas próximas à indústria
petrolífera e petroquímica a altas concentrações de substâncias aromáticas, como o benzeno,
constitui um sério risco para a saúde (HAQUE et al., 2003; GLASS & GRAY, 2001; RANA
& VERMA, 2005; WANG, 2008; JAMALL & WILLHITE, 2008). A exposição ao benzeno
ocorre principalmente pela via respiratória e, em função de sua lipossolubilidade é
preferencialmente armazenado no tecido adiposo (RUIZ et al., 1993). Assim, o sistema
nervoso central (SNC), que é rico em lipídios, poderia ser local para o armazenamento dessa
substância. O benzeno é metabolizado por ação de enzimas específicas no fígado. Dentre seus
metabólitos intermediários e finais, destacam-se a hidroquinona e o catecol (1,2dihidroxibenzeno) (RICKERT et al., 1979; GAD-EL-KARIM et al., 1989; SNYDER &
HEDLI, 1996; RANA & VERMA, 2005; AHMAD, 2007). Estes produtos podem induzir
estresse oxidativo e danificar macromoléculas celulares ligando-se covalentemente
(ATKINSON, 2008). O catecol facilmente se oxida para formar quinonas potencialmente
tóxicas e espécies reativas de oxigênio (EROs) (BENNDORF et al., 2001). Lesões oxidativas
têm um importante papel em muitas doenças neurodegenerativas (GILGUN et al., 2004) e
existe um crescente interesse em se estudar a toxicidade de catecóis. A neurotoxicidade da
dopamina, por exemplo, que é um catecol, e seus metabólitos oxidados, estão associados à
geração de EROs que induzem morte celular programada (HAQUE et al., 2003; WANG et
al., 2008).
A dieta humana é rica em produtos fitoquímicos, muitos deles com atividade
biológica. A vitamina C, importante antioxidante natural, é conhecido por reduzir o risco de
desordens degenerativas como o mal de Alzheimer (PERRIG et al., 1997; MASAKI, et al.,
2000). Outra classe de moléculas que tem demonstrado propriedade antioxidante são os
flavonóides, compostos abundantes em plantas e, conseqüentemente, na alimentação de
humanos, capazes de proteger tecidos contra danos oxidativos devido à propriedade de
inativar uma grande variedade de EROs e outras espécies reativas como aquelas derivadas de
nitrogênio (ERNs) (RICE-EVANS et al., 1997; HEIM et al., 2002; WOJDYLO et al., 2007;
FERNANDEZ-PANCHON et al., 2008).
7
Células de origem glial podem ser cultivadas como linhagens celulares e podem
constituir modelos alternativos confiáveis para o estudo de propriedades e resposta de células
gliais a agentes externos (LAL et al., 1996). Nossos estudos prévios revelaram que o catecol
induz citotoxicidade in vitro em células gliais da linhagem GL-15, a qual foi atribuída à
produção de superóxido (O2–) e à formação de quinonas reativas (PEREIRA et al., 2004).
Estudos in vitro, já demonstraram que os flavonóides rutina e quercetina apresentam
potencial antioxidante, contudo, os efeitos destes compostos frente aos danos induzidos pelo
catecol no Sistema Nervoso Central ainda não estão bem estabelecidos. Assim, neste estudo,
após uma revisão sobre os principais aspectos toxicológicos do catecol, bem como sobre as
atividades biológicas de flavonóides e da vitamina C, em especial sobre suas propriedades
antioxidantes, apresentamos nossos resultados sobre as capacidades antioxidantes da vitamina
C e dos flavonóides rutina e quercetina em células gliais da linhagem GL-15 submetidas ao
estresse oxidativo induzido pelo catecol.
2
REVISÃO DE LITERATURA
2.1. TOXICIDADE DO BENZENO E SEU METABÓLITO CATECOL
O benzeno (fig. 1) é um hidrocarboneto aromático, com a fórmula molecular C6H6,
empregado na indústria química. Foi descoberto por Michael Faraday em 1825 e sua estrutura
química foi determinada em 1858 por Augusto Kekulé (RANA & VERMA, 2005). A
exposição crônica ao benzeno é um problema que afeta os trabalhadores da indústria
petrolífera (GLASS & GRAY, 2001; RANA & VERMA, 2005; ZHANG et al., 2007;
WANG, 2008). A população geral também está exposta a altas concentrações de benzeno em
áreas próximas às indústrias de pneus, refinarias, calçados e em locais onde a gasolina é
manuseada rotineiramente (JAMALL & WILLHITE, 2008). O benzeno também é encontrado
na fumaça do tabaco (VAINIOTALO et al., 2008), resultando em risco para os fumantes,
ativos e passivos (STOHS et al., 1997). A exposição ao benzeno ocorre principalmente pela
via respiratória e, em função de sua lipossolubilidade, é preferencialmente armazenado no
tecido adiposo (RUIZ et al., 1993), o que faz do sistema nervoso central (SNC) um local com
grande potencial para armazenamento. O benzeno é metabolizado no fígado, por enzimas da
fração microssomal hepática, sendo hidroquinona e catecol (1,2-dihydroxybenzene) dois de
8
seus principais metabólitos (RICKERT et al., 1979; GAD-EL-KARIM et al., 1989; SNYDER
& HEDLI, 1996; RANA & VERMA, 2005; AHMAD, 2007). Estes produtos são danosos
para macromoléculas biológicas e podem induzir estresse oxidativo (ATKINSON, 2008). O
catecol, facilmente se oxida em condições fisiológicas para formar quinonas potencialmente
tóxicas e espécies reativas de oxigênio (EROs) (BENNDORF et al., 2001). Essa exposição
acarreta um aparecimento de cânceres geralmente associado a um aumento de aberrações
cromossômicas nestes indivíduos (RIBEIRO et al., 1994; HUFF, 2007;).
A inalação de hidrocarbonetos aromáticos é extremamente danosa para o sistema
biológico. A manifestação da intoxicação aguda é identificada pelos seguintes sinais e
sintomas: fraqueza, cefaléia, náuseas, vômitos, sensação de peso no tórax e, nos casos mais
graves, turvação da visão, tremores, salivação, taquipnéia, arritmias cardíacas, convulsões,
paralisias e perda de consciência. Na intoxicação crônica (principal problema ocupacional), o
principal órgão afetado é a medula óssea; ocorre redução na atividade mitótica e na maturação
das células-tronco, levando a pancitopenia (manifestada inicialmente como leucopenia)
(GOLDSTEIN 1988, JAMALL & WILLHITE, 2008). A exposição ao benzeno está associada
a uma série de patologias incluindo leucemia, mieloma múltiplo (WONG, 1995) e síndromes
mielodisplásicas (HAYES et al., 2000).
Figura 1: Formas de representação da estrutura química do benzeno
Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Benzene
Cerca de 50 a 70% do benzeno e seus derivados são metabolizados no fígado, maior
local de metabolismo de xenobióticos, pelas enzimas do complexo P450 (CYPs) dando
origem a fenóis e derivados catecólicos (SNYDER & HEDLI, 1996). Existem ainda sítios
extra-hepáticos responsáveis pela metabolização de xenobióticos, dentre eles pulmões e rins,
9
contudo estas vias não estão claramente estabelecidas (EL-SANKARY et al., 2001). A
identificação de CYPs no cérebro, em tipos celulares distintos, particularmente em células
neuronais, ampliam a questão de funções específicas possíveis destas enzimas na fisiologia do
cérebro. A presença de CYPS mostrou ser importante na indução da bioativação e do dano
celular de órgãos alvo para a atividade de drogas e agentes ambientais tóxicos que atravessam
a barreira hemato-encefálica (BHE) (MIKSYS & TYNDALE, 2004).
Os catecóis são produtos intermediários da degradação de compostos aromáticos como
benzeno, estrógenos e neurotransmissores como a dopamina (SCHWEIGERT et al., 2001).
