UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES SANGUÍNEA DE
CLOROQUINA E DESETILCLOROQUINA EM PACIENTES COM MALÁRIA VIVAX
ATENDIDOS NA FMTAM
MARLY MARQUES DE MELO
MANAUS
2009
i
MARLY MARQUES DE MELO
DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES SANGUÍNEA DE
CLOROQUINA E DESETILCLOROQUINA EM PACIENTES COM MALÁRIA
VIVAX ATENDIDOS NA FMTAM.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas, em
convênio com a Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas, para obtenção do
título de Mestre em Doenças Tropicais e
Infecciosas.
Orientadora: Profª. Dra. Maria das Graças Costa Alecrim
Co-orientadores: Franklin Simões de Santana Filho
Mônica Regina Farias Costa
MANAUS
2009
FICHA CATALOGRÁFICA
MARQUES, Marly de Melo
Determinação das Concentrações Sanguíneas de Cloroquina e
Desetilcloroquina em Pacientes com Malária vivax Atendidos na FMTAM.
Marly Marques de Melo. - Manaus – AM: UEA; FMTAM, 2009.
LXXXVI,p
Dissertação de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas. Universidade do
Estado do Amazonas
Chloroquine and desethylchloroquine levels in late parasitological failure cases of
malaria vivax from Manaus, Brazil
1. Malária 2. resistência 3.Cloroquina 4. dosagem sérica 5 Resistência 6. Plasmodium
vivax.
ii
FOLHA DE JULGAMENTO
DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES SANGUÍNEA DE
CLOROQUINA E DESETILCLOROQUINA EM PACIENTES COM
MALÁRIA VIVAX ATENDIDOS NA FMTAM.
MARLY MARQUES DE MELO
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa
de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do
Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas”.
Banca Julgadora:
_____________________________________
Profª. Maria das Graças Costa Alecrim, Dra.
Presidente
_________________________________
Prof. José Luiz Fernandes Vieira, Dr.
Membro
___________________________________
Profª. Cíntia Mara Costa de Oliveira, Dra.
Membro
iii
AGRADECIMENTOS
Dedico este trabalho
Aos meus pais , Maria Lucia Marques e Valentim Brito de Lima, pelo exemplo de
vida, lutas e vitórias conquistadas, pela participação definitiva no meu caráter e personalidade, e
em especial ao meu filho Ildemar Rodrigues Lima Junior pelo amor incondicional,
companheirismo, incentivo e solidariedade constantes.
Aos meus irmãos, Francisco Melo, Marileide Melo, Marilucia Marques,
Marilena Marques e Sidney Marques, aos meus sobrinhos, cunhados e cunhadas,
pelo carinho, amor. As palavras seriam poucas para expressar toda minha gratidão.
Ao meu amigo Ildemar Rodrigues Lima, pelo apoio, solidariedade, convívio e amizade,
faltam palavras para expressar minha sincera gratidão.
Dedico-lhes esse êxito com muita gratidão!
A Deus pela luz com a qual ilumina os caminhos que sigo em minha vida.
A minha orientadora professora Doutora Maria das Graças Costa Alecrim, pela
oportunidade, confiança, orientações durante a realização deste trabalho, além
da possibilidade de participação e colaboração no grupo de pesquisa da
Gerência de Malária, e em especial, pela sua amizade.
Ao Professor Dr. José Luiz Fernandes Viera, chefe do Laboratório de
Toxicologia da Universidade Federal do Pará, pela amizade, atenção,
orientação e por ter compartilhado seus conhecimentos técnicos e científicos
para a concretização deste estudo, o meu obrigada.
Ao meu co-orientador e amigo Franklin Simões de Santana Filho pelas
valorosas recomendações e ensinamentos na elaboração e execução deste
estudo.
A Mônica Regina Farias Costa, pelo incentivo de uma verdadeira amiga,
destituída de interesses e vaidades.
Aos dois anjos que Deus na sua infinita bondade colocou no meu caminho,
Larissa Borges e Margareth Tavares pelo incentivo amigo e verdadeiro, apoio
solidário, pela organização das atividades laboratoriais e análise dos
resultados, sem as quais não teria conquistado esta vitória.
As estudantes Maria do Gloria de Souza Lima e Laise Magalhães que
dispensaram boa vontade no aprendizado e auxilio nas atividades laboratoriais
deste estudo.
iv
A todos os funcionários da Gerência de Malária da Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas, que em algum momento estiveram comigo, meu sincero
agradecimento pela amizade, apoio, paciência e carinho.
Aos amigos e colegas Mauro Gomes Coelho, Rosemary Viana, Maria Lucia
Mota, Irislene Figueiredo, Ednildo Rocha e Marta Lavareda, aos revisores,
Eckner Lessa, Raimunda Barreto e Marinete Quadros, minha gratidão pelo
companheirismo e convívio.
Aos meus amigos, secretários do mestrado Conceição Tufic e Marcos André
Castro, minha eterna gratidão.
Aos meus amigos e colegas de curso Ádila Dias e Luiz Francisco Rocha e
Silva, pela incondicional amizade e pelo incentivo de sempre.
Aos médicos do ambulatório em especial, Dr. Orlando, Dra. Leni, Dra Vera
Márcia, enfermeira Almada e sua equipe, meus agradecimentos sinceros.
Aos
novos
amigos da farmácia (UFPA), Michelle,
Juan,
Patrícia e
especialmente a Priscila, meu agradecimento sincero.
Aos
pacientes
anônimos
que,
voluntariamente,
contribuíram
para
o
conhecimento da malária através de suas próprias mazelas.
A Universidade do Estado do Amazonas – UEA, pelo Programa de Mestrado
em Doenças Tropicais e Infecciosas.
A Superintendência da Zona Franca de Manaus - SUFRAMA, financiadora do
Programa de Pós-graduação da UEA.
A Fundação de Apoio Institucional MURAKI, pelo suporte na compra das
passagens para o convidado e membro da banca julgadora deste estudo.
A Universidade Federal do Pará – UFPA/Laboratório de Toxicologia que
através de sua estrutura laboratorial viabilizou parte deste trabalho.
Ao Ministério da Saúde (Secretaria de Vigilância em Saúde/GerênciaTécnica
de Malária) e a Organização Pan-Americana da Saúde que, através da
RAVREDA, proporcionou o desenvolvimento deste estudo.
A todos que, de forma direta e indireta, contribuíram para a realização deste
trabalho.
v
EPÍGRAFE
PEGADAS DE JESUS
Os caminhos de Nosso Senhor;
Só quem ama percorreu;
Só quem sonha conheceu;
São caminhos cheios de amor;
Que nem sempre o sonhador;
É capaz de entender
Alguém me disse que sonhou
Que estava numa praia
Caminhando com Jesus
E olhando o céu viu sua vida
Tanta estrada percorrida
Sempre em busca de uma luz
E olhando as marcas na areia
Viu ao lado de seus passos as pegadas de Jesus
E aí ele falou:
"-Não te entendo meu Senhor"
E olhou para o chão:
"- Nos caminhos mais difíceis eu não vejo tuas marcas
porque me deixaste só?"
Jesus respondeu:
"- Os passos são só meus, jamais te abandonei,
É QUE NOS MOMENTOS MAIS DIFÍCEIS DE VIVER
NOS MEUS BRAÇOS TE LEVEI"
vi
RESUMO
A determinação das concentrações sanguíneas de cloroquina (CQ) e
desetilcloroquina (DCQ) foi estudada em 14 pacientes com malária por Plasmodium
vivax, sendo sete sensíveis e sete resistentes, do estado do Amazonas. Os
pacientes receberam esquema oral de CQ 25 mg/kg dividido em três dias e
primaquina 0,5 mg/kg/dia durante sete dias, conforme preconizado pelo manual de
terapêutica da malária. As concentrações sanguíneas de CQ e DCQ foram
quantificadas por cromatografia líquida de alta eficiência nos dias três (D3), sete
(D7), quatorze (D14) e vinte oito (D28) após a instituição da terapia. A média
geométrica da densidade parasitária dos participantes resistentes e sensíveis no D0
foi de 2526,65 ± 7050,26 parasitos/mm3 (16 - 16.465) e 2730,10 ± 2581,49
parasitos/mm3 (125 – 8400), respectivamente. Os pacientes com recorrência
parasitária apresentaram reativação da parasitemia em D28 com densidade
parasitária média de 2926,75 ± 2216,54 e intervalo de 543 a 6980 parasitos/mm3. As
concentrações sanguíneas médias de CQ em D3, D7, D14 e D28 nos pacientes
sensíveis foram de 2519,04 ± 2013,8 ng/mL, 1251,22 ± 1250,5 ng/mL, 642,05 ±
1275,67 ng/mL e 203,49 ± 361,5 ng/mL, respectivamente. Já para DCQ foram de
793 ± 637 ng/mL, 657,2 ± 498 ng/mL, 709,34 ± 586 ng/mL e 580,3 ± 432,4 ng/mL.
As concentrações sanguíneas de CQ em D3, D7, D14 e D28 nos pacientes com
recorrência parasitária foram de 670 ± 629,7 ng/mL, 411,8 ± 381,2 ng/mL, 384,3 ±
324,3 ng/mL e 209,9 ± 187,94 ng/mL, respectivamente. Para DCQ os valores foram
de 495,5 ± 306 ng/mL, 873,8 ± 767 ng/mL, 660 ± 456,4ng/mL e 506 ± 289 ng/mL,
respectivamente. Não foi observada diferença significativa nos teores médios de CQ
e DCQ entre os grupos nos diversos dias de estudo (p>0,05). Entretanto, foi
observada diferença significativa nos níveis sanguíneos de CQ+DCQ entre
pacientes sensíveis e resistentes em D3. Todos os pacientes resistentes
apresentaram concentrações de CQ+DCQ acima de 100 ng/mL em D28
evidenciando a existência de P. vivax resistente a CQ em Manaus, Amazonas.
Palavras-chaves: cloroquina, desetilcloroquina, monitorização, resistência, malária.
vii
ABSTRACT
The determination of chloroquine (CQ) and disetylchloroquine (DCQ) blood
concentrations were obtained from 14 patients with malaria vivax (seven) of
Amazonas state harboring resistant strains (7) and sensitive strains (7). According to
the Ministry of Health, the enrolled patients underwent supervised oral treatment with
CQ 25 mg/kg within three days plus primaquine 0,5 mg/kg/day during seven days.
