ANA CAROLINA DE ALMEIDA AZEVEDO
AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE A
FLUCONAZOL E VORICONAZOL FRENTE A ISOLADOS
DE Candida spp. PELO MÉTODO DE DISCO-DIFUSÃO
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
SÃO PAULO
2005
ANA CAROLINA DE ALMEIDA AZEVEDO
AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE A
FLUCONAZOL E VORICONAZOL FRENTE A ISOLADOS
DE Candida spp. PELO MÉTODO DE DISCO-DIFUSÃO
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
Orientador:
Colombo
São Paulo
2005
ii
Prof.
Dr.
Arnaldo
Lopes
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
Chefe do Departamento: Profa. Dra. Emília Inoue Sato
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório Especial de Micologia, da
Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, aprovado
pelo Comitê de Ética (0735/02), contando com o apoio financeiro da
Coordenação e Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
iii
Ana Carolina de Almeida Azevedo
AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE A FLUCONAZOL E
VORICONAZOL FRENTE A ISOLADOS DE Candida spp. PELO MÉTODO
DE DISCO-DIFUSÃO
Presidente da banca:
Prof. Dr.: Arnaldo Lopes Colombo
________________________________________________________________________
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Sydney Hartz Alves
Profa. Dra. Mariceli Araújo Ribeiro
Dr. Patrício Godoy Martinez
SUPLENTE
Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo
iv
Dedicatória
Aos meus pais,
Antonio de Almeida Azevedo e
Maria Aparecida Azevedo
que com todo amor e carinho me ensinaram
a cultivar valores importantes como os da
amizade, caráter, respeito e amor. Princípios
que dinheiro nenhum no mundo compram.
Amo vocês.
Ao meu irmão,
Victor Hugo de Almeida Azevedo,
por me mostrar exemplo de
caráter e determinação.
Meu amor e admiração.
v
Ao Xinho,
Sergio Bachini Pereira Júnior,
Por sempre me apoiar nos momentos em
que mais precisei e por me fazer feliz.
Meu carinho e amor.
À Natasha Bachini Pereira
Que sempre me incentivou a finalizar
mais esta etapa da minha vida.
vi
Ao meu irmão de coração,
Patrício Godoy Martinez,
Por sempre me estender a mão nos momentos mais
turbulentos da minha vida, por nunca me julgar pelos
meus erros, tendo sempre uma palavra sábia de
consolo para que eu pudesse me erguer. Amigo
como você é muito difícil encontrar.
Minha eterna amizade e respeito.
vii
Agradecimentos
Por mais que esta caminhada seja árdua, aprendemos no final das
contas que na verdade o que nos faz grande não é a concretização desta
tese, e sim tudo que aprendemos com ela, principalmente as inúmeras
pessoas que contribuem para a realização de mais este sonho. Este espaço
é dedicado a vocês.
À Deus; por colocar pessoas tão especiais em minha vida e sempre me
dar força para concretizar mais esta etapa.
Ao Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo, pela orientação para o
aprimoramento dos longos passos destinados a realização deste trabalho, e
pela oportunidade do grande desenvolvimento profissional e pessoal que me
foi oferecida ao longo neste estudo.
À Daniel Archimedes da Matta que me deu a oportunidade de iniciar
minha jornada científica, sempre tendo paciência com minhas teimosias,
minha eterna amizade e admiração.
Á Thomas Chagas, que se mostrou uma pessoa amiga e pronta a
ajudar em todos os momentos que precisei. Sem você talvez esta tese
demoraria muito mais para sair. Minha eterna gratidão.
À secretária Joseli que sempre foi uma pessoa amiga, me ajudando no
que fosse necessário e sempre dividindo comigo suas frutinhas. Fico feliz por
Deus ter colocado uma pessoa especial no meu caminho.
viii
À Sarah Gonçalves e Vagner, que apesar do pouco tempo que nos
conhecemos, estiveram sempre me dando força e auxiliando no que fosse
necessário. Minha eterna amizade e gratidão.
À Paty Girl, amiga que apesar de não conviver mais diretamente com
sua alegria, mora em meu coração.
À Edméa Helena, que sempre teve uma palavra amiga para me ajudar
nos momentos difíceis, agradeço pela atenção e carinho.
A todos os amigos do LEMI que compartilharam comigo toda a
tragetória da minha tese e que de alguma forma me ajudaram a realizar este
sonho: Thelma Alves, Thaís Guimarães, Vinicius Ponzio, Leila Paula,
Viviane Reis, Cledja Amorim, Zelinda Nakagawa e Analy Sales.
Á Miriam Amaral e André por todo apoio oferecido durante a
elaboração desta tese.
Á Maria, por toda ajuda prestada nas horas em que precisei.
Á Nilva Franco, comadre que sempre me meu força para lutar pelos
meus sonhos.
A todos aqueles que em algum momento passaram pela minha vida e
puderam contribuir para aquilo que sou hoje.
Muito Obrigada ....
ix
“Na nossa busca, devemos superar obstáculos,
superar provas. Isso nos assusta. Devemos
transitar pela escuridão com fé, crendo que uma
mão nos leva enquanto vamos tateando o
caminho. De repente, a luz se faz. Então,
reconhecemos que valeu a pena ser valentes e
atravessar um terreno desconhecido”.
(Paulo Coelho)
x
SUMÁRIO
Dedicatória ............................................................................................................
v
Agradecimentos ....................................................................................................
viii
Listas .....................................................................................................................
xi
Resumo .................................................................................................................
xvii
1
INTRODUÇÃO ...................................................................................... 1
1.1
Testes de susceptibilidade a antifúngicos: a padronização do método de
diluição em caldo ...................................................................................... 2
1.1.1
EUCAST: a padronização européia para ensaios de microdiluição..........
6
1.1.2
Sensititre Yeast-One: sistema colorimétrico para ensaios de diluição em
caldo..........................................................................................................
9
Testes de susceptibilidade a antifúngicos – avanços em métodos de
ágar difusão...............................................................................................
13
1.2.1
Ensaios com E-test....................................................................................
13
1.2.2
Ensaios com disco-difusão........................................................................
17
1.3
Resistência a amostras de Candida spp. no Brasil...................................
25
2
OBJETIVOS........................................................................................... 29
3
MATERIAL E MÉTODOS................................................................... 31
3.1
Seleção de microrganismos....................................................................... 32
3.2
Identificação de leveduras.........................................................................
3.2.1
Análise de micromorfologia das colônias................................................... 33
3.2.2
Perfil bioquímico........................................................................................
33
3.3
Teste de susceptibilidade a antifúngicos: disco-difusão (NCCLS M44-A)
..............................................................................................................
35
3.3.1
Preparo do meio........................................................................................
35
3.3.2
Preparo do inóculo .................................................................................... 36
3.3.3
Ensaio de disco-difusão ............................................................................ 36
1.2
xi
32
3.3.4
Leitura e interpretação dos resultados ...................................................... 37
3.3.5
Interpretação dos halos inibitórios: definição qualitativa de
susceptibilidade das leveduras ................................................................. 38
3.3.6
Interpretação dos halos inibitórios: definição quantitativa de
susceptibilidade das leveduras aos antifúngicos ......................................
40
3.4
Análise dos dados...................................................................................... 41
4
RESULTADOS.......................................................................... 42
4.1
Microrganismos.......................................................................................... 43
4.2
Distribuição das amostras de Candida spp. avaliadas em ensaios de
disco-difusão com fluconazol ...................................................................
43
Controle de qualidade dos ensaios de disco-difusão com fluconazol
utilizando a cepa-controle C. albicans (ATCC 90028) .............................
46
4.3
4.4
Apresentação dos resultados qualitativos do método de disco-difusão
com discos de fluconazol ................................................................................. 47
4.5
Análise de resultados quantitativos de susceptibilidade com discos de
fluconazol gerados pelo software do sistema Biomic ................................... 51
4.5.1
Análise comparativa do perfil de susceptibilidade a fluconazol em
amostras testadas em dois períodos diferentes ............................................ 53
4.6
Distribuição das amostras de Candida spp. avaliadas em ensaios de
disco-difusão com voriconazol .........................................................................
55
Controle de qualidade dos ensaios de disco-difusão com voriconazol
utilizando a cepa-controle C. albicans (ATCC 90028) ..............................
56
4.7
4.8
Apresentação dos resultados qualitativos do método de disco-difusão
com discos de voriconazol ............................................................................... 58
4.9
Análise de resultados quantitativos de susceptibilidade com discos de
voriconazol gerados pelo software do sistema Biomic ................................
61
5
DISCUSSÃO ............................................................................ 63
6
CONCLUSÕES ........................................................................ 76
7
ANEXOS
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................ 81
9
Abstract ..............................................................................
78
xii
94
Listas de tabelas
Tabela 1.
Distribuição de 4.625 isolados de Candida spp. identificados em diferentes
culturas de materiais biológicos avaliados no período de 1998 a
40
2003.....................................................................................................................
Tabela 2.
Análise dos resultados da média e mediana dos diâmetros dos halos
inibitórios para discos de fluconazol referentes a amostras testadas no
período de 1998 a 2003................................................................................. 44
Tabela 3.
Média dos diâmetros dos halos inibitórios (mm) com discos de fluconazol
frente a 4.625 isolados de Candida spp. identificados em diferentes
culturas de materiais biológicos obtidos de pacientes hospitalizados no
período de 1998 a 2003................................................................................
45
Tabela 4.
Interpretação do perfil de susceptibilidade a fluconazol em categorias:
susceptível, SDD e resistente frente a amostras de Candida spp. obtidas
no período de 1998 a 2003........................................................................... 46
Tabela 5.
Resultados quantitativos do perfil de susceptibilidade a fluconazol de 4.625
amostras de Candida spp............................................................................. 48
Tabela 6.
Interpretação das categorias de susceptibilidade a fluconazol dos
organismos testados pelo método de disco-difusão em dois períodos: de
1998 a 2000 e 2001 a 2003.......................................................................... 50
Tabela 7.
Distribuição de 2.793 isolados de Candida spp. identificados em diferentes
culturas de materiais biológicos avaliados no período de 2001 a 2003 ....... 51
Tabela 8.
Análise dos resultados de média e mediana dos diâmetros dos halos
inibitórios (mm) para discos de voriconazol referentes a amostras testadas
no período de 2001 a 2003 ................................................................................... 54
Tabela 9.
Média dos diâmetros dos halos inibitórios (mm) com discos de voriconazol
frente a 2.793 isolados de Candida spp. identificados em diferentes
culturas de materiais biológicos obtidos de pacientes hospitalizados no
período de 2001 a 2003................................................................................ 55
Tabela 10. Comparação do perfil de susceptibilidade a 2.793 isolados de Candida
spp. frente a discos de fluconazol e voriconazol em ensaios realizados no
período de 2001 a 2003 ............................................................................... 57
xiii
Lista de figuras
Figura 1. Distribuição das cinco principais espécies de Candida identificadas em
diferentes fluídos biológicos ao longo do estudo ........................................
41
Figura 2. Avaliação da reprodutibilidade na leitura dos diâmetros dos halos
inibitórios obtidos com discos de fluconazol utilizando a cepa-controle
ATCC 90028 (C. albicans) .......................................................................... 42
Figura 3. Avaliação da reprodutibilidade na leitura dos diâmetros dos halos
inibitórios obtidos com discos de voriconazol utilizando a cepa-controle
ATCC 90028 (C. albicans) .......................................................................... 47
xiv
Lista de abreviaturas e símbolos
A
Aprovado
aids
“Acquired Immunodeficiency Syndrome”
ATCC
“American Type Culture Collection”
o
Graus Celcius
C
C
Meio de assimilação de carbono
CIM
Concentração inibitória mínima
CIM50
CIM de antifúngico capaz de inibir o crescimento de 50% dos isolados
CIM90
CIM de antifúngico capaz de inibir o crescimento de 90% dos isolados
CQ
Controle de qualidade
et al.
E outros
EUA
Estados Unidos da América
EUCAST
European Committe on Antimicrobial Susceptibility Testing
FDA
“Food and Drug Administration”
g
Gramas
g/L
Gramas por litro
HAART
Terapia anti-retroviral de alta potência
h
Hora (s)
µg
Micrograma
µL
Microlitro
LEMI
Laboratório Especial de Micologia
MHA
Mueller-Hinton ágar
mm
Milimetro
mL
Mililitro
MOPS
Ácido morfolinopropanosulfônico
NaCl
Cloreto de sódio
NCCLS
National Committee for Clinical Laboratory Standards
nm
Nanômetro
No
Número
P
Proposta
pH
Potencial hidrogeniônico
R
Resistente
®
Marca registrada
xv
S
Susceptível
SHDM
Shadomy
S-DD
Susceptibilidade-dose dependente
SENTRY
Programa Internacional de Vigilância das Infecções da Corrente Sanguínea
spp.
Espécies
T
Tentativa
UFC
Unidade formadora de colônia
x
Vezes
≤
Menor do que ou igual a
≥
Maior do que ou igual a
%
Por cento
5-FC
5-Fluorocitosina
xvi
Resumo
Introdução: Em 2004, o NCCLS padronizou a técnica de disco-difusão para ensaios com
fluconazol. Este teste permite a análise de grande número de amostras com custo
reduzido, resultado rápido e de fácil interpretação, não exigindo equipamento especial,
sendo assim de grande utilidade em estudos de vigilância de resistência a fluconazol e
voriconazol. Objetivos: 1) Avaliar a distribuição de espécies de Candida identificadas em
diferentes materiais biológicos obtidos de pacientes hospitalizados. 2) Descrever o perfil
de susceptibilidade pelo método de disco-difusão para as diferentes amostras de Candida
spp. frente a fluconazol e voriconazol. 3) Avaliar a prevalência de isolados de Candida
spp. resistentes a fluconazol. Material e Métodos: Foram incluídas todas as amostras de
Candida spp. isoladas de diversos materiais biológicos, provenientes de dois hospitais
terciários da cidade de São Paulo, entre janeiro de 1998 a dezembro de 2003. Após
triagem de Candida albicans, utilizando-se meio cromogênico CHROMagar- Candida, os
isolados de Candida não-albicans foram identificados por análise do perfil bioquímico pelo
método comercial ID-32C, complementados por análise de microcultivo. O perfil de
susceptibilidade das amostras frente a fluconazol e voriconazol foi realizado pelo método
de disco-difusão, de acordo com a normatização do documento do NCCLS M44-A (2004).
A determinação dos diâmetros dos halos inibitórios foi realizada utilizando de um sistema
automatizado de leitura de placas para análise das imagens - BIOMIC. Resultados:
Avaliou-se 4.625 isolados clínicos de Candida spp., incluindo 2.393 cepas de C. albicans
(51,7%), 658 de C. tropicalis (14,2%), 503 de C. glabrata (11%), 495 de C. parapsilosis
(10,8%), 292 de C. rugosa (6,3%), 195 de C. guilliermondii (4,2%), 53 de C. krusei (1,1%)
e 36 de Candida spp. Na análise dos resultados qualitativos de susceptibilidade a
fluconazol as amostras de C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis apresentaram
diâmetro dos halos inibitórios maiores, resultado este que sugere alta susceptibilidade
destas cepas a fluconazol. Para os isolados de C. glabrata, C. krusei e C. rugosa os halos
obtidos apresentaram menores diâmetros, dado compatível com susceptibilidade reduzida
destas espécies a fluconazol. Em relação a voriconazol, os isolados de C. albicans, C.
parapsilosis, C. glabrata e C. tropicalis apresentaram diâmetros dos halos inibitórios
maiores. Para as amostras de C. krusei e C. rugosa, os halos apresentaram menor
diâmetro em relação as espécies mais susceptíveis. Na análise dos resultados
quantitativos de susceptibilidade a fluconazol as taxas de SDD/R para os isolados
avaliados foram de 2,0 e 5,8%, respectivamente, sendo visto maior porcentagem de
SDD/R com C. glabrata, C. krusei e C. rugosa. Com exceção das amostras de C. rugosa,
todas as amostras testadas com voriconazol apresentaram valores de CIM90 ≤ 0,5µg/mL.
Conclusão: 1. Em nosso estudo, das 4.625 espécies de Candida testadas, C. albicans foi
a espécie prevalente em todos os fluídos biológicos avaliados. 2. Entre as leveduras de
Candida não-albicans, as espécies mais freqüentes foram C. tropicalis, C. glabrata e C.
parapsilosis em ambos os períodos avaliados. 3. Susceptibilidade dose-dependente (SDD)
e resistência a fluconazol foram pouco freqüentes, ocorrendo em apenas 2,0 e 5,8% das
amostras, respectivamente. As espécies com maior porcentagem de isolados SDD/R para
fluconazol foram C. glabrata, C. krusei e C. rugosa. 4. Voriconazol apresentou melhor
atividade in vitro comparado a fluconazol, mesmo em cepas fluconazol-resistentes. 5. Não
houve aumento de resistência a fluconazol e voriconazol nas amostras de Candida spp.
testadas ao longo do período avaliado.
xvii
Azevedo, Ana Carolina de Almeida
Avaliação do perfil de susceptibilidade a fluconazol e voriconazol
frente a isolados de Candida spp. pelo método de disco-difusão. / Ana
Carolina de Almeida Azevedo. – São Paulo, 2005.
xvii 94f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Evaluation of the fluconazole and voriconazole susceptibility
profile of yeasts clinical isolates for disk diffusion method.