Os metabólitos do benzeno, em especial os catecóis, auto-oxidam-se formando espécies
reativas do oxigênio (EROs), e quinonas também reativas (PEREIRA et al., 2004). O catecol
está presente também em muitos produtos naturais, incluindo os alcalóides, como lamelarina
S, obtidos a partir dos organismos marinhos (Didemnum sp) e compostos sintéticos como
lamelarina Y (FAN et al., 2007).
O 1,2-dihidroxibenzeno (catecol, fig. 2) é um derivado do benzeno, encontrado em
produtos que o empregam como matéria-prima, tais como, materiais para revelação
fotográfica, óleos, tintas, medicamentos, adesivos, inseticidas, pneus, plásticos, entre outros.
Recentemente, a Agência Internacional para Pesquisa em Câncer, órgão vinculado à OMS,
classificou o catecol no grupo 2B, como possível carcinógeno para o homem (IARC, 1999). O
4-metil-catecol induziu apoptose em várias linhagens de células tumorais murinas (MORITA
et al., 2003), sugerindo que esse mecanismo de morte celular pode ser o responsável pela
toxicidade dessa categoria de compostos.
Figura 2: Estrutura química do catecol
Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Catechol
10
A ação pró-oxidante dos catecóis inicia-se após a sua auto-oxidação, oxidação por íon
metálico ou através do citocromo P450, resultando na formação de quinonas (fig. 3), que são
bastante citotóxicas (O’BRIEN, 1991; CAVALIERI et al., 2002). De uma forma geral as
quinonas podem ser consideradas como produtos da oxidação de fenóis. Na presença de
agentes oxidantes, o catecol pode se oxidar e gerar semiquinonas e, numa próxima etapa, obenzoquinonas. A oxidação dos catecóis na presença de oxigênio forma O2- e na presença de
metais de transição o O2- é reduzido a H2O2 e radicais HO•. Essas EROs podem ser danosas
para as células e organismos se não forem eliminadas através de sistemas antioxidantes
(SCHWEIGERT et al., 2001)
Catecol
Semiquinona
Quinona
Figura 3: Auto-oxidação do catecol
Fonte: SCHWEIGERT et al., 2001 (modificado)
2.2. ESTRESSE OXIDATIVO (EO)
O estresse oxidativo resulta da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), que
incluem: radical superóxido (O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (OH•),
que induzem várias mudanças celulares, como oxidação no DNA, liberação de cálcio,
depleção e oxidação de glutationa, NADPH, proteínas e lipídios (HALLIWELL, 2001). O
estresse oxidativo também ocorre quando a formação de radicais livres excede a capacidade
de proteção no organismo o que pode levar à lesão tecidual após o trauma, eventos
inflamatórios e condições crônicas, tais como aterosclerose, doença degenerativa e câncer
(AMES et al., 1994).
11
O EO caracteriza-se pela produção excessiva de EROs ou a diminuição nas defesas
antioxidantes endógenas e exógenas e parece ser a causa de morte celular em muitas
patologias do SNC, incluindo isquemia (HALL, 1993), como também uma das causas
sugeridas de doenças neurodegenerativas relacionadas ao envelhecimento como Doença de
Parkinson e Mal de Alzheimer (HALLIWELL, 2001).
2.3. SISTEMAS ANTIOXIDANTES
De todo oxigênio disponível pela célula, cerca de 5 % se transforma em espécies
reativas de oxigênio: O2–, H2O2 e OH•. A produção desses elementos é contínua e ininterrupta.
As EROs são geradas pela liberação de elétrons da cadeia respiratória com redução das
moléculas de oxigênio para radical superóxido. O superóxido é transformado em peróxido de
hidrogênio pela enzima superóxido dismutase (SOD) dependente de Mn mitocondrial e pela
SOD dependente de Cu e Zn citoplasmática. O H2O2 é menos reativo que o radical
superóxido, porém, quando reage com metais de transição como o ferro e o cobre, forma-se o
radical hidroxil, o mais reativo de todos os radicais livres (reação de Fenton). Além das
EROs, o organismo gera as espécies reativas tóxicas de nitrogênio: oxido nítrico (NO-),
dióxido de nitrogênio (NO2-) e peroxinitrito (ONOO-) (NAKAO et al., 1995; STOWE, 2009).
O sistema de defesa antioxidante protege as estruturas celulares da lesão oxidativa e já
foi demonstrado, por intermédio de estudos epidemiológicos, uma diminuição da incidência
de câncer, de doenças cardiovasculares e de outras condições dependentes dos radicais livres,
em populações com um bom sistema de defesa antioxidante. Entretanto a geração de radicais
livres é um dos mecanismos protetores apresentados pelo sistema imunológico. O excesso de
antioxidantes é prejudicial pois diminui a geração de radicais livres e provoca inibição de
apoptose com a parada da eliminação das células malignas ou lesadas. Em estudos realizados
foi observado aumento da morte celular por apoptose com aumento de EROs em ratos com
tumor cerebral com uma dieta deficiente em antioxidantes (SALGANIK et al., 2000). O
estresse oxidativo e o sistema antioxidante endógeno podem ser compreendidos como
representado na figura 4.
12
Figura 4: Estresse oxidativo e sistema antioxidante
Fonte: http://www.biozentrum.uni-frankfurt.de/Pharmakologie/EU-Web/Goethe.htm
Em condições fisiológicas normais, o uso de oxigênio por células com metabolismo
aeróbico gera EROs (I). A célula tem a capacidade de degradar os radicais livres. A enzima
superóxido dismutase (SOD) ativada transforma ânion superóxido (O2-•) em peróxido de
hidrogênio (H2O2), que pode ser convertido pela enzima catalase em água (H2O) e oxigênio
(O2) (II). Uma segunda via de detoxicação envolve a enzima glutationa-peroxidase (GPx), que
converte peróxido de hidrogênio em água utilizando a co-enzima glutationa (GSH).
Glutationa pode ser reciclada pela enzima glutationa-redutase (GSRed) (III). A falta de
correspondência entre a produção de antioxidantes e prooxidantes em células pode levar ao
estresse oxidativo. Isto conduz a uma elevado saldo de radicais livres, como radicais hidroxil
(OH•), que podem levar a sérios danos na célula (IV). Radicais livres podem causar danos ao
DNA, peroxidação de proteínas e de ácido graxos insaturados, como, por exemplo, aqueles
das membranas de neurônios.
13
2.4. PROPRIEDADES BIOLÓGICAS E POTENCIAL ANTIOXIDANTE DA
VITAMINA C.
O ácido ascórbico (AA), conhecido popularmente por vitamina C (fig. 5) foi primeiro
isolado em 1928, pelo bioquímico húngaro Szent-GyorGyi, trabalho este contemplado com o
premio Nobel de medicina de 1937. Esta substância trata-se de um potente antioxidante
hidrossolúvel cuja atividade pode ser explicada por dois fatores (BUETTNER,1993; CARR &
FREI, 1999). Primeiro, tanto o ascorbato quanto o radical ascorbil (fig. 5), no seu estado
oxidado, apresentam um baixo potencial de redução. Contudo eles podem reduzir radicais
mais relevantes e biologicamente oxidantes como o radical hidroxil, ânion superóxido ácido
hipocloroso ou oxigênio molecular (FREI et al., 1999; HALLIWELL, 2007). Segundo, o
ascorbato pode ser facilmente regenerado, além disso, o radical ascorbil, que é relativamente
estável devido à estabilização por ressonância, pode desmutar para ácido ascórbico e
dehidroascórbico.
Ácido ascórbico
Ácido dehidroascórbico
Ascorbato
Radical ascorbil
Figura 5: Estrutura química e diferentes estados do ácido ascórbico
(Modificado de VERRAX & CALDERON 2008)
14
Inúmeros estudos descritos na literatura têm demonstrado o potencial antioxidante do
AA em diferentes modelos de estresse oxidativo, sejam eles associados a doenças
degenerativas, danos físicos, químicos ou traumáticos.