The blood concentrations of CQ and DCQ were measured by high efficiency liquid
chromatography on Day 3 (D3), Day 7 (D7), Day 14 (D14) e Day 28 (D28) of the
therapy. On D0, the geometric mean of the parasitic density (GMPD) in patients with
failures and responsive ones were 2526,65 ± 7050,26 parasites/mm3 (16 - 16.465)
and 2730,10 ± 2581,49 parasites/mm3 (125 – 8400) respectively. All the seven
patients who failured presented recurrent parasitemia on D28 with GMPD - 2926,75
± 2216,54 (543-6980 parasites/mm3). The CQ mean blood concentrations on D3,
D7, D14 e D28 of patients harboring sensitive strains were 2519,04 ± 2013,8 ng/mL,
1251,22 ± 1250,5 ng/mL, 642,05 ± 1275,67 ng/mL and 203,49 ± 361,5 ng/mL,
respectively. In the same group the levels of DCQ mean blood concentrations
observed were 793 ± 637 ng/mL, 657,2 ± 498 ng/mL, 709,34 ± 586 ng/mL and 580,3
± 432,4 ng/mL. On D3, D7, D14 e D28, the CQ mean blood concentrations in
patients with recurrent parasitemia were 670 ± 629,7 ng/mL, 411,8 ± 381,2 ng/mL,
384,3 ± 324,3 ng/mL 209,9 ± 187,94 ng/mL respectively. In relation to DCQ the
levels were 495,5 ± 306 ng/mL, 873,8 ± 767 ng/mL, 660 ± 456,4ng/mL e 506 ± 289
ng/mL respectively. There were no significant difference in the comparison blood
concentrations of CQ to DCQ among groups in the days of follow-up (p>0,05).
Therefore, on D3 a significant difference in the levels of whole CQ (CQ+DCQ) blood
levels was confirmed comparing patients with sensitive P.vivax strians to resistant
cases. All individuals with parasitic recurrence showed whole CQ blood
concentrations higher than 100 ng/mL on D28 attesting the existence of CQ-resistant
P. vivax in Manaus, Amazonas.
Keywords: chloroquina, desetylchloroquina, monitoring, resistance, malaria. P.vivax.
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Agente etiológico: Gênero: Plasmodium ....................................................01
Figura 2. Anopheles (N) darlingi;principal transmissor na região Amazônica..........02
Figura 3: Distribuição da malária no mundo...............................................................03
Figura 4. Ciclo dos Plasmodium SP...........................................................................06
Figura 5. Ação Terapêutica dos antimaláricos...........................................................09
Figura 6. Fórmula estrutural da Cloroquina...............................................................10
Figura 7. Estrutura da Ferriprotoporfirina IX, β-Hematina e hemozoína....................11
Figura 8. Fórmula estrutural da desetilcloroquina......................................................15
Figura 9. Foto FMTAM...............................................................................................24
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Tabela de Tratamento................................................................................17
x
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
CEM
cm
CLAE
dL
DP
DR
D0
D1
D2
D3
D7
D14
D21
D28
F+V
FT
FMTAM
FUNASA
Hb
IPA
mg
mL
mm3
ng
MS
OMS
OPAS
pH
P. falciparum
P. malariae
P. ovale
P. vivax
PCR
RCPA
SIVEP_MALÁRIA
RAVREDA
SVS
TCLE
USAID
Concentração efetiva mínima
Centímetro
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Decilitro
Desvio padrão
Dia de recorrência parasitária
Dia de inclusão - primeira avaliação clínico-parasitológica
Segunda avaliação clínico-parasitológica
Terceira avaliação clínico-parasitológica
Quarta avaliação clínico-parasitológica
Quinta avaliação clínico-parasitológica
Sexta avaliação clínico-parasitológica
Sétima avaliação clínico-parasitológica
Oitava avaliação clínico-parasitológica
Plasmodium falciparum + Plasmodium vivax
Fracasso terapêutico
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
Fundação Nacional de Saúde
Hemoglobina
Índice parasitário anual
Miligrama
Mililitro
Milímetro cúbico
Nanograma
Ministério da Saúde
Organização Mundial de Saúde
Organização Pan-Americana de Saúde
Potencial hidrogeniônico
Plasmodium falciparum
Plasmodium malariae
Plasmodium ovale
Plasmodium vivax
Reação em cadeia da polimerase
Resposta clínico-parasitológica adequada
Sistema de Informações de Vigilância Epidemiológica NacionalNotificação de Caso de Malária
Rede Amazônica de Vigilância da Resistência às Drogas
Antimaláricas
Secretaria de Vigilância em Saúde
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
United States Agency for International Development
xi
SUMARIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................
1.1 Considerações gerais...................................................................................
1.1.1 Plasmódios humanos e seus vetores........................................................
1.2 Epidemiologia ..............................................................................................
1.2.1 Malária no mundo .....................................................................................
1.2.2 Malária nas Américas e no Brasil .............................................................
1.3 Ciclo biológico do Plasmodium no homem ..................................................
1.4 Malária causada pelo P. vivax .....................................................................
1.5 Tratamento da malária..................................................................................
1.6 Cloroquina ...................................................................................................
1.6.1 Química ....................................................................................................
1.6.2 Mecanismo de ação da cloroquina ...........................................................
1.6.3 Propriedades farmacocinéticas da cloroquina...........................................
1.6.4 Desetilcloroquina......................................................................................
1.6.5 Terapêutica da malária vivax.....................................................................
1.6.6 Resistência do P. vivax à cloroquina.........................................................
1.6.7 Concentrações séricas efetivas da cloroquina .........................................
1.6.8 Determinação das concentrações séricas da cloroquina .........................
1.7 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ........................................
2 Objetivos........................................................................................................
2.1 Geral ............................................................................................................
2.2 Específicos ..................................................................................................
3 Material e Métodos........................................................................................
3.1 Local do Estudo............................................................................................
3.2 Participantes.................................................................................................
3.3 Exame microscópico do sangue e determinação da parasitemia ...............
3.3.1 Coleta de sangue ..................................................................................
3.4 Dosagem Sanguínea de cloroquina.............................................................
3.5 Diagnóstico pela reação em cadeia da polimerase (PCR)..........................
3.6 Tratamento dos pacientes...........................................................................
3.6.1 Medicamentos Utilizados...........................................................................
3.6.2 Tratamento com cloroquina e primaquina.................................................
3.6.3 Tratamento concomitante..........................................................................
3.6.4 Tratamento alternativo...............................................................................
3.7 Clareamento Parasitário...............................................................................
3.8 Determinação das concentrações do antimalárico.......................................
3.8.1 Equipamentos e Acessários......................................................................
3.8.1.1 Reagentes e solventes...........................................................................
3.8.1.2 Preparação das soluções padrão...........................................................
3.8.1.3 Solução de estoque................................................................................
3.8.1.4 Soluções intermediárias ........................................................................
3.8.1.5 Soluções de Trabalho ............................................................................
3.8.1.6 Solução do padrão interno .....................................................................
3.8.1.7 Condições cromatográficas ...................................................................
3.8.2 Procedimento de extração de cloroquina e desetilcloroquina ..................
3.8.3 Curva de Calibração .................................................................................
3.8.4 Determinação das concentrações de cloroquina e desetilcloroquina .......
3.9Análise estatística dos resultados.................................................................
01
15
15
16
16
17
18
20
21
23
24
25
28
29
29
31
34
34
36
37
37
37
38
38
39
39
40
40
41
41
41
41
42
42
43
43
43
43
44
44
44
44
44
45
45
45
46
46
xii
3.10 Considerações éticas ................................................................................
3.11 Consentimento após a informação............................................................
3.12 Custos financeiros do projeto.....................................................................
4. Resultados e Discussão – Artigo....................................................................
5. CONCLUSÃO.................................................................................................
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................
7 ANEXOS .........................................................................................................
7.1 Termo de consentimento livre e esclarecido – TCLE ..................................
7.2. Certificado físico-químico da droga.............................................................
7.3 Autorização para uso das amostras ...........................................................
7.4 Ofício a CONEP............................................................................................
7.5 Aprovação da CONEP .................................................................................
7.6 Normas da revista.........................................................................................
47
47
48
49
59
60
78
78
81
83
84
85
86
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais
1.1.1 Plasmódios humanos e seus vetores
A malária humana é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada por
quatro espécies de protozoários unicelular do gênero Plasmódio, pertencentes ao
filo Apicomplexa, classe Sporozoea, ordem Eucocciida e família Plasmodiidae Plasmodium: P. malariae (Laveran, 1881), P. vivax (Grassi e Feletti, 1890), P.
falciparum (Welch, 1897) e
P. ovale (Stephens, 1922); tem como sua principal via
de transmissão ao homem a picada infectante das fêmeas de alguns insetos
dípteros culicídeos do gênero Anopheles, (Garnham, 1998; Gilles, 1998). (Figura 1).
Figura 1 - Agente etiológico: Gênero: Plasmodium
Fonte: (OMS, 2008).
No Brasil, várias espécies são vetores em potencial, predominando o
Anopheles (N) darlingi como principal transmissor na região Amazônica, sendo esta
mais antropofílica e eficaz na transmissão (Tadei e Dutary – Thatcher, 2000).( figura
2).
Outras espécies apresentam capacidade de transmissão e são classificadas
como secundárias, tais como Anopheles (N) aquasalis (principal vetor no litoral do
país), Anopheles (N) albitarsis, Anopheles (K) cruzii (predominante no sul do Brasil)
e Anopheles (K) bellator (Forattini, 2002).
2
Figura 2. Anopheles (N) darlingi como principal transmissor na região
Amazônica.
Fonte: (TADEI & DUTARY – THATCHER, 2000); (FORATTINI, 2002).
1.2 Epidemiologia
1.2.1 Malária no mundo
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, a malária é considerada
endêmica em 109 países e territórios nas regiões tropicais e subtropicais do planeta,
onde 3,3 bilhões de pessoas estão expostas ao risco de adoecer, representando
40% da população mundial. O maior enfoque epidemiológico tem sido direcionado
ao P.falciparum, pois é a espécie de maior morbidade e mortalidade dentre os
diferentes tipos de malária humana (OMS, 2008). Em 2006, estima-se que houve
881 000 (610 000–1 212 000) mortes relacionadas à malaria, das quais 90%
ocorreram na África e 4% no Sudeste asiático e o Leste do Mediterrâneo (OMS,
2008).(figura 3).
3
Áreas onde ocorre transmissão de malária
Sem malária
Fonte: WHO/RBM
Figura 3: Distribuição da malária no mundo.
Fonte: (OMS), 2008.
A malária vivax fora do continente africano (África Sub sahareana)
corresponde a 55% dos casos mundiais da doença, sendo relevante no sudeste da
Ásia, na Índia e nas Américas Central e do Sul. Setenta e cinco por cento (75%) das
formas clínicas ocorrem na Ásia, incluindo o Oriente Médio, 15%-20% nas Américas
Central e do Sul e 5%-15% na África (Luxemburger, 1999; Miller et al., 2002;
Pukrittayakamee et al., 2004).
1.2.2 Malária nas Américas e no Brasil
Nas Américas, no ano de 2008, foram notificados 917.828 casos de malária. O
Plasmodium vivax predominou no continente em 80%, sendo no Brasil 60%.(OPAS,
2008).