1. Disco-difusão. 2. Candida spp. 3. Fluconazol . 4. Voriconazol. 5. Resistência
a fluconazol.
xviii
1. INTRODUÇÃO
__________________________________
INTRODUÇÃO
2
1.1 Testes de susceptibilidade a antifúngicos: a padronização do método
de diluição em caldo
O desenvolvimento de métodos de susceptibilidade a antifúngicos
tem
sua
história
vinculada
aos
avanços
obtidos
na
quimioterapia
antibacteriana. Assim sendo, a utilização de testes de susceptibilidade in vitro
envolvendo princípios das metodologias conhecidas como difusão em ágar e
diluição em caldo foi inicialmente realizado por Flemming, durante a
investigação do potencial terapêutico da penicilina. Rapidamente, com o
advento de novos antimicrobianos, bem como o reconhecimento de bactérias
resistentes à penicilina, inúmeros laboratórios de microbiologia passaram a
realizar testes de susceptibilidade a antimicrobianos (Sherris, 1989).
A quimioterapia de doenças fúngicas apresentava, até um
passado recente, grande disparidade em relação à terapêutica antibacteriana.
Até o advento dos antifúngicos azólicos na década de 70, apenas a
anfotericina-B e a 5-fluorocitosina (5-FC) encontravam-se disponíveis para o
tratamento de micoses sistêmicas. Atualmente, no Brasil, são encontrados
comercialmente diversas drogas antifúngicas para uso sistêmico, incluíndo
anfotericina-B desoxicolato e formulações lipídicas, fluconazol, itraconazol,
cetoconazol, 5-FC e recentemente, voriconazol e caspofungina (Dismukes,
2001; Groll et al., 2002; Colombo et al., 2003; Datry, Bart Delabesse, 2005).
Além do lançamento de voriconazol e caspofungina, outras três drogas
encontram-se em fase avançada de investigação clínica: ravuconazol,
posaconazol e micafungina (Arikan, Rex, 2002; Ostrosky-Zeichner, 2003;
Espinel-Ingroff et al., 2003; Groll et al., 2005).
INTRODUÇÃO
3
Se por um lado, temos hoje maior número de opções de drogas
antifúngicas, por outro, há crescente preocupação com o aumento da
resistência a estas drogas. Estudos de vigilância de resistência a antifúngicos
no mundo todo mostram a emergência de leveduras de Candida não-albicans
como causa de infecções superficiais e invasivas, sendo que muitas destas
espécies apresentam menor susceptibilidade a anfotericina-B e/ou azólicos
(Pfaller et al., 2002; Krcmery, Barnes, 2002; Colombo, 2003a; Hajjeh et al.,
2004; Almirante et al., 2005).
Diante deste fato, aumentou o interesse da comunidade científica
no aperfeiçoamento de testes de susceptibilidade para auxiliar na escolha mais
adequada na terapêutica antifúngica como também, da indústria farmacêutica
para utilizar essa ferramenta no desenvolvimento de novas drogas (Rex et al.,
2001; Pfaller et al., 2002; Bedout et al., 2003).
No final da década de 80, como parte da estratégia para obter um
método de alta reprodutibilidade, o National Committee for Clinical Laboratory
Standards (NCCLS) conduziu vários estudos multicêntricos para definir as
condições ideais de realização de ensaios de diluição em caldo. Neste sentido, as
variáveis que foram objeto de padronização incluíram a definição do método e
preparação de inóculo, a composição e o pH do meio a ser utilizado, a
temperatura, o tempo de incubação e determinação dos critérios de leitura do
teste (NCCLS, 1992; Pfaller, Rinaldi, 1993; Rex et al., 1993).
Pfaller et al. (1988) realizaram estudo com o objetivo de
padronizar o inóculo a ser utilizado no ensaio, comparando a técnica de
espectrofotometria com três outros testes. A partir dos resultados obtidos,
concluíram
que
a
espectrofotometria
foi
a
metodologia
com
melhor
reprodutibilidade e fácil execução para o teste de susceptibilidade a
antifúngicos. Verificaram também que as leveduras avaliadas apresentaram
INTRODUÇÃO
4
crescimento mais rápido quando incubadas à 35oC do que à 30oC (Pfaller et al.,
1990).
Fromtling et al. (1993) desenvolveram trabalho multicêntrico
envolvendo
13
laboratórios
diferentes
para
otimizar
a
correlação
interlaboratorial dos resultados do método de microdiluição em caldo, testando
três classes de drogas antifúngicas frente a 100 isolados de Candida spp..
Foram comparados dois tamanhos de inóculo (5x104 e 2-5x103 UFC/mL) e dois
tempos de leitura (24h e 48h de incubação). Houve maior reprodutibilidade nos
ensaios que utilizaram menor concentração do inóculo (2-5x103 UFC/mL) e
leitura de 48h, mostrando assim melhor correlação interlaboratorial dos
resultados obtidos.
Estes trabalhos foram fundamentais para a padronização do teste
de susceptibilidade a antifúngicos pelo NCCLS que ocorreu após 15 anos de
trabalhos colaborativos possibilitando a publicação de normas e técnicas
envolvendo os documentos M27-P (proposta - 1992), M27-T (tentativa - 1995),
M27-A (aprovado - 1997) e, mais recentemente a versão M27A-2 (2002)
(NCCLS, 1992; NCCLS, 1995; NCCLS, 1997; Rex et al., 2001; NCCLS, 2002).
Estes documentos fundamentaram a metodologia de diluição em
caldo (macrodiluição ou microdiluição em caldo como técnica equivalente)
como padrão ouro para testes de susceptibilidade a antifúngicos. Desta forma,
o NCCLS estabeleceu a utilização do meio de cultura RPMI -1640 com Lglutamina, sem bicarbonato e tamponado com ácido morfolinopropanosulfônico
(MOPS) com pH 7,0; o tamanho do inóculo de 0,5 à 2,5 X 103 UFC/mL utilizando
espectrofotometria, a temperatura de incubação de 35°C com períodos variando
de 48h para isolados de Candida spp. e 72h para Cryptococcus neoformans. O
critério de leitura dos ensaios com azólicos e 5-FC foi definido como a menor
concentração capaz de gerar inibição significativa (50% para microdiluição e
80% para macrodiluição). Para anfotericina-B, a concentração inibitória mínima
INTRODUÇÃO
5
(CIM) foi definida como a menor concentração capaz de inibir qualquer
crescimento visível (Pfaller et al., 1988; Pfaller et al., 1990; Espinell-Ingroff et
al., 1992; Fromtling et al., 1993; Pfaller, Rinaldi, 1993; Rex et al., 1993; Rex et
al., 2001; NCCLS, 2002).
A correlação clínico-laboratorial dos valores das CIMs gerados
pelo método de microdiluição em caldo foi avaliada em diversos estudos em
pacientes com aids, portadores de candidíase orofaríngea. Dados obtidos por
vários autores mostraram que valores mais elevados das CIMs frente a
fluconazol para isolados de Candida albicans originários da cavidade oral de
pacientes com aids, correlacionaram-se com falência terapêutica. De forma
complementar, aqueles isolados cujos valores das CIMs foram baixos,
correlacionaram-se com êxito à terapêutica antifúngica (Rex et al.,2001; Pfaller
et al., 2004). Após a revisão dos dados de correlação clínico-laboratorial
obtidos por diversos trabalhos, o NCCLS publicou uma proposta para a
interpretação dos valores das CIMs de fluconazol e itraconazol, dividindo as
amostras testadas em três categorias: susceptível, susceptibilidade dosedependente (SDD) ou resistente (Rex et al., 1997, Martin-Mazuelos et
al.,1999).
INTRODUÇÃO
6
1.1.1 EUCAST: a padronização européia para ensaios de microdiluição
Paralelamente aos esforços do NCCLS para o aprimoramento de
testes de susceptibilidade, a comunidade científica européia se organizou na
realização de estudos para otimização destes ensaios. Recentemente, a
entidade responsável pela normatização de técnicas de laboratório clínico na
Europa, o European Committe on Antimicrobial Susceptibility Testing
(EUCAST), designou um subcomitê para elaborar uma proposta alternativa em
relação a padronização do teste de microdiluição em caldo para leveduras
fermentadoras,
baseada
no
documento
NCCLS
M27-A
(1997).
Esta
metodologia incorporou algumas modificações no teste padrão do NCCLS,
sendo as principais a utilização do meio RPMI suplementado com 2% de
glicose, para suportar melhor crescimento de leveduras fermentadoras, o
aumento no tamanho do inóculo para 0,5-2,5x105 UFC/mL, possibilitando
menor tempo de incubação do ensaio de 48h para 24h e, finalmente, a leitura
dos testes por espectrofotometria, para eliminar a subjetividade da leitura visual
do ensaio (Cuenca-Estrella et al., 2002; Chryssanthou et al., 2002; CuencaEstrella et al., 2003).
Cuenca-Estrella et al. (2002) avaliaram a correlação dos resultados
obtidos entre dois métodos de microdiluição em caldo: NCCLS M27-A (1997)
versus EUCAST. Foram avaliadas um total de 109 amostras de Candida spp.
isoladas de hemoculturas obtidas de um programa de vigilância de resistência
a antifúngicos em Baltimore, Connecticut. Foram utilizadas as seguintes drogas
antifúngicas: anfotericina-B, fluconazol, 5-FC e itraconazol. A leitura dos
ensaios do EUCAST foi realizada após 24h de incubação e a metodologia do
NCCLS, após 48h de incubação. O índice de correlação entre as CIMs geradas
pelos dois métodos foi de 92%. Para ensaios com anfotericina-B houve boa
concordância entre todas as amostras testadas: Candida glabrata (95,3%),
Candida parapsilosis (95,1%), Candida albicans (94,5%) e Candida tropicalis
(93,1%). Houve também boa concordância para 5-FC em todos os isolados
INTRODUÇÃO
7
avaliados (100%). Em relação a fluconazol houve boa correlação para todas as
amostras: C. parapsilosis (94,6%), C. albicans (93,9%), C. glabrata (93,8%) e
C. tropicalis (88,5%). Entretanto, para itraconazol houve menor concordância
em ensaios envolvendo C. glabrata (81%), C. parapsilosis (80,7%), C. albicans
(80,4%) e C. tropicalis (78,8%). Pode-se concluir que em relação as amostras
avaliadas, houve maior correlação entre os ensaios envolvendo isolados de C.
albicans e C. parapsilosis e menor correlação para as amostras de C. tropicalis.
Já para as drogas testadas, houve concordância maior em ensaios envolvendo
anfotericina-B, fluconazol e 5-FC, sendo menor para itraconazol. De forma
geral, os autores concluíram que a concordância entre os dois métodos foi
bastante significativa, havendo vantagem de leitura após 24h para os ensaios
do EUCAST.
Em estudo realizado por Chryssanthou et al. (2002) foi analisada
a concordância entre os valores das CIMs para voriconazol e caspofungina em
relação a dois diferentes ensaios: o método de microdiluição em caldo
padronizado pelo NCCLS M27-A (1997) e a proposta do EUCAST. Foram
avaliadas 102 amostras de leveduras isoladas de vários materiais biológicos
provenientes de pacientes admitidos no Hospital Karolinska, Suécia. A
correlação entre os resultados das CIMs obtidas pelas duas metodologias para
leitura de 24h foi boa para ambas as drogas testadas: voriconazol (99%) e
caspofungina (98%). Já a correlação entre as leituras de 24h para o EUCAST e
48h para o NCCLS foi maior para caspofungina (96%) e menor para
voriconazol (87%). Em ensaios com leitura de 48h para ambas as
metodologias, a concordância foi boa para as duas drogas testadas:
voriconazol (97%) e caspofungina (100%). Os autores concluíram que a leitura
de 24h pelo método EUCAST oferece excelente performance e permite a
divulgação dos resultados com maior antecedência.
INTRODUÇÃO
8
Cuenca-Estrella et al. (2003) realizaram estudo multicêntrico
avaliando a reprodutibilidade de dois métodos de microdiluição em caldo:
EUCAST e NCCLS M27-A2 (2002). Participaram deste trabalho nove
laboratórios, sendo testados 60 isolados clínicos de Candida spp. frente a três
drogas antifúngicas (fluconazol, itraconazol e 5-FC). A correlação entre as
leituras de 24h para ambos os métodos foi de 99,2% e após 48h foi de 96,4%.
A leitura de 24h do EUCAST possibilitou concordância maior que 95% para a
grande maioria das drogas e para as espécies de leveduras testadas. Apenas
ensaios realizados com isolados de C. glabrata apresentaram menor
concordância e reprodutibilidade. Estes dados confirmam que a leitura de 24h
do EUCAST oferece melhores resultados, devendo-se realizar leitura de 48h
apenas para amostras com limitado crescimento após curto período de
incubação.
Espinel-Ingroff et al. (2005) compararam as CIMs de fluconazol,
itraconazol, posaconazol e voriconazol obtidas segundo duas metodologias:
EUCAST e NCCLS M27-A2 (2002). Foram selecionados 421 isolados de
Candida spp. de seis diferentes centros. A concordância entre as duas
metodologias para leitura de 24h em ambos os métodos foi boa em todas as
drogas avaliadas: fluconazol (95%), voriconazol (94%), posaconazol (91%) e
itraconazol (90%). A leitura de 48h não aumentou a concordância entre os
métodos avaliados. Entretanto, os autores verificaram que os resultados das
CIMs do EUCAST em relação a azólicos foram consistentemente menores que
os dados obtidos com o método padrão do NCCLS. Sendo assim, é possível
que os pontos de corte para a susceptibilidade a azólicos sugeridos pelo
NCCLS M27-A2 não sejam aplicáveis à metodologia do EUCAST.
INTRODUÇÃO
9
1.1.2 Sensititre Yeast-One: sistema colorimétrico para ensaios de diluição
em caldo
Devido à necessidade de métodos de susceptibilidade a
antifúngicos que pudessem gerar resultados com maior rapidez e praticidade,
auxiliando a rotina de laboratórios clínicos, vários sistemas comerciais foram
desenvolvidos para a avaliação in vitro de drogas antifúngicas. Dentre eles,
destaca-se o sistema comercial Sensititre Yeast-One, consistindo numa placa
de microdiluição contendo diferentes concentrações de cinco agentes
antifúngicos: anfotericina-B, fluconazol, 5-FC, itraconazol e cetoconazol. Essa
placa contém um indicador colorimétrico (azul de alamar) que permite visualizar
mudança de pH frente à multiplicação das células fúngicas. Desta forma, este
sistema colorimétrico desencadeia uma reação de óxido-redução com
conseqüente mudança de cor azul para vermelho nos poços onde há
crescimento do inóculo. Essa reação facilita a identificação do ponto de leitura
das CIMs, na transição de mudança de cor. As vantagens desse método
comercial incluem não apenas as facilidades operacionais, (visto que as drogas
já se apresentam prontas na placa de leitura), como também a rápida liberação
de resultados (leitura de 24h) e interpretação do ponto de leitura por mudança
de cor (Tiballi et al., 1995; Espinel-Ingroff et al., 1999; Chryssanthou, 2001;
Morace et al., 2002).
No estudo conduzido por Davey et al. (1998) foram comparados
os seguintes métodos de microdiluição em caldo: Sensititre Yeast-One e
NCCLS M27-A (1997) para determinar a susceptibilidade de 180 isolados de
Candida spp. em relação a quatro drogas antifúngicas: anfotericina-B,
fluconazol, itraconazol e cetoconazol. Houve concordância superior a 90%
entre os métodos para ensaios envolvendo anfotericina-B e fluconazol em
relação a todas as cepas avaliadas. Em ensaios envolvendo itraconazol e
cetoconazol os índices de concordância para a maioria das amostras avaliadas
foi boa (91%), com exceção de ensaios envolvendo isolados de C. tropicalis
(75%). Através deste estudo, pode-se concluir que a concordância entre as
INTRODUÇÃO
10
duas metodologias foi maior com testes envolvendo fluconazol e anfotericina-B,
tendo menor concordância para amostras de C. tropicalis em relação a
antifúngicos azólicos.
Espinel-Ingroff et al. (1999) avaliaram a concordância do método
comercial Sensititre Yeast-One em relação ao método padronizado pelo
NCCLS M27-A (1997), em três diferentes laboratórios, testando 1.176 isolados
clínicos de espécies de Candida. Os resultados das CIMs do método comercial
em relação aos cinco agentes antifúngicos (anfotericina-B, fluconazol, 5-FC,
itraconazol e cetoconazol) foram comparados após 24h de incubação para o
teste colorimétrico, e 48h para o método do NCCLS. A concordância entre as
duas metodologias variou de 90 a 98% para todas as espécies avaliadas. Os
dados sugerem que a placa Sensititre Yeast-One tem uso potencial em
laboratórios de rotina por sua facilidade de execução e concordância com o
NCCLS.
Chryssanthou et al. (2001) conduziram estudo comparando o
sistema Sensititre Yeast-One com o método de macrodiluição em caldo frente a
anfotericina-B, fluconazol, itraconazol e 5-FC. Foram selecionadas para o
estudo 233 espécies de Candida isoladas de hemoculturas na Suécia. A
concordância entre as leituras de 24h para o teste colorimétrico e 48h para o
método do NCCLS foi de 87%. Houve concordância maior para anfotericina-B
(97%), 5-FC (94%), fluconazol (93%) e menor para itraconazol (70%) quando
avaliadas amostras de C. albicans. Já para as espécies de Candida nãoalbicans, houve concordância maior apenas para anfotericina-B (82%), sendo
menor para fluconazol (78%), 5-FC (75%) e itraconazol (44%). Os autores
concluíram que houve discrepância de resultados entre as espécies avaliadas,
sendo que para ensaios com isolados de C. albicans houve boa correlação em
quase todas as drogas avaliadas, exceto para itraconazol. Em relação as
amostras de Candida não-albicans, principalmente C. glabrata, C. krusei e C.
parapsilosis apresentaram baixa correlação de resultados para quase todas as
drogas avaliadas, exceto para anfotericina-B. Devido a esta inconsistência, faz-
INTRODUÇÃO
11
se necessária a confirmação dos resultados com o método de referência para
os resultados do teste de susceptibilidade a azólicos frente aos isolados de C.
glabrata, C. krusei e C. parapsilosis.