A vitamina C é, portanto, conhecida por reduzir o risco de doenças neurodegenerativas
como a doença de Alzheimer (PERRIG et al., 1997; MASAKI, et al., 2000), por proteger a
LDL (lipoproteína de baixa densidade) de peroxidação induzida por irradiação UV (NEGRE
et al., 1995), por proteger o DNA de danos oxidativos (NOROOZI et al., 1998; BLASIAK et
al., 2002; LOPEZ-BURILLO et al., 2003; PITARQUE et al., 2006; ARRANZ et al., 2007), e
atuar no reparo de lesões mutagênicas de DNA (DUARTE et al., 2009), por proteger contra o
estresse oxidativo induzido em gastrite crônica (SASAZUKI et al., 2008).
Entretanto, na presença de metais de transição, como os íons ferro e cobre, o AA
torna-se pró-oxidante. Os íons metais podem reagir com peróxido de hidrogênio, a conhecida
reação de Fentom, ou hidroperóxidos lipídios e produzir outros radicais hidroxil ou radicais
alcoxil. Essas reações entre AA e metais de transição são responsáveis pelas propriedades
pró-oxidante e citotóxicas do AA observadas in vitro (DROUIN et al., 1996, CLEMENT et
al., 2001; HALLIWELL, 1999; DE VRIESE et al., 2008).
2.5. FLAVONÓIDES
O uso de plantas, como medicamentos, é muito comum no Brasil e grande parte da
população de baixa renda tem, nessa prática, a sua principal fonte de tratamento para diversos
males. As propriedades terapêuticas das plantas têm despertado interesse crescente, e por esta
razão, vários componentes bioativos dos vegetais têm sido isolados e caracterizados. Dentre
estes componentes naturais, encontram-se os flavonóides (HOSTETTMAN et al., 1995;
WOOD et al., 1999; DE CLERCQ, 2000; VAN DER WATT et al., 2001, JANBAZ et al.,
2002). Os flavonóides são pigmentos hidrossolúveis presentes nos vacúolos das células
vegetais e que representam o maior grupo de compostos fenólicos naturais. O termo
flavonóide engloba um grupo de compostos polifenólicos complexos derivados de benzogama-pirona, os quais são estruturalmente constituídos de 15 átomos de carbono (C15) no seu
esqueleto fundamental (YOKOZAWA et al., 1997); apresentam uma estrutura comum,
caracterizada por dois anéis aromáticos (A e B), e um anel heterocíclico oxigenado (anel C)
(fig. 6).
15
Figura 6: Estrutura química básica dos flavonóides
Fonte: http://www.lurj.org/vol3n2/flavonoids-fig1.jpg
Por serem amplamente distribuídos no reino vegetal (geralmente na forma solúvel de
heterosídeos, presentes em todas as angiospermas), os flavonóides fazem parte,
obrigatoriamente, da dieta humana (YUNES, 2001). Na família dos flavonóides, já foram
descritos mais de 4.000 compostos, os quais se subdividem em flavonóis, flavanonas,
flavonas e antocianidinas (HARBONE, 1988 apud YUNES, 2001; ERDMAN et al., 2007).
As isoflavonas são caracterizadas pela ligação na posição 2 do anel B ao invés da posição 3.
As proantocianidinas são oligômeros de flavonas. Antocianidinas são distinguidas de outros
flavonóides com uma classe separada em virtude da habilidade destes em formar cátions
(MAZZA et al., 1993). Dentro de cada grupo podem ocorrer diferenças individuais resultantes
de variações no número e posição dos grupamentos hidroxilas, por modificações nos núcleos
(especialmente o pirânico), e pelo grau de metilação e glicosilação, os quais afetam várias
propriedades dos flavonóides, particularmente a hidrofobicidade das moléculas (YUNES,
2001).
2.5.1. Metabolismo e toxicidade de flavonóides
A digestão e a absorção de polifenóis iniciam no estômago. A absorção depende da
ingestão dietética de gordura (LESSER et al., 2004), da forma de preparo do alimento
ingerido (alimentos in natura, extrato, macerado, infusão, decocto), do tempo de trânsito
intestinal e da taxa de degradação fecal. Muitas agliconas de polifenóis são absorvidas no
estômago. Uma exceção são as antocianinas (uma glicona - forma glicosilada das
antocianidinas) que são absorvidas intactas no estômago (PASSAMONTI, 2003;
TALAVERA et al., 2003). A maioria dos flavonóides glicosilados chegam ao intestino
delgado intactos, a ligação glicosídica é removida durante a absorção, exceto para
antocianinas. O epitélio intestinal, rico em enzimas metabolizadoras de drogas, é importante
16
na formação de metabólitos glucoronidatados, metilados e sulfatados. (MANACH et al.,
2004; MAZZA et al., 2002; WU et al., 2002; FELGINES et al., 2003; KAY et al., 2005). Os
polifenóis mais estudados em termos de absorção são as isoflavonas, seguidas do glicosídio
quercetina (flavonol). As proantocianidinas e a epigalocatequina-galato (EGCG) são os que
apresentam menor absorção. Esta característica, entretanto, deve-se a sua instabilidade
química e não a absorção por si só (MANACH; 2005 et al.). Os metabólitos de polifenóis são
eliminados através da urina e da bile; a excreção urinária é uma importante via de eliminação
de flavanonas, isoflavonas e flavonas (10% ou mais da dose é excretada por este caminho). A
excreção biliar é muito importante para todos os polifenóis (ERDMAN et al., 2007).
Os flavonóides apresentam baixa toxicidade devido à baixa solubilidade da aglicona
(estrutura não glicosídica) em água e ao rápido catabolismo do núcleo pirona no fígado. Além
de não serem acumulados no fígado, os produtos de sua decomposição, como os ácidos
caféico e cinâmico, são completamente excretados com a urina numa taxa similar à da cafeína
(HAVSTEEN, 2002). A DL-50 de flavonóides tipo agliconas para ratos é de
aproximadamente 2,0 g/kg de peso corpóreo (CASLEY-SMITH & CASLEY-SMITH, 1986
apud HAVSTEEN, 2002). Em humanos, devido à baixa solubilidade dos flavonóides
agliconas em água, o pouco tempo em que estas moléculas permanecem no fígado e ao seu
baixo coeficiente de absorção, é rara a intoxicação aguda pelo consumo de flavonóides,
excetuando-se uma rara ocorrência de alergia (GROTZ & GÜNTER, 1971 apud
HAVSTEEN, 2002).
17
TABELA 1. Subclasses de flavonóides e suas estruturas químicas, nomes de flavonóides
provenientes de alimentos e fontes alimentícias comuns (ERDMAN et al., 2007).
Subclasses de
flavonóides
Estrututura
química
O
Flavonols
OH
Flavonóides provenientes de
alimentos
Kampferol, mirecetina e
quercetina
O
Apigenina, luteolina
Especiarias de folhas verde
(por exemplo: salsa)
Eriodictiol, esperitina e
naringenina
Frutas cítricas
Daidzeína, genisteina e gliciteina
Soja e leguminosas
O
Flavonas
Fontes alimentícias
comuns
Cebola, alho poro, tomate
cereja, brócolis, vinho
tinto, framboesas, couveflor e chá,
O
O
flavanonas
O
O
Isoflavonas
O
Flavans
O
OH
Antocianidinas
O
OH
(+)catequina,(+) galocatequina,
(-) epicatequina,(-)epigalocaquina
(-)epicatequina 3-galato,
(-)epigalocatequina 3-galato
Cianidina, delfinidina, malvidina,
pelargonidina,
Peonidina, petunidina
Chás, uvas vermelhas,
vinho tinto, cacau,
chocolates e damasco
Mirtilo vermelho e roxo,
uvas pretas, folhosos e
raízes.