Em 2008 foram registrados 314.559
casos de malária no país. Destes
casos, 266.124 foram causados pelo P. vivax, sendo esta a espécie de maior
prevalência (MS, 2008; SIVEP, 2008; OPAS, 2008).
4
No Brasil, a malária figura como uma das principais endemias parasitárias,
sendo a região amazônica responsável por 99,8% dos casos notificados no país. Na
maioria dos estados amazônicos, a maior incidência é no período de junho a
setembro. A incidência parasitária anual (IPA) da malária, na Amazônia Legal, no
período de 2003 a 2006, ficou entre 18,3 e 26,6 casos por mil habitantes,
respectivamente. Em 2007 o IPA geral do país foi de 18,7/1000 habitantes (MS,
2007; SIVEP, 2008).
O P. vivax é a espécie responsável pelo maior número de casos no Estado do
Amazonas, dos 113.796 casos notificados em 2008, 82,0 % foram causados por
esta espécie. A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas notificou no ano de
2008 6.876 casos de malária, sendo o P. vivax responsável por 6.029 dos casos,
cabendo ao P. falciparum apenas 825 dos diagnósticos positivos. Em 2007 a
Fundação registrou 14.249 casos, havendo uma diminuição signicativa no ano
anterior (FMTAM; 2008, SIVEP, 2008).
1.3 Ciclo biológico do Plasmadium no homem
O ciclo endógeno começa após a picada infectante da fêmea do anofelino, que
inocula esporozoítas da saliva (que serve como anticoagulante) de plasmódios nos
capilares subcutâneos, os quais ganham a corrente sangüínea e se aderem à
superfície dos hepatócitos. A transmissão pode ocorrer através da via materno-fetal,
de transfusão de sangue e seus derivados e, menos freqüentemente, mediante o
compartilhamento de seringas contaminadas com sangue de usuários de drogas malária induzida (Gilles, 1998; Garnham, 1998). (Figura 4).
Em menos de uma hora após a inoculação, os esporozoítas deixam a
circulação sanguínea e invadem as células hepáticas, onde se transformam em
criptozoítas (estrutura arredondada), e logo em seguida Trofozoíto (que será
responsável pela Esquizogonia hepática "formação de milhares de Merozoítos"
estes irão invadir as hemacias. Nessa fase inicia-se o ciclo pré-eritrocítico ou exoeritrocítico e ou esquizogonia pré-eritrocítica ou hepática (Gilles, 1998; Garnham,
1998).
5
Assim que começam as divisões nucleares, os parasitas passam a ser
chamados esquizontes e, no fim da esquizogonia, dão lugar à formação de milhares
de elementos filhos, os merozoítas. O ciclo pré-eritrocítico dura de 6 a 16 dias,
dependendo da espécie do Plasmodium. A célula hepática rompe-se liberando os
merozoítas, muitos dos quais são fagocitados e destruídos pelas células de Kupffer
(células presentes no fígado com ação fagocitária). (Gilles, 1998; Garnham, 1998).
Os sobreviventes invadem as hemácias e dão início ao segundo ciclo de
reprodução assexuada dos plasmódios, possibilitando o início do ciclo eritrocitário.
No hospedeiro humano, os períodos médios de incubação das espécies P. vivax e
P. falciparum são, respectivamente, de 12-17 dias e 7-10 dias. A doença se inicia
com a multiplicação parasitária assexuada nos eritrócitos e continua pela reinfecção
promovida pelos merozoítos em outras hemácias. Uma pequena quantidade de
parasitos se diferencia em gametócitos, que são essenciais na transmissão da
infecção através da picada do vetor. No interior do trato digestivo do anofelino, as
células sexuais por sua vez irão desenvolver o ciclo evolutivo sexual dos plasmódios
com formação do zigoto, oocito e, finalmente esporozoitos. Posteriormente, essas
formas poderão infectar seres humanos (Gilles, 1998; Garnham, 1998).
O ciclo de diferenciação e multiplicação do plasmódio nos hepatócitos possui
algumas peculiaridades para as espécies P. vivax e P.ovale. Algumas formas
dormentes desses parasitos não desenvolvem a esquizogonia tissular (esquizontes
pré-eritrocíticos) e interrompem o ciclo replicativo assexuado no interior do
hepatócito (hipnozoítos), podendo vir a ser continuado posteriormente, promovendose assim o quadro de recaída da malária (Krotoski, 1985; Lopez-antuñano, 1990)
Estudos relativos aos hipnozoítos do P. vivax postulam a existência de
populações de esporozoítos geneticamente distintos que se desenvolvem em
merozoítos no interior dos hepatócitos, enquanto outros permanecem dormentes
nestas células por um período maior, em estado de latência. Proporções variáveis
dos esporozoítos podem produzir hipnozoítos com diferentes períodos de
6
quiescência e variações médias que vão de 15 dias (zonas tropicais) a 20 meses
(zonas temperadas), podendo se estender por anos (Krotoski, 1985; Warrell, 1998).
Figura 4. Ciclo dos Plasmodium SP
Fonte: www.imm.ul.pt/html/Ciclo_Vida.bmp,2008
1.4 Malária causada pelo P. vivax
O P. vivax é menos patogênico, quando comparado ao P. falciuparum,
habitualmente não alcançando altas densidades parasitárias e seqüestro nos
capilares e vênulas (Pukrittayakamee et al., 2000), embora o roseamento de
hemácias parasitadas já tenha sido relatado (Chotivanich et al. 1998). A infecção
por P. vivax causa a forma clínica de malária, denominada febre terçã benigna, cuja
evolução clínica apresenta predomínio de formas menos graves e baixa letalidade,
significando que a mesma venha a ser uma forma benigna de adoecimento. As
infecções maláricas por esta espécie possuem atualmente maior importância como
causa de morbidade e de grandes perdas sócio-econômicas mundiais em
conseqüência do elevado número de casos (Mendis et al., 2001).
Apesar das formas clínicas benignas serem mais freqüentes, com quadros de
menor gravidade e baixa letalidade, não significa que a infecção por P. vivax não
possa evoluir com gravidade e letalidade. Diversos relatos de evolução da doença
com complicações, às vezes letais, têm sido descritos na literatura médica,
7
alertando para a necessidade de melhor conhecimento da fisiopatogenia e manejo
clinico adequado dos pacientes (Kochar et al., 2009; Rogerson & Carter, 2008;
Tjitra et al, 2008).
Nas Américas, os aspectos clínicos da malária causada pelo P. vivax mostramse similares aos de outros continentes. Febre ou história recente de febre
(temperatura superior a 38°C) está quase sempre presente. O padrão da febre nem
sempre é regular como o esperado. Outros sintomas inespecíficos são: calafrios,
astenia, dor de cabeça, mialgia, tosse e sintomas gastrintestinais (Ventura 1997).
Febre, icterícia e hepatosplenomegalia são os achados mais freqüentes ao exame
físico (Alecrim, 2000; Blair et al, 2003).
1.5 Tratamentos da malária
O tratamento adequado e oportuno tanto previne a ocorrência de casos graves
e, conseqüentemente a morte por malária, quanto elimina fontes de infecção para
os
mosquitos,
contribuindo
para
a
redução
da
transmissão
da
doença
(Brasil/MS/FUNASA/CENEPI, 2001). Uma vez que o diagnóstico da malária foi
confirmado, a terapêutica apropriada deve ser iniciada imediatamente. Esta deve
ser guiada por três fatores principais: a espécie infectante do Plasmódio, o estado
clínico do paciente e a susceptibilidade da droga aos parasitos infectantes, que é
determinada pela área geográfica onde a infecção foi adquirida (CDC, 2008).
A quimioterapia da malária tem como objetivos interromper a esquizogonia
sangüínea responsável pela patogenia e pelas manifestações clínicas da infecção;
proporcionar a erradicação das formas latentes do parasito (hipnozoítas) do P. vivax
e do P. ovale no ciclo tecidual, evitando as recaídas; e reduzir as fontes de infecção
para os mosquitos, eliminando as formas sexuadas dos parasitos, (Brasil/SVS/,
2001).
Como agentes terapêuticos contra as formas eritrocíticas assexuadas dos
parasitas, se destacam a cloroquina, a quinina, a quinidina, a mefloquina e a
halofantrina. A pirimetamina, as sulfonamidas, as sulfonas e as tetraciclinas
8
compartilham esta propriedade, mas são de ações mais lentas, menos eficazes e
devem ser combinadas com outros antimaláricos. A primaquina é usada
clinicamente para erradicar formas tissulares latentes, responsáveis pelas recaídas
nas malárias por P. vivax e P. ovale (Tracy & Webster, 2002).
O tratamento da malária é complexo. Dificilmente, apenas um medicamento é
utilizado, em geral, são duas ou três diferentes drogas associadas (Brasil/SVS/GVE,
2005). A cloroquina é o fármaco de primeira escolha para malária vivax. Na malária
falciparum recorre-se ao quarten, a quinina associada a doxiciclina e/ou
clindamicina, a mefloquina e derivados de artemisina (Tracy & Webster, 2002).
A inexistência, até o momento, de um único tratamento igualmente efetivo
contra ambas espécies de plasmódio mais prevalentes no Brasil (P. vivax e P.
falciparum) e a grande dificuldade para, na maioria das vezes, diferenciar
clinicamente a infecção por uma espécie ou por ambas simultaneamente, levaram à
necessidade do estabelecimento do diagnóstico laboratorial específico para o
tratamento adequado dos pacientes (Brasil/MS/FUNASA/CENEPI, 2001).
Há uma busca contínua por novas drogas antimaláricas ou novos métodos que
reforcem a aceitação das drogas pelos pacientes. Muitos autores têm investigado se
a redução da dose, duração ou freqüência do tratamento, poderiam ser tão eficazes
quanto aqueles usados nos esquemas padrões (Ferraroni, 1983; Andrade et. al,
1992 e Pinto et. al, 2003;).
1.6 Cloroquina
A cloroquina é um dos quimioterápicos mais importantes da história da
indústria farmacêutica. A droga foi concebida cinco anos antes da II Guerra Mundial
no âmbito de um programa para reposição dos “stocks” de quinina. Curiosamente, a
cloroquina foi rapidamente abandonada em conseqüência da observação de efeitos
tóxicos, em uma triagem envolvendo quatro pacientes infectados com P. vivax. Em
1945, ensaios clínicos levados a cabo por investigadores americanos conduziram à
9
recuperação da cloroquina como fármaco de eleição no tratamento e profilaxia da
malária (Vale at al., 2005). (figura 5).
AÇÃO DOS ANTIMALÁRICOS
Ciclo exoeritrocítico
Ciclo eritrocítico
Cloroquina
Primaquina
Hipnozoito
Esquizogonia
Primaquina
Glândula
salivar
Homem
Cloroquina
Primaquina
Intestino médio
Esporogonia
(ARÉVALO-HERRERA et al., 2002; WONGSRICHANALAI, 2002;
HASTINGS, 2003; WHITE, 2004)
Figura 5. Ação Terapêutica dos antimaláricos.