Morace et al. (2002) determinaram a susceptibilidade de
fluconazol através de seis metodologias, dentre estas o comercial Sensititre
Yeast-One e NCCLS M27-A (1997), sendo testadas 800 amostras clínicas de
Candida spp. A concordância entre os métodos avaliados foi de 81,4%. Houve
maior correlação em ensaios com fluconazol para isolados de C. parapsilosis
(88,9%), C. albicans (88,4%), C. tropicalis (83,1%) e menor em amostras de C.
krusei (66,7%) e C. glabrata (50,8%). Através deste estudo, os autores
concluíram que os resultados do teste colorimétrico para os isolados de C.
krusei e C. glabrata apresentaram baixa correlação com o método de
referência. Isto pode ser devido as dificuldades de adaptação a diferença de
curva de crescimento para amostras de C. glabrata e C. krusei em diferentes
condições na realização do teste de susceptibilidade a antifúngicos.
Trabalhos mais recentes têm avaliado a eficácia deste sistema
comercial com novas drogas antifúngicas como: voriconazol, posaconazol e
ravuconazol. No estudo de Pfaller et al. (2004b) foi avaliado o sistema
Sensititre Yeast-One, comparando os resultados do teste com o NCCLS M27A2 (2002). Foram avaliados 300 isolados clínicos de C. albicans, C.
parapsilosis, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis e C. glabrata frente a
fluconazol, voriconazol, posaconazol e ravuconazol. A concordância entre os
resultados dos métodos avaliados foi de 95,4%. Em relação a fluconazol,
ravuconazol, voriconazol e posaconazol houve boa correlação para todas as
espécies testadas (98%, 96%, 95,3% e 92,3%, respectivamente). No trabalho
citado acima, foram obtidos melhores resultados para o sistema comercial
Sensititre Yeast-One envolvendo azólicos quando comparados aos estudos de
Chyssanthou et al., (2001) e Morace et al., (2002).
INTRODUÇÃO
12
Após vários anos de pesquisas avaliando o sistema comercial
Sensititre Yeast-One, pode-se concluir que este método apresenta boa
reprodutibilidade e acurária significativa comparado ao NCCLS M27-A2 (2002).
Entretanto, os resultados parecem depender da combinação entre espécies de
Candida e as drogas testadas. Estes estudos levaram à aprovação deste
sistema pelo “Food and Drug Administration” (FDA) nos EUA. Contudo, por se
tratar de um método com custo elevado, torna-se limitante a utilização em
laboratórios de rotina em nosso meio.
INTRODUÇÃO
13
1.2 Testes de susceptibilidade a antifúngicos – avanços em métodos de
ágar difusão
1.2.1 Ensaios com E-test
Apesar dos métodos de diluição em caldo representarem um
importante avanço no desenvolvimento de testes de susceptibilidade a
antifúngicos, seja por suas características de reprodutibilidade e boa correlação
clínica observada, tratam-se de métodos laboriosos e de difícil execução em
laboratórios de rotina. Por estes motivos, vários pesquisadores tiveram a
necessidade de desenvolver ensaios mais adequados à rotina de laboratórios
clínicos, cujos resultados fossem equivalentes àqueles gerados pelo método de
referência (Martin-Mazuelos et al., 1999; Koc et al., 2000; Laverdiere et al.,
2002).
Na tentativa de encontrar ensaios que pudessem ser utilizados
em laboratórios de rotina para obter maior rapidez e praticidade, foram
desenvolvidos métodos alternativos de difusão em ágar, como o teste de discodifusão e o E-test, com a finalidade de determinar in vitro a susceptibilidade de
leveduras frente a várias classes de antifúngicos (Colombo et al.,1995; Koc et
al., 2000; Matar et al., 2003; Maxwell et al., 2003; Hospenthal et al., 2004).
O E-test (AB Biodisk, Solna, Suécia) é um teste de difusão em
ágar, que fornece valores quantitativos referentes à CIM do antifúngico para o
microrganismo em estudo. Este método consiste numa fita plástica contendo
droga em diferentes concentrações expressas no reverso da tira. Uma vez
colocada na superfície do meio solidificado, a droga contida na fita difunde-se
rapidamente para o meio, mantendo por longo tempo um gradiente fixo de
concentração em torno da fita. A difusão da droga a partir da fita para o ágar
INTRODUÇÃO
14
inibe o crescimento do microrganismo inoculado no meio, gerando área de
inibição em formato de elipse. A CIM é lida como sendo a concentração da
droga superior àquela expressa na fita no ponto em que a tira de E-test
intercepta a borda da zona de inibição. Deste modo, este método reúne a
vantagem na simplicidade de execução de testes de difusão em ágar, com as
informações quantitativas fornecidas pelos ensaios de diluição (Baker et al.,
1991; Sanchez, Jones, 1993; Colombo et al., 1995).
Colombo et al. (1995) analisaram a concordância de dois
métodos: E-test e NCCLS M27-T (1992). Foram avaliados 100 isolados de
Candida spp. frente a fluconazol, cetoconazol e itraconazol. A correlação entre
as metodologias para fluconazol foi maior em ensaios envolvendo as amostras
de C. glabrata (95%) e C. albicans (84%), sendo menor para os isolados de C.
tropicalis e C. parapsilosis (53%). Em ensaios envolvendo cetoconazol a
correlação foi maior entre as amostras de C. albicans (88%) e C. parapsilosis
(87%), tendo menor correlação para isolados de C. tropicalis (73%) e C.
glabrata (45%). Em relação a itraconazol, houve maior concordância em
relação as amostras de C. glabrata (100%) e C. parapsilosis (87%), tendo
menor concordância entre os isolados de C. albicans (76%) e C. tropicalis
(33%). Em conclusão, o E-test apresentou correlação variável com o método
de referência, com maior acurácia em ensaios com itraconazol e fluconazol e
menor para cetoconazol. Entre as espécies testadas houve menor performance
apenas para amostras de C. tropicalis.
Em estudo desenvolvido por Martin-Mazuelos et al. (1999) foi
avaliada a utilização do E-test em relação ao teste padronizado pelo NCCLS
M27-A, (1997) para ensaios com fluconazol e itraconazol. Foram testadas 102
amostras de Candida spp. isoladas da cavidade orofaríngea de pacientes
admitidos no Hospital da Universidade de Sevilla, Espanha. A concordância
entre as metodologias avaliadas foi de 74,5%. A concordância para ensaios
com fluconazol foi maior nos testes envolvendo amostras de C. tropicalis
(88,2%), C. parapsilosis (85,7%), sendo menor para C. albicans (74,7%) e C.
INTRODUÇÃO
15
glabrata (66,6%). Em relação a itraconazol, a correlação foi maior entre os
isolados de C. glabrata (88,8%) e C. tropicalis (82,3%), apresentando menor
correlação para C. albicans (60,5%) e C. parapsilosis (42,9%).
Koc et al. (2000) avaliaram a concordância do E-test com o teste
de microdiluição em caldo frente a anfotericina-B, fluconazol, itraconazol e
cetoconazol. Foram selecionados para o estudo 102 isolados de Candida spp..
A concordância entre as metodologias para anfotericina-B foi boa em relação a
todas as amostras avaliadas: C. parapsilosis (100%), C. albicans (96,7%), C.
tropicalis (90%) e C. glabrata (87,5%). Em ensaios com fluconazol e itraconazol
houve maior concordância entre as amostras de C. albicans (83,3%) e C.
tropicalis (80%) e menor para C. parapsilosis e C. glabrata (75%). Ensaios
envolvendo cetoconazol foram similares a fluconazol e itraconazol, mudando
apenas em relação aos isolados de C. albicans (86,7%). Sendo assim, pode-se
concluir que houve maior concordância entre as metodologias nos ensaios
envolvendo anfotericina-B, sendo menor com azólicos. Entre as espécies
analisadas houve menor correlação para as amostras de C. glabrata quando
testadas com azólicos.
Laverdiere et al. (2002) determinaram a susceptibilidade a
anfotericina-B, fluconazol, itraconazol e caspofungina através de dois métodos:
E-test e NCCLS M27-A (1997). Foram testadas 178 amostras de Candida spp.
isoladas de hemoculturas, provenientes de dois centros canadenses. A
correlação entre as duas metodologias com a variação de até duas diluições
para as espécies avaliadas variou de 81% à 97%. A correlação para
anfotericina-B foi boa para todas as amostras avaliadas: C. albicans, C.
glabrata, C. tropicalis (100%) e C. parapsilosis (90%). Em relação a fluconazol
houve maior correlação entre as amostras de C. parapsilosis (90%), C. albicans
(87%), C. glabrata (80%), sendo menor para isolados de C. tropicalis (73%).
INTRODUÇÃO
16
Em relação a itraconazol houve maior correlação para C. tropicalis (86%), C.
parapsilosis (85%) e C. albicans (84%), sendo menor para C. glabrata (77%).
Já para caspofungina, houve boa correlação em relação a todas as amostras
testadas: C. tropicalis (100%), C. parapsilosis (90%), C. albicans (88%) e C.
glabrata (85%). Em conclusão, os autores confirmaram que apesar da
correlação satisfatória entre os dois métodos, há variáveis de concordância
conforme a droga e espécie avaliada.
Maxwell et al. (2003) avaliaram a performance do E-test para
fluconazol e voriconazol frente aos resultados das CIMs determinadas pelo
método NCCLS M27-A (2002). Foram avaliadas 279 amostras de Candida spp.
isoladas
de
hemoculturas,
obtidas
de
68
diferentes
laboratórios.
A
concordância entre os resultados das metodologias avaliadas em ensaios com
fluconazol foi boa para todas as espécies testadas. Já em relação a voriconazol
houve maior concordância para C. lusitaniae e C. rugosa (100%), sendo menor
para amostras de C. guilliermondii (79%). Os autores concluíram que houve
boa correlação para as duas drogas avaliadas, tendo baixa correlação para os
isolados de C. guilliermondii quando testado voriconazol. O E-test pareceu ser
um método alternativo para determinar a susceptibilidade de espécies
incomuns de Candida.
Os resultados dos vários estudos demonstram que o E-test
apresenta significativa concordância com o método padronizado pelo NCCLS
M27-A2 (2002). Conseqüentemente, este teste também foi aprovado pelo FDA
para utilização em laboratórios de rotina. Deve-se mencionar que vários
autores sugerem que E-test gera maior variação de valores das CIMs para
anfotericina-B quando comparado ao NCCLS. Esta qualidade permite maior
poder discriminatório para o E-test na identificação de espécies resistentes a
anfotericina-B (Koc et al., 2000; Peyron et al., 2001, Pfaller et al., 2004c).
INTRODUÇÃO
17
1.2.2 Ensaios com disco-difusão
O método de disco-difusão, descrito por Anderson e modificado
por Kirby e Bauer, vem sendo empregado com sucesso na bacteriologia desde
1966, com a finalidade de determinar a susceptibilidade de bactérias a
antimicrobianos, apresentando ótima correlação clínico-laboratorial. Tendo em
vista sua simplicidade operacional e bons resultados obtidos na bacteriologia é
de extrema importância a tentativa de adaptar esta metodologia para os
ensaios com antifúngicos (Bauer et al., 1966; Jorgensen et al., 1977; NCCLS,
1993; ).
Nas décadas de 70 e 80, vários autores trabalharam com o
método de disco-difusão em micologia utilizando discos de 5-FC, anfotericinaB, miconazol e clotrimazol. Entretanto, os trabalhos foram realizados com
diferentes metodologias, sendo difícil a comparação entre seus resultados. Da
mesma forma, não houve preocupação dos autores no desenvolvimento de
estudos
que
possibilitassem
a
padronização
de
diferentes
variáveis
fundamentais para garantir consistência e reprodutibilidade nos ensaios
(Marks, Eickhoff, 1970; Utz, Shadomy, 1977; Grendahl, Sung, 1978; Saubolle,
Hoeprich, 1978; Casals, 1979; Torres-Rodríguez et al., 1990).
Na década de 90, após a padronização do método de
microdiluição em caldo, o NCCLS designou um subcomitê para padronizar o
teste de disco-difusão frente a leveduras, onde vários estudos foram realizados
analisando as variáveis mais importantes na acurácia dos ensaios, incluindo o
meio a ser utilizado, a temperatura, o tempo de incubação, o disco contendo
antifúngico e a determinação dos critérios de leitura do teste (Pfaller et al.,
1992; Sandven et al., 1993; Barry, Brown, 1996).
INTRODUÇÃO
18
O meio de cultura a ser utilizado no teste de disco-difusão deve
ser capaz de suportar crescimento adequado dos microrganismos a serem
testados, sem causar qualquer interação com a atividade das drogas utilizadas
no
ensaio.
Têm
sido
preconizados
meios
de
composição
química
completamente definida, para viabilizar a reprodutibilidade dos ensaios
(Hoeprich et al.,1970; Hoeprich, Finn,1972; Radetsky, 1986).
Barry, Brown (1996) propuseram estudo com o método de discodifusão utilizando o meio RPMI-1640 com 2% glicose e 1,5% de ágar, levando
em conta os bons resultados deste meio nos ensaios de microdiluição em caldo
padronizados pelo NCCLS M27-T (1995). Neste estudo, os autores observaram
que o meio RPMI parece não ser apropriado para testar algumas espécies de
leveduras que apresentam pobre crescimento nesse meio, como foi visto para
amostras de C. glabrata e C. krusei, que apresentaram crescimento satisfatório
somente após 48h de incubação.
Estudos posteriores foram realizados a fim de encontrar um meio
mais adequado para o teste de disco-difusão na rotina de laboratórios clínicos.
Barry et al. (2002) avaliaram a utilização de dois meios para o método de discodifusão a fluconazol, testando 495 isolados de Candida spp.: meio MuellerHinton ágar (MHA) suplementado com glicose e azul de metileno e o meio
RPMI-1640 ágar suplementado com glicose. Os resultados do teste de discodifusão para os dois meios foram comparados com os resultados do método de
referência (microdiluição em caldo). A correlação dos resultados para os dois
meios avaliados foi maior para a leitura de 24h com MHA (96,9%), sendo
menor com o meio RPMI (93,6%). Já em relação a leitura de 48h, houve menor
concordância para ensaios com ambos os meios testados: MHA (93,3%) e
RPMI (93,5%). Pode-se verificar que com a utilização do meio RPMI as
amostras de C. glabrata apresentaram pobre crescimento, necessitando de
INTRODUÇÃO
19
tempo maior (48h) para a leitura do teste. Também houve problemas com três
isolados de C. krusei e duas amostras de C. albicans. Para ensaios com o meio
MHA suplementado com glicose e azul de metileno houve melhor crescimento
para todos os isolados de diferentes espécies testadas e melhor definição do
halo de inibição, respectivamente. Os autores verificaram que ensaios de
disco-difusão utilizando o meio MHA apresentaram maior compatibilidade com
os resultados da microdiluição, suportando melhor o crescimento para as
diferentes espécies de leveduras avaliadas. Além disso, os resultados gerados
pelo teste de disco-difusão após 24h de incubação apresentaram maior
reprodutibilidade que aqueles obtidos após 48h de incubação.
Rubio et al. (2003) desenvolveram estudo para avaliar a
performance de três meios em relação ao teste de disco-difusão: meio MHA
suplementado com dextrose e azul de metileno, meio RPMI-1640 com glicose e
o meio Shadomy (SHDM). Foram selecionados 150 isolados de Candida spp.
provenientes de pacientes admitidos no Hospital Universitário Lozano Blesa,
Espanha. Os resultados do teste de disco-difusão para os três meios avaliados
foram comparados com os resultados do método de microdiluição em caldo
(NCCLS M27-A2). A correlação dos resultados após 24h de incubação foi
maior para o meio MHA (95,3%), sendo um pouco menor para os meios RPMI
(94%) e SHDM (92,6%). Em relação as leituras de 48h também houve maior
correlação com o meio MHA (94,6%), sendo menor para os meios SHDM
(91,3%) e RPMI (75,3%). O crescimento de microcolônias dentro do halo de
inibição foi comum para os meios RPMI (63,4%) e SHDM (64,7%), sendo
infrequente para o meio MHA (8,7%). O meio MHA apresentou um halo de
inibição claro e definido em 91,3% dos testes de disco-difusão. Com este
estudo, os autores concluíram que o meio MHA parece ser o meio ideal para o
método de disco-difusão devido à menor ocorrência de crescimento de
microcolônias dentro do halo de inibição, facilitando a leitura do teste e
minimizando qualquer subjetividade. Da mesma forma, o MHA apresentou
melhores índices de equivalência com os resultados gerados pelo método de
referência NCCLS M27-A2 (2002).