2.5.2. Potencial antioxidante de flavonóides
Nos últimos anos o interesse pelas propriedades farmacológicas e bioquímicas dos
flavonóides tem sido bastante ampliada destacando-se suas propriedades antioxidantes na
prevenção de peroxidação lipídica, quelante de metais e removedor de EROs (RICE-EVANS
et al., 1997; HEIM et al., 2002; WOJDYLO et al., 2007; FERNANDEZ-PANCHON et al.,
2008), uma vez que a presença destes têm sido relacionadas a certas doenças crônicas e
neurodegenerativas como câncer, mal de Alzheimer e doença de Parkinson (HALLEWELL &
GUTERIDGE, 1991HALLIWELL, 2001;). Estudos têm revelado a propriedade destas
moléculas em atravessar a barreira hematoencefálica e em interferir na atividade biológica das
células do SNC (YOUDIM et al., 2004). A atividade antioxidante dos flavonóides tem sido
associada com características estruturais como duplas ligações C=C, substituições odihidroxi, número e posições dos grupos hidroxila (OH), que conferem à molécula a
capacidade de reduzir espécies reativas oxidando-se (RICE-EVANS et al., 1997).
18
Flavonóides contidos em vinhos tintos, entre eles a quercetina (3,5,7,3’,4’
pentahidroxiflavona) (fig. 7A), têm sido associados à saúde cardiovascular devido,
provavelmente, ao seu efeito antioxidante (HAVSTEEN, 2002). A quercetina é descrita como
o mais abundante dos flavonóides e constitui a espinha dorsal para muitos outros, incluindo a
rutina (forma glicosilada da quercetina) (fig. 7B), hesperidina e naringenina (BISCHOFF,
2008). Ela tem sido descrita como um potente antioxidante in vitro e o mais potente
removedor de espécies reativas de oxigênio, incluindo o ânion superóxido (HANASAKI et
al., 1994; CUSHNIE & LAMB, 2005) e espécies reativas de nitrogênio como o radical óxido
nítrico (VAN ACKER et al., 1995; HAENEN & BAST, 1999). Outras atividades biológicas
têm sido atribuídas ao flavonóide quercetina, entre estas capacidade antiinflamatória (READ
1995; ORSOLIC et al., 2004) e anti-hipertensiva (MACKARAJ et al, 20008; EDWARDS et
al., 2007).
O flavonóide rutina (3-ramnoglicosídeo da 3,5,7,3’,4’ pentahidroxiflavona) é uma
substância de cor amarela, encontrado em frutas especialmente as cítricas como laranja,
limão, toranja e lima, e foi isolado primeiramente em 1842 por Weiss, usando a planta Ruta
gravendes. Só em 1966 é que se verificou a ocorrência deste flavonóide em Dimorphandra
mollis. A rutina é o glicosídeo mais comum derivado da quercetina (JANBAZ et al., 2002), é
bem conhecida e amplamente estudada por apresentar múltiplas atividades farmacológicas,
dentre elas a atividade antioxidante. Estudo feito por Rodrigues e colaboradores (2003)
demonstrou os efeitos benéficos da rutina com a elevação de HDL e diminuição dos fatores de
risco para a arteriosclerose e outras doenças cardiovasculares, mostrando, além disso, que a
atividade antioxidante da rutina está relacionada à destruição do radical superóxido.
OH
OH
HO
O
OH
HO
O
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
(A)
(B)
Figura 7: Estrutura química dos flavonóides (A) quercetina (aglicona) e (B) rutina (glicosídeo)
Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Quercetin
http://en.wikipedia.org/wiki/Rutin
19
Outras atividades biológicas atribuídas ao flavonóide rutina são a normalização da
resistência e da permeabilidade das paredes dos vasos capilares, principalmente quando
associada à vitamina C (JANBAZ et al., 2002), atividades anticarcinogênica, citoprotetora,
antiplaquetária, antitrombótica, vasoprotetora e atividades cardioprotetoras (SCHWEDHELM
et al., 2003; SHEU et al., 2004; JANBAZ et al., 2002; LA CASA et al., 2000; MELLOU et
al., 2006; TRUMBECKAITE et al., 2006), bem como efeito antiinflamatório (KIM et al.,
2005; KWON, 2005). A rutina demonstrou ser um agente neuroprotetor e pode ser usado para
melhorar lesão isquêmica no coração e cérebro (NASSIRI-ASL, 2001; LEBEAU et al., 2001;
DE CELLE et al., 2004; GUPTA et al., 2003; NEUMAYER et al., 2006).
No Brasil, uma fonte importante do flavonóide rutina são os frutos da planta
Dimorphandra mollis Benth (Leguminosae-Caesalpinoideae) (fig. 8), também conhecida
como Fava-d'anta, uma espécie arbórea, com 8-14 metros de altura, encontrada em diversas
regiões do País (FERREIRA et al., 2001; LORENZI, 2002). A planta cresce no Cerrado dos
estados do Amazonas, Bahia, Goiás, Maranhão, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Pará,
Piauí, São Paulo, Tocantins e Distrito Federal (ALMEIDA, 1998; LORENZI, 2002). A
produção de rutina atinge no Brasil cerca de 100 toneladas anuais e a maior parte é destinada
à exportação (RIBEIRO et al., 2005), representando uma alternativa de renda para
agricultores familiares do Norte de Minas Gerais.
Figura 8: Dimorfandra mollis e detalhes da enflorencência e frutos
Fonte: www.arvores.brasil.nom.br/dimorphranda.gif
http://www.cnpgc.embrapa.br/publicacoes/livros/plantastoxicas/favadeanta.jpg
http://www.agenciaminas.mg.gov.br/maisfotos.php?cod_noticia=20553
20
2.6. BREVE SUMARIO DE ASPECTOS FUNCIONAIS E PLASTICIDADE DE CÉLULAS
DO SNC
No Sistema Nervoso Central (SNC) os neurônios são células extremamente
especializadas na condução de um potencial de ação ao longo de sua membrana plasmática e
na passagem dessa sinalização a outras células semelhantes. As células da glia (ou neuroglia)
estão distribuídas em três grupos extensos: a macroglia, da qual fazem parte astrócitos e
oligodendrócitos, a microglia; e as células ependimárias. As interações metabólicas e
sinalização entre os neurônios e as células gliais têm sido amplamente descritas. Estas
interações extremamente íntimas são necessárias para o desenvolvimento e manutenção das
funções e estruturas cerebrais, assim como para a neuroproteção, inclusive contra danos
produzidos por agressões químicas (ESKES et al., 2003; ZURICH et al., 2002, 2004).
Os astrócitos são fundamentais para a captação de nutrientes e de oxigênio do sangue
para os neurônios, para a manutenção da homeostase do SNC, e participam ainda dos
mecanismos de defesa imunitária do tecido nervoso e dos fenômenos de detoxificação
cerebral (TARDY, 1991; LENT, 2001). As duas populações celulares no SNC que são
capazes de reagir a injúrias causadas aos neurônios, seja alterando a morfologia, seja
modificando o padrão de expressão de fatores neurotróficos e/ou neurotóxicos, ou ainda, a
associação desses dois fenômenos, são os astrócitos e a microglia (STREIT et al., 1999).
Após danos no sistema nervoso, os astrócitos invariavelmente proliferam, sofrem extensiva
hipertrofia do núcleo, do corpo e dos processos celulares, e desenvolvem fibrose pelo
aumento da expressão da GFAP, sendo este estado conhecido como gliose ou astrogliose
reativa, um processo que não é estereotípico podendo variar em extensão, tempo de
desenvolvimento, grau de hipertrofia ou hiperplasia e outras propriedades, dependendo da
natureza da lesão e da área específica afetada do SNC (MONTGOMERY, 1994; COOKSON
& PENTREATH, 1994; ASCHNER, 1998; MEAD & PENTREATH, 1998; GOMES et al.,
1999). A astrogliose é geralmente detectada antes de um efeito tóxico em neurônios e,
portanto, pode ser considerada como um marcador precoce de neurotoxicidade
(O’CALLAGHAN, 1991; MONNET-TSCHUDI et al., 1995). As inter-relações entre células
gliais e neurais não só contribuem para o desenvolvimento, função e capacidade reparativa do
cérebro, mas também podem participar na sua deterioração devido à senescência ou doença
(DAVIES et al., 2000). Segundo Rutka & Smith (1993), os astrócitos podem reagir e
proliferar após injúria cerebral e ter a mais alta predisposição à transformação maligna.