Fonte: Arévalo-Herrera, 2002; Wongsrichanalai, 2002; Hastings, 2003; White, 2004)
1.6.1 Química da cloroquina
Quimicamente, a cloroquina é denominada de 7 cloro-4-[[4-(dietilamino-1metilbutil ] amino] quinolina, apresentando peso molecular 319,88 e fórmula
molecular C18H26ClN3. É um pó cristalino branco ou levemente amarelo, inodoro e de
sabor amargo. É pouco solúvel em água, solúvel em ácidos diluídos, clorofórmio e
éter. Como base livre, apresenta-se como pó cristalino amarelo ou branco, inodoro.
Também é encontrada nas formas de fosfato ou cloridrato (Farmacopéia brasileira,
1977).( figura 6).
10
As formas d (dextrógiras), l (levógira) cloroquina apresentam potência igual no
modelo da malária aviária, sendo que o isômero d é menos tóxico do que o isômero
l em mamíferos. Um átomo de cloro ligado na posição 7 do anel quinolínico, confere
maior atividade antimalárica tanto na malária aviária quanto na humana (Brocks &
Mehvar, 2003).
Figura 6. Fórmula estrutural da Cloroquina.
Fonte: Vale, 2005.
1.6.2 Mecanismo de ação da Cloroquina
O mecanismo de ação da cloroquina não é bem conhecido, mas pode
envolver: ligação direta ao grupo heme, inibição de uma ferriprotoporfirina IX
polimerase não identificada (inibição de polimerização da heme), inibição de uma
fosfolipase vacuolar, inibição da síntese de proteína, interação com o DNA (Foley &
Tilley, 1997).
Apesar do mecanismo não está completamente esclarecido, existem
evidências de que a interação entre os antimaláricos esquizonticidas sangüíneos
com o grupo heme ferriprotoporfirina IX (Fe (III) PPIX) está envolvida na toxicidade
11
destes fármacos ao parasito intra-eritrocítico. Vários experimentos in vitro
estabeleceram que fármacos antimaláricos quinolínicos agem por interferência na
cristalização da hemozoína, que tem por
unidade básica a β-hematina , como
demonstra a Figura 10 (Sullivan Jr. et al., 1998).
É consenso que estes fármacos inibem a formação da hemozoína. Persiste,
entretanto, uma divergência sobre como isto ocorre (Egan & Marques, 1999).
Heme ou
Ferriprotoporfirina IX
β-Hematina - unidade
básica dos cristais de
He
Figura 7. Estrutura da Ferriprotoporfirina IX, β-Hematina e hemozoína.
Fonte: Adaptado de Pagola et al., 2000; Wiser, 2003.
Os parasitos degradam cerca de 75% da hemoglobina dos eritrócitos e a
utilizam como fonte alimentar. A hemoglobina é importada para dentro de um
compartimento acídico do parasito, conhecido como vacúolo alimentar, e é
quebrada por enzimas proteolíticas, chamadas plasmecinas, em peptídeos que,
posteriormente, são degradados a aminoácidos (Egan & Marques,1999). O resíduo
livre heme ou ferriprotoporfirina IX (Fe (III) PP IX) é tóxico ao parasito. A Fe (III) PP
IX é polimerizada formando um composto inerte, insolúvel e não tóxico ao parasito,
o pigmento malárico hemozoína (Egan & Marques,1999).
Slater & Cerami (1992), sugeriram que a reação de formação da hemozoína no
parasito é catalisada por uma enzima, que seria inibida pelos antimaláricos
quinolínicos.
Esta
conclusão
foi
baseada
nas
condições
extremas
que,
12
aparentemente, seriam requeridas para a formação por síntese da β-hematina e na
observação que um extrato de membrana plasmodial aparentemente catalisa esta
formação.
Entretanto, Dorn et al. (1995) encontraram que a formação de β-hematina é
independente de proteínas e sugeriram que ela é autocatalítica, sendo que o agente
catalítico no extrato do parasito é, de fato, a própria hemozoína. Uma outra hipótese
é que os antimaláricos quinolínicos podem inibir a formação de hemozoína, pela
interação direta com a Fe (III) PP IX.
Egan et al. (1994), demonstraram que a cloroquina, quinina e amodiaquina são
capazes de inibir a polimerização espontânea da Fe (III) PP IX em solução de ácido
acético, enquanto a 9-epiquinina e outras substâncias inativas na fase eritrocítica da
malária não são.
Dorn et al. (1998), também relataram que a formação de β-hematina é inibida
por antimaláricos quinolínicos sob condições mais brandas, que se aproximam mais
daquelas que são esperadas in vivo. Assim, o efeito primário dos fármacos
antimaláricos que atuam na fase eritrocítica da doença é a ligação com a
Fe(III)PPIX e a inibição da sua polimerização para formação da hemozoína.
Secundariamente, a Fe (III) PP IX e o complexo FE (III) PP IX-fármaco acumulamse e ficam disponíveis para exercer seus efeitos tóxicos (Orjih et al., 1994).
A base precisa para os efeitos tóxicos da Fe (III) PP IX livre e seus complexos
com antimaláricos quinolínicos no parasito não está completamente estabelecida
(Egan & Marques, 1999).
Uma das hipóteses é que esta toxicidade resulta da atividade peroxidativa da
Fe(III)PPIX e dos complexos Fe(III)PPIX-fármaco sobre os lipídeos da membrana
(Sugioka & Suzuki , 1991).
13
Outra hipótese é que a Fe(III)PPIX lisa o parasito via um mecanismo
colóidoosmótico, possivelmente pela inibição da manutenção do gradiente de
cátions (Egan & Marques, 1999).
Alguns autores têm sugerido que o mecanismo de ação da cloroquina pode ser
similar aos dos quinolinimetanóis (Slater, 1993), entretanto, as evidências que
sustentam as interações heme como modo de ação das 4-amoniquinoleínas não
está completamente esclarecida, assim como, não está claro se o heme é o único
alvo de ação dos antimaláricos quinolinometanóis (Chou et al., 1980; Chevli & Fitch,
1982).
Estudos iniciais sugeriram que a cloroquina assim como a quinina pode inibir a
replicação do DNA e a síntese do RNA do Plasmodium, ainda que, através de
elevadas concentrações de droga (Parker e Irvin 1952, Cohen & Yielding 1965,
citados em Foley & Tilley, 1998; Thelu et al., 1994).
Os efeitos morfológicos no parasito seguidos ao tratamento com a cloroquina
são similares aos efeitos observados pelo tratamento com o quinina e mefloquina,
por exemplo, há uma expansão inicial de o vacúolo alimentar (Jacob et al., 1987;
Olliaro et al., 1989; Peters et al., 1977).
É largamente aceito que a cloroquina exerce seu efeito antimalárico pela
interação com o processo de degradação da hemoglobina dentro do parasito,
provavelmente por meio uma interação com a hematina (Dorn, et al., 1998; Ridley
1997a; Ridley et al., 1997b), embora o completo mecanismo de ação, seja até hoje
debatido (Asawamahasakda,
et al., 1994;
Ward et al., 1997), a inibição da
polimerização da hematina tem sido usada como marcante representante do tipo de
atividade antimalarial das 4-aminoquinolinas (Slater et al., 1992; Raynes et al.,1996;
Hawley et al., 1998).
1.6.3 Propriedades farmacocinéticas da cloroquina
14
A cloroquina é eficientemente absorvida quando administrada pela via oral,
alcançando concentrações máximas no plasma dentro de 3 h (variando entre 2 a 12
h). Rapidamente metaboliza-se através das enzimas do citocromo P450, nos
metabólitos ativos disetilcloroquina e bisetilcloroquina. Ambas são depuradas
lentamente com meia-vida de 20 a 60 dias. A biodisponobilidade por via oral é de 70
a 75%. Pela via intramuscular ou intravenosa a concentração sanguínea assemelhase aquela da via oral, porém o nível máximo é alcançado entre 5 a 20 minutos.
Ligam-se às proteínas plasmáticas em torno de 55%. Tem elevada capacidade de
ligação tecidual, particularmente a tecidos dérmicos e oculares contendo melanina.
Concentram-se, preferencialmente, nos eritrócitos, sobretudo os infectados.
(Ducharme & Farinotti, 1996; Warrel, 1998; Karunajeewa et al, 2008).
No interior das hemácias alcançam concentrações três vezes superiores
aquelas do plasma. Também se concentra nos leucócitos e nas plaquetas.
Atravessa a barreira placentária e, em tratamentos prolongados, pode causar lesão
no feto e alcança pequena concentração no leite materno.
É excretada,
principalmente, pela via renal, com meia vida de eliminação de 1 a 2 meses.
(Nosten et al., 2006; Lee et al. 2008).
1.6.4 Desetilcloroquina
A desetilcloroquina é um metabólito que apresenta atividade antimalárica
similar ao fármaco original (figura 3) (OMS, 2006).
R1
Desetilcloroquina
Cloroquina
Figura 8. Fórmula estrutural da desetilcloroquina
CH2CH3
R2
H
CH2CH3 CH2CH3
15
Fonte: Cardoso & Bonato, 2005
Holmberg et. al. (1983) demonstraram que a desetilcloroquina tem meia vida
de 25% inferior quando comparada a meia vida da cloroquina, porém pode ser
prolongada depois do aumento da dose do fármaco.
A maior parte da biotransformação da cloroquina em desetilcloroquina ocorre
no fígado com a participação do complexo enzimático P-450 (CYP-450). Várias
enzimas deste complexo participam do metabolismo de antimaláricos no organismo
humano (Guzman & Fonseca, 2006).
1.6.5 Terapêutica da malaria vivax
A cloroquina tem um papel central no tratamento como na profilaxia da malária,
principalmente nos países em desenvolvimento, pelo seu baixo custo, eficácia e
segurança (Whitby, 1997). Possui ação esquizonticida nos eritrócitos infectados
pelos P. vivax, P. ovale e P. malariae, além de exercer efeito gametocitocida nas
espécies mencionadas e limitada ação, quando há sensibilidade, sobre algumas
cepas de P. falciparum (Warrel, 1998; Brasil, 2001).
Os comprimidos contendo 250 mg de sal, na forma de difosfato ou sulfato,
equivalentes a 150 mg de base livre, são os mais usados pelo Ministério da Saúde.
Existem apresentações injetáveis de cloroquina, porém o seu uso não tem sido
recomendado, pelo alto risco de efeitos cardiotóxicos agudos e graves, não estando
disponível no Brasil, (Brasil, 2001). O esquema de primeira escolha, recomendado
para tratamento das infecções por Plasmodium vivax com cloroquina em 3 dias e
primaquina em 7 dias está representado na Tabela 1.
