FUNÇÃO DA CADEIA RESPIRATÓRIA NA PROLIFERAÇÃO E SENSIBILIDADE A
ESTRESSES OXIDATIVOS NO FUNGO Paracoccidioides brasiliensis.
Natalia M. Junqueira, Claudia B. L. Campos
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D), Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) Faculdade de
Ciências da Saúde – FCS – UNIVAP, Av. Shishima Hifumi, 2911 - Urbanova - 12244-000 - São José dos
Campos – SP, [email protected], [email protected]
Resumo- O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma das
principais micoses profundas prevalentes no Brasil. A infecção por esse fungo depende de sua capacidade
adaptativa ao ambiente do hospedeiro, sendo que a mitocôndria exerce papel importante na adaptação
metabólica a estresses ambientais. Em fungos, a cadeia respiratória mitocondrial é ramificada em cadeia
clássica dos citocromos (inibida por antimicina A) e cadeia alternativa da enzima oxidase alternativa (inibida
pelo ácido salicilhidroxâmico). Neste trabalho avaliamos o papel da cadeia respiratória na proliferação do P.
Brasiliensis e sua sensibilidade ao agente oxidativo menadiona. Os resultados mostram que a inibição de
cada ramo da cadeia respiratória tem efeito fungicida sobre o P. brasiliensis. Análises bioquímicas
mostraram que 50 µM de menadiona gerou intensa produção de espécies reativas de oxigênio, porém, essa
concentração gerou pouco efeito antiproliferativo, enquanto 100 µM matou o fungo. Nossos dados indicam a
necessidade de ambos os ramos da cadeia respiratória ativos ao mesmo tempo para garantir a proliferação
e que a cadeia respiratória do Paracoccidioides brasiliensis é relativamente resistente ao estresse oxidativo.
Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis, cadeia respiratória, estresse oxidativo e proliferação.
Área do Conhecimento: Microbiologia
Introdução
O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o
causador da paracoccidioidomicose (PCM), uma
doença granulomatosa sistêmica humana. É um
fungo termodimórfico que se apresenta sob a
forma miceliana à temperatura ambiente (23 a 28
°C) e de levedura à temperatura de 35 a 37 °C
(LACAZ,
1994).
Sua
fase
leveduriforme
caracteriza-se pela presença de células esféricas
ou ovais, com paredes bem definidas,
aparentemente duplas, podendo apresentar multi
brotamentos (SAN-BLAS; NIÑO-VEGA, 2001). A
fase miceliana apresenta hifas delgadas e longas,
dependendo das condições de cultivo.
Dados epidemiológicos indicam uma larga
distribuição do fungo Paracoccidioides brasiliensis
nas Américas Central e do Sul, estendendo-se do
México até a Argentina, ocorrendo principalmente
na Colômbia, Venezuela e Brasil. (RESTREPO et
al., 2001).
A infecção pelo fungo P. brasiliensis se dá a
partir de sua forma miceliana pela inalação de
microconídeos propagados no ar. Uma vez no
epitélio alveolar e à temperatura do hospedeiro
o
(37 C), os microconídeos sofrem transformação
para a fase leveduriforme patogênica (RESTREPO
et al., 2001). A doença (PCM) afeta principalmente
homens, na proporção de ≈ 13 homens para 1
mulher (ARISTIZABAL et al., 1998), já que
hormônios femininos como estrogênios, parecem
bloquear a transição morfológica (ARISTIZABAL et
al., 1998).
O desenvolvimento da doença depende da
interação entre o fungo e condições imunológicas
e nutricionais do hospedeiro. Ao que parece, a
patogenicidade do fungo está relacionada à
transição dimórfica, pois isolados incapazes de se
transformarem em leveduras são avirulentos
(MARQUES, 2007).
A conversão da forma miceliana para
leveduriforme do fungo P. brasiliensis, depende da
variação
da
temperatura.
Porém
fatores
nutricionais também estão envolvidos.
Apesar da importância da transição dimórfica de
micélio para levedura para o estabelecimento da
doença pelo fungo P. brasiliensis, pouco é
conhecido a respeito dos mecanismos bioquímicos
que promovem o dimorfismo.
