DNA Microarrays
O que é DNA Microarray?
• Também conhecido como chip de DNA
• Permite a medida do nível de transcrição
de cada gene no genoma (expressão dos
genes)
• Transcrição?
– Processo de cópia do DNA em RNA
mensageiro
– Dependente do meio
• Microarray detecta mRNA
O que é DNA Microarray?
Cheung et al. 1999
Como fazer um microarray?
• Começa-se com genes individuais (p. ex.
~6,200 genes do genoma de fungos)
• Amplifica-se todos eles por PCR
• “Spot” todos em um meio, como por
exemplo lâmina de vidro de microscopia.
• Cada spot tem 100 µm de diâmetro
• Spotting feito por um robô.
• Etapa complexa e crítica do processo.
Como fazer um microarray?
Cheung et al. 1999
Exemplo
• Fungo
• Cresce em ambientes aeróbicos e
anaeróbicos
• Diferentes genes serão ativados no intuito
de se adaptar a cada ambiente.
• Extrai-se o mRNA
• Converter o mRNA em cDNA marcado
com fluorescência
Exemplo
• Misturar o cDNA
• Hibridizar com a sonda
• Cada sequência hibridiza com o gene
correspondente no array
• Lavar o cDNA não hibridizado
• Ler com laser
• Analisar a imagem
Brown & Botstein, 1999
Lendo um array
• O laser escaneia o array e produz
imagens
• Um laser para cada cor (um para verde,
outro para vermelho)
• Análise da imagem:
– Supressão de background
– Localização e detecção dos spots, incluindo a
redução da intensidade de background,
posição do spot e tamanho deste.
Lendo um array (cont.)
Block
Column
Row
Gene
Name
Red
Green
Red:Green
Ratio
1
1
1
tub1
2,345
2,467
0.95
1
1
2
tub2
3,589
2,158
1.66
1
1
3
sec1
4,109
1,469
2.80
1
1
4
sec2
1,500
3,589
0.42
1
1
5
sec3
1,246
1,258
0.99
1
1
6
act1
1,937
2,104
0.92
1
1
7
act2
2,561
1,562
1.64
1
1
8
fus1
2,962
3,012
0.98
1
1
9
idp2
3,585
1,209
2.97
1
1
10
idp1
2,796
1,005
2.78
1
1
11
idh1
2,170
4,245
0.51
1
1
12
idh2
1,896
2,996
0.63
1
1
13
erd1
1,023
3,354
0.31
1
1
14
erd2
1,698
2,896
0.59
Real DNA Microarray
Y-fold
– Fold – quantas vezes
– Expressão como repressão ou indução Y-fold
– Calculado como o inverso da razão
• Razão de 0.33 = repressão 3-fold
• Razão de 10 = indução de 10-fold
Codificação de cor
• Dados apresentados em escala de cor
• Esquema:
– Verde: reprimido (menos mRNA)
– Vermelho = induzido (mais mRNA)
– Preto = sem mudança (1:1 ratio)
• Ou
– Verde - controle (e.g. aeróbico)
– Vermelho = experimento (e.g. anaeróbico)
• Somente usada razão
Complicação: Série em Tempo
• Medida a cada 2 horas por 10 horas
(depleção de oxigênio)
• 31,000 razões da expressão de genes
• 6,200 diferentes gráficos com 5 pontos
cada
• Alguns genes respondem de maneira
igual a depleção de oxigênio?
Exemplo: mudança de ratios
(razão)
Name
0 hours
2 hours
4 hours
6 hours
8 hours 10 hours
Gene C
1
8
12
16
12
8
Gene D
1
3
4
4
3
2
Gene E
1
4
8
8
8
8
Gene F
1
1
1
0.25
0.25
0.1
Gene G
1
2
3
4
3
2
Gene H
1
0.5
0.33
0.25
0.33
0.5
Gene I
1
4
8
4
1
0.5
Gene J
1
2
1
2
1
2
Gene K
1
1
1
1
3
3
Gene L
1
2
3
4
3
2
Gene M
1
0.33
0.25
0.25
0.33
0.5
Gene N
1
0.125
0.0833
0.0625
0.0833
0.125
Campbell & Heyer, 2003
Exemplo: transformação em log
Name
0 hours
2 hours
4 hours
6 hours
8 hours
10 hours
Gene C
0
3
3.58
4
3.58
3
Gene D
0
1.58
2
2
1.58
1
Gene E
0
2
3
3
3
3
Gene F
0
0
0
-2
-2
-3.32
Gene G
0
1
1.58
2
1.58
1
Gene H
0
-1
-1.60
-2
-1.60
-1
Gene I
0
2
3
2
0
-1
Gene J
0
1
0
1
0
1
Gene K
0
0
0
0
1.58
1.58
Gene L
0
1
1.58
2
1.58
1
Gene M
0
-1.60
-2
-2
-1.60
-1
Gene N
0
-3
-3.59
-4
-3.59
-3
Campbell & Heyer, 2003
Examplo: Coeficiente de Pearson
Gene C
Gene D
Gene E
Gene F
Gene G
Gene H
Gene I
Gene J
Gene K
Gene L
Gene M
Gene N
Gene C
1
0.94
0.96
-0.40
0.95
-0.95
0.41
0.36
0.23
0.95
-0.94
-1
Gene D
0.94
1
0.84
-0.10
0.94