Tanto crianças, quanto adultos devem receber uma dose de cloroquina total de
25 mg de base/kg, administrada no transcorrer de três dias. Um regime adequado,
sob o aspecto farmacocinético, consiste em administrar uma dose inicial de 10 mg
de base/kg, seguida de 5 mg/kg, seis a oito horas após e 5 mg/kg em cada um dos
dois dias seguintes. Outro esquema terapêutico mais prático, utilizado em diversas
16
regiões, consiste em 10 mg/kg no primeiro dia, seguida de 7,5 mg/kg no segundo e
terceiro dias. Ambos correspondem a uma dose total de 25 mg/kg (1.500 mg de
base para um adulto com 60 kg) (Brasil, 2001).
A primaquina é responsável pela cura radical prevenindo recaídas (Brasil,
2001), uma vez que algumas formas dormentes de
P. vivax (e P.ovale)
não
desenvolvem a esquizogonia tissular (esquizontes pré-eritrocíticos) e interrompem o
seu ciclo replicativo assexuado no interior do hepatócito (hipnozoítos), podendo vir a
ser continuado posteriormente, promovendo-se assim o quadro de recaída da
malária vivax (Krotoski, 1985; Warrell, 1998).
Grupos
Etários
Cloroquina
Menor de 6
6
a
11
1 a 2 anos
3 a 6 anos
7 a 11 anos
12 a
14
15 ou mais
Comprimido
1/4
1/2
1
1
2
3
4
1º dia
Primaquina
Adulto Infantil
1
1
2
1
1
1e½
2
-
Drogas e Doses
2º e 3º dias
Cloroquina
Primaquina
Adulto Infantil
comprimido
1/4
1/2
1
1/2
1
1
2
1
1
2
1 e 1/2
3
2
-
4º e 7º dias
Primaquina
Adulto Infantil
1
1
2
1
1
1 e1 /2
2
-
Tabela 1. Tabela de Tratamento
Fonte: MS -2004
1.6.6 Resistência do P. vivax à Cloroquina
Um dos aspectos limitantes do sucesso do tratamento da malária é a variação
da resposta dos parasitos aos medicamentos comumente utilizados. (Noedl et al.,
2003). Segundo a Organização Mundial de Saúde, (1973), define-se resistência do
plasmódio às drogas antimaláricas a capacidade de uma determinada cepa, como
17
também multiplicar-se, a despeito da administração correta do medicamento de
efeito plasmodicida e da absorção deste, o qual é prescrito em doses iguais ou
superiores as normalmente recomendadas, mas dentro dos limites de tolerância do
indivíduo. OMS,(2003).
Define-se como P. vivax cloroquina-resistente quando ocorre a recorrência ou
persistência parasitária até 35 dias do seguimento dos indivíduos tratados,
comprovando-se que os níveis de cloroquina e seus produtos de biotransformação
(desetilcloroquina e cloroquina) no sangue são ≥ 100ng/ml ou no plasma de ≥ 10ng
(Baird, 1997; 2004; Berliner et al., 1948; Coatney et al., 1949). A duração mais curta
do período de observação de 28 dias é atualmente recomendada pela OMS (2003).
Os critérios metodológicos mais confiáveis para classificar a resposta in vitro do P.
vivax aos antimaláricos ainda não estão padronizados, em conseqüência da
dificuldade de adaptação dos parasitos em cultivo contínuo (Hamedi et al., 2003;
Baird, 2004).
A epidemiologia da resistência do P. vivax à cloroquina é pouco estudada,
mostrando-se como um problema sério na Indonésia, Papua Nova Guiné e áreas
adjacentes (White, 2004). Relatos iniciais de resistência clínica ocorreram em 1989
em soldados australianos provenientes da Papua Nova Guiné (Rieckmann, 1989;
Schuurkamp, 1989). Desde 1989, inúmeros relatos esporádicos de reduzida
sensibilidade ao antimalárico têm surgido em diversos países: Miamar (Than et al.,
1995); Papua Nova Guiné (Schuurkamp et al.; 1992); Índia (Garg et al., 1995; Dua
et al.,1999a; Dua et.al.,200b); Filipinas (Baird et al., 1996); Guiana (Phillips et al.,
1996); Brasil (Garavelli e Corti, 1992; Alecrim et al., 1999b; de Santana et al.,2007);
Tailândia (Looareesuwan et al., 1999); Peru (Ruebush II et al., 2003a ; Vietnam
(Taylor et al., 2000); Etiópia (Teka et al, 2008; Ketema et.al.,2009);Coréia do Sul
(Lee et al, 2009).
Alecrim et al. (2000), no Amazonas (Manaus), avaliando a sensibilidade do P.
vivax à cloroquina em estudo conduzido na FMTAM, acompanhou 331 pacientes,
dos quais 158 finalizaram os 28 dias de seguimento clínico. Todos foram tratados
inicialmente com cloroquina (25mg/kg) associada à primaquina após o 5º dia de
18
seguimento. Em 151 pacientes (95,5%) não houve recorrência parasitária e em sete
(4,4%) a parasitemia recrudesceu após o 14º dia.
No mesmo município, um estudo de eficácia da cloroquina com base no
protocolo da OPAS/OMS de 2004, seguimento clinico-parasitológico de 28 dias,
observou o percentual de fracasso terapêutico (10,1%) entre 152 indivíduos
avaliados (11/152). Este fato alerta para probabilidade de ocorrência de maior
número de casos que possivelmente não são identificados pela atenção básica de
saúde, podendo significar um fator co-promotor da endemia malária vivax,
interferindo nas ações de controle da disseminação da morbidade (de Santana
Filho, 2007).
No Peru, Ruebush II et al. (2003a) investigando a possibilidade de P.vivax
resistente a cloroquina, entre 1998 e 2001, conduziu um estudo in vivo na bacia
amazônica, peruana e na costa pacífica norte do país. De acordo com o novo
protocolo de avaliação da eficácia da cloroquina na malária vivax recomendado pela
OMS (2003), foram avaliados 242 pacientes com febre documentada ou relato de
história de febre, 177 da região amazônica e 65 da costa pacífica. O tratamento com
cloroquina isolada (25mg/kg) foi supervisionado e 212 pacientes (88%) completaram
o seguimento de 28 dias. Entre os mesmos, dois apresentaram resistência
parasitária à cloroquina comprovada pela dosagem sangüínea dos níveis de
cloroquina e desetilcloroquina e pela genotipagem de polimorfismo pela reação em
cadeia da polimerase.
Alguns estudos com o uso isolado da cloroquina já foram realizados na
América Latina, Soto et al. (2001), na Colômbia, avaliando a eficácia da cloroquina
isolada em 27 pacientes com malária vivax, acompanhados por 28 dias e com
tratamento supervisionado (25mg/kg), encontrou um percentual alto de resistência
de 11% (4), atentando para a importância de se monitorar P. vivax cloroquinaresistente nas Américas.
Em Georgetown (Guiana), na avaliação 13 pacientes tratados com cloroquina
e acompanhados por 28 dias, Baird et al. (2002) identificaram dois casos de
19
recorrências parasitárias tardias no D14 e D21, respectivamente, porém os níveis
sangüíneos de cloroquina e disetilcloroquina dosados estiveram abaixo da
concentração efetiva mínima do antimalárico (≥100ng/ml), não sendo possível
comprovar os casos de infecção por P. vivax cloroquina-resistente.
Esta claramente documentada a existência de resistência á cloroquina em P.
vivax, se manifestando por falha terapêutica quando usada de forma isolada ou não,
no tratamento desta forma da malaria. Dada a importância epidemiológica da
malaria por P. vivax e a existência de cepas resistentes desta espécie de
Plasmodium, em áreas até então livres deste fenômeno, fez com que as autoridades
sanitárias a uma maior mobilização para caracterizar a distribuição da resistência,
considerando-se importante para os programas de controle estruturar um sistema
para monitorar as variações temporais e espaciais na resposta terapêutica a este
medicamento, valendo-se de ferramentas como estudos de eficácia recomendados
pela OMS (Teka et al, 2008; Ketema et al,2009; Lee et al, 2009).
1.6.7 Concentrações séricas efetivas da cloroquina
Diversos estudos realizados na década de 1940 a 1960 indicaram que a
concentração efetiva mínima de cloroquina deve ser 10ng/ml de plasma. Entretanto
duas questões emergem deste valor obtido naquela época, quer sejam a
metodologia utilizada e a correlação entre os níveis plasmáticos e no sangue total
do fármaco. Os métodos iniciais de análise não faziam a distinção entre a cloroquina
e seu principal produto de biotransformação, desetilcloroquina, portanto tal valor de
10ng/ml representa a soma do fármaco e de seu produto de biotransformação, que
possuem atividade antimalárica equivalente. O valor de 10ng/ml no plasma deverá
servir de orientação para determinação dos teores do fármaco no sangue total, que
pode ser estimado em 100 ng/ml (Baird, 2004).
Baseando-se nestes valores pode-se inferir que a parasitemia recorrente, após
35 dias de terapia, com concentrações no sangue total de cloroquina e
desetilcloroquina superior a 100ng/ml, caracteriza a resistência do parasito ao
fármaco (Baird, 2004).
20
Portanto, a determinação do fármaco e seu produto de biotransformação
requerem métodos altamente sensíveis e específicos, no qual se enquadra a
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), que obedece aos pré-requisitos
analíticos básicos (FDA, 1994).
1.6.8 Determinação das concentrações séricas da cloroquina
Diversas metodologias estão disponíveis atualmente para determinação da
cloroquina e de seu principal metabólito em fluídos biológicos empregando a
cromatografia líquida de alta eficiência com detectores de fluorescência ou
ultravioleta (FDA, 2001; Paredes et. al., 2002).
Patchen et. al (1983) descreveram um método de quantificação de cloroquina
e do seu principal metabólito, desetilcloroquina, em sangue total coletado em papel
de filtro, usando a CLAE com detecção de fluorescência. A metodologia permite
uma efetiva avaliação da resistência do parasita à cloroquina nas regiões
endêmicas.
As análises de cloroquina e de desetilcloroquina usando detecção por
fluorescência foram feitas por Projean et. al (2003) para identificação de isoformas
de P450 (CYP2C8, CYP3A4 e CYP2D6) envolvendo a N-desetilação de cloroquina,
para uma melhor caracterização da biotransformação do fármaco em humanos.
Cardoso e Bonato (2005), também descrevem um método de quantificação de
desetilcloroquina e desetilhidroxicloroquina aplicando a CLAE.
Samanidou et. al (2005), publicaram a validação de um método simultâneo de
determinação de quinina e cloroquina em fluidos biológicos. Deng et. al (2006)
desenvolveram um método sensível, específico e reprodutível
para separar
simultaneamente um composto farmacológico a uma 4-aminoquinolina (AQ-13),
bem como cloroquina e seus metabólitos em sangue total, em ambos empregando
a CLAE com detector de fluorescência.