INTRODUÇÃO
20
Barry et al. (2003) propuseram trabalho colaborativo internacional
envolvendo oito instituições para definir os limites do halo de inibição para as
cepas-controle a serem utilizadas nos testes de disco-difusão com fluconazol,
em meio MHA suplementado com glicose e azul de metileno. As oito
instituições avaliaram em dez dias distintos, três cepas-controle como controle
de qualidade (CQ) para definir o tamanho do halo de inibição: C. albicans
(ATCC 90028), C. parapsilosis (ATCC 22019), C. tropicalis (ATCC 750). Os
resultados gerados pelas cepas-controle foram: C. albicans variaram de 28 a
39mm, para C. parapsilosis
variaram de 22 a 33mm e para C. tropicalis
variaram de 26 a 37mm. Os autores concluíram que houve maior
reprodutibilidade com leitura de 24h de incubação em todos os ensaios. Os
resultados mostraram também que a adição de azul de metileno ao meio MHA
define melhor o halo de inibição, produzindo um halo de inibição com razoável
grau de precisão quando avaliadas as cepas-controle C. albicans (ATCC
90028), C. parapsilosis (ATCC 22019) e C. tropicalis (ATCC 750).
Pfaller et al. (2004d) realizaram estudo similar ao citado
anteriormente, mas para determinar os resultados de leitura para o controle de
qualidade no teste de disco-difusão a voriconazol com o meio MHA
suplementado com glicose e azul de metileno. Foram utilizadas três cepascontrole no ensaio: C. albicans (ATCC 90028), C. parapsilosis (ATCC 22019) e
C. krusei (ATCC 6258). Assim como no teste para fluconazol, foram realizadas
leituras de 24h e 48h para determinar o impacto do tempo de incubação nas
leituras para este método. Os resultados gerados pelas cepas-controle foram:
ATCC 90028 – (31 a 42mm), ATCC 22019 - (28 a 37mm) e ATCC 6258 – (16 a
25mm). Os autores concluíram que, assim como reportado para os testes com
fluconazol, houve melhor performance dos resultados com leitura de 24h de
incubação para voriconazol. Pode-se também estabelecer a confiabilidade das
cepas-controle como parâmetros para interpretação dos testes: C. albicans
(ATCC 90028), C. parapsilosis (ATCC 22019) e C. krusei (ATCC 6258).
INTRODUÇÃO
21
Os trabalhos de Barry et al. (2003) e Pfaller et al. (2004d)
avaliando as cepas-controle foram fundamentais para consolidar a leitura de
24h como melhor parâmetro de leitura para o teste de disco-difusão, como
também para permitir o uso de cepas-padrão no controle de qualidade destes
ensaios em laboratórios de rotina.
Uma vez definida a melhor condição de realização do método de
disco-difusão, foi importante avaliar qual a sua correlação com o método
referência de diluição em caldo do NCCLS M27A-2 (2002), na categorização
dos isolados como: susceptível, SDD ou resistente.
Barry et al. (2002) compararam os métodos de disco-difusão e
microdiluição em caldo para avaliar o perfil de susceptibilidade a antifúngicos
frente a 495 isolados de Candida spp.. Através de uma curva de regressão
linear os autores correlacionaram o tamanho do halo inibitório do teste de
disco-difusão com os valores das CIMs gerados pelo método de microdiluição.
Todas as espécies avaliadas para a susceptibilidade foram interpretadas frente
a três categorias: isolado susceptível - se observado valores das CIMs de ≤
8µg/mL ou diâmetro do halo de ≥19mm; amostra SDD - se observado valores
das CIMs de 16 a 32µg/mL ou diâmetro do halo de 15 a 18mm; isolado
resistente - se observado valores das CIMs de ≥ 64µg/mL ou diâmetro do halo
de ≤ 14mm. Os resultados do teste de microdiluição em caldo tiveram uma
concordância de 97% com o método de disco-difusão. A correlação entre as
duas metodologias foi realizada frente a três resultados de discrepância: erro
gravíssimo (a espécie testada apresenta susceptibilidade para o teste de discodifusão e resistência para o método de microdiluição em caldo); erro grave (a
espécie avaliada apresenta resistência para o teste de disco-difusão, sendo
susceptível para o método de microdiluição); e erro leve (a espécie apresenta
SDD para um teste e susceptível ou resistente para o outro método). Os
resultados mostraram erro gravíssimo somente para uma amostra de C. krusei,
não apresentando ocorrência de erro grave. Houve a presença de 14 erros
leves envolvendo oito isolados de C. krusei, três isolados de C. parapsilosis,
INTRODUÇÃO
22
duas amostras de C. glabrata e um isolado de C. albicans. Os autores
concluíram que os resultados do teste de susceptibilidade a fluconazol pelo
método de disco-difusão tiveram boa equivalência com o método de
microdiluição em caldo, tendo aplicação potencial em laboratórios de rotina
para a triagem de amostras resistentes a fluconazol.
Matar et al. (2003) avaliaram a concordância do método de discodifusão com o teste de microdiluição em caldo padronizado pelo NCCLS M27A2 (2002) frente a fluconazol e voriconazol. Foram avaliadas 400 amostras de
Candida spp. isoladas de hemocultura. Os diâmetros dos halos de inibição
foram interpretados com base no estudo prévio de Barry et al. (2002). A
concordância
entre
as
categorias
de
susceptibilidade
a
fluconazol,
considerando resultados gerados pelo teste de disco-difusão e microdiluição
em caldo, foi de 88,8% para leitura de 24h. Erro gravíssimo foi observado em
15 amostras testadas, não ocorrendo erro grave. Houve a presença de 14 erros
leves para os isolados testados. Em relação a voriconazol, como ainda não
foram definidos os pontos de corte de susceptibilidade, foi realizada apenas
análise descritiva dos resultados dos métodos de microdiluição e teste de
disco-difusão após 24h de incubação. Esses dados sugerem que apesar da
boa equivalência entre os métodos, o teste de disco-difusão tem melhor
performance na identificação de amostras susceptíveis e algumas limitações no
reconhecimento de amostras resistentes.
Finquelievich et al. (2003) conduziram estudo para avaliar o teste
de disco-difusão para fluconazol comparando os resultados com o método de
microdiluição em caldo padronizado pelo NCCLS M27-A2 (2002), sendo
testados 290 isolados de Candida spp. A concordância entre as duas
metodologias foi de 90%. Foram identificadas 258 amostras susceptíveis para
o método de microdiluição, em contrapartida com 245 isolados para o teste de
INTRODUÇÃO
23
disco-difusão, com concordância de categoria de 99,6%. Houve 13 amostras
SDD para o teste de microdiluição e 21 isolados para o método de discodifusão. Em relação a resistência, houve 19 amostras para o teste de
microdiluição e 21 isolados para o método de disco-difusão. Não ocorreu erro
gravíssimo na correlação dos dois métodos. Entretanto, erro grave ocorreu em
1,03% dos isolados testados e erro leve em 8,97% das espécies avaliadas. Os
resultados sugerem que o método de disco-difusão tem boa correlação com o
teste de referência para determinar amostras susceptíveis a fluconazol. Já a
menor correlação entre as duas metodologias para SDD e resistência pode ter
ocorrido devido ao fenônemo in vitro conhecido como “trailing”, sendo
caracterizado pelo crescimento reduzido mais persistente de alguns isolados
de Candida spp. na presença de drogas fungistáticas. Este fenômeno pode
prejudicar a leitura e, por conseguinte, o resultado final do ensaio de discodifusão.
Pfaller et al. (2004e) avaliaram a acurácia dos resultados do teste
de disco- difusão comparado ao método de microdiluição em caldo a fluconazol
dos laboratórios participantes do projeto ARTEMIS. Foram selecionados 2.949
isolados de Candida spp. com significância clínica nos sítios de infecção
(sangue e sítios estéreis) causando infecção invasiva em pacientes de diversos
hospitais sentinela da América do Norte, América Latina, Europa, África e Ásia.
Estas amostras foram posteriormente enviadas para o laboratório central em
Iowa (EUA) para comparação dos resultados obtidos entre as duas
metodologias. Através de uma curva de regressão linear foram correlacionados
o tamanho do halo inibitório do teste de disco-difusão com os valores das CIMs
gerados pelo método de microdiluição. Foi realizado monitoramento do
diâmetro do halo do disco relatado em 54 diferentes centros médicos entre
2001 e 2002. A concordância entre as metodologias avaliadas foi maior para o
laboratório referência (92,8%), sendo menor entre os laboratórios participantes
INTRODUÇÃO
24
(87,4%). A concordância entre as metodologias foi maior para amostras de C.
albicans (97,7%) não apresentando erro gravíssimo, ocorrência de 1,4% dos
isolados com erro grave e 0,9% das amostras com erro leve. Para ensaios com
C. tropicalis houve concordância de 87,7%, apresentando erro gravíssimo em
7,3% dos isolados, 3,4% das amostras com erro grave e 0,6% de erro leve. A
concordância para isolados de C. parapsilosis foi de 85,5%, apresentando erro
gravíssimo em 9,7% dos isolados, 4,8% das amostras com erro grave e
nenhum erro leve. Houve menor concordância para os isolados de C. glabrata
(60,6%), com ocorrência de erro gravíssimo em 31,3% dos isolados, erro grave
para 7,4% das amostras e erro leve para 0,7% dos isolados. Este estudo foi de
grande importância para validação da performance do teste de disco-difusão de
acordo com o NCCLS M44-A (2004), no programa de vigilância antifúngica
entre os laboratórios participantes e o centro de referência em Iowa.
Baseado nos resultados mencionados anteriormente, o NCCLS
padronizou o método de disco-difusão através do documento M44-A (2004),
utilizando o meio MHA suplementado com dextrose e azul de metileno, o
tamanho do inóculo de 0,5 a 2,5x103 UFC/mL preparado com o auxílio de
espectrofotometria, a temperatura de incubação de 35oC e com tempo de
leitura de 24h.
O teste de disco-difusão proporciona um resultado rápido, de
baixo custo, não exigindo equipamento especial, proporcionando resultados
qualitativos de fácil interpretação, podendo assim ser utilizado em laboratórios
de rotina avaliando a susceptibilidade de espécies de Candida para discos de
fluconazol e voriconazol. Entretanto, é necessário cautela na interpretação de
resultados de disco-difusão em ensaios envolvendo amostras de C. glabrata e
C. krusei, onde o crescimento inadequado da espécie testada pode ocasionar
resultado de falsa susceptibilidade.
INTRODUÇÃO
25
1.3 Resistência a amostras de Candida spp. no Brasil
No Brasil, são poucos os estudos disponíveis na detecção de
resistência a azólicos envolvendo um número significativo de amostras clínicas
de Candida spp.. Nos anos 90, alguns autores destacaram a ocorrência de
espécies de Candida resistentes a azólicos em pacientes com aids. Na era préHAART (terapia anti-retroviral de alta potência), cerca de 50 a 90% dos
pacientes evoluíam com candidíase oral recorrente necessitando de uso
prolongado de azólicos e, conseqüentemente, a seleção de isolados
resistentes. Milan et al. (1998) conduziram o primeiro trabalho para determinar
resistência a azólicos frente a 109 pacientes com aids apresentando cultura de
cavidade oral positiva para isolados de Candida spp.. Os autores concluíram
que 21 (19%) dos pacientes avaliados apresentavam isolados SDD ou
resistentes a um ou mais azólicos, sendo que 18 destes isolados pertenciam a
espécies de Candida não-albicans.
Na era pós-HAART, Sant’Anna et al. (2002) realizaram estudo
multicêntrico para avaliar o perfil de susceptibilidade a azólicos de 142
amostras de Candida spp. isoladas de 130 pacientes com aids apresentando
candidíase oral. Os resultados deste estudo demostraram redução de 19%
para 11% na porcentagem de espécies de Candida apresentando SDD ou
resistência a azólicos comparado ao estudo de Milan et al. (1998). No ambiente
hospitalar, há crescente preocupação com a emergência de cepas resistentes
a fluconazol, particularmente nos EUA e Europa (Pfaller et al., 1998, Diekema
et al., 2002; Ostrosky-Zeichner et al., 2003; Almirante et al., 2005).
Estudo multicêntrico conduzido por Godoy et al. (2003) foi
avaliado o perfil de susceptibilidade a antifúngicos envolvendo pacientes
internados em cinco hospitais terciários da América Latina, reunindo 103
amostras de Candida spp. isoladas de hemocultura. Neste estudo, apenas um
isolado de C. albicans mostrou resistência a 5-FC, porém isolados de Candida
não-albicans apresentaram valores das CIMs elevadas a azólicos, mas com
INTRODUÇÃO
26
susceptibilidade preservada a anfotericina-B. Pode-se concluir que os isolados
de C. glabrata desta casuística apresentaram valores das CIMs menores para
fluconazol, o que se justifica pelo menor uso de fluconazol nos países da
América Latina, em contrapartida com os EUA e Europa.
Colombo et al. (2003b) determinaram a susceptibilidade a
antifúngicos frente a 200 espécies de Candida isoladas de hemocultura de
cinco hospitais terciários. Em relação a fluconazol foi observado resistência
somente para duas amostras de C. krusei e nove de C. glabrata, Apenas uma
amostra de C.albicans e um isolado de C. guilliermondii apresentaram SDD.
Em relação a itraconazol, apenas uma amostra de C. glabrata apresentou
resistência e 13 isolados (6,5%) exibiram SDD. Em ensaios com 5-FC, 3% dos
isolados foram resistentes. Para anfotericina-B foi observada resistência em
2,5% dos isolados (duas amostras de C. albicans e C. parapsilosis e um
isolado de C. krusei). Através deste estudo os autores concluíram que é
necessário realizar vigilância periódica no perfil de susceptibilidade para
detectar resistência a drogas antifúngicas.
Antunes et al. (2004) avaliaram a susceptibilidade a antifúngicos,
selecionando 120 isolados de Candida spp. provenientes do Complexo
Hospitalar da Santa Casa, Porto Alegre. Para as drogas antifúngicas testadas,
fluconazol apresentou SDD em 1,6% das amostras testadas. Já para ensaios
com itraconazol foi observado SDD em 14,2% das espécies avaliadas. Não foi
encontrada resistência aos antifúngicos testados, possivelmente devido ao
baixo consumo de fluconazol neste hospital.
Devido ao aumento da incidência de candidemias, vários
programas de vigilância têm sido implantados nos Estados Unidos da América
(EUA) para analisar a epidemiologia das infecções fúngicas, incluindo o
Programa Internacional de Vigilância das Infecções da Corrente Sanguínea
(SENTRY) e o Programa de Susceptibilidade Antifúngica Global Ártemis
(Pfaller et al.,1998; Pfaller et al., 2001).
INTRODUÇÃO
27
O programa de vigilância SENTRY utiliza um laboratório central
para monitorar variação da susceptibilidade antifúngica e resistência em 74
hospitais sentinelas em 11 países. Desde 1997, um dos principais objetivos
deste programa é realizar vigilância de resistência antifúngica entre espécies
de Candida causando infecções na corrente sanguínea nos EUA, Canadá,
América Latina e Europa (Pfaller et al., 2001; Pfaller et al., 2002; Antunes et al.,
2004; Hajjeh et al., 2004).
TrabaIhos envolvendo o SENTRY, em centros nos EUA, Canadá
e América do Sul relataram que 2,4% das amostras de Candida spp. originadas
da América do Sul foram resistentes a fluconazol. Entretanto, o número de
cepas analisadas nos cinco centros da América do Sul que participaram deste
estudo foi muito pequeno (n=42) e, portanto, não foi representativo da
realidade epidemiológica destes países. Outro dado a ser citado é que o estudo
SENTRY não coleta nem analisa dados clínicos e epidemiológicos dos
pacientes dos quais os isolados são obtidos (Pfaller et al., 1998, Pfaller et al.,
2001).
O programa Artemis foi iniciado em 2001, contando com a
participaçäo de mais de 80 laboratórios em 35 países, incluíndo o Brasil,
promovendo monitoramento dos resultados de vigilância a fluconazol e
voriconazol frente a isolados de Candida spp. com relevância clínica. Além
disso, este programa auxilia na continuidade no desenvolvimento e validação
de vários testes de susceptibilidade, dentre eles o teste de disco-difusão. Os
isolados coletados nestes programas são enviados ao laboratório de referência
central em Iowa, sendo utilizados como ferramenta importante na detecção de
resistência principalmente com fungos emergentes. Claramente, os resultados
gerados por tais programas de vigilância servem como base para o tratamento
antifúngico empírico de diferentes grupos de risco (Pfaller et al., 2003; Hazen et
al.,2003; Pfaller et al., 2004e).
INTRODUÇÃO
28
As publicações referentes a estes programas não permitem
análise acurada do fenômeno de resistência no Brasil, pois os resultados são
avaliados em conjunto com outros países da América Latina. No Artemis,
apesar de haver algum detalhamento de Brasil, não há informações sobre as
diferentes espécies de Candida e materiais biológicos. Sendo assim, estes
estudos sugerem que resistência a fluconazol em pacientes atendidos na
comunidade e no ambiente hospitalar ainda é pouco freqüente, e particularmente
relacionada a amostras de C. glabrata e C. krusei. Tendo em vista o crescente
uso de azólicos em esquemas de profilaxia e terapêutica empírica, é fundamental
a realização contínua de estudos de vigilância para detecção de amostras
resistentes a estes antifúngicos no sentido de otimizar as opções terapêuticas em
diferentes cenários clínicos.
2. OBJETIVOS
__________________________________
OBJETIVOS
30
A presente investigação tem por objetivos:
I – Estabelecer e correlacionar a distribuição de espécies de Candida
identificadas com relação a diferentes materiais biológicos obtidos de pacientes
hospitalizados.
II - Descrever o perfil de susceptibilidade pelo método de disco-difusão para as
diferentes amostras de Candida spp. frente a discos de dois antifúngicos
triazólicos: fluconazol e voriconazol.
III - Avaliar a prevalência de isolados de Candida spp. resistentes a fluconazol.