21
2.6.1. Culturas de células do SNC como modelos de estudos farmacológicos e
toxicológicos
A utilização de modelos in vitro como o cultivo de neurônios e células da glia, bem
como culturas de linhagens celulares de origem glial ou neuronal, é uma etapa essencial para
a investigação da especificidade dos efeitos e mecanismos de ação de agentes químicos, bem
como para os mecanismos de patogênese de doenças de diferentes origens no SNC
(COOKSON et al., 1994; SANFELIU et al., 1999). Astrócitos derivados do córtex de ratos ou
de camundongos neonatos e cultivados in vitro constituem modelos confiáveis no estudo do
potencial tóxico de compostos químicos. Estas culturas são utilizadas há décadas e derivam de
ratos ou camundongos de até dois dias, sendo cultivadas em meio específico ao longo de 20
dias, quando adquirem sua forma característica, com densa arborização (BOOHER &
SENSENBRENNER, 1972). Culturas primárias de astrócitos são também utilizadas para
estudar condições neurodegenerativas, como o mal de Alzheimer (VERNADAKIS &
FLEISCHER-LAMBROPOULOS, 2000), para avaliar a função dos astrócitos em respostas
imuno-mediadas do SNC (ASCHNER, 1998) e para avaliar o efeito de neurotoxinas como a
fumonisina B1 (KWON et al., 2001). Estudos in vitro demonstram claramente que astrócitos
reativos em culturas primárias modificam sua morfologia, transformando seus corpos
celulares, ocorrendo uma retração na monocamada celular com emissão de processos
celulares distintos e acúmulo de filamentos neuroquimicamente expressos como um aumento
da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (ASCHNER, 1998; COSTA et al., 2002). Culturas
primárias de neurônios têm sido igualmente adotadas para o estudo de substâncias
neurotóxicas tal como o metil-mercúrio (SANFELIU et al., 2001) e o herbicida fentrazamine
(SCHMUCK et al., 2003).
As células gliais, principalmente os astrócitos, podem se transformar em astrocitomas
malignos e serem distintos em graus de malignidade crescentes segundo os critérios da
Organização Mundial de Saúde (OMS), sendo o grau IV o mais agressivo, onde se inserem os
glioblastomas multiformes (GBM) (HILDEBRAND et al., 1997). Células tumorais derivadas
de glioblastomas têm sido linhagens celulares amplamente utilizadas para o estudo das
propriedades dos astrócitos (BRISMAR, 1995). Células de origem glial podem ser cultivadas
como linhagens celulares e podem constituir modelos alternativos confiáveis para o estudo de
propriedades e resposta de células gliais a agentes externos (LAL et al., 1996). As linhagens
de gliomas de rato C6, 9L, CNS-1 e BT-4 são as mais empregadas. Estas linhagens derivam
22
de tumores induzidos quimicamente em ratos por agentes alquilantes carcinogênicos, como o
metil- e etilnitrosouréia (DAI et al., 2001). Em 1991, BOCCHINI et al. estabeleceram a
linhagem GL-15 a partir de glioblastoma multiforme humano e confirmaram, através de
marcação imunocitoquímica, a expressão, de forma constitutiva, das proteínas do
citoesqueleto, vimentina e GFAP. Costa e colaboradores (2001) confirmaram estudos de
Bocchini e colaboradores (1991), no qual a dupla marcação vimentina/GFAP revelou que a
população das células GL-15 GFAP(+) representam cerca de 30% das células Vimentina(+) Já
foi demonstrado que as células GL-15 são capazes de se diferenciarem morfologicamente em
uma forma mais estrelada com aumento da expressão de GFAP, seja por uma privação de
soro, um importante suplemento utilizado no meio de cultura, seja pela ação do éster de forbol
(PMA), um ativador da proteína cinase C (PKC) (ARCURI et al., 1995) e por retinóides
(COSTA et al., 2001). Dessa forma, em função das características estruturais e bioquímicas
das células gliais, a linhagem GL-15 constitui um bom modelo para o estudo da ação de
compostos purificados ou complexos farmacologicamente ativos, tanto em relação à
citotoxicidade quanto a determinação de seu potencial terapêutico.
23
3. ARTIGO CIENTÍFICO: EFFECTS OF FLAVONOIDS (RUTIN AND QUERCETIN)
AND VITAMIN C ON OXIDATIVE DAMAGE INDUCED BY CATECHOL IN
GLIOBLASTOMA CELLS
EFEITO DE FLAVONOIDES (RUTINA E QUERCETINA) E VITAMINA C NO DANO
OXIDATIVO INDUZIDO PELO CATECOL EM CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA
GRANGEIRO, M.S., OLIVEIRA, D.M., SOUZA, C.S., SILVA, A.R., PITANGA, B.S.,
COSTA, M.F.D., EL-BACHÁ, R.S. and COSTA, S.L.
Laboratório de Neuroquímica e Biologia Celular, Instituto de Ciências da Saúde,
Departamento de Biofunção/Bioquímica, Salvador, BA, 40.110-100, Brasil.
ABSTRACT
In this work, it was studied the cytotoxicity and antioxidant properties of flavonoids rutin and
quercetin and the well known antioxidant ascorbic acid (AA) against the catechol induced
cytotoxicity in GL-15 cells. Catechol was toxic to GL-15 cells. The values of IC50 obtained
were 2368µM and 252µM, after 24h and 72 h, respectively. The IC50 obtained after 24h of
treatment with the flavonoid rutin was 622µM. The IC50, for the same flavonoid, after 72 h of
treatment, was 284µM. The flavonoid quercetin (0.6-100µM) and AA (20-3000µM) did not
show toxicity for GL-15 cells. The flavonoids rutin and quercetin didn’t protect the GL-15
cells to catechol induced toxicity. Moreover they induced an increase in cell death and
quinone formation when adopted at sub-toxic concentrations (0.6-100µM). On the other hand,
the AA showed a protective antioxidant activity in GL-15 cell cultures against to oxidative
damage induced by catechol. Concentrations of AA between 20-300µM, partially protected
the cells subjected to oxidative stress model adopted. The AA reduced completely the
formation of reactive quinones and protected cells from catechol toxicity in the range of
concentration between (600-3000µM). These results show that the flavonoids rutin and
quercetin not have antioxidant activity against the toxicity induced by catechol in glial cells,
moreover, AA reversed completely the cellular damage induced by catechol.
Key words: catechol, antioxidants, ascorbic acid, rutin, quercetin, and glia.
24
3.1. INTRODUCTION
Aromatic substances such as benzene are risk factors to the health of workers in the oil and
petrochemical industry (GLASS & GRAY, 2001; ZHANG et al., 2007). People are also
exposed to high concentrations of benzene in areas close to industries of tires, refineries,
footwear, and in places where gasoline is handled routinely (JAMALL & WILLHITE, 2008).
Benzene is also found in tobacco smoke (VAINIOTALO et al., 2008) resulting in risk for
smokers, and also for non-smokers near them. Exposure to benzene occurs mainly by the
respiratory route and due to its lipossolubility is stored in tissues rich in fat (RUIZ et al.,
1993). Thus, the central nervous system (CNS), which is rich in lipids, could be a target for
storage of hydrophobic substances, such as benzene. Benzene is metabolized in the liver by
the microsomal fraction to phenol hydroquinone and catechol (1,2-dihydroxybenzene)
(RICKERT et al., 1979; GAD-EL-KARIM et al., 1989; SNYDER & HEDLI, 1996; RANA &
VERMA, 2005; AHMAD, 2007). These products can damage cellular macromolecules
covalently by linking to them and inducing oxidative stress (ATKINSON, 2009).
Furthermore, catechol easily oxidizes to form potentially toxic quinones, and reactive oxygen
species (ROS) (BENNDORF et al., 2001).