21
Green et. al (2006), usando a CLAE com detector de UV fizeram análise de
especialidades farmacêuticas de cloroquina, quinina e sulfadoxina com o objetivo de
comparar a validação de dois métodos (refractométrico e colorimétrico).
O
desenvolvimento e validação de métodos usando fase reversa para potencial
análise de falsificação de medicamentos antimaláricos como cloroquina, quinina e
mefloquina, também foram descritos na literatura por Gaudiano et. al (2006).
1.7 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
O desenvolvimento de métodos analíticos confiáveis, rápidos, precisos e de
baixo custo para determinação de princípios ativos é atrativo (Paredes et al., 2002).
Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia ocupa um lugar de
destaque devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e
quantificação das espécies químicas (Collins, 1990).
A cromatografia líquida de alta eficiência tem sido o método analítico de
escolha para quantificação de níveis plasmáticos de drogas antimaláricas e de seus
metabólitos no sangue. Estes incluem a cromatografia de fase normal (a fase
estacionária é mais polar) ou de fase reversa (a fase móvel é mais polar) após a
extração, usando o detector de ultravioleta (UV) ou por fluorescência (Cardoso et
al., 2005; Deng et al.,2006).
A CLAE utiliza instrumentos sofisticados que podem ser totalmente
automatizados. É um tipo de cromatografia que emprega pequenas colunas,
recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel que é eluida
sob alta pressão. Tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas
de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras,
em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e
sensibilidade (Guimarães & Collins,1990).
22
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Comparar concentrações sangüíneas de cloroquina e desetilcloroquina em
sangue de pacientes com malária vivax, com e sem falha terapêutica atendidos no
Ambulatório de Malária da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.
2.2 Específicos
Determinar as concentrações sangüíneas de cloroquina e desetilcloroquina em
pacientes com ou sem falhas terapêuticas durante o seu seguimento em 28 dias;
Comparar as concentrações sangüíneas de cloroquina e desetilcloroquina nos
dois grupos do estudo;
Correlacionar às concentrações sangüíneas de cloroquina e desetilcloroquina
com a densidade parasitária e negativação da parasitemia nos dois grupos de
estudo.
23
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Local do Estudo
O estudo foi realizado na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas –
FMTAM, autarquia estadual de referência para assistência, ensino e pesquisa em
doenças tropicais, situada em Manaus – Amazonas. Considerada como um grande
centro de referência para malária na bacia amazônica foi responsável por quase
15% do atendimento médico dos pacientes com diagnóstico de malária no município
e dos provenientes do interior do Estado.
4.2 População do estudo
Figura 9. Foto FMTAM
Fonte: Próprio Autor
A população do estudo foi composta de 154 pacientes de ambos os sexos, na
faixa etária de 12-60 anos com malária vivax, diagnosticados no Laboratório de
Malária da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM), oriundos das
áreas urbana e periféricas de Manaus, no período de dezembro de 2007 a junho de
2008, e referenciados para atendimento médico no Ambulatório de Malária da
referida instituição.
24
3.2 Participantes
Foram elegíveis para o presente estudo 14 pacientes, classificados como
portador de P. Vivax
sensíveis e resistentes, oriundo de um estudo prévio de
eficácia da cloroquina em associação a primaquina tendo como base diretriz da
OPAS.
3.3 Exame microscópico do sangue e determinação da parasitemia
As lâminas para diagnóstico da malária foram coletadas mediante punção da
polpa digital do dedo indicador, este previamente higienizado com álcool iodado,
com lanceta estéril, identificadas e a sua preparação para a coloração realizada
segundo os procedimentos descritos no Basic Malaria Microscopy (OMS, 1991),
usando-se coloração por Giemsa (pH de 7,2). As leituras das mesmas foram
realizadas pelos técnicos em microscopia do Laboratório de Malária da FMTAM.
As gotas espessas coletadas, no momento da inclusão dos pacientes e nos
dias de seguimento tiveram uma padronização de tamanho para aumentar a
precisão da contagem, seguindo um gabarito como modelo, com base na medida
recomendada pela (OMS, 2003). Para a contagem de parasitos nas pesquisas
posteriores de plasmódio, a mesma técnica de preparo e coloração da gota espessa
foi empregada.
A determinação da parasitemia teve como base a contagem de parasitos
assexuados por 200 leucócitos e, no caso de menos de 10 parasitos identificados
na leitura, a contagem dos mesmos prosseguia até 500 leucócitos. Finalmente, a
determinação da fórmula parasitária levava em conta a quantificação de leucócitos
de cada paciente (leucograma). Para o cálculo da parasitemia foi utilizada a
seguinte fórmula (OPAS, 2004):
25
Densidade parasitária/µL = número de parasitos contados x leucometria ____
número de leucócitos contados=200
A gota espessa de sangue foi negativa quando, ao se examinar, no mínimo
300 campos da lamina, não se encontrou formas assexuadas de P.vivax
(OPAS,2004)
Todas as gotas espessas foram examinadas por dois revisores. A densidade
parasitária final foi estimada na média das duas contagens. Caso a gota espessa
apresentasse resultados divergentes (diferença em densidade parasitária > 50%),
as mesmas eram reexaminadas por um terceiro microscopista e a densidade
parasitária calculada, extraindo-se a média das contagens dos dois microscopistas
concordantes.
3.3.1 Coleta de sangue
Foi colhida uma amostra de sangue venoso de cada paciente que serviu para
a realização dos exames hematológicos, dosagem plasmática da fração cloroquina
e desetilcloroquina e PCR diagnóstica quando aplicável. O método de colheita de
sangue venoso foi a vácuo (Vacutainer ®), por punção venosa, com tubos com
EDTA.
3.4 Dosagem sanguínea de cloroquina.
Parte do sangue venoso coletado (tubo com EDTA) foi impregnado em papel
de filtro que serviu para a determinação dos níveis sanguíneos da fração cloroquina
e desetilcloroquina nos dias D0, D3, D7, D14, D28, em todos os pacientes que
mostraram recorrência parasitária nos 28 dias de seguimento (suspeita de fracasso
terapêutico), tendo como valor de referência, no dia da recorrência parasitária
26
(fracasso terapêutico), níveis ≥ 100ng/mL (BAIRD, 1997, 2004; Patchen 1983;
OPAS, 2004; Yonemitsu et al., 2005).
O método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) empregado foi
segundo Yonemitsu et al. (2005), utilizazando-se o cromatógrafo líquido marca
VARIAN®, modelo PRO-STAR. As amostras tiveram seu processamento no
Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal do Pará, sob supervisão do
Professor Doutor José Luiz Fernades Vieira.
3.5 Diagnóstico pela reação em cadeia da polimerase (PCR)
Com a finalidade de confirmação diagnóstica, a PCR das amostras de sangue
foi realizada no dia da recorrência parasitária durante os 28 dias de seguimento,
conforme técnica padronizada no laboratório da Gerência de Malária da FMTAM,
que resulta na amplificação de uma região específica do DNA, utilizando-se
iniciadores (primers) pré-desenhados e descritos por Snounou et al. (1993). Nos
casos de divergência de diagnóstico, o exame foi repetido.
3.6 Tratamento dos pacientes
3.6.1 Medicamentos utilizados
A cloroquina utilizada na avaliação teve a apresentação em comprimidos de
250mg de sal, sobre a forma de cloridrato, equivalente a 150mg da concentração da
base. A primaquina utilizada foi na apresentação em comprimidos de 15mg e 5mg
do sal sobre a forma de difosfato, administrada ao inicio da avaliação em
complementação ao tratamento curativo. Ambas fez parte de um lote garantido por
controle de qualidade físico-química.
3.6.2 Tratamento com Cloroquina e Primaquina
Todas as doses do tratamento foram administradas sob supervisão médica e o
cálculo da dosagem de acordo com a posologia ajustada ao peso do paciente.
27
Como se pretendeu avaliar a eficácia da cloroquina em associação a primaquina e
considerando-se que a primaquina possui fraca ação esquizonticida sangüínea, esta
droga foi administrada a partir do zero dia de acompanhamento dos pacientes (D0).
O tratamento com cloroquina foi na dose total de 25mg/kg de peso, distribuída
em três dias com administração supervisionada diária da droga, no D0 - 10 mg/kg,
D1 - 7,5mg/kg e
D2 - 7,5mg/kg. A primaquina na dose 0,5mg/kg/dia, por 7
dias,iniciando também no dia zero (D0). (BRASIL, 2001).
Os parâmetros clínicos (febre, persistência de sintomas ou sinais de malária
grave) e parasitológicos (desaparecimento parasitário ou persistência de parasitos),
bem como os efeitos adversos causados pelo uso da cloroquina foram monitorados
durante um período de seguimento de 28 dias.
3.6.3 Tratamento concomitante
Quando necessário, foram administrados medicamentos sintomáticos aos
pacientes nas seguintes situações:
- Paracetamol ou dipirona para temperaturas > 37, 8 ºC e/ou algias;
- Em caso de febre, os pais ou responsáveis por menores de idade foram
instruídos sobre o uso da aplicação de compressas úmidas;
- Em caso de náuseas e vômitos foi prescrito metoclopramida .
3.6.4 Tratamento alternativo
Os pacientes em avaliação que reuniram os critérios de fracasso do tratamento
com cloroquina, receberam tratamento de 2ª linha com mefloquina de acordo com
as orientações do Ministério da Saúde (BRASIL, 2001) - 20mg/kg de peso, até a
dose máxima de 1.000mg por tratamento, seguida de primaquina (0,5mg/kg/dia, por
7 dias).
28
3.7 Clareamento parasitário
O acompanhamento parasitológico dos pacientes se estendeu até o 28º dia de
seguimento (OPAS, 2004), possibilitando o rastreamento da ocorrência de
recorrência parasitária.
3.8 Determinação das concentrações do antimalárico
3.8.1 Equipamentos e acessórios
As análises foram realizadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência
Varian®, composto por uma bomba isocrática modelo ProStart 300, injetor manual
reodyne, com loop de 50uL, detector duplo canal ultravioleta e vísivel ProStar,
modelo 220. A separação cromatográfica foi realizada a temperatura ambiente
empregando-se uma coluna X-TERRA RP8 5μm 4.6 X 150mm (Waters, Saint
Quentin-en-Y velines, France).
No preparo das amostras também foram utilizados um agitador de tubos
vortex, Q-22ob1, Quimis; Ultra-som, Q-335D, Quimis; Centrífuga, 2K15, Sigma
Laborzentrifugen; peagâmetro digital PHS-3B, pHtek; Balança, VL–1mg,
Acculab; Homogeneizador BHS-300, Benfer; Bomba de vácuo, Fabbe;
desionizador de água Aquapur AQ 0010;
microseringa de 50µL, Halmliton;
Papel de filtro Qualy (14µg de poro) ; micropipetas automáticas com volume
regulável Finnpipette (10µL a 100µL, 20µL a 200µL e 200µL a 1000µL),
Labsystems.