3. MATERIAL E MÉTODOS
__________________________________
MATERIAL E MÉTODOS
32
3.1 Seleção de microrganismos
Foram
incluídas
no
estudo
amostras
de
Candida
spp.
provenientes de dois hospitais terciários (Hospital São Paulo e Hospital e
Maternidade Santa Marcelina), sendo encaminhadas ao Laboratório Especial
de Micologia (LEMI) durante o período de janeiro de 1998 a dezembro de 2003.
Estas culturas foram originadas de diversos materiais biológicos, incluíndo
amostras de sangue, secreção vaginal, urina, cavidade oral, lavado
broncoalveolar e trato gastrointestinal.
Estes isolados foram encaminhados ao Laboratório Especial de
Micologia (LEMI) da Disciplina de Infectologia, Universidade Federal de São
Paulo, sendo todas as amostras submetidas a identificação quanto à espécie e
análise do perfil de susceptibilidade a antifúngicos.
3.2 Identificação das leveduras
Uma vez no laboratório, as amostras foram semeadas em meio
cromogênico seletivo CHROmagar Candida®
(Microbiology Paris), para
certificação da pureza do cultivo e viabilidade das colônias. Após 48h de
incubação a 37oC, foram selecionadas colônias de mesma cor, sendo em
seguida semeadas em ágar Sabouraud dextrose para posterior identificação.
MATERIAL E MÉTODOS
33
As colônias de coloração verde foram consideradas sugestivas de
C. albicans e tiveram sua identificação confirmada por microcultivo para
pesquisa de clamidoconídios e teste hipertônico para diferenciação de C.
dubliniensis.
Colônias de outras cores foram consideradas como leveduras de
Candida não-albicans, sendo re-isoladas em Sabouraud, para posterior
identificação com base na micromorfologia e perfil bioquímico (Warren, Hazen,
1995; Baumgartner et al.,1996).
3.2.1 Análise de micromorfologia das colônias
Cada amostra foi semeada, com o auxílio de agulha de níquelcromo, em três estrias paralelas sobre a superfície de meio contendo ágar fubá
com Tween-80, preparado previamente em placa de Petri de 90mm. As estrias
foram cobertas com lamínula e, em seguida, as placas foram incubadas a
30oC, durante 48-72h. Posteriormente, as colônias foram avaliadas ao
microscópio óptico, através de objetiva com aumento de 10x e 40x, para
pesquisa das seguintes estruturas: blastoconídios, clamidoconídios, hifas,
pseudo-hifas e artroconídios.
3.2.2 Perfil bioquímico
As provas bioquímicas para identificação das leveduras foram
realizadas pelo sistema comercial ID32C (bioMérieux, Marcy-I’Étoile, França).
A solução padrão de inóculo foi preparada a partir de um cultivo de 24-48h da
levedura a ser testada, consistindo de uma suspensão do microrganismo em
água destilada esterilizada, com turbidez ajustada ao padrão no 2 da escala
McFarland.
MATERIAL E MÉTODOS
34
Foram aspirados 250µL desta suspensão, inoculando-os na
ampola com o meio C, sendo esta delicadamente homogeneizada. Finalmente,
alíquotas de 135µL do conteúdo da ampola foram distribuídas em cada cúpula
da galeria do sistema ID32C. Uma vez preparada, as galerias foram
posicionadas na câmara úmida e incubadas durante 72h, a 30oC.
A avaliação das provas bioquímicas foi realizada diariamente,
com leitura final de 72h, sendo a positividade do teste indicada pela cúpula que
apresentou turvação superior aquela do controle negativo (Fricker-Hidalgo et
al., 1996).
A identificação das amostras foi obtida pela definição de código
numérico gerado pela presença ou ausência de crescimento em cada
substrato, sendo a interpretação final realizada com a ajuda de Software
Analítico enviado pelo fabricante (bioMérieux, Marcy-I’Étoile, França).
MATERIAL E MÉTODOS
35
3.3 Teste de susceptibilidade aos antifúngicos: método de disco-difusão
(NCCLS M44-A)
A susceptibilidade dos isolados em estudo foi realizada pelo
método de disco difusão frente a fluconazol e voriconazol. A metodologia
utilizada foi aquela sugerida por Barry, Brown (1996), sendo posteriormente
normatizado pelo documento NCCLS M44-P (2003) e M44-A (2004).
Os discos contendo 25µg/mL de fluconazol e 1µg/mL de
voriconazol (Becton Dickinson, MD) foram gentilmente cedidos pela Pfizer Inc.
(New York, USA) e estocados em um dissecador a 4oC, para posterior uso.
Foram observadas as datas de validade informadas pelo fabricante. Importante
observar que, no período de janeiro de 1998 a dezembro de 2000, não havia
disponível discos de voriconazol no laboratório, visto tratar-se de um triazólico
recentemente desenvolvido pela Pfizer. Sendo assim, as amostras coletadas
no período citado acima foram testadas apenas para fluconazol e a partir de
janeiro de 2001, as cepas foram testadas para ambas as drogas.
3.3.1 Preparo do meio
O meio utilizado no teste de disco-difusão foi o MHA (Difco),
sendo re-hidratado em água destilada esterilizada, na concentração de 38g/L,
suplementado com 2% de glicose e 0,5µg/mL de azul de metileno. Para
realização do ensaio, alíquotas de 30mL do meio foram distribuídas em placas
de Petri de 90mm, de modo a obter-se quantidade suficiente para 4mm de
espessura.
MATERIAL E MÉTODOS
36
3.3.2 Preparo do inóculo
Todas as cepas a serem testadas tiveram um cultivo recente
realizado em ágar Sabouraud, por técnica de esgotamento, sendo incubado em
estufa a 35oC, por 24h.
No dia do ensaio, o inóculo foi preparado selecionando-se cinco
colônias distintas, de aproximadamente 1mm de diâmetro, que foram
suspensas em 4mL de solução salina esterilizada (8,5g/L NaCl; 0,85% salina)
em tubo de vidro com rosca. A suspensão da levedura foi agitada em vortex,
por 15 segundos, sendo sua turbidez ajustada na escala 0,5 de McFarland,
correspondente a 90% de transmitância a 530nm, em espectrofotometria. Ao
final deste procedimento, obteve-se uma suspensão de leveduras com inóculo
apresentando concentração variando entre 1-5x106 células/mL.
3.3.3 Ensaio de disco-difusão
Amostras de cada inóculo previamente preparados no dia do
ensaio, foram homogeneamente distribuídas sobre a superfície do meio MHA
(Difco), com o auxílio de swab de algodão, semeando a levedura em três
direções diferentes, de modo a permitir a semeadura sobre toda a superfície do
ágar. As placas semeadas ficaram em descanso por cerca de 5-10 minutos,
permitindo completa absorção do inóculo pela superfície do meio.
MATERIAL E MÉTODOS
37
Posteriormente, os discos contendo fluconazol e voriconazol
foram distribuídos de forma eqüidistante na superfície do meio de cultivo,
utilizando-se pinça esterilizada. Para evitar prejuízos na interpretação das
zonas de inibição de crescimento gerados pelos discos, os mesmos foram
distribuídos na superfície do meio MHA, observando-se uma distância de 20 a
24mm entre eles e de 15 a 20mm entre cada disco e a borda da placa de Petri.
Cada disco foi pressionado, suavemente, sobre a superfície do ágar com a
ponta da pinça esterilizada.
É importante ressaltar que os discos não foram movidos após a
sua colocação, evitando assim prejuízos na leitura do teste. As placas foram
invertidas e incubadas por 24h a 35oC, em estufa microbiológica. Os isolados
com crescimento insuficiente após 24h de incubação, permaneceram na estufa
até 48h de incubação.
Foi incluída em cada dia de ensaio uma cepa-controle C.
albicans (ATCC 90028). Para controle de qualidade dos testes foram utilizados
os valores dos halos de inibição sugeridos pelo NCCLS M44-A para esta cepa,
a saber: diâmetros de 28-39mm para fluconazol e 31-42mm para voriconazol.
3.3.4 Leitura dos resultados
A leitura do ensaio foi realizada com o auxílio de um sistema
informatizado de leitura BIOMIC (Giles Scientific Inc., Santa Bárbara). Este
sistema consiste de uma torre contendo uma câmera de alta resolução
acoplada ao computador, capaz de capturar a imagem dos testes, realizando
automaticamente as leituras dos diâmetros de zonas de inibição gerados pelo
teste de disco difusão.
MATERIAL E MÉTODOS
38
As placas foram retiradas da estufa, após 24h de incubação, para
realização da leitura dos ensaios. Para armazenamento adequado dos
resultados, os dados epidemiológicos referentes a cada isolado foram
cadastrados no programa ARTEMIS (Pfizer). Entre os dados solicitados pelo
programa podemos destacar: número de registro do LEMI, sítio de coleta, setor
de internação do paciente e identificação do microrganismo.
Após este cadastro, as placas foram colocadas no aparelho leitor
BIOMIC, sempre com o disco de fluconazol voltado para o pólo superior da
placa, para padronizar a leitura. A imagem capturada pelo leitor BIOMIC foi
então digitalizada, processada e transferida para um software específico no
computador acoplado ao sistema. Este software permite o delineamento
preciso, através de movimentos do mouse, dos diâmetros de zonas de inibição
gerados pelos ensaios. Estes diâmetros foram medidos no limite do ponto de
transição onde há decréscimo abrupto do padrão de crescimento das cepas
semeadas no meio MHA. Posteriormente, os resultados qualitativos foram
disponibilizados, sendo armazenados para análise dos dados obtidos.
3.3.5 Interpretação dos halos inibitórios: definição qualitativa de
susceptibilidade das leveduras aos antifúngicos
Considerou-se para análise qualitativa de susceptibilidade das
leveduras aos antifúngicos testados as dimensões dos diâmetros dos halos
inibitórios gerados por cada uma das drogas. Utilizou-se como parâmetros os
halos inibitórios gerados nos diferentes ensaios, os valores sugeridos pelo
NCCLS no documento M44-A (2004).
MATERIAL E MÉTODOS
39
As categorias de interpretação do ponto de corte para análise de
susceptibilidade foram classificadas como:
•
Susceptível ao fluconazol as cepas que apresentam halo de inibição
>19mm.
•
Susceptibilidade dose-dependente administrada (SDD): isolados que
demonstram halos entre 15 e 18mm.
•
Resistente a fluconazol os isolados que apresentam halo de inibição <
14mm.
Em
relação
a
voriconazol,
não
há
definições
seguras
estabelecidas para as categorias de susceptibilidade/resistência. Sendo assim,
foi realizada apenas uma análise descritiva dos halos inibitórios encontrados
em diferentes espécies de leveduras.
MATERIAL E MÉTODOS
40
3.3.6 Interpretação dos halos inibitórios: definição quantitativa de
susceptibilidade das leveduras aos antifúngicos
Através do software disponível no sistema BIOMIC-ARTEMIS
pode-se transformar os valores obtidos com halos inibitórios em valores das
CIMs através de uma curva padrão de regressão linear concebida pelo
fabricante, utilizando dados gerados em estudos anteriores (Barry et al., 2002;
Pfaller et al., 2004). Nesta conversão, os halos inibitórios são transformados
em valores das CIMs, permitindo inferência de resultados quantitativos do perfil
de susceptibilidade aos antifúngicos testados.
Vale salientar que o diâmetro do halo de inibição é inversamente
proporcional à CIM do antifúngico testado, ou seja, quanto maior o diâmetro do
halo, menor a CIM, e vice-versa.
MATERIAL E MÉTODOS
41
3.4 Análise dos dados
A) Apresentou-se de forma descritiva a distribuição de espécies de Candida
das amostras testadas em função dos seus respectivos sítios de isolamento.
B) Demonstrou-se de forma qualitativa a variação dos diâmetros dos halos
inibitórios obtidos com ensaios de disco-difusão para fluconazol e voriconazol
frente aos isolados de Candida spp..
C) Exibiu-se de forma quantitativa os resultados das CIMs frente a discos de
fluconazol e voriconazol para os diferentes isolados de Candida spp. obtidos de
amostras clínicas de pacientes com infecções hospitalares. A distribuição dos
valores das CIMs para fluconazol e voriconazol foi apresentada como:
1. CIM50, definida como a concentração inibitória mínima de antifúngico capaz
de inibir o crescimento de 50% dos isolados testados.
2. CIM90, definida como a concentração inibitória mínima de antifúngico capaz
de inibir o crescimento em 90% dos isolados testados.
D) Identificou-se a prevalência das amostras de Candida spp. resistentes a
fluconazol em função de dois períodos diferentes: de 1998 a 2000 e 2001 a
2003.
4. RESULTADOS
__________________________________
RESULTADOS
43
4.1 Microrganismos
Foram selecionados para o estudo 4.625 isolados clínicos de
leveduras que foram encaminhados ao LEMI, Disciplina de Infectologia da
UNIFESP, durante o período de janeiro de 1998 até dezembro de 2003. As
leveduras foram obtidas de diversas culturas de materiais biológicos, a saber:
sangue, secreção vaginal, urina, cavidade oral, lavado broncoalveolar e trato
gastrointestinal de pacientes internados no Hospital São Paulo e Hospital e
Maternidade Santa Marcelina. Importante observar que, os discos de
voriconazol tornaram-se disponíveis no laboratório apenas em janeiro de 2001,
visto tratar-se de um triazólico recentemente desenvolvido pela Pfizer®. Sendo
assim, as amostras coletadas no período de janeiro de 1998 até dezembro de
2000 foram testadas apenas com discos de flucozanol, e a partir de 2001, as
cepas foram testadas para ambas as drogas.
4.2 Distribuição das amostras de Candida spp. de acordo com origem do
material clínico e período avaliado
A distribuição de espécies do total de 4.625 cepas avaliadas
neste estudo incluiu: 2.393 cepas de C. albicans (51,7%), 658 de C. tropicalis
(14,2%), 503 de C. glabrata (11%), 495 de C. parapsilosis (10,8%), 292 de C.
rugosa (6,3%), 195 de C. guilliermondii (4,2%), 53 de C. krusei (1,1%), 36 de
Candida spp. (0,7%) (ver Tabela1).
RESULTADOS
44
Tabela 1. Distribuição de 4.625 isolados de Candida spp. identificados em
culturas de diferentes materiais biológicos avaliados no período de 1998 a 2003
Espécies / No *
Sangue
Urina
T. R. *
S. V.*
T.G.I. *
Outros
C. albicans (2.393)
448
532
632
81
20
680
C. tropicalis (658)
234
189
106
3
5
121
C. glabrata (503)
42
187
109
9
4
152
C. parapsilosis (495)
271
102
61
1
4
56
C. rugosa (292)
42
65
21
1
0
163
C. guilliermondii (195)
140
15
22
0
0
18
C. krusei (53)
13
16
11
4
0
9
Candida spp. (36)
14
1
15
1
0
5
1.204
1.107
977
100
33
1.204
Total
(4.625)
Legenda:
Candida spp.: C. lusitaniae (15), C. kefyr (11), C. famata (5), C. lipolytica (3), C. norvegensis
(1), C. pelliculosa (1); No - total de amostras; S.V. - amostras biológicas obtidas de secreção
vaginal; T.R. - amostras biológicas obtidas de trato respiratório; T.G.I. - amostras biológicas
obtidas de trato gastrointestinal
A distribuição de espécies de Candida identificadas em diferentes
materiais biológicos de pacientes admitidos no Hospital São Paulo e Hospital e
Maternidade Santa Marcelina foi detalhada na tabela 1. De forma geral, podese observar o predomínio dos isolados de C. albicans em todos os sítios
biológicos, representando 51,7% das amostras avaliadas. C. tropicalis e C.
glabrata foram as espécies de Candida não-albicans mais freqüentes, com
prevalências de 14,2% e 11%, respectivamente. C. parapsilosis respondeu por
10,8% das amostras, seguida por C. rugosa (6,3%), C. guilliermondii (4,2%) e
C. krusei (1,1%).
RESULTADOS
45
Vale ressaltar que, apesar do predomínio de isolados de C.
albicans em todos os fluídos biológicos, ocorreu pequena variação no perfil de
espécies de Candida não-albicans nos sítios avaliados. No sangue houve a
presença de 771 isolados de Candida não-albicans, tendo a prevalência de 271
amostras de C. parapsilosis (35,8%) e 234 de C. tropicalis (30,9%). Na urina foi
observado um total de 575 isolados de Candida não-albicans, com a
prevalência de 189 amostras de C. tropicalis (32,8%) e 187 de C. glabrata
(32,5%). Já em outros materiais biológicos houve a ocorrência de 524 isolados
de Candida não-albicans, com prevalência de 163 isolados de C. rugosa
(31,1%).
Figura 1. Distribuição das cinco principais espécies de Candida identificadas
Jul. 03 – Dez. 03
Jan. 03 – Jun. 03
Jul. 02 – Dez. 02
Jan. 02 – Jun. 02
Jul. 01 – Dez. 01
Jan. 01 – Jun. 01
Jul. 00 – Dez. 00
Jan. 00 - Jun. 00
Jul. 99 - Dez. 99
Jan. 99 - Jun. 99
Jul. 98 – Dez. 98
Jan. 98 – Jun. 98
Porcentagem de isolados
em diferentes fluídos biológicos ao longo do estudo
A figura 1 ilustra a distribuição de amostras de Candida spp. no período
de janeiro de 1998 a dezembro de 2003. Pode-se observar a prevalência de
isolados de C. albicans ao longo de todo o período em estudo. As demais
espécies avaliadas apresentaram ocorrência constante ao longo do período,
exceto para amostras de C. glabrata que registraram aumento na incidência no
período de 2002, havendo um decréscimo em 2003.