Goldman e colaboradores (2003) pesquisaram
genes expressos na forma infectiva do P.
brasiliensis (levedura) com similaridade a genes
relacionados à patogenicidade e virulência de
Candida albicans e, dentre os diversos transcritos
descritos, o gene da oxidase alternativa (AOX)
mostrou estar expresso em níveis altos.
A AOX é uma enzima encontrada apenas em
mitocôndrias de plantas e alguns eucariotos
inferiores, responsável pela respiração definida
como insensível a antimicina A (AA) e cianeto,
dois conhecidos inibidores da cadeia clássica de
transporte de elétrons. A via alternativa é inibida
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especificamente por agentes complexantes de
ferro, como ácido salicilhidroxâmico (SHAM)
(VANLERBERGHE; MCINTOSH, 1997), entre
outros. Na via clássica dos citocromos, os elétrons
são doados aos complexos III e IV da cadeia
respiratória pela ubiquinona, enquanto na via
alternativa, a ubiquinona doa os elétrons para a
oxidase alternativa. A existência de uma cadeia
respiratória ramificada confere aos fungos uma
rápida e grande plasticidade metabólica que está
associada à adaptação a estresses ambientais e
proteção contra espécie reativa de oxigênio
(EROs).
Na planta Nicotiana tabacum, a inibição do ramo
clássico da cadeia respiratória com antimicina A,
inibidor do complexo III, bloqueia o transporte de
elétrons através da cadeia clássica, porém sem
gerar alteração de proliferação ou viabilidade
(VANLERBERGHE et al., 2002). Nesse trabalho,
os autores mostraram que a inibição da via
clássica estimula a expressão da oxidase
alternativa com conseqüente ativação da via
paralela, e compensação do efeito inibidor da AA.
Já no fungo Cryptococcus neoformans, a inibição
da oxidase alternativa foi relacionada à perda de
virulência e sua superexpressão protegeu este
fungo contra estresses de origem externa, como
também contribuiu para sua virulência e
sobrevivência (BRAIDOT, et al., 1999).
No Paracoccidioides brasiliensis, resultados não
publicados deste grupo indicam que as formas
micelianas apresentam a cadeia respiratória
clássica e alternativa funcionais e que o fluxo
forçado de elétrons através da via alternativa
(obtido pela inibição da cadeia clássica principal
com antimicina A) foi relacionado à diminuição da
geração de espécies reativas de oxigênio. Esses
dados sugerem que a AOX seja importante no
processo de transição dimórfica e na fisiologia da
forma leveduriforme do fungo Paracoccidioides
brasiliensis. Não se conhece o comportamento da
cadeia respiratória em leveduras do P. brasiliensis.
O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da
inibição de cada ramo da cadeia respiratória sobre
a proliferação de leveduras de P. brasiliensis, bem
como a sensibilidade do fungo ao agente oxidante
menadiona. Assim, via clássica dos citocromos foi
inibida por antimicina A, e a cadeia alternativa da
enzima oxidase alternativa, inibida pelo ácido
salicilhidroxâmico – SHAM.
Metodologia
O isolado Pb18 do fungo foi cultivado em meio
YPD líquido (1% extrato de levedo, 2% peptona,
2% dextrose) a 37ºC (para os que vão utilizar
leveduras). Ao final de aproximadamente 5 dias de
cultivo, os fungos (2-5% do volume final) foram
inoculados em meio fresco e cultivados por mais
24-48 h. Ao final deste período, a cultura foi
dividida nos diferentes grupos experimentais e as
drogas adicionadas, o que marcará o início do
experimento (tempo zero). Os fungos foram
cultivados por até 6-8 dias e as análises foram
realizadas diariamente.
Para verificação de alteração morfológica, uma
alíquota da cultura foi retirada diariamente até o
término do experimento para observação e fotodocumentação sob microscopia optica. Para
medida de proliferação, 1 ml da cultura foi retirada
diariamente, os fungos foram mortos com
hipoclorito e secos em estufa a 50ºC para terem
seu peso seco estimado.