Oxidative lesions play an important role in many neurodegenerative diseases (GILGUN et al.,
2004). There is a growing interest in the study of the toxicity of catechols since they generate
ROS. The neurotoxicity of dopamine, which is a catechol, and its dopamine (DA)-oxidized
metabolites, for example, is associated to the generation of ROS that cause apoptosis and cell
death (especifique a linhagem) (HAQUE et al., 2003; WANG et al., 2008). Moreover,
catechol is also present in many natural products, including alkaloids as lamellarin S obtained
from the marine organism Didemnum sp and synthetic compounds as lamellarin Y (FAN et al.
2007). The human diet is rich in phytochemicals, many of which have significant
bioactivities. Vitamin C, a naturally occurring antioxidant, is known to reduce the risk of
neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease (PERRIG et al., 1997; MASAKI, et
al., 2000). Flavonoids are polyphenolic compounds abundant in plants and human food with
known antioxidant properties. They can protect tissues against oxidative damages through the
ability to scavenge a wide range of reactive oxygen, nitrogen, and chlorine species, such as
superoxide, hydroxyl radical, peroxyl radicals (RICE-EVANS et al., 1997; HEIM et al., 2002;
WOJDYLO et al., 2007; FERNANDEZ-PANCHON et al., 2008). Antioxidant activity of
25
flavonoids has been associated with their structural characteristic as C–C double bonds, odihydroxy substitutions, and free OH groups (RICE-EVANS et al., 1997).
Our previous study demonstrated that catechol induced cytotoxicity to GL-15 glial cells in
vitro, which was attributed to superoxide (O2–) and quinone generation (PEREIRA et al.,
2004). Tumor derived cells, such as glioblastoma cell lines, have been largely used for the
study of astrocyte properties (BRISMAR, 1995). Although the GL-15 line of human
glioblastoma derived cells (BOCCHINI et al., 1993) are poorly differentiated, they express
the astrocyte marker GFAP (glial fibrillary acidic protein) and proliferate rapidly in culture. In
this study we investigated the possible antioxidant properties of the well-known antioxidant
ascorbic acid (AA), also known as vitamin C (FREI et al., 1999; HALLIWELL, 2007), and
the flavonoids quercetin and its glycoside rutin, on oxidative stress induced by catechol in
GL-15 cells. Quercetin (3,5,7,3',4'-pentahydroxyflavone, Fig. 1A) was selected because it is
abundant in food and in plants and displays the structural requirements (a C-2–C-3 double
bond, an o-dihydroxy substitution on ring B, a free OH group at C-3) favourable to strong
antioxidant activity. Rutin (3-ramnoglucoside of 3,5,7,3',4'-pentahydroxyflavone, Fig. 1B),
specially abundant in the legumes of the Brazilian plant Dimophandra mollis (GOMES &
GOMES, 2000; RIBEIRO et al., 2005), was also considered because it also belongs to the
most prominent flavonoids in the human diet, and also in order to outline the influence of a
sugar substituent on antioxidant potential.
26
3.2. MATERIALS AND METHODS
3.2.1- Glial cell cultures
GL-15 cells derived from human glioblastoma (Bocchini et al., 2003) were cultured as
previously described (Costa et al., 2001). GL-15 stock cultures (passages 83-93) were
maintained in a humidified atmosphere of 95% air and 5% CO2 at 37°C in medium consisting
of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) and supplemented with 10% foetal bovine
serum (GIBCO BRL, Grand Island, NY), a nutrient mixture (7 mM glucose, 2 mM glutamin,
0.011 g/l pyruvate), and in presence of antibiotics (100 UI/ml penicillin G, 100 µg/ml
streptomycin). Cells were grown in 100 mm diameters tissue culture plates (TTP,
Switzerland) containing 10 ml medium, which was replaced three times per week. Stock
cultures were passaged into new plates once every 3-4 days, and cultures for experiments
were seeded into polystyrene culture dishes plates as needed. Experiments were initiated 72
hours after plating.
3.2.2- Drugs and treatments
The flavonoid rutin was obtained in the form of powder at the Laboratory of Natural Products
Research (Faculty of Pharmacy / UFBA) and Quercetin dihydrate was obtained from SigmaAldrich (98% purity). The 1.2-diidroxibenzeno (catechol) was obtained from Riedel-de Haën,
Buchs, Switzerland. The catechol diluent, cloridric acid 0,005M, was obtained from Nuclear,
Diadema, Sao Paulo. Bromide 3-(4,5 dimethylthiazole-2-yl) -2,5-difeniltetrazolium (MTT),
trypsin (EC 3.4.21.4). The ascorbic acid (AA) was obtained from J. T. Baker, E. U. A. The
flavonoids were dissolved in DMSO (0.5% v / v). Exponential dilutions were performed with
catechol and flavonoids in order to obtain the IC50. The negative control group cells was
treated with yours respectives solvents. Confluent cells were treated with catechol (20 - 6000
µM), in plates of 96 wells in order to evaluate the cytotoxicity of this substance. The same
procedure was adopted with the flavonoid rutin, ranging from 1µM to the merger and thinner
1000µM which is DMSO with the final dilution of 0.5%. The flavonoid quercetin only
27
allowed changes in concentrations between 0.6 and 100µM, since this substance is soluble in
the culture medium to 100µM and DMSO (0.5% v / v). While adopting the same procedure
for ascorbic acid, which was used as positive control for antioxidant activity of flavonoids, is
its concentration ranged between 20µM and thinner 3000µM taking as the culture medium
DMEM. The cells treatments were made in period of 24 or 72 hours.
3.2.3- Test of cell viability
For the cytotoxicity test, the cells of glioblastoma lines of GL-15 were grown on plates of 96
wells. The active mitochondrial dehydrogenases, present in viable cells, convert the MTT,
which is naturally yellow, in formazan, consisting of a purple color. The cells were exposed to
drugs and two hours before the time of exposure, the culture medium was replaced with a
MTT solution, diluted in DMEM (1mg/ml) keeping the plates for two hours at 37 oC. For the
dissolution of crystals of formazan formed by the action of mitochondrial dehydrogenases on
the substrate MTT, was an increased volume of the lysis buffer (20% SDS, 50% DMF, pH
4.7), keeping the plates for 24 hours at room temperature. The optical absorbance of each
sample was measured using a spectrophotometer BIO-RAD 550PLUS at a wavelength of 540
nm.
3.2.4- - Test of antioxidant activity of flavonoids rutin, quercetin and ascorbic acid in
cell cultures treated with catechol.
The confluent cells were treated with catechol at 300 µM in the presence of flavonoids (0.6 –
100 µM), during 72h. To evaluate the action of ascorbic, cells were treated in the presence of
this vitamin (20 - 3000µM, considered as sub-toxics) and catechol 600 µM, during 72h either.
The cells were exposed to drugs, and after the time of exposure, cell viability was measured
by the MTT test.
28
3.2.5- Quinone formation
Catechol may undergo spontaneous oxidative decomposition in neutral aqueous solutions
through a multi step reaction resulting in ROS and quinone derivatives formation. The
quinone formation was measured in culture medium of GL-15 cells in control condition or
exposed to catechol and antioxidants, using a spectrophotometer BIO-RAD 550PLUS at a
wavelength of 405 nm
3.2.6- Statistical analysis of results
Each variable experiment was done in quadruplicate and three independent experiments and
the results expressed average standard deviation. In cases where the groups have normal
distribution analysis of the results were analyzed using the One Way ANOVA followed by
Student's test-Newmann-Keuls. When the test of normality failed the results were expressed
by median and percentiles, being used ANOVA on ranks, followed by Dunnett test to analyze
the data. P-values <0.05 were considered statistically significant. The tests were performed
using GraphPad Prism version 5.00 for Windows, GraphPad Software.