RESULTADOS
46
4.3 Controle de qualidade dos ensaios de disco-difusão com fluconazol
utilizando a cepa-controle C. albicans (ATCC 90028)
A cepa-padrão C. albicans (ATCC 90028) foi incluída em todos os dias
de ensaio para controle de qualidade do método de disco-difusão. Os
resultados gerados por esta amostra em diferentes experimentos realizados ao
longo do projeto, encontram-se na figura 2. Os valores dos halos inibitórios da
cepa-controle apresentaram variação de 28 a 41mm. Verificou-se que 98% dos
resultados tiveram halos inibitórios dentro dos valores recomendados pelo
documento do NCCLS M44-A (2004), variando de: 28 a 39mm. Os ensaios
cujos valores de controle de qualidade estavam fora do recomendado foram
repetidos.
Figura 2. Avaliação da reprodutibilidade na leitura do diâmetro dos halos de
inibição obtidos com discos de fluconazol utilizando a cepa-controle ATCC
90028 (C. albicans)
No de Testes CQ
Variação CQ
Total N: 70
Halo inibitório (mm)
Legenda
No - número de amostras testadas; Variação CQ – variação dos resultados do
controle de qualidade obtidos com a cepa-controle ATCC 90028 (C. albicans);
mm - milímetro
RESULTADOS
47
4.4 Apresentação dos resultados qualitativos do método de disco-difusão
obtidos com discos de fluconazol
Durante o período de janeiro de 1998 a dezembro de 2003 foram
avaliados os resultados qualitativos do teste de disco-difusão frente a
fluconazol para as amostras de Candida spp. analisadas. Foram apresentados
os valores de média e mediana dos halos inibitórios gerados com as amostras
testadas, sendo os resultados detalhados em função dos diferentes fluídos
biológicos e espécies de Candida avaliadas. Foi realizada também a
interpretação do perfil de susceptibilidade das cepas a fluconazol em três
categorias: susceptível, SDD e resistente. Estes resultados foram detalhados
nas tabelas 2, 3 e 4.
Avaliando-se os resultados dos halos inibitórios médio e mediano,
pode-se observar que as amostras de C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis
e C. guilliermondii apresentaram halos inibitórios variando de 36 a 30,7mm. Os
isolados de C. glabrata apresentaram halos inibitórios entre 29,2 a 26,3mm.
Finalmente, em relação aos isolados de C. krusei e C. rugosa foram
observados halos inibitórios entre 17,1 a 13mm.
Ensaios realizados com cepas de C. albicans, C. parapsilosis e C.
tropicalis apresentaram pequena variação na média dos halos inibitórios em
função do sítio de isolamento. Em relação a isolados de C. rugosa, C. krusei,
C. glabrata e C. guilliermondii houve alguma variação de média dos halos em
função dos fluídos, mas esta variação foi sempre inferior àquela esperada para
as leituras obtidas com a cepa-controle.
RESULTADOS
48
A concordância entre os valores de halos inibitórios préestabelecidos pelo método de referência e aqueles obtidos com os isolados de
C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis observou-se que todas estas cepas
foram susceptíveis a fluconazol. Amostras de leveduras com halos inibitórios
menores, apresentaram maior ocorrência com cepas SDD/R. Em relação aos
isolados de C. glabrata, houve ocorrência de 2,2% de SDD e 5,6% de cepas
resistentes a fluconazol. Para ensaios com amostras de C. krusei houve
presença de SDD em 41,5% das amostras e resistência em 26,4% dos
isolados. Amostras de C. rugosa apresentaram 7,2% de SDD e 57,9% de
resistência a fluconazol. Apesar dos ensaios envolvendo isolados de C.
guilliermondii terem apresentado diâmetros de halos inibitórios médio e
mediano > 30mm, houve amostras com perfil de susceptibilidade SDD (6,2%
dos isolados) e resistentes (4,1% dos isolados).
Tabela 2. Análise dos resultados da média e mediana dos diâmetros dos halos
inibitórios para discos de fluconazol referentes a amostras testadas no período
de 1998 a 2003
No
Halo médio
Halo mediano
(%) dos isolados
(mm)
(mm)
C. albicans
2.393 (51,7)
35,6
36,0
C. tropicalis
658 (14,2)
33,7
34,0
C. glabrata
503 (11,0)
29,2
30,0
C. parapsilosis
495 (10,8)
35,2
34,0
C. rugosa
29 (26,3)
16,9
13,0
195 (4,2)
30,7
33,0
C. krusei
53 (1,1)
17,1
17,0
Candida spp.
36 (0,7)
33,1
35,0
Espécies
C. guilliermondii
Legenda:
Candida spp.: C. lusitaniae (15), C. kefyr (11), C. famata (5), C. lipolytica (3), C. norvegensis
(1), C. pelliculosa (1); No – número de amostras testadas.
RESULTADOS
49
Tabela 3. Média dos diâmetros dos halos inibitórios (mm) com discos de
fluconazol frente a 4.625 isolados de Candida spp. identificados em diferentes
culturas de materiais biológicos obtidos de pacientes hospitalizados no período
de 1998 a 2003
Espécies / No
Sangue
Urina
T. R.
S. V.
T.G.I.
Outros
(1.204)
(1.107)
(977)
(100)
(33)
(1.204)
(mm)
C. albicans (2.393)
35,3
35,1
37,4
34,8
32,6
34,8
C. tropicalis (658)
33,4
33,5
34,7
35,0
31,2
32,5
C. glabrata (503)
26,2
29,3
29,3
29,9
24,5
29,7
C. parapsilosis (495)
35,2
35,7
36,9
42,0
29,5
33,3
C. rugosa (292)
13,5
19,4
15,2
17,0
0
17,0
C. guilliermondii (195)
32,0
23,7
28,1
0
0
29,9
C. krusei (53)
14,3
15,1
21,1
21,8
0
18,0
Candida spp. (36)
32,8
36,5
26,0
0
0
38,0
Total
33,0
32,4
35,2
33,7
31,0
31,4
(4.625)
Legenda:
Candida spp.: C. lusitaniae (15), C. kefyr (11), C. famata (5), C. lipolytica (3), C. norvegensis
(1), C. pelliculosa (1); No - número de amostras testadas; S.V. - amostras biológicas obtidas de
secreção vaginal; T.R. - amostras biológicas obtidas de trato respiratório; T.G.I. - amostras
biológicas obtidas de trato gastrointestinal; mm - milímetro
RESULTADOS
50
Tabela 4. Interpretação do perfil de susceptibilidade a fluconazol em
categorias: susceptível, SDD e resistente frente a amostras de Candida spp.
obtidas no período de 1998 a 2003
Espécies
No
(%) dos isolados
S (%)
SDD (%)
R (%)
C. albicans
2.393 (51,7)
98,0
0,6
1,4
C. tropicalis
658 (14,2)
98,3
1,4
0,3
C. glabrata
503 (11,0)
92,2
2,2
5,6
C. parapsilosis
495 (10,8)
97,2
1,0
1,8
29 (26,3)
34,9
7,2
57,9
195 (4,2)
89,7
6,2
4,1
C. krusei
53 (1,1)
32,1
41,5
26,4
Candida spp.
36 (0,7)
100,0
0
0
92,2
2,0
5,8
C. rugosa
C. guilliermondii
Total
4.625 (100)
Legenda:
Candida spp.: C. lusitaniae (15), C. kefyr (11), C. famata (5), C. lipolytica (3), C. norvegensis
(1), C. pelliculosa (1); No – número de amostras testadas; S (%) – porcentagem de isolados
susceptíveis; SDD (%) – porcentagem de isolados com susceptibilidade-dose dependente; R
(%) – porcentagem de isolados resistentes
RESULTADOS
51
4.5 Análise de resultados quantitativos de susceptibilidade com discos de
fluconazol gerados pelo software do sistema Biomic
Os resultados de susceptibilidade a fluconazol foram
avaliados pelo sistema informatizado Biomic, cujo software utiliza uma curva de
regressão linear padrão que transforma valores de halos inibitórios em CIMs
(Sales Manager, Giles Scientific). Sendo assim, todas as amostras avaliadas
em função de seus resultados qualitativos oferecidos pelo método de discodifusão tiveram conversão para os dados quantitativos de susceptibilidade,
referentes aos valores das CIMs gerados pelo software.
Na tabela 5, pode-se avaliar os resultados quantitativos do perfil
de susceptibilidade das amostras de Candida spp. frente a fluconazol. Houve
significativa diferença no padrão de susceptibilidade para as espécies de
leveduras testadas. Pode-se notar que os isolados de C. albicans, C. tropicalis
e C. parapsilosis apresentaram valores das CIMs menores, sendo classificados
como susceptíveis a fluconazol. Em ensaios envolvendo amostras de C.
glabrata, C. rugosa e C. krusei, foram observados valores das CIMs maiores,
variando em SDD/resistentes a fluconazol. Vale mencionar que a maioria dos
dados
apresenta
concordância
anteriormente (tabelas 2, 3 e 4).
com
os
valores
qualitativos
descritos
RESULTADOS
52
Tabela 5. Resultados quantitativos do perfil de susceptibilidade a fluconazol de
4.625 amostras de Candida spp.
Espécies
No
CIM (µg/mL)
(%) dos isolados
CIM50
CIM90
C. albicans
2.393 (51,7)
0,32
2,37
C. tropicalis
658 (14,2)
0,53
2,37
C. glabrata
503 (11,0)
1,44
17,44
C. parapsilosis
495 (10,8)
0,53
5,00
C. rugosa
29 (26,3)
100,12
≥165
C. guilliermondii
195 (4,2)
0,68
28,73
C. krusei
53 (1,1)
36,88
≥165
Candida spp.
36 (0,7)
0,41
5,00
Legenda:
Candida spp.: C. lusitaniae (15), C. kefyr (11), C. famata (5), C. lipolytica (3), C. norvegensis
(1), C. pelliculosa (1)
No – número de isolados testados
CIM50 - CIM do antifúngico capaz de inibir o crescimento de 50% dos isolados testados
CIM90 - CIM do antifúngico capaz de inibir o crescimento de 90% dos isolados testados
µg/mL – micrograma por mililitro
RESULTADOS
53
4.5.1 Análise comparativa do perfil de susceptibilidade a fluconazol em
amostras testadas em dois períodos diferentes
A tabela 6 ilustra o padrão de susceptibilidade a fluconazol dos
isolados de Candida spp. testados em dois períodos: janeiro de 1998 a
dezembro de 2000 e janeiro de 2001 a dezembro de 2003. Pode-se notar que
não houve variação significativa no perfil de susceptibilidade para a maioria das
amostras avaliadas ao longo dos períodos em questão. Analisando-se
exclusivamente as espécies com menor susceptibilidade a fluconazol (C.
glabrata e C. krusei) foi possível observar algumas diferenças nas taxas de
ocorrência de SDD/R. Em relação a C. krusei, vale mencionar que o número
testado nos dois períodos foi pequeno, sendo que somando-se cepas SDD e
resistentes obteve-se porcentagem semelhante de cepas com reduzida
susceptibilidade a fluconazol nos dois períodos: período 1 : 20 cepas (71,4%) e
período 2 : 16 cepas (64%). Já para as amostras de C. glabrata houve
significativa redução na porcentagem de cepas SDD/R. Entretanto, vale
mencionar que no período 1 foram testadas apenas 93 amostras desta
espécie, sendo que no período 2 o universo ampliou-se para 410 isolados.
Para as amostras de C. rugosa, esta análise não foi realizada visto que não
houve dados referentes ao período 1.
RESULTADOS
54
Tabela 6. Interpretação das categorias de susceptibilidade a fluconazol dos
organismos testados pelo método de disco-difusão em dois períodos: de 1998
a 2000 e 2001 a 2003
Espécies
No de isolados
C. albicans (1135 - 1288)
S (%)
Per. 1
Per. 2
Per. 1
N (%)
Per. 2
R (%)
Per. 1
N (%)
Per. 2
N (%)
1093 (95,8)
1283 (99,6)
10 (1,0)
4 (0,3)
32 (3,2)
1 (0,1)
263 (97,8)
362 (98,7)
4 (1,5)
5 (1,3)
2 (0,7)
0
75 (80,6)
384 (94,9)
6 (6,5)
5 (1,2)
12 (12,9)
16 (3,9)
197 (99,0)
280 (95,9)
1 (0,5)
4 (1,4)
1 (0,5)
C. tropicalis (269 - 367)
C. glabrata (93 - 405)
C. parapsilosis (199 - 292)
C. rugosa (0 - 291)
C. guilliermondii (89 - 102)
C. krusei (28 - 25)
Candida spp. (19 - 23)
Total
SDD (%)
(1.832 – 2.793)
...
101 (34,9)
...
21 (7,2)
...
8 (2,7)
169 (57,9)
85 (95,5)
86 (84,9)
1 (1,1)
11 (10,4)
3 (3,4)
5 (4,7)
8 (28,6)
9 (36,0)
11(39,3)
11 (44,0)
9 (32,1)
5 (20)
23 (100)
0
0
0
33
61
59
19 (100)
1.740
2.528
Legenda:
Candida spp.: C. lusitaniae (15), C. kefyr (11), C. famata (5), C. lipolytica (3), C. norvegensis (1),
C.pelliculosa (1)
No - número de amostras testadas
S (%) - porcentagem dos isolados susceptíveis a fluconazol
SDD (%) - porcentagem de isolados com susceptibilidade-dose dependente a fluconazol
R (%) - porcentagem dos isolados resistentes a fluconazol
Per. 1 - período de 1998 a 2000
Per. 2 - período de 2001 a 2003
... - ausência de amostras referentes a esta espécie no período 1.
0
204
RESULTADOS
55
4.6 Distribuição das amostras de Candida spp. avaliadas em ensaios de
disco-difusão com voriconazol
A distribuição de espécies do total de 2.793 cepas avaliadas
neste estudo incluiu: 1.288 cepas de C. albicans (46,3%) 405 de C. glabrata
(14,5%), 367 de C. tropicalis (13,1%), 292 de C. parapsilosis (10,4%), 291 de
C. rugosa (10,4%), 102 de C. guilliermondii (3,6%), 25 de C. krusei spp. (0,9%)
e 23 de Candida spp. (0,8%). (ver Tabela 7).
Tabela 7. Distribuição de 2.793 isolados de Candida spp. obtidos de diferentes
culturas de materiais biológicos avaliados no período de 2001 a 2003
Espécies / no *
Sangue
Urina
T. R. *
S. V.*
T.G.I.*
outros
C. albicans (1.288)
220
268
279
78
20
423
C. glabrata (405)
22
145
100
9
4
125
C. tropicalis (367)
139
94
73
3
5
53
C. parapsilosis (292)
171
43
34
1
4
39
C. rugosa (291)
42
65
21
1
0
162
C. guilliermondii (102)
62
15
18
0
0
7
C. krusei (25)
7
5
8
4
0
1
Candida spp. (23)
3
0
12
1
0
7
666
635
545
97
33
817
Total
(2.793)
Legenda:
Candida spp.: C. kefyr (10), C. lusitaniae (6), C. famata (4), C. lipolytica (2), C. norvegensis (1)
No - número de amostras testadas; S.V. - amostras biológicas obtidas de secreção vaginal; T.R.
- amostras biológicas obtidas de trato respiratório; T.G.I. - amostras biológicas obtidas de trato
gastrointestinal
RESULTADOS
56
A distribuição de amostras de Candida spp. identificadas em
diferentes materiais biológicos obtidas do Hospital São Paulo e Hospital e
Maternidade Santa Marcelina foi detalhada na tabela 7. Houve a prevalência de
isolados de C. albicans, em todos os materiais biológicos, sendo esta espécie
responsável por 46,3% das amostras testadas. C. glabrata e C. tropicalis foram
as amostras de Candida não-albicans mais frequentes, com prevalências de
14,5 e 13,1%, respectivamente. C. parapsilosis e C. rugosa responderam a
10,4% das amostras, seguida de C. guilliermondii (3,6%) e C. krusei (0,9%).
Pode-se notar que apesar de C. albicans ser a amostra prevalente
em todos os materiais biológicos, houve alguma variação na ocorrência de
isolados de Candida não-albicans nos sítios avaliados. No sangue houve a
presença de 479 isolados de Candida não-albicans, com predomínio de 171
isolados de C. parapsilosis (35,7%) e 139 amostras de C. tropicalis (29%). Na
urina foi observado um total de 367 amostras de Candida não-albicans, com
prevalência de 145 amostras de C. glabrata (39,5%) e 94 isolados de C.
tropicalis (25,6%). Já em outros materiais biológicos houve a ocorrência de 394
amostras de Candida não-albicans, com prevalência de 162 isolados de C.
rugosa (41,1%).
4.7 Controle de qualidade dos ensaios de disco-difusão com voriconazol
utilizando a cepa-controle C. albicans (ATCC 90028)
A cepa-padrão C. albicans (ATCC 90028) foi incluída em todos os
dias de ensaio para controle de qualidade do método de disco-difusão. Os
resultados gerados por estas amostras encontram-se na figura 3. Os valores
dos halos inibitórios da cepa-controle apresentaram variação de 30 a 42mm.
Verificou-se que 99% dos resultados tiveram halos inibitórios dentro dos
valores recomendados pelo documento do NCCLS M44-A (2004), que
apresentam variação de 31 a 42mm. Os ensaios cujos valores de controle de
qualidade estavam fora do recomendado foram repetidos.