-0.94
0.68
0.24
-0.07
0.94
-1
-0.94
Gene E
0.96
0.84
1
-0.57
0.89
-0.89
0.21
0.30
0.43
0.89
-0.84
-0.96
Gene F
-0.40
-0.10
-0.57
1
-0.35
0.35
0.60
-0.43
-0.79
-0.35
0.10
0.40
Gene G
0.95
0.94
0.89
-0.35
1
-1
0.48
0.22
0.11
1
-0.94
-0.95
Gene H
-0.95
-0.94
-0.89
0.35
-1
1
-0.48
-0.21
-0.11
-1
0.94
0.95
Gene I
0.41
0.68
0.21
0.60
0.48
-0.48
1
0
-0.75
0.48
-0.68
-0.41
Gene J
0.36
0.24
0.30
-0.43
0.22
-0.21
0
1
0
0.22
-0.24
-0.36
Gene K
0.23
-0.07
0.43
-0.79
0.11
-0.11
-0.75
0
1
0.11
0.07
-0.23
Gene L
0.95
0.94
0.89
-0.35
1
-1
0.48
0.22
0.11
1
-0.94
-0.95
Gene M
-0.94
-1
-0.84
0.10
-0.94
0.94
-0.68
-0.24
0.07
-0.94
1
0.94
Gene N
-1
-0.94
-0.96
0.40
-0.95
0.95
-0.41
-0.36
-0.23
-0.95
0.94
1
Campbell & Heyer, 2003
Exemplo: reorganização de
Name
0 hours
2 hoursdados
4 hours
6 hours
8 hours 10 hours
Gene M
1
0.33
0.25
0.25
0.33
0.5
Gene N
1
0.125
0.0833
0.0625
0.0833
0.125
Gene H
1
0.5
0.33
0.25
0.33
0.5
Gene K
1
1
1
1
3
3
Gene J
1
2
1
2
1
2
Gene E
1
4
8
8
8
8
Gene C
1
8
12
16
12
8
Gene L
1
2
3
4
3
2
Gene G
1
2
3
4
3
2
Gene D
1
3
4
4
3
2
Gene I
1
4
8
4
1
0.5
Gene F
1
1
1
0.25
0.25
0.1
Campbell & Heyer, 2003
Exemplo:
Campbell & Heyer, 2003
Genoma inteiro do fungo
Campbell & Heyer, 2003
Tecnologia do DNA Microarray
DNA Microarrays
O que é Microarray?
• Coleção de sondas de DNA marcadas em
meio sólido de forma ordenada.
PAra que é utilizado?
• Análise de expressão
•
•
•
•
Genotipagem de SNP
Profile de cromatina
Identificação de inserções
Análise de metilação de DNA
Por que usar Microaaray para
análise de expressão?
• Análises de expressão convencionais
somente permite o estudo de um gene em
um experimento
• Permite o estudo da expressão de
milhares de genes em um único
experimento
• Permite a análise da expressão global de
genes o que não é possível em técnicas
convencionais
Análise de Expressão
Convencional
Control
Cells
Treated
Cells
RNA
RNA
Electrophoresis
and Blotting
Hybridization
Labeled probe –
gene “X”
Análise de expressão usando
Microarray
Control
Cells
Treated
Cells
RNA
RNA
Label with Cy5
Label with Cy3
Hybridize,
wash, and scan
Microarray containing 16 probes
Tipos de Microarrays
• Spotted Arrays
– cDNA ou DNA genômico
– Oligonucleotídeos
• Affymetrix
Spotted Arrays
•
•
•
•
Homemade
Desenhado
Mais barato?
Máximo de 24.000
análises por
experimento
• Susceptível a
variabilidade
Affymetrix Arrays
• Disponível
comercialmente
• Definido anteriormente
• Mais caro?????
• Maximo de 500.000
análises por
experimento
• Menos variável
Produção de Spotted Arrays
• Sondas de DNA preparadas em placas de 384
• Lâminas de vidro compradas comercialmente ou
homemade mesmo
• Arrays são spoted com um robô comercial
• Replicatas
• Controles
Spotted Array Printing
Sonicator
Water bath
Sonicate
Pick up
Wash
Print
384-well plate
1” x 3”
glass slide
Spotted Array Printing
Sonicator
Sonicate
Pick up
Water bath
Wash
Print
384-well plate
1” x 3”
glass slide
Preparação da amostra alvo,
marcação, hibridização, scaning e
aquisição de dados
• Isolamento de RNA
– Total RNA
– mRNA
• Transcrição reversa
• Marcação
• Hibridização e lavagem
• Scaning
Treated
Cells
Control
Cells
Isolate RNA
RNA
RNA
Reverse transcription
cDNA
cDNA
Label with Cy3
Label with Cy5
Hybridize
Microarray
containing 16
probes
Wash and Scan
Bibliografia
• Hedge, P., et al. A concise guide to cDNA
microarray analysis. Biotechniques 29, 548-562
(2000).
• Lipshutz, R.J., et al. High density synthetic
oligonucleotide arrays. Nature Genetics
Supplement 21, 20-24 (1999).
• Pritchard, C.C., Project normal: Defining normal
variance in mouse gene expression. PNAS 98,
13266-13271 (2001).