A produção de EROs por fungos em cultura foi
determinada em espectrofluorômetro utilizando-se
compostos indicadores que emitem fluorescência
quando oxidados permeáveis à membrana
plasmática e a parede celular. Os compostos
utilizados para a medida da produção de EROs
foram: MitoTracker Red CM-H2XROs, com
comprimento de onda de excitação em 579 nm e
emissão em 599 nm; Amplex Red e peroxidase,
com excitação em 563 nm e emissão em 587 nm.
Para tal, estes compostos foram adicionados na
cultura em diferentes condições e a fluorescência
do sobrenadante foi medida após 10-30 min.
Resultados
Como a AOX está relacionada ao controle de
geração de espécies reativas de oxigênio (EROs),
testamos a sensibilidade de leveduras de P.
brasiliensis ao agente complexante de ferro
(SHAM) e ao inibidor do complexo III da cadeia
respiratória, AA (não mostrado).
A figura 1 mostra que leveduras do grupo
controle tiveram um desenvolvimento morfológico
característico ao longo do período de crescimento
de 7 dias (mostrado até 4 dias), apresentando
células esféricas com paredes bem definidas,
aparentemente duplas e com presença de multi
brotamentos (blastoconídeos em forma de roda de
leme) no quarto dia de cultivo.
Já leveduras tratadas com 0,5 mM de SHAM
apresentaram
desenvolvimento
morfológico
semelhante ao grupo controle. No entanto,
leveduras tratadas com 2 mM de SHAM
apresentaram um desenvolvimento morfológico
alterado, com alguns pequenos brotos e com
morfologia de células em degeneração; na qual a
parede celular se apresentou irregular, mais fina e
com
citoplasma
vacuolizado.
Resultado
semelhante foi observado com AA (não mostrado).
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2
de cultivo. Grupo controle (▲),AA 0,001 µM (♦),AA
0,005 µM (-),AA 0,01 µM (●).
Os grupos experimentais foram analisados com
o objetivo de avaliar o efeito da inibição da cadeia
respiratória clássica dos citocromos sobre a
proliferação de leveduras de P. brasiliensis com
diferentes concentrações de AA (figura 2). Nesse
experimento, as leveduras ficaram expostas ao
composto ao longo de 7 dias de cultivo.
A figura 2 mostra que leveduras do grupo
controle (CTR) apresentaram um crescimento
lento durante o primeiro dia, crescendo bastante a
partir daí atingindo seu pico de crescimento no
quarto dia de cultivo, entrando em sua fase de
declínio até o sétimo dia.
As leveduras tratadas com a concentração de
0,001 uM de AA não tiveram seu crescimento
inibido,
porém
apresentaram
crescimento
comparável ao grupo CTR, atingindo seu pico de
crescimento no terceiro dia e entrando em sua
fase de declínio até o sétimo dia de cultivo.
12
10
Massa (mg peso seco)
Figura 1 - Morfologia celular de leveduras de P.
brasiliensis em diferentes concentrações de
SHAM.
As concentrações de 0,005 e 0,01 uM de AA,
as leveduras tiveram seu crescimento retardado,
no qual continuaram crescendo mais lentamente
até o último dia do cultivo.
Na figura 3, os grupos experimentais foram
analisados com o objetivo de avaliar o segundo
ramo da cadeia respiratória, a cadeia alternativa
da enzima oxidase alternativa. Foi avaliado a
proliferação de leveduras de P. brasiliensis com
diferentes concentrações de SHAM. Nesse
experimento, as leveduras ficaram expostas ao
composto durante os sete dias de cultivo.
O grupo não tratado (CTR) cresceu
gradativamente até o quarto dia de cultivo,
atingindo aí seu pico de crescimento, entrando
logo depois em sua fase de declínio até o sétimo
dia.
As leveduras cultivadas com 0,5 mM de SHAM,
não teve sua proliferação inibida, porém obteve
seu crescimento diminuido, onde no sétimo dia de
cultivo a mesma ainda crescia bastante em
relação ao grupo não tratado.
Nas concentrações de 1 e 2 mM de SHAM, as
leveduras não proliferaram, o que mostra que o
inibidor da oxidase alternativa (SHAM) possui um
efeito antiproliferativo sobre o fungo P.
Brasiliensis.