RESULTADOS
57
Figura 3. Avaliação da reprodutibilidade na leitura dos diâmetros dos halos
inibitórios obtidos com discos de voriconazol utilizando a cepa-controle ATCC
90028 (C. albicans)
No de Testes CQ
Variação CQ
Total N: 68
Halo inibitório (mm)
Legenda:
No - número de amostras testadas; Variação CQ – diâmetros dos halos
inibitórios obtidos com a cepa-controle ATCC 90028 (C. albicans); mm - milímetro
RESULTADOS
58
4.8 Apresentação dos resultados qualitativos do teste de disco-difusão
obtidos com discos de voriconazol
No período de janeiro de 2001 a dezembro de 2003 foram
analisados os resultados qualitativos gerados pelo método de disco-difusão
para os isolados de Candida spp.. Foram apresentados os valores de média e
mediana dos halos de inibição gerados com as amostras testadas, sendo os
resultados detalhados em função dos diferentes fluidos biológicos e espécies
de Candida avaliadas. Estes resultados foram detalhados nas tabelas 7 e 8.
Avaliando-se os resultados dos halos inibitórios médio e mediano,
pode-se observar que os isolados de C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata e
C. tropicalis apresentaram halos inibitórios variando de 34,9 a 30,6mm. Em
ensaios envolvendo C. guilliermondii, C. krusei e C. rugosa apresentaram halos
inibitórios entre 29,1 a 21,5mm.
Ensaios realizados com cepas de C. albicans, C. parapsilosis e C.
tropicalis apresentaram pequena variação na média dos halos inibitórios em
função do sítio de isolamento. Em relação a isolados de C. guilliermondii, C.
krusei, C. glabrata e C. rugosa houve também variação de média dos halos em
função dos fluídos, mas esta variação foi sempre inferior àquela observada na
variação esperada para as leituras obtidas com a cepa-controle. Não foi
possível realizar a interpretação do perfil de susceptibilidade a voriconazol em
categorias, visto que ainda não foram definidos os pontos de corte para este
antifúngico.
RESULTADOS
59
Tabela 8. Análise dos resultados de média e mediana dos diâmetros dos halos
inibitórios (mm) para discos de voriconazol referentes a amostras de Candida
spp. testadas no período de 2001 a 2003
No
Halo médio
Halo mediano
(%) de isolados
(mm)
(mm)
C. albicans
1.288 (46,3)
34,9
35,0
C. glabrata
405 (14,5)
31,0
32,0
C. tropicalis
367 (13,1)
30,6
31,0
C. parapsilosis
292 (10,4)
32,0
32,0
C. rugosa
291 (10,4)
21,5
18,0
C. guilliermondii
102 (3,6)
28,7
28,5
C. krusei
25 (0,9)
27,6
27,0
Candida spp.
23 (0,8)
29,9
28,0
Espécies
Legenda:
Candida spp.: C. kefyr (10), C. lusitaniae (6), C. famata (4), C. lipolytica (2), C. norvegensis (1);
No – número de amostras testadas; mm – milímetro.
RESULTADOS
60
Tabela 9. Média dos diâmetros dos halos inibitórios (mm) com discos de
voriconazol frente a 2.793 isolados de Candida spp. identificados culturas de
diferentes materiais biológicos obtidos de pacientes hospitalizados no período
de 2001 a 2003
Espécies / No
Sangue
Urina
T. R.
S. V.
T. G.I.
Outros
(666)
(635)
(545)
(97)
(33)
(817)
(mm)
C. albicans (1.288)
33,0
35,2
35,2
38,0
32,7
35,7
C. glabrata (405)
27,6
31,5
30,7
30,6
29,3
31,2
C. tropicalis (367)
29,8
30,7
31,2
36,0
30,8
31,2
C. parapsilosis (292)
31,4
32,3
33,3
43,0
30,0
33,1
C. rugosa (291)
16,2
24,2
20,3
21,0
0
21,9
C. guilliermondii (102)
29,2
26,4
28,2
0
0
30,6
C. krusei (25)
25,0
27,6
28,8
29,3
0
30,0
Candida spp. (23)
28,4
33,5
0
0
0
35,0
Total
30,5
32,2
32,7
35,4
31,7
31,6
(2.793)
Legenda:
Candida spp.: C. kefyr (10), C. lusitaniae (6), C. famata (4), C. lipolytica (2), C. norvegensis (1)
No - total de amostras testadas; S.V. - amostras biológicas obtidas de secreção vaginal; urina amostras biológicas obtidas de trato respiratório; T.R. - amostras biológicas obtidas de trato
urinário; T.G.I. - amostras biológicas obtidas de trato gastrointestinal; mm - milímetro
RESULTADOS
61
4.9 Análise dos resultados quantitativos de susceptibilidade com discos
de voriconazol gerados pelo software do sistema Biomic
Os resultados de susceptibilidade a voriconazol foram avaliados
pelo sistema informatizado Biomic, cujo software contém uma curva de
regressão linear padrão que transforma valores de halos inibitórios em valores
das CIMs (Sales Manager, Giles Scientific). Sendo assim, todas as amostras
avaliadas em função de seus resultados qualitativos oferecidos pelo teste de
disco-difusão tiveram conversão dos dados quantitativos de susceptibilidade,
referentes aos valores das CIMs gerados pelo software.
Na tabela 10 foi realizada a comparação do perfil de
susceptibilidade a 2.793 isolados de Candida spp. frente a discos de fluconazol
e
voriconazol, em ensaios realizados no período de 2001 a 2003. Com
exceção das amostras de C. rugosa, todas as demais espécies testadas
exibiram alta susceptibilidade, apresentando valores das CIMs ≤ 0,5µg/mL.
Pode-se observar significativa diferença no padrão de susceptibilidade para
discos de fluconazol e voriconazol. Os valores das CIM50 e CIM90 foram
menores em relação a voriconazol para quase todas as amostras avaliadas.
Excetuando-se os isolados de C. rugosa todos os valores das CIM50 e CIM90
para voriconazol foram < 1µg/mL.
RESULTADOS
62
Tabela 10. Comparação do perfil de susceptibilidade a 2.793 isolados de
Candida spp. frente a discos de fluconazol e voriconazol em ensaios realizados
no período de 2001 a 2003
Espécies
No isolados
CIM (µg/mL)
CIM (µg/mL)
Fluconazol
Voriconazol
CIM50
CIM90
CIM50
CIM90
C. albicans (1.288)
0,53
1,84
0,02
0,06
C. glabrata (405)
0,87
10,58
0,10
0,42
C. tropicalis (367)
0,87
2,37
0,05
0,18
C. parapsilosis (292)
0,87
9,41
0,04
0,22
100,12
>165
0,76
3,25
C. guilliermondii (102)
3,04
36,88
0,09
0,51
C. krusei (25)
36,88
146,76
0,12
0,37
Candida spp. (23)
1,44
7,79
0,10
0,22
C. rugosa (291)
Legenda:
Candida spp.: C. kefyr (10), C. lusitaniae (6), C. famata (4), C. lipolytica (2), C. norvegensis (1)
No – número de amostras testadas
CIM50 – CIM do antifúngico capaz de inibir o crescimento de 50% dos isolados testados.
CIM90 - CIM do antifúngico capaz de inibir o crescimento de 90% dos isolados testados.
µg/mL – micrograma por mililitro
5. DISCUSSÃO
__________________________________
DISCUSSÃO
64
Em nossa casuística, C. albicans foi o isolado prevalente em
todos os fluídos biológicos, respondendo por 2.393 (51,7%) das 4.625
amostras avaliadas. Contudo, similar aos relatos no mundo todo sobre a
emergência de espécies de Candida não-albicans como causa de infecções
superficiais e invasivas, essas apresentaram 48,3% dos casos avaliados. Entre
as leveduras de Candida não-albicans mais freqüentes, houve o predomínio de
658 isolados de C. tropicalis (14,2%), 503 de C. glabrata (11%), 495 de C.
parapsilosis (10,8%) e 292 de C. rugosa (6,3%). Vale mencionar que, a alta
prevalência de amostras de C. rugosa deve-se ao surto ocorrido em pacientes
admitidos no Hospital e Maternidade Santa Marcelina, sendo que a fonte das
infecções por este agente desconhecida. Esta espécie de levedura têm sido
raramente isolada de amostras clínicas, sendo sua freqüência de isolamento no
presente estudo muito diversa em relação a casuísticas de outros serviços
(Colombo, 2000; Krcomery, Barnes, 2002; Colombo et al., 2003c).
Houve diferença na prevalência de espécies de Candida nãoalbicans nos diferentes fluídos biológicos estudados. Entre as 771 amostras de
leveduras isoladas de hemoculturas, houve predomínio de C. parapsilosis,
respondendo por 271 isolados (35,8%), seguida por 234 amostras de C.
tropicalis (30,9%). Estes dados estão em concordância com informações
obtidas em séries publicadas anteriormente (Colombo et al.,1999; Costa et al.,
2000; Pfaller et al., 2001; Godoy et al., 2003; Colombo et al., 2003d; Antunes et
al., 2004).
No Brasil, poucos trabalhos têm avaliado a distribuição de espécies
relacionadas a candidemias. Colombo et al. realizaram estudo multicêntrico de
candidemia, envolvendo seis hospitais localizados nas cidades de São Paulo e
do Rio de Janeiro, entre 1995 e 1996, onde foram avaliados 145 casos de
candidemia. Pode-se observar prevalência de 63% das espécies de Candida
não-albicans, com maior ocorrência de cepas de C. parapsilosis (25%), seguido
por C. tropicalis (24%).
DISCUSSÃO
65
Costa et al. (2000) analisaram todas as fungemias provenientes
do Hospital das Clínicas, São Paulo, no período de 1995 a 1996. Pode-se
concluir que dos 86 casos de fungemia avaliados, 97% ocorreram pelo gênero
Candida, sendo C. albicans a espécie responsável por 50% dos episódios.
Dentre as espécies de Candida não-albicans encontradas, C. parapsilosis foi a
espécie prevalente (17%), seguida por C. tropicalis (12%) e C. guilliermondii
(10%).
Em 2004, Antunes et al. realizaram trabalho para determinar a
distribuição de 120 espécies de Candida associadas a candidemia,
provenientes da Santa Casa Complexo Hospitalar, Porto Alegre. Os resultados
mostraram que C. albicans foi a amostra prevalente (48,3%). Entre as espécies
de Candida não-albicans predominantes, pode-se observar a ocorrência de
isolados de C. parapsilosis (25,8%), seguido por amostras de C. tropicalis
(13,3%).
Pfaller et al. (2001) conduziram estudo analisando a distribuição
das espécies de Candida isoladas em UTI no programa de vigilância
internacional Sentry, coletando amostras dos EUA, Canadá, América Latina e
Europa no período de 1997 a 1999. Os autores observaram prevalência de
55% a 60% de amostras de C. albicans na América do Norte e Europa,
respectivamente, e 45% na América Latina. Em relação as amostras de
Candida não-albicans, C. parapsilosis foi o primeiro agente com maior
ocorrência na América Latina, Canadá e Europa. A segunda espécie mais
frequentemente recuperada de hemoculturas na América Latina foi C.
tropicalis, ocupando o quarto lugar nas outras regiões estudadas. Amostras de
C. glabrata foram o segundo isolado mais prevalente nos EUA (21%), sendo o
terceiro lugar no Canadá (12%) e Europa (10%), tendo apenas o quarto lugar
na América Latina (6%).
DISCUSSÃO
66
Em estudo prospectivo multicêntrico, Godoy et al. (2003)
avaliaram 103 episódios de candidemia, envolvendo pacientes internados em
cinco hospitais localizados em quatro países da América Latina, no período de
1999 a 2000. Neste estudo, pode-se notar a prevalência das amostras de C.
albicans (42%), seguida por isolados de C. tropicalis (24%) e C. parapsilosis
(21%).
Colombo et al. (2003a) analisaram a distribuição de espécies de
Candida provenientes de estudo multicêntrico com caspofungina, sendo
incluídos 210 pacientes com fungemia. Neste estudo, houve isolamento de 3%
de amostras de C. glabrata na América Latina, 8% na Europa e 18% nos EUA.
Em relação a C. parapsilosis, a distribuição foi de 30% na América Latina, 18%
na Europa e 11% nos EUA. Da mesma forma, C. tropicalis também foi a
espécie mais freqüente na América Latina (25%) quando comparados aos EUA
(14%) e Europa (8%).
Através dos diversos trabalhos citados anteriormente, pode-se
concluir que no Brasil e América Latina as espécies de Candida não-albicans
associadas a candidemia são representadas basicamente por amostras de C.
tropicalis e C. parapsilosis.
Este achado não coincide com a realidade da
Europa e dos EUA onde ocorre maior prevalência de amostras de C. glabrata
em relação aos isolados de C. tropicalis e C. parapsilosis (Pfaller et al., 2001;
Diekema et al., 2002; Cuenca-Estrella et al., 2002b; Colombo et al., 2003b;
Krcmery et al., 2002; Almirante et al., 2005).
DISCUSSÃO
67
Em relação à participação de cepas de Candida não-albicans em
outros fluídos biológicos, houve diferença na distribuição de espécies. Para as
amostras de urina avaliadas nesse estudo houve isolamento de 575 cepas de
Candida não-albicans, incluíndo 189 amostras de C. tropicalis (32,8%) e 187
isolados de C. glabrata (32,5%). Estes dados guardam semelhança aos
achados de outros autores avaliando o perfil etiológico de candidúria no Brasil
e outros países, onde há maior prevalência de amostras de C. tropicalis e C.
glabrata na urina entre as espécies de Candida não-albicans (Febré et al.,
1999; Oliveira et al., 2001; Kobayashi et al., 2004).
Febré et al. (1999) estudaram 70 pacientes internados em UTI
provenientes do Hospital São Paulo, para determinar a incidência de candidúria
nosocomial, no período de junho de 1995 a janeiro de 1996. Os autores
analisaram pequeno número de amostras (13), sendo que entre as espécies de
Candida não-albicans houve o predomínio de C. glabrata (30,77%), seguida
por isolados de C. krusei (7,7%).
Em 2001, Oliveira et al. avaliaram a distribuição de espécies de
Candida spp. em 166 pacientes internados que desenvolveram candidúria,
todos provenientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, São Paulo. Entre as espécies de Candida não-albicans, C.
tropicalis foi a espécie prevalente, respondendo
por 53% dos isolados
avaliados. A segunda espécie mais isolada foi C. glabrata respondendo por
8% dos casos.
Em estudo conduzido por Kobayashi et al. (2004) foi avaliada a
ocorrência de candidúria nosocomial em 205 pacientes hospitalizados no
Hospital de Goiânia, Goiás, durante 1 ano. Os resultados demonstraram que C.
tropicalis foi a espécie mais comum entre as espécies de Candida nãoalbicans, respondendo por 22,2% dos isolados. Em relação a outras espécies,
DISCUSSÃO
68
C. parapsilosis foi isolada em 11,1% e C. glabrata respondeu por 8,9% dos
casos avaliados.
Os estudos mencionados nos parágrafos anteriores mostram que
no Brasil as espécies de Candida não-albicans relacionadas a candidúria são
representadas basicamente por amostras de C. tropicalis e C. glabrata. Esta
realidade parece ser semelhante aos achados de hospitais dos EUA. Em
estudo multicêntrico conduzido por Kauffman et al. (2000) foram avaliados 861
episódios de fungúria. Observou-se que 48,2% destes casos foram por
espécies de Candida não-albicans, sendo C. tropicalis e C. glabrata as mais
prevalentes.
A distribuição de espécies em outros materiais biológicos como
secreção vaginal, trato respiratório e trato gastrointestinal também tiveram
padrão semelhante aos previamente observados em outras séries (Ribeiro et
al., 2000; Saporiti et al., 2001; Dorko et al., 2002; Ruiz-Sanchez et al., 2002;
Sobel et al., 2003; Erden et al., 2003; Reide, Bruce, 2003; Barenfanger et al.,
2003; Sheviakov et al., 2003; Lopez Consolaro et al., 2004; Thorpe et al.,
2004). A única diferença observada nestes materiais foi a maior ocorrência de
C. rugosa, aspecto este já discutido anteriormente.
Ao avaliar-se as tendências de isolamento das cinco principais
espécies encontradas em diferentes materiais biológicos ao longo do nosso
estudo, observou-se que não houve mudança na freqüência de ocorrência das
cinco principais espécies de Candida: C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C.
parapsilosis, e C. krusei. Em relação aos períodos avaliados, pode-se notar
que as amostras de C. glabrata mostraram transitório aumento na freqüência
em 2002, mas retornou aos níveis basais na casuística de 2003. Apesar de
diversos estudos nos EUA registrarem maior incidência de infecções por C.
glabrata nos hospitais devido ao aumento do consumo de azólicos, esta parece
DISCUSSÃO
69
ainda não ser a realidade observada em nossos hospitais (Pfaller et al., 2003;
Pfaller et al., 2002; Pfaller et al., 2004a, Sanguinetti et al., 2005).
Tendo em vista as vantagens operacionais dos ensaios de discodifusão pudemos avaliar o perfil de susceptibilidade a fluconazol e voriconazol
de um universo bastante significativo de cepas. Este é o maior estudo já
realizado em nosso meio utilizando metodologia padronizada pelo NCCLS
M44-A (2004) para avaliar a ocorrência de resistência de espécies de Candida
frente a azólicos.
Os resultados dos ensaios de disco-difusão com fluconazol e
voriconazol utilizando a cepa-controle C. albicans (ATCC90028) obtidos neste
estudo mostraram excelente reprodutibilidade em relação a técnica utilizada,
sendo os resultados dos halos inibitórios obtidos compatíveis com aqueles
sugeridos pelo documento do NCCLS M44-A (2004). Estes achados
comprovam que os testes foram realizados em ensaios bem padronizados,
com confiabilidade nos padrões de qualidade.