29
3.3. RESULTS
3.3.1. Cytoxicity of catechol, rutin, quercetin and ascorbic acid (AA)
Catechol-induced cytotoxicity to glioblastoma GL-15 cells
The effect of the concentration of catechol on the induction of cytotoxicity to glioblastoma
GL-15 cells was investigated. The MTT test clearly demonstrates that catechol was toxic to
GL-15 cells with mitochondrial failure, showing dose- and time-dependent activity (Fig. 2A2B). The equations that represent the dose-response curves, constructed from non-linear
regression with the experimental data, were used to calculate the values of IC50. Catecholinduced cytotoxicity after 24 hours exposition was fitted to Eq. 2A: V = {-3134 + (3.24) / [1 +
10(-3.35 – 0.47C)]} (R2 = 0.9815) and after 72 hours exposition was fitted to Eq. 2B: V = {3266 + (105.26) / [1 + 10(-5.72 + 2.38C)]} (R2 = 0.9777), in which V corresponds to cell
viability normalized to data measured under control conditions and [c] is the catechol
concentration. The calculated IC50 for catechol on GL-15 cells was 2368µM (24 h) and
252µM (72 h).
Rutin-induced cytotoxicity to glioblastoma GL-15 cells
The MTT test clearly demonstrates that the flavonoid rutin was toxic to GL-15 cells, showing
dose dependent activity (Fig. 2 C-D) based on non-linear regression analysis. Rutin-induced
cytotoxicity, after 24 hours, was fitted to Eq. 2C: V = {7.79+(104.14) / [1 + 10(2.05+0.70C)]} (R2 =0.9011) and, after 72 hours, it was fitted to Eq. 3D: V = {7.79+(104.14) /
[1 + 10(-2.05+0.70C)]} (R2 = 0.9011), in which V corresponds to cell viability normalized to
data measured under control conditions, and [c] is the rutin concentration. The calculated IC50
for rutin GL-15 cells was 621.74µM (24 h) and 284µM (72 h).
30
Lack of cytotoxicity of quercetin to glioblastoma GL-15 cells
On the other hand, the same test shows that the flavonoid quercetin was not toxic to GL-15 at
the concentrations tested (0.6 - 100µM) (Fig. 2E), with no statistically significant differences
for treatments when compared with the control. As this substance is insoluble in the culture
medium at concentrations upper than 100µM, it was not possible to determine the IC50 value.
Lack of cytotoxicity of ascorbic acid to glioblastoma GL-15 cells
The AA also did not present toxicity to GL-15 cells at concentrations tested ranging from
20µM to 3000µM (Fig. 2F).
3.3.2. Protective activity against cytotoxicity induced by catechol
To evaluate of protective effect of the compounds rutin, quercetin and ascorbic acid against
the toxicity induced by catechol in GL-15 cells we tested these compounds at sub-toxic
concentrations and in the presence of cytotoxic concentrations of catechol (300-600 µM). The
cell viability was determined after 72 h treatment by the MTT test. Catechol oxidation
generates reactives quinones (MELIKIAN et al., 2008). We also determine the formation of
reactive quinones of cells submitted to the oxidative stress induced by catechol alone and in
the presence of antioxidants with catechol. We observed that the flavonoids rutin and
quercetin (10-100 µM) induced a dose-dependant increase in cell death, and a dose-dependant
increase on quinone formation in GL-15 cells submitted to the oxidative stress induced by
catechol (Fig. 3 A-D). On the other hand, the well known antioxidant AA presented a very
efficient protective effect, since the concentration of 20 µM, against the catechol induced
cytotoxicity at 300 µM concentration (data not shown) and this protective effect was
maintained when the concentration of catechol was elevated to 600 µM (Fig. 3 E). Moreover,
AA also inhibited the quinone formation in GL-15 cells submitted to the oxidative stress
induced by catechol (Fig. 3 F).
31
3.3.3 Morphological analysis
Cytotoxicity of catechol and protective effects of antioxidants were also assed by phasecontrast microscopy (Fig. 4 and 5). In control conditions, after 72h treatment, (Fig. 4 A and
Fig. 5 A), GL-15 cells have a bipolar fibroblast like phenotype, whose size varies to some
extent depending on the density of the culture. Exposure to catechol (300 µM) induced toxic
effect with morphological changes, characterized by detaching cells presenting round
cytoplasm and adherent cells presenting very contracted cytoplasm with a filamentary aspect
(Fig. 4 B). Exposure GL-15 cells to 600 µM catechol amplified the toxic effect, the majority
of detaching cells presenting round and granulated cytoplasm (Fig. 5 B).
Exposure GL15 cells to quercetin (60 µM) did not induce significant morphological changes,
and this flavonoid did not reverse the toxic effect of catechol (Fig. 4 C and D). However, the
exposure to rutin (60 µM) induced cells to change to a filamentary phenotype, with contracted
cytoplasm (Fig. 4 E), and the majority of cells exposed to both catechol and rutin presented a
round cytoplasm apparently amplifying the toxic effects (Fig. 4F).
The protective effect of acid ascorbic against catechol induced cytotoxicity was also
evidenced by phase-contrast microscopy, after 72 h experiment. The majority of the GL-15
cells maintaining its morphology even in the presence of 600 µM catechol with ascorbic acid
(100-600 µM) (Fig. 5 C-D).
A
B
OH
HO
OH
O
OH
HO
O
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
Quercetin
Rutin
Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Quercetin http://en.wikipedia.org/wiki/Rutin
Figure 1 - Chemical structures of flavonoids quercetina (A) and its glycoside rutin (B).
32
Figure 2 – Determination of cytotoxicity of catechol and antioxidants in GL-15 cell cultures by the MTT test.
Dose-response curves obtained after 24 h (A), and 72 h (B) exposure to catechol (Eq 2A and 2B); Dose-response
curves obtained after 24 h (C), 72 h (D) exposure to rutin (Eq 2C and 2D); (E) toxicity of quercetin after 72 h
exposure; (F) toxicity of ascorbic acid after 72 h exposure. Results are expressed as means  SD; Non-linear
regression was used to calculate the IC50 values.
33
Cell viability
Quinones formation
Figure 3 - Determination of protective effect of antioxidants against catechol induced cytotoxicity in GL-15
cells cultures by the MTT test and by the measure of quinones formation (A) Dose-response curves of cell
viability obtained after 72 h exposure to catechol and rutin and quinone formation (B); (C) Dose-response curves
of cell viability obtained after 72 h exposure to catechol and quercetin and quinone formation (D); (E) Doseresponse curves of cell viability obtained after 72 h exposure to catechol and ascorbic acid and quinone
formation (F). Results are expressed as the mean  SD of the ABS at 405 nm; * P < 0.0
34
Figure 4 - Photomicrographs by phase microscopy of GL-15 cells cultures in control conditions (A) or after 72 h
exposure to 300µM catechol (B), 60µM rutin (C), 60µM rutin and 300µM catechol (D), 60µM quercetin (E),
60µM quercetin and 300µM catechol (F) Obj. 200.70; Scale bars = 10 µm.
35
Figure 5 - Photomicrographs by phase microscopy of GL-15 cells cultures in control conditions (A) or after 72 h
exposure to 600µM catechol (B), 600µM catechol and 100µM ascorbic acid (C), 600µM catechol and 600µM
ascorbic acid (D). Obj. 200.70; Scale bars = 10 µm.
36
3.4. DISCUSSION
We observed that catechol was toxic to GL-15 cells. The IC50 values decreased along the time
of exposition. The cytotoxicity of catechol against GL-15 cells was associated with the
induction of quinone formation as already demonstrated in our previous study (PEREIRA et
al., 2004). In the same work, the catechol induced toxicity on GL-15 cells was only partially
inhibited by dismutase superoxide (SOD) suggesting that catechol toxicity is can also be
attributed the generation of ROS.