8
6
4
2
12
0
Massa (mg peso seco)
10
0
1
2
3
4
7
Dias
8
Figura 3 – Gráfico de proliferação celular de
leveduras de P. brasiliensis após tratamento com
SHAM em diferentes concentrações por todo
período de cultivo. Grupo controle (♦),SHAM 0,5
mM (▲), SHAM 1,0 mM (●), SHAM 2,0 mM (-).
6
4
2
0
0
1
2
3
4
7
Dias
Figura 2 – Gráfico de proliferação celular de
leveduras de P. brasiliensis após tratamento com
diferentes concentrações de AA, por todo período
Para testar a sensibilidade do fungo ao agente
oxidante menadiona, foi realizado uma curva dose
resposta para determinar uma concentração do
composto com atividade antiproliferativa e sua
capacidade de gerar EROs.
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3
Massa (mg peso seco)
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0
1
2
Dias
3
4
Figura 4 – Curva dose-resposta de leveduras
tratadas com diferentes concentrações do agente
oxidante
menadiona.
Grupo
controle
(♦),Menadiona 5µM (■), Menadiona 10µM (▲),
Menadiona 50µM (-), e Menadiona 100 µM (•).
Após testar o papel da cadeia respiratória na
proliferação de leveduras de P. brasiliensis e sua
sensibilidade a diferentes concentrações do
agente oxidativo menadiona, definimos então, uma
concentração de menadiona com atividade
antiproliferativo e sua capacidade de gerar EROs.
Análises bioquímicas mostraram que 50 uM de
menadiona gerou intensa produção de espécies
reativas de oxigênio, porém, essa concentração
gerou pouco efeito antiproliferativo, enquanto 100
uM gerou muita espécies reativas de oxigênio
atingindo mais rápido a saturação.
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
01:30:00
01:20:00
01:10:00
01:00:00
00:50:00
00:40:00
00:30:00
00:20:00
00:10:00
0
00:00:00
Unidades Atributárias de Fluorescência
Para isto, demos inicio ao experimento, no qual
avaliamos o papel da cadeia respiratória na
proliferação de leveduras de P. brasiliensis através
da sensibilidade a diferentes concentrações do
agente oxidativo menadiona. As leveduras ficaram
expostas ao composto durante quatro dias de
cultivo.
Cultivando as leveduras de P. brasiliensis,
observamos que o grupo não tratado (CTR),
obteve um ótimo crescimento até o terceiro dia,
atingindo seu pico de crescimento e entrando em
sua fase de declínio a partir daí (figura 4).
Na presença do composto, observamos que os
grupos tratados com concentrações de 5 a 50 uM
de menadiona, cresceram comparável ao controle
(CTR), no qual continuaram crescendo até o final
do experimento.
A concentração de 100 uM de menadiona,
podemos observar que gera nenhum efeito
proliferativo sobre o P. brasiliensis, impedindo o
crescimento saudável do fungo. Esse resultado
indica que a concentração de 100 uM do
composto possui efeito antiproliferativo sobre o
mesmo, apresentando morfologia de células em
degeneração; na qual a parede celular se
apresentou mais fina e com citoplasma
vacuolizado (não mostrado).
Tempo
Figura 5 – Análise de geração de espécies
reativas de oxigênio em leveduras de P.
Brasiliensis ao agente oxidante menadiona. Grupo
controle (♦), Menadiona 5µM (■), Menadiona 10µM
(▲), Menadiona 50µM (-), e Menadiona 100 µM
(●).
Discussão
Resultados anteriores do nosso grupo de
pesquisa
demonstram
que
o
acido
salicilhidroxâmico (SHAM), conhecido como
inibidor da oxidase alternativa (AOX), bloqueou a
proliferação de leveduras (37ºC) do fungo P.
brasiliensis.
Várias concentrações de SHAM, antimicina A e
menadiona foram testadas na tentativa de avaliar
um efeito antiproliferativo sobre o fungo.