No presente estudo, houve variação significativa dos resultados
qualitativos de susceptibilidade a fluconazol em função das espécies avaliadas.
As amostras de C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis apresentaram
diâmetro dos halos inibitórios maiores, resultado este que sugere alta
susceptibilidade destas cepas a fluconazol. Já, para os isolados de C. glabrata,
C. krusei e C. rugosa os halos obtidos apresentaram menores diâmetros, dado
compatível com susceptibilidade reduzida destas espécies a fluconazol. Estes
achados são compatíveis com os resultados obtidos na maioria das séries
avaliadas (Meis et al., 2000; Colombo et al., 2002; Rubio et al., 2003; Matar et
al., 2003; Bedout et al., 2003).
DISCUSSÃO
70
Meis et al. (2000) realizaram estudo para determinar o perfil de
susceptibilidade a fluconazol pelo método de disco-difusão de 20.900 isolados
clínicos de Candida spp. provenientes de 40 hospitais em 26 países. Os
resultados mostraram que os isolados mais susceptíveis a fluconazol
pertenciam as espécies de C.albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis. Já em
relação as amostras de C. glabrata, C. rugosa e C. krusei foi verificado menor
susceptibilidade a fluconazol.
Em estudo de vigilância de resistência desenvolvido por Colombo
et al. (2002) foi avaliado o perfil de susceptibilidade a fluconazol pelo método
de disco-difusão de 1.784 isolados clínicos de Candida spp. provenientes do
Hospital São Paulo e Hospital e Maternidade Santa Marcelina, Brasil. Através
deste trabalho pode-se observar que as amostras de C. albicans (994), C.
tropicalis (273) e C. parapsilosis (200) foram susceptíveis a fluconazol. Já os
isolados de C. glabrata e C. krusei apresentaram maiores taxas de SDD/R a
fluconazol.
Rubio et al. (2003) analisaram a susceptibilidade a fluconazol pelo
método de disco-difusão frente a 150 isolados clínicos de Candida spp.
provenientes do Hospital Clínico em Lozano Blesa (Espanha) através do
Programa Biomic. Entre os isolados avaliados, foi observado que C. albicans,
C. parapsilosis e C. tropicalis apresentaram susceptibilidade a fluconazol. Em
relação as amostras de C. glabrata e C. krusei, pode-se notar menor
susceptibilidade a fluconazol.
Matar et al. (2003) determinaram estudo para avaliar a
susceptibilidade a fluconazol pelo método de disco-difusão testando 400
isolados de Candida spp.. Os autores observaram que as amostras de C.
albicans (205), C. tropicalis (56) e C. parapsilosis (66) apresentaram
susceptibilidade a fluconazol. Para os isolados de C. glabrata (39) e C. krusei
(24) houve susceptibilidade reduzida a este antifúngico.
DISCUSSÃO
71
Em estudo de Bedout et al. (2003) foram avaliadas 2.139
amostras de Candida spp. pelo teste de disco-difusão a fluconazol através do
Programa Biomic, em hospitais da Colômbia, Equador e Venezuela. Os
resultados mostraram que as 1.233 amostras de C. albicans, 206 de C.
parapsilosis e 163 de C. tropicalis foram susceptíveis a fluconazol. Para os 53
isolados de C. glabrata e 33 de C. krusei houve menor susceptibilidade a
fluconazol.
Através dos resultados dos trabalhos citados anteriormente,
pode-se observar concordância com os dados obtidos no presente estudo,
havendo maior susceptibilidade frente a isolados de C. albicans, C. parapsilosis
e C. tropicalis, em contrapartida com as amostras de C. glabrata, C. rugosa e
C. krusei que apresentaram menor susceptibilidade a fluconazol.
Em
relação
aos
resultados
quantitativos
do
perfil
de
susceptibilidade a fluconazol referentes ao nosso estudo, pode-se verificar que
as amostras de C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis apresentaram
valores de CIM90 ≤ 5µg/mL. Os isolados de C. glabrata apresentaram valores
de CIM90 ≤ 28,73 µg/mL. Já as amostras de C. rugosa e C. krusei
demonstraram valores de CIM90 ≥ 64 µg/mL. Estes achados são compatíveis
com os valores obtidos em séries anteriores.
Através dos resultados obtidos neste estudo, é possível afirmar
que as taxas de SDD/R para C. albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis em
nosso estudo foram de 0,6%/1,4%, 1,4%/0,3% e 1,0%/1,8%, respectivamente.
Estes dados são compatíveis com as demais séries, onde as taxas de SDD/R
para estas três espécies foram sempre ≤ 2% (Colombo et al., 2003b; Pfaller et
al., 2002; Pfaller et al., 2003; Goldani, Mario, 2003).
DISCUSSÃO
72
A porcentagem de SDD/R para amostras de C. glabrata foram de
2,2%/5,6%, sendo que nos demais estudos há variação do perfil de
susceptibilidade dependendo da região analisada. Nos EUA e Europa as taxas
de SDD/R para este isolado atingem 31%/9% (Ostrosky-Zeichner et al., 2003;
Rajjeh et al., 2004; Pfaller et al., 2004f; Sanguinetti et al., 2005). Isolados de C.
krusei apresentaram taxas de SDD/R de 41,5%/26,4% e 7,2%/57,9% sendo
nas demais séries de 45%/30% (Bille et al.,1997; Resende et al., 1999;
Ostrosky-Zeichner et al., 2003; Pfaller et al., 2003).
Na tentativa de avaliar mudanças de comportamento no perfil de
susceptibilidade a fluconazol ao longo de 6 anos, comparou-se a prevalência
de cepas SDD/R a fluconazol em dois períodos diferentes: de 1998 a 2000 e
2001 a 2003. Nesta análise notou-se diminuição aparente de resistência a
fluconazol para as amostras de C. krusei e C. glabrata no período em estudo.
Entretanto, mais do que mudança real no padrão de susceptibilidade a estes
agentes, acreditamos que esta mudança esteja relacionada a limitações do
tamanho amostral destas cepas, já que para C. krusei o número testado nos
dois períodos foi pequeno (período 1 – 28 cepas, período 2 - 25 cepas). Em
relação a C. glabrata, houve diferença significativa no número de amostras nos
dois períodos avaliados: 93 amostras no período 1 versus 405 isolados no
período 2.
Pfaller et al. (2004a) desenvolveram estudo de 10 anos para
avaliar o perfil de susceptibilidade a fluconazol frente a 6082 isolados de
hemoculturas provenientes de 250 centros médicos em 32 países no período
de 10 anos. Pode-se observar que as amostras de C. albicans, C. parapsilosis
e C. tropicalis apresentaram baixa variação de susceptibilidade, mantendo-se
susceptíveis de todo o período de estudo, com taxa de resistência sempre
inferior a 3%. Em relação a amostras de C. glabrata os autores observaram
redução nos níveis de resistência entre 1999 e 2000, com retorno a taxas de
resistência de 7% em 2001. Diferente da realidade dos EUA e Europa, os
dados obtidos em nosso estudo não apontam para maior ocorrência de
resistência a C. glabrata. Em análise recente realizada por Hazen et al. (2003)
DISCUSSÃO
73
avaliando a susceptibilidade a fluconazol frente a 22.111 amostras de Candida
spp. do Brasil, foi observado estabilidade dos níveis de resistência ao longo do
período de 1997 a 2001.
Voriconazol faz parte de uma nova classe de antifúngicos
azólicos, apresentando amplo espectro de ação sobre patógenos tais como
Aspergillus spp., Candida spp. incluíndo cepas de C. krusei e C. glabrata
resistentes a fluconazol e também Cryptococcus spp. (Johnson, Kauffman,
2003; Ostrosky-Zeichner et al., 2003; Greer, 2003; Kullberg et al., 2005).
Em relação aos resultados qualitativos frente a voriconazol, houve
também variação significativa de susceptibilidade em relação as amostras
testadas. Os isolados de C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata e C. tropicalis
apresentaram diâmetros dos halos inibitórios maiores. C. krusei e C. rugosa
apresentaram menores diâmetros de halo, em relação às espécies mais
susceptíveis. Estes resultados são similares aos dados encontrados na
literatura (Pfaller et al., 2004a; Pfaller et al, 2005).
Pfaller et al. (2002) avaliaram 6970 isolados clínicos de Candida
spp. provenientes de 200 centros médicos no mundo todo, incluíndo 80% dos
isolados recuperados de hemoculturas realizados entre 1993 a 2001. Os
autores concluíram que 90% das amostras avaliadas foram inibidas por
voriconazol na concentração de até 0,25µg/mL. Vale ressaltar que 92% dos
isolados de C. glabrata e 99% de C. krusei também foram inibidos por este
antifúngico até a concentração de 1,0 µg/mL.
Pfaller et al. (2003) determinaram a susceptibilidade a voriconazol
pelo teste de disco-difusão a voriconazol frente a 1.586 isolados de Candida
spp. provenientes de centros monitorados pelo Programa Artemis. Os autores
observaram que as amostras de C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis
DISCUSSÃO
74
apresentaram perfil susceptível a voriconazol. Em amostras de C. glabrata
foram observados 93% de cepas susceptíveis e para isolados de C. krusei
ocorreram 100% de cepas susceptíveis a este antifúngico.
Pfaller et al. (2005) desenvolveram estudo de vigilância para
avaliar o perfil de susceptibilidade a voriconazol pelo método de disco-difusão
de 2.934 isolados de Candida spp. provenientes de 54 centros participantes do
projeto Artemis na América Norte, América Latina, Europa, África e Ásia. Os
autores observaram que as amostras de C. albicans, C. parapsilosis e C.
tropicalis demonstraram alta susceptibilidade a voriconazol. Em relação a C.
glabrata apenas 1,5% das amostras foram SDD e 2,2% resistentes a este
antifúngico. C. krusei apareceu com 1,2% de cepas SDD, não sendo detectada
resistência a voriconazol.
Comparando-se os dados de susceptibilidade das amostras de
Candida spp. obtidas em ensaios realizados com fluconazol e voriconazol é
substancial e relevante a diferença encontrada entre os antifúngicos avaliados.
Com exceção das amostras de C. rugosa, todas as demais espécies avaliadas
apresentaram valores de CIM90 ≤ 0,5µg/mL para voriconazol. Já em relação a
fluconazol pode-se observar que todas as amostras apresentaram valores de
CIM90 ≥ 1,8µg/mL, sendo que os isolados de C. glabrata e C. parapsilosis
apresentaram CIM90 ≥ 9,4µg/mL, para as amostras de C. guilliermondii foram
observados CIM90 ≥ 36,9µg/mL e finalmente para as amostras de C. krusei e C.
rugosa foram apresentados valores de CIM90 ≥ 146,8 µg/mL. Através deste
trabalho pode-se concluir que voriconazol apresentou melhor atividade in vitro
que fluconazol nas amostras de Candida spp avaliadas.
Este dado é
compatível com vários estudos prévios, onde foi encontrado melhor atividade
antifúngica a voriconazol frente a espécies de Candida, quando comparado a
fluconazol (Cuenca-Estrella et al., 2002b; Duran et al.,2003; Hajeh et al.,2004).
DISCUSSÃO
75
Este estudo permite sugerir que a grande maioria das infecções
fúngicas por espécies de Candida em diferentes fluídos biológicos é causada
por C. albicans ou espécies de Candida não-albicans susceptíveis a fluconazol.
Apesar de alguma variação na prevalência de diferentes espécies de Candida
não-albicans em diferentes fluídos biológicos, a ocorrência de resistência a
fluconazol foi restrita a apenas 5,8% do total de amostras avaliadas. Não houve
mudanças significativas no comportamento de distribuição de espécies e
ocorrência de resistência a fluconazol no período de 1998 a 2003. Ao final,
verificou-se que voriconazol apresentou maior atividade in vitro em relação a
fluconazol, mesmo em cepas fluconazol resistentes.
Apesar dos dados apresentados sugerirem que fluconazol ainda é
droga segura para terapêutica da maioria dos casos de candidíase superficial
e/ou invasiva, é fundamental que estudos de vigilância epidemiológica sejam
realizados continuamente para surpreender mudanças no perfil microbiológico
em função das práticas terapêuticas.
6. CONCLUSÃO
__________________________________
CONCLUSÕES
77
1. Em nosso estudo, das 4.625 espécies de Candida testadas, C.
albicans foi a espécie prevalente em todos os fluídos biológicos avaliados.
2. Entre as leveduras de Candida não-albicans, as espécies mais
freqüentes foram C. tropicalis, C. glabrata e C. parapsilosis em ambos os
períodos avaliados. Entretanto, houve alguma diferença no predomínio de
espécies de Candida não-albicans nos diferentes fluídos biológicos avaliados.
Entre os isolados de hemoculturas testados ocorreu prevalência de isolados de
C. parapsilosis, seguido por C. tropicalis. Já na urina houve a prevalência de C.
tropicalis, seguido por C. glabrata.
3. Isolados com susceptibilidade dose-dependente (SDD) e
resistência a fluconazol foram pouco freqüentes, ocorrendo em apenas 2,0 e
5,8% das amostras, respectivamente. As espécies com maior porcentagem de
isolados SDD/R foram C. glabrata, C. krusei e C. rugosa.
4. Voriconazol apresentou melhor atividade in vitro comparado a
fluconazol, mesmo em cepas fluconazol-resistentes.
5. Não houve aumento de resistência a fluconazol e voriconazol
nas amostras de Candida spp. testadas ao longo do período avaliado.
7. ANEXOS
__________________________________
ANEXOS
Anexo 1. Ensaios de disco-difusão com discos de
voriconazol frente a amostras de Candida spp.
35mm
79
fluconazol e
36mm
Fig 4. Ensaio de disco-difusão com discos de fluconazol e voriconazol frente
a amostra de C. albicans apresentando diâmetros dos halos inibitórios com
perfil susceptível aos antifúngicos testados
15mm
21mm
Fig 5. Ensaio de disco-difusão com discos de fluconazol e voriconazol frente
a amostra de C. glabrata apresentando diâmetro dos halos inibitórios com
perfil de susceptibilidade dose-dependente (SDD) aos antifúngicos testados
ANEXOS
80
10mm
12mm
Fig 6. Ensaio de disco-difusão com discos de fluconazol e voriconazol frente
a amostra de C. rugosa apresentando diâmetros dos halos inibitórios com
perfil resistente aos antifúngicos testados
6mm
13mm
Fig 7. Ensaio de disco-difusão com discos de fluconazol e voriconazol frente
a amostra de C. krusei apresentando diâmetros dos halos inibitórios com perfil
resistente aos antifúngicos testados
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Abstract
Introduction: The disk diffusion for fluconazole and voriconazole recently
standardized by the NCCLS M44-A is suitable to test a large number of
samples.. Objectives: 1) Evaluate the distribution of Candida species identified
in different biological materials obtained from hospitalized patients in 2 tertiary
hospitals. 2) Describe the antifungal susceptibility profile of different Candida
species by the disk diffusion technique, using fluconazole and voriconazole
disks. 3) Assess the prevalence of fluconazole resistant Candida spp. isolates.
Methods: All clinical samples of Candida species originated from various types
of biological material, between January 1998 to December 2003 in 2 tertiary
hospitals in São Paulo were evaluated in this study. After initial screening for
Candida albicans in chromogenic medium CHROMagar® Candida, the samples
of non-albicans Candida species were identified by analysis of their biochemical
profiles in the commercial system ID 32C and supplemented with microcultive.
In vitro susceptibility to fluconazole and voriconazole were evaluated by
according to the NCCLS M44-A disk diffusion method that was determination of
inhibition diameters was read and interpreted automatically by the BIOMIC®
image-analysis plate reader system. Results: A total of 4,625 yeast isolates
were tested, including the following species: 2,393 C. albicans (51,7%), 658 C.
tropicalis (14,2%), 503 C. glabrata (11%), 495 C. parapsilosis (10,8%), 292 C.
rugosa (6,3%), 195 C. guillermondii (4,2%), 53 C. krusei (1.1%) e 36 Candida
spp. The analyses of the qualitative results of susceptility profile to fluconazole,
C. albicans, C. parapsilosis and C. tropicalis showed large inhibition zones
diameters, suggesting high susceptibility of these strains to this antifungal.
Isolates of C. glabrata, C. rugosa and C. krusei exhibited smaller diameters,
compatible with the reduced susceptibility of these species to fluconazole.
Regarding voriconazole, the isolates of C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis
and C. glabrata showed large inhibition zones diameters. However, C. krusei
and C. rugosa isolates generated smaller inhibition zones diameters than other
species more susceptible. In the analyses of the quantitative results of
susceptility profile to fluconazole, a percentage of SDD/R to the isolates
evaluated were 2,0% and 5,8%, respectively. The species that exhibited the
highest rate of DDS/R were C. glabrata, C. krusei and C. rugosa. Regarding
voriconazole, the majority of all yeast isolates tested showed CIM90 ≤ 0,5
µg/mL, except the samples of C. rugosa. Conclusion: 1. Among 4,625 yeast
cultures evaluated, C. albicans was the species with the greatest frequency in
all biological materials evaluated. 2. Among non-albicans Candida species, C.
tropicais, C. glabrata and C. parapsilosis were most frequently in both the
period assess. 3. DDS/R were low frequency, occurring in 2,0% and 5,8% of the
samples, respectively. The incidence of species judged as DDS/R to
fluconazole was C. glabrata, C. krusei and C. rugosa. 4. Voriconazole exhibited
better activity in vitro than fluconazole, even in isolates resistant-fluconazole. 5.
The resistance of fluconazole and voriconazole did not increase in the isolates
of Candida spp. during the evaluated period.