3.8.1.1 Reagentes e solventes
Acetonitrila, metanol, trietilamina (grau cromatográfico) foram obtidos da
Merck. Hidróxido de sódio e ácido clorídrico da Labsynth. A água foi purificada
29
com o sistema Aquapur AQ 0010 para a preparação da solução de hidróxido de
sódio a 2 M e ácido clorídrico a 0,01 e 1 N.
3.8.1.2 Preparação das soluções-padrão
3.8.1.3 Soluções estoque
As soluções estoques de cloroquina (Sigma) em concentração de 1,4 mg/mL
e desetilcloroquina (Sigma) em concentração de 12µg/mL foram preparadas em
ácido clorídrico a 0,01 N. Já a solução de quinina (Sigma) em concentração de
2,04mg/mL foi preparada pela dissolução em metanol.
3.8.1.4 Soluções intermediárias
A solução estoque de cloroquina foi diluída em ácido clorídrico a 0,01 N e
desetilcloroquina em metanol, a fim de obter-se as concentrações de 20,0 µg/mL e 8
µg/mL, respectivamente.
3.8.1.5 Soluções de trabalho
Foram efetuadas diluições da solução intermediária de cloroquina em ácido
clorídrico a 0,01 N e desetilcloroquina em metanol, para obtenção das soluções de
trabalho em concentrações de 5,0 µg/mL e 5,0 µg/mL, respectivamente.
3.8.1.6 Solução do padrão interno
A solução estoque de quinina foi diluída em metanol, para obtenção de
concentração de 20,0 µg/mL.
Todas as soluções padrões foram acondicionadas a – 5 ºC e protegidas da luz
em frasco âmbar, envolto em papel alumínio durante o processo.
30
3.8.1.7 Condições cromatográficas
A fase móvel foi uma mistura isocrática de acetonitrila e solução aquosa de
trietilamina 0,01 M (40:60, v/v) pH 11, ajustado com ácido orto-fosfórico a 50%. A
solução preparada foi submetida à filtração e desgaseificação em ultra-som por 10
minutos antes do uso. O fluxo utilizado foi de 1,0 mL/min e comprimento de onda de
333 nm (referencia).
3.8.2 Procedimento de extração de cloroquina e desetilcloroquina
Os “spots” em pequenas peças foram transferidos para tubos de centrífuga de
polipropileno de capacidade de 15mL e adicionado1.5mL Hcl 0.1N. Os tubos foram
transferidos para um agitador mecânico e submetidos à agitação por 20 minutos. A
seguir, os mesmos foram para banho de ulta-som por uma hora. O papel de filtro foi
retirado, com auxílio de um palito de madeira e adicionado 0,5mL de NaOH 2M,
100ul do padrão interno e 6mL de metil terc butil éter. Os tubos foram agitados por
15 minutos e centrifugados a 2000 rpm por 15 minutos. A camada orgânica foi
separada e evaporada em banho de água a 60 ºC. O resíduo foi ressuspendido com
100 uL da fase móvel e injetado, em volume de 50 uL no cromatógrafo.
3.8.3 Curva de calibração
Foram utilizados calibradores contendo cloroquina e desetilcloroquina, em
concentrações de 100, 250, 500, 750 e 1000 ng/mL, respectivamente, os quais
foram analisados em quintuplicata. As relações das áreas e do padrão interno foram
plotadas no eixo da ordenada e as concentrações na abscissa. Foi realizada a
regressão linear para obtenção da equação da reta e calculado o coeficiente de
correlação de Pearson (r).
A curva foi construída utilizando o sangue em papel de filtro previamente
enriquecido com cloroquina e desetilcloroquina nas concentrações de 0,18 ng/mL a
2,25 µg/mL cada e submetidas ao procedimento de extração descrito acima
(ANVISA, 2003; FDA, 2001).
31
Os ensaios foram realizados em quintuplicata e as relações das áreas de cada
substância de interesse e do padrão interno foram projetadas no eixo da ordenada e
as concentrações na abscissa. A regressão linear foi feita para obtenção da
equação da reta e o coeficiente de Pearson (r) foi calculado para estabelecer a
correlação entre as concentrações dos fármacos e as respectivas relações das
áreas do analito e do padrão interno (ANVISA, 2003; FDA, 2001).
3.8.4 Determinação das concentrações de cloroquina e desetilcloroquina
As concentrações de cloroquina e desetilcloroquina foram determinadas a
partir da relação entre as áreas dos picos dos referidos fármacos e do padrão
interno, que foi plotado na curva de calibração, para obtenção das concentrações de
interesse.
3.9 Análise estatística dos Resultados
Foi montado um banco de dados no programa Microsoft Excel. A analise foi
realizada com os pacotes estatísticos EPI Info 6.04 e SPSS; programa BioEstat 3.0
(Ayres et al.,2003 foram usados os testes de Qui-quadrado com correção de Yates
para comparar proporções e o teste t de Student para comparação entre médias.
Também, foi estimada a razão de probabilidades (Odds Ratio) usando intervalo de
confiança de 95% para medir a força de associação entre duas variáveis. Foi
considerado um nível de significância estatística menor ou igual a 5% para rejeitar a
hipótese nula.
3.10 Considerações Éticas
A execução deste protocolo ficará ao da cargo da equipe técnica da pesuisa,
incluindo um profissional médico e farmacêutico/bioquímico(mestranda). Que terá
como primeira responsabilidade o bem estar dos doentes que participam do estudo.
Em todo o momento, a atenção adequada aos pacientes tem precedência sobre a
32
continuação dos trabalhos, toda equipe conheciam integralmente o protocolo do
estudo, com verdadeiro rigor metodologico.
3.11 Consentimento após informação
O presente estudo foi executado segundo as normas da Organização Mundial
da Saúde para a Prática Clínica Adequada, além de todos os requisitos legais que
rege a Resolução 196 a éticos para pesquisas envolvendo seres humanos no Brasil.
O presente estudo é parte integrante das atividades de investigação científica
da RAVREDA – Rede de Vigilância da Resistência dos Plasmódios aos
Antimaláricos na Bacia Amazônica, estando em conformidade com os preceitos da
ética em pesquisa com seres humanos.
Os voluntários incluídos foram devidamente instruídos em detalhe sobre os
objetivos e procedimentos do estudo, assim como de seus direitos como voluntários.
A maior idade no Brasil e de 18 anos. Os voluntários que tinham 18 anos de idade
ou mais a que concordaram em participar, foi solicitados a assinatura do
consentimento informado. Os termos do consentimento foram também assinados
por uma testemunha, que foi uma pessoa não associada com a equipe de
investigarão. No caso das pessoas analfabetas, foram perguntadas verbalmente
pelo seu consentimento, e duas pessoas não associadas com a equipe do estudo
assinaram o termo de consentimento como testemunhas. Todos os indivíduos
receberam cópias dos termos de consentimento.
3.12 Custos financeiros do Projeto
O estudo foi financiado com recursos destinados à RAVREDA - Rede de
Vigilância da Resistência dos Plasmódios aos Antimaláricos na Bacia Amazônica,
cedidos pelo Convênio USAID (United States Agency for International Development)
/ OPAS / MINISTÉRIO DA SAÚDE / SECRETARIA DE VIGILÂNCIA A SAÚDE Carta
Acordo
FMTAM/OPAS/MINISTÉRIO
DA
SAÚDE/RAVREDA,
nº
BRA/03/00679-5. Parte dos insumos de laboratório também teve o seu patrocínio
33
com recursos cedidos pelo Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal do
Pará-UFPA.
Os medicamentos utilizados no estudo foram fornecidos pelo Gerencia Técnica
de Malária do Ministério da Saúde. Por exigência do protocolo oficial , todos os
medicamentos que foram utilizados no estudo de resposta terapêutica tiveram a
garantia de controle de qualidade físico-química, dentro das normas da Agencia
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Os medicamentos, ao inicio do estudo,
tiveram que ter prazo de validade o mais longo possível (2 anos no mínimo).
34
4. Resultados
Os resultados e discussões estão sendo apresentado em forma de artigo:
Chloroquine and desethylchloroquine levels in late parasitological
failure cases of malaria vivax from Manaus, Brazil
Authors
Marques MMa , Costa MRFa, Simões FSFa, Viera JLFd , Borges LGd ,Nascimento
MTSd, Alecrim MGC.a, b, c
a
Department of Malaria– The Foundation for Tropical Medicine of Amazonas
(FMTAM), Manaus, Amazonas, Brazil
b
Amazonas State University (UEA), Manaus, Amazonas, Brazil
c
Nilton Lins University, Manaus, Amazonas, Brazil
d
The Federal University of Pará, Belém, Pará, Brazil
Corresponding author: José Luis Fernandes Vieira
The Federal University of Pará
Rua Augusto Corrêa, 01 - 66.000-000 Belém – PA, Brasil
55 (91) 8841-8678
35
Abstract
We report the occurrence of resistance to chloroquine administered at a dose of 25
mg / kg in seven patients with vivax malaria treated in a reference center in Manaus,
Brazil, from December 2007 to June in 2008. All patients were evaluated clinically
and parasitologically-blood levels of chloroquine and desetilcloroquina were obtained
on days 0, 3, 7, 14 and 28 of treatment. The data point to the importance of
resistance to chloroquine in Manaus, Amazonas, Brazil.
Keywords: Plasmodium vivax, chloroquine resistance, Amazonas.
1. Introduction
Monitoring the effectiveness of antimalarial treatment is crucial; therefore,
resistance to antimalarial drugs in the world is one of the obstacles to controlling the
disease. The spread of strains of P. vivax resistant to chloroquine, as the literature,
has a broad geographical distribution in various regions of the world as Indo-Pacific,
Asia and South America ( Alecrim., 2000; Baird,2004; De Santana et al., 2007;
Mendis et al.,2001; OPAS., 2004; Soto et al., 2001).
In the Brazilian Amazon, chloroquine plus primaquine is the treatment of
choice for malaria caused by P. vivax and they remain with a good therapeutic
efficacy (Alecrim et al.,2000 ; De Santana et al., 2007). However, it is reported in this
study, the occurrence of resistance to chloroquine in patients treated in the reference
center in Manaus, AM, Brazil. They were analyzed for concentrations of chloroquine
36
and desetilcloroquina in patients with and without treatment failure, suggesting the
possibility of decreased sensitivity and therapeutic failure related to strains of P.
vivax, as in the cases described the blood concentrations of chloroquine and its
active metabolite, were above minimum effective concentration for susceptible
strains of P. vivax (MEC ≥ 100 ng / mL), as characterized previous studies that
establish patterns of parasite resistance ( Baird., 2004).