Na planta Nicotiana tabacum, a inibição do
ramo clássico da cadeia respiratória com
antimicina A estimula a expressão da oxidase
alternativa em contrapartida, o efeito inibidor da
AA,
não
gera
efeito
na
proliferação
(VANLERBERGHE, et al., 2002). Ao contrário,
nesse trabalho, quando utilizado as mesmas
concentrações, a antimicina inibiu por completo a
proliferação do fungo (não mostrado). Contudo,
quando foi utilizado uma concentração 100 vezes
menor (0,01 uM de antimicina A) não houve
inibição sobre a proliferação do fungo, mas
retardou seu crescimento.
Com relação a oxidase alternativa, no fungo
Cryptococcus neoformans, a inibição da mesma
foi relacionada à perda de virulência e sua
superexpressão protegeu este fungo contra
estresses de origem externa, como também
contribuiu para sua virulência e sobrevivência
(BRAIDOT, et al., 1999).
Experimentos de outros membros desse grupo
de pesquisa (não publicado), descrevem que o
tratamento com 2 mM de SHAM por 24 horas inibe
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a oxidase alternativa mas não gera um efeito
antiproliferativo em leveduras do P. Brasiliensis.
Os resultados neste trabalho mostra que
concentrações de 1 e 2 mM de SHAM, inibiram o
crescimento do fungo P. Brasiliensis, gerando um
efeito antiproliferativo sobre o mesmo, indicando
que a oxidase alternativa está relacionada com a
proliferação do fungo.
Os experimentos realizados com menadiona
mostram que concentrações utilizadas de 5 a 50
uM do composto não inibiram a proliferação do P.
brasiliensis gerando pouca espécies reativas de
oxigênio
(EROs).
Quando
aumentada
a
concentração para 100 uM inibiu totalmente a
proliferação, na qual as leveduras geraram muito
EROs atingindo rapidamente um pico de
saturação.
-GOLDMAN, G.H.; MARQUES E.R.; RIBEIRO,
D.C.D.; BERNARDES, L.A.S.; QUIAPIN, A.C.;
VITORELLI, P.M.; SAVOLDI, M.; SEMIGHINI,
C.P.;
OLIVEIRA,
R.C.;
NUNES,
L.R.;
TRAVASSOS, L.R.; PUCCIA, R.; BATISTA, W.L.;
FERREIRA, L.E.; MOREIRA, J.C.; BOGOSSIAN,
A.P.; TEKAIA, F.; NOBREGA, M.P.; NOBREGA,
F.G.; GOLDMAN, M.H. Expressed Sequence Tag
bAnalysis
of
the
Human
Pathogen
Paracoccidioides
brasiliensis
Yeast
Phase:
Identification of Putative Homologues of Candida
albicans Virulence and Pathogenicity Genes.
Eukaryotic Cell. V.2, n.1, p.34–48, 2003.
Conclusão
-HELMERHORST,
E.J.;
MURPHY,
M.P.;
TROXLER,
R.F.;
OPPENHEIM,
F.G.
Characterization of the mitochondrial respiratory
pathways in Candida albicans. Biochim. Biophys.
Acta. V.1556, p.73–80, 2002.
Esses resultados mostraram que a atividade da
cadeia respiratória clássica e alternativa são
importantes para a proliferação, e que existem
mecanismos de proteção contra estresse oxidativo
no fungo Paracoccidioides brasiliensis.
-LACAZ, C.S. Historical evolution of the knowledge
on Paracoccidioides brasiliensis In: Franco, M.,
Lacaz, C.S., Restrepo-Moreno, A.; Del Negro, G.
Paracoccidioidomicosys. Boca Raton: CRC
Press. p.1-4, 1994.
Agradecimentos
-MARQUES, S.A.; et al. Paracoccidioidomicose:
freqüência, morfologia e patogênese de lesões
tegumentares. An Bras Dermatol. V.82, n.4,
p.41141, 2007.
Agradeço a Universidade do Vale do Paraíba e
a todas as pessoas que participaram direta e
indiretamente deste projeto. Agradeço também a
FAPESP pelo apoio financeiro.
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Paracoccidioides brasiliensis conidia to yeast cell:
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-RESTREPO, A.; MCEWEN, J.G.; CATAÑEDA, E.
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-SAN-BLAS, G.; NIÑO-VEGA, G.; and Iturriaga, T.
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brasiliensis
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paracoccidioidomycosis: molecular approaches to
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