In order to find effective antioxidant molecules against catechol induced toxicity, we
evaluated the protective effect of AA and two related flavonoids, quercetin and its derivative
rutin. Quercetin and rutin are flavonoids abundant in plants, vegetables and fruits. These
flavonoids have been described as antioxidants due its ability to scavenger ROS (ZIELINSKA
et al. 2003; CHEN et al., 2006; BOOTS, 2008). In function of its limited solubility in the
aquoseous conditions of the culture medium, quercetin toxicity was tested only at 100µM. In
the range of concentration between 0.6µM until 100µM the quercetin was not toxic to GL-15
cells, according to the MTT assay. The flavonoid rutin showed cytotoxic effects with IC50
values of 622µM and 284µM, after 24 h and 72 h, respectively. Rutin also induced change on
cell morphology at sub toxic concentrations (10 to 100µM). Quercetin and its glycoside rutin
in concentrations sub-toxic were not able to protect GL-15 cells against oxidative stress
induced by catechol. TAN and collaborators (2009) observed that quercetin or rutin can
significantly attenuate DNA damage in human hepatoma cells and human hepatocyte cells,
indicating that the polyphenols did not work through an enzymatic mechanism. The inhibitory
effect of polyphenols has to be assigned to non-enzymatic repair mechanism rather than to
enzymatic repair mechanism, nor to antioxidant mechanism.
We found that rutin and quercetin at subtoxic concentrations enhanced dose-dependently the
quinone formation in cultures of GL-15 cells exposed to catechol. It may explain the inability
of these flavonoids to revert cytotoxicity of catechol. Oxidation of flavonoids generating
quinones was already demonstrated in different systems (DANGLES et al., 1999; AWAD,
2002; BOOTS et al., 2003).
Rutin was more cytotoxic to GL-15 cells than quercetin in the presence of catechol as
revealed by MTT test and also by the cell morphology analyzes. It may be associated to the
higher increase on oxidation and quinone formation in the presence of catechol. This can also
37
be due to its greater solubility in water than quercetin. The presence of sugar in rutin increases
water solubility and decreases the ability to penetrate lipid membranes and antioxidant
activity (RICE-EVANS et al., 1997). Moreover, as demonstrated in the study of Zielinska et
al. (2003) quercetin, protected C6 cells from oxidative stress only at low concentrations but
neither rutin nor the other two glycosides, were able to protect C6 cells from cytotoxicity and
lipid peroxidation induced by cumene hydroperoxide. The flavonoids quercetin and rutin at
concentrations sub-toxic catechol had associated with the increase of cell death in GL-15
showing pro-oxidant activity as preliminary data (BORCHARDT et al., 1975), (DULLOO et
al., 1999). Beside, Duursen et al. (2004) showed that flavonoids inhibited the activity of
catechol-O-methyl-tranferase (COMT), an enzyme that catalyzes the hydroxyl catechol
metoxilation, thus preventing its oxidation. It has been suggested that phytochemicals with a
catechol structure have the potential to reduce COMT (DUURSEN et al., 2004), this enzyme
it’s also involved in the inactivation of many endogenous catechol substrates, as estrogens,
thereby preventing their oxidation (MÄNNISTÖ & KAAKKOLA, 1999). As observed in
mammary tissues (BORCHARDT et al., 1975; DULLOO et al. 1999; DURSEN et al., 2004)
the flavonoids quercetin, catechin, and epicatechin were more efficient in inhibit COMT
activity than phytochemicals without a catechol structure (genistein, chrysin, and flavone). It
may be also a mechanism by which the association of flavonoids rutin and quercetin enhanced
cytotoxicity induced by catechol in GL-1 cells.
Although the cell death induced by catechols has relationship with the production of ROS,
there may also be the involvement of other mechanisms. The toxicity of catechol to GL-15
cells, for example, is due in part to the production of reactive quinones (PEREIRA et al,
2004).
AA did not show toxicity toward GL-15 cells even at the high concentration adopted of
3000µM, and efficiently protected these cells against oxidative damage induced by catechol.
At concentrations of 20-300µM, AA partially protected GL-15 cells from cytotoxic damage
induced by catechol. Oxidation of catechol generates ROS, including H2O2 and OH2•, and
forms potentially reactive and toxic o-benzoquinones. AA can scavenger ROS and reacts with
quinones (PETHIG et al., 1983). This vitamin, at an equimolecular concentration of catechol,
efficiently depleted or inhibited the reactive compounds generated from catechol oxidation,
emphasizing its role of dietary antioxidant. o-benzoquinones generated from catechol
oxidation are able to react with the nucleophilic group in the side chain of cysteine. This
reaction could lead to the loss of cellular reduced glutathione (GSH), a mechanism that
38
induces neuron degeneration (YOUDIM et al. 2006). In effect, a study using N2a cells as a
model of neuronal cells met that catechol-induced cytotoxicity was not directly a consequence
of reactive oxygen species production, but a consequence of GSH depletion followed by the
induction of apoptosis (LIMA et al., 2008). In the study conducted by Jenner et al. (2002), it
was reported that vitamin C attenuates HOCl-induced DNA base and protein damage and
depletion of intracellular GSH and ATP in human arterial smooth muscle cells. It may be
another mechanism of protection of vitamin C against catechol induced toxicity in glial cells.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from National Council for Scientific and
Technological Development (CNPq) and Foundation for the Support of Research and
Extension of the State of Bahia (FAPESB). We gratefully acknowledge the research support
provided by Program of Pos-Graduation in Biotechnology/UEFS.
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43
3.5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O benzeno é um composto aromático produzido naturalmente e obtido através da
destilação do piche e do carvão vegetal e constitui um sério risco para trabalhadores da
indústria petroquímica e para a sociedade, porque o seu metabolismo gera metabólitos
tóxicos, como o 1,2-dihidroxibenzeno (catecol), podendo gerar estresse oxidativo celular,
condição envolvida na etiopatogenia de diversas doenças do SNC.
Em nossos estudos anteriores observamos que citotoxicidade do catecol em células
GL-15 deve-se especialmente pela formação de quinonas reativas (PEREIRA et al., 2004),
pois a utilização do varredor endógeno de radicais livres como a SOD somente inibiu
parcialmente a sua toxicidade. Em nossas condições experimentais observamos que a
vitamina C protegeu efetivamente a citotoxicidade induzida pelo catecol nas células GL-15,
proteção atribuída à reversão total da formação de quinonas. Por outro lado nossos resultados
apontaram que os flavonoids rutina e quercetina não apresentaram proteção na citotoxicidade
induzida pelo catecol. Ainda um aumento da formação de quinonas no meio extracelular foi
observado quando da associação dos flavonóides com o catecol e um aumento da toxicidade.
A ação antioxidante dos flavonóides rutina e quercetina em outros sistemas biológicos (RICEEVANS et al., 1997) tem sido atribuída à remoção de radicais livres como o peróxido de
hidrogênio e ânion superóxido. Portanto, nas nossas condições experimentais, a falta de
proteção antioxidante dos flavonóides rutina e quercetina poder estar relacionada à
incapacidade destas moléculas em reverter a formação de quinonas.
Os resultados do presente trabalho contribuem para compreensão da toxicidade de um
dos metabólitos do benzeno, o que fornece mais um dado para a discussão da intoxicação pelo
benzeno nas dimensões clínica, ambiental e ocupacional, para que medidas de prevenção à
exposição ao benzeno possam ser adotadas.
Uma questão crucial, no entanto, refere-se ao uso benéfico da dieta ou do uso
terapêutico de substâncias naturais como os flavonóides, visto que no presente modelo de
estudo a rutina mostrou ser tóxica para estas células em altas concentrações e mesmo em
concentrações sub-tóxicas rutina e quercetina aumentaram o dano celular quando associadas
ao catecol. Por outro lado nossos resultados reforçam a vasta propriedade antioxidante da
vitamina C, também efetiva para toxicidade induzida pelo catecol em células gliais.
44
Os resultados obtidos no presente estudo poderão também servir de suporte para novos
estudos dos mecanismos de toxicidade do catecol e compostos antioxidantes nas diferentes
populações de células do SNC e suas interações, utilizando por exemplos, sistemas de cultura
complexos de culturas primarias de células gliais e neuronais normais de murinos.
45
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Eventos
Participação em eventos
"I CONGRESSO IBRO/LARC DE NEUROCIÊNCIAS DA AMÉRICA LATINA, CARIBE
E PENÍNSULA IBÉRICA".Antioxidant effects of ascorbic acid and pro-oxidant effects of
quercetin on catechol - induced citotoxicity to GL-15 glioblastoma cells.. 2008. (Congresso).
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