2. Materials and methods
The study was conducted at the Tropical Medicine Foundation of Amazons
(FMTAM), in Manaus, in the period December 2007 to June 2008. The study
included 14 patients classified as having P. vivax, seven sensitive and seven
resistant, from a previous study involving 154 patients that evaluated the efficacy of
chloroquine in combination with primaquine.
According to the protocol of the Pan American Health Organization (OPAS.,
2004), eligible patients had clinical follow-up for parasites 28 days segment of both
sexes aged 12 to 60 years, with positive diagnosis of P. vivax not serious, with
parasite density from 250 to 100,000 parasites / mL, axillary temperature ≥ 37.5 ° C
or history of fever in the first 48 hours. The total dose of 25mg/kg was clororoquina
weight, distributed in three days with daily supervised administration of drugs in D010 mg / kg, D1-7.5 mg / kg and D2-7.5 mg / kg and primaquine in dose 0.5 mg / kg /
day for 7 days ( Dua et al.,1999). The drug used in the study were first analyzed for
their physical and chemical characteristics at the Federal University of Minas Gerais
(Fharmacopeia & UNITED., 1988). Patients with recurrence were treated with
parasitic mefloquine under the guidelines of the Ministry of Health of Brazil (Brazilian
37
Ministry of Health, 2001).
- 20 mg / kg - followed by administration of primaquine. The
actual rate of therapeutic failure was estimated by performing diagnostic PCR in
blood samples collected in D28( Snounou et al ., 1993). The determination of
chloroquine (CQ) and desetilcloroquina (DCQ) in whole blood samples collected on
filter paper on days D0, D3, D7, D14 and D28 were analyzed at the Federal
University of Pará (UFPA) in the toxicology laboratory, using if Cromatogragfia Liquid
(HPLC), according to the method described by (Patchen et al., 1983). The study
was submitted and approved by the Ethics Committee of the IMT-AM Protocol
25.000.105898/2004-74 (RAVREDA, 2008). The data were analyzed using EXCEL
2007. The frequency of resistance was estimated by means of proportion to their
respective confidence interval of 95% with a significance level of 5%.
3. Results
Of the 14 patients selected for the study are predominantly male with a
mean age of patients resistant to 34 ± 9.4 years and the tender of 36 ± 7 years. The
parasite density of resistant participants, 7050.26±expressed as geometric mean
and standard deviation, the D0 was 2526.65 parasitas/mm3 (16 to 16,465
parasitos/mm3), decreasing to 437.19 ± 1282.57 D1, 236, 30 ± 400 in D2. The
patients showed reactivation of parasitemia at D28 with a mean parasite density of
2926.75 ± 2216.54 interval from 543 to 6980 parasitos/mm3. Since the parasite
density of sensitive participants was 2730.10 ± 2581.49 parasitos/mm3 (125 - 8400)
at baseline (D0), showing a decrease from D1 to become negative on D7. The
average blood concentrations of CQ at D3, D7, D14 and D28 in sensitive patients
were 2519.04 ± 2013.8 ng / mL, 1251.22 ± 1250.5 ng / mL, 1275.67 ± 642.05 ng /
38
mL and 203.49 ± 361.5 ng / mL, respectively. As for DCQ were 793 ± 637 ng / mL,
657.2 ± 498 ng / mL, 709.34 ± 586 ng / mL and 580.3 ± 432.4 ng / mL. The blood
concentrations of CQ at D3, D7, D14 and D28 in patients with recurrent parasite
were 670 ± 629.7 ng / mL, 411.8 ± 381.2 ng / mL, 384.3 ± 324.3 ng / mL and 209.9 ±
187.94 ng / mL, respectively. For DCQ values were 495.5 ± 306 ng / mL, 873.8 ±
767 ng / mL, 660 ± 456.4 ng / mL and 506 ± 289 ng / mL, respectively. There was no
significant difference in average levels of CQ and DCQ between the groups in
several days of study (p> 0.05). However, there was significant difference in blood
levels of CQ + DCQ only D3. The average amount of blood concentrations of CQ +
DCQ in the days of follow-up are illustrated in Table 1.
TABLE 1: Comparison between the average concentrations of CQ + DCQ in
sensitive and resistant patients.
Dia
CQ+DCQ
Pacientes Sensíveis
D3
D7
D14
D28
(x ± DP)
3311,1 ± 2361,8
1914,2 ± 1700
1351,4 ± 1763
783,8 ± 530,3
Valores de p
Pacientes Resistentes
(x ± DP)
1069,8 ± 810,64
1321,5 ± 922,6
1044,3 ± 667,6
647,4 ± 227,2
0,04892
0,4631
0,6794
0,5433
4. Discussion
All subjects in this study were adequately treated medically supervised and
controlled the factors related to tolerance to the drug and its intake, a situation
characterized by the concentration of CQ and DCQ in D3 in both groups. The
average blood concentrations of CQ and DCQ in D3 sensitive patients was 2519 ±
39
2013.8 ng / mL and 793 ± 637 ng / mL, respectively. Similar results were found in 61
Indian patients treated orally with 25 mg chloroquine base / kg body weight for 3
days and reaching the D2 average blood concentration of CQ, 1980 ng / mL, and
1510 ng / mL present in red cells and 470 ng / mL in plasma from the same patients
(Dua et al.,1999) . In the same study the blood concentration of DCQ was 760 ng /
mL, erythrocyte levels of 540 ng / mL plasma and 220 ng / mL. These figures
demonstrate that the CQ was well absorbed from the gastrointestinal tract, indicating
that there were other factors that may influence the kinetics of the drug, including
rapid excretion or poor absorption (Dua et al.,1999). Assessing levels of QC 785.4 ±
800.1 ng / ml in patients of Manaus. Eleven patients were resistant to P. vivax, with
concentrations of 356.6 ± 296.1 ng / mL, lower than those found in patients sensitive
( De Santana et al ., 2007). Among the resistant patients, two had blood
concentrations of DCQ on D0 characterizing drug intake before the start of
treatment, without reporting the inclusion of the study. One of those reporting the
highest parasite density in D28. It is noteworthy that one of the patients had
previously acquired malaria by at least 7 times, justifying the levels found. However,
the resistant patients had lower concentrations of CQ and DCQ in D3 (p> 0.05) with
values of 670 ± 629.7 ng / mL and 495.5 ± 306 ng / mL, respectively, but without
statistical significance, the which may be linked to the number of study participants.
Assessing resistant patients had a mean CQ in the blood of 880 ng / mL, with 420 ng
/ mL found in red blood cells and 320 ng / mL in plasma. The blood concentration of
DCQ was 440 ng / mL with 260 ng / mL present in red blood cells and 180 ng / mL in
plasma
( Dua et al ., 2000). Was found a large interindividual difference of
chloroquine in whole blood of patients in both groups, in agreement with previous
studies ( Baird ., 2004; Dua et la ., 1999; Dua et al ., 2000).The average blood
40
concentrations of CQ + DCQ in sensitive and resistant patients in D3 was 3311.1 ±
2361.8 and 1069.8 ± 810.64 ng / mL, respectively. Statistically significant difference
between the two groups with p = 0.04892. This difference was not observed on days
7, 14 and 28. In the study evaluating the mean concentration of CQ + DCQ in
erythrocytes and plasma of patients was significantly more sensitive than in resistant
patients with p <0.0001 and p <0.02, respectively ( Dua et al., 2000).However, on
day 7 no significant difference between the sensitive and resistant cases. Similarly,
the mean concentration of CQ in plasma of patients was more sensitive than in
resistant patients (p> 0.05), ( Karim et al., 1992) , blood concentrations of CQ in D7
were lower in patients resistant than the sensitive ( Hellgren et al .,1989). Confirming
the results found in this study.
The relatively low concentration of CQ in resistant patients may be caused
by changes in absorption or the inter-individual variability in the pharmacokinetics of
CQ ( Dua et al ., 1999).In D28 the average concentrations of CQ+DCQ in sensitive
and resistant patients was 783.8 ± 530.3 ng / mL and 647.4 ± 227.2 ng/mL,
respectively.
The resistance of P. vivax chloroquine characterized as parasitic recurrence within
28 days of clinical follow-parasites in subjects treated adequately with chloroquine
(total dose - 25 mg / kg), confirming that the total levels of chloroquine (CQ + DCQ)
in plasma or blood are above the minimum effective concentration of already
standardized reference: ≥ 100 ng / mL in blood and plasma ≥ 10ng/mL ( Baird et al.,
1996). In this study all patients had concentrations of CQ + DCQ above 100 ng / ml
in D28 showing the existence of P. vivax resistant to CQ in Manaus, Amazonas.
Although the study data confirm the emergence of P. vivax resistant to CQ in
Manaus, the level of resistance is still not so high as to require a change in treatment
41
policy. The monitoring of therapeutic levels of this drug is useful for alerting the
authorities to control the levels of resistance and determine the extent of the problem
in the region, given that P. vivax is responsible for the largest number of malaria
cases in Brazil.
Acknowledgments:
This study was part of a scientific protocol for programming multi Amazon
Network for Monitoring Antimalarial Drug Resistance (RAVREDA) Secretariat of
Health Surveillance / Ministry of Health, with financial support also from the
Laboratory of Toxicology, Federal University of Pará (UFPA ) and FMTAM, serving
also as a topic for dissertation in the Masters in Tropical and Infectious Diseases at
the University of the State of Amazonas (UEA)
References
Alecrim, MGC. 2000., Estudo clínico, resistência e polimorfismo parasitário na malária
pelo Plasmodium vivax, Manaus – AM. Brasília: UNB, 2000. PhD Thesis, Faculdade
de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, Universidade de Brasília.
Baird, J.K. 2004., Chloroquine resistance in Plasmodium vivax. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy. 48,4075–4083.
Baird, J.K, Caneta-Miguel ES., Masbar DB., Abrenica JA., Layawen AVO., Calulu T.,
Leksana JMB, Wignall FS., 1996. Survey of resistance to chloroquine of falciparum
and vivax malaria in Palawan, the Philippines. Transaction of the Royal Society of
Tropical Medicine and Hygiene. 90,413–414.
Ministério da Saúde / Fundação Nacional de Saúde / Centro Nacional de Epidemiologia /
Assesoria de Descentralização e Controle de Endemias / Centro Nacional de
Epidemiologia. Manual de Terapêutica da Malária.,2001. Brasil. 6, 110-113.
De Santana Filho FS, Arcanjo AR, Chehuan YM, Costa MR, Martinez-Espinosa FE,
Vieira JL, Barbosa MG, Alecrim WD, Alecrim MG., 2007. Chloroquine-resistant
Plasmodium vivax, Brazilian Amazon. Emerging Infectous Diseases. 13, 1125-1126.
42
Dua, VK; Kar, PK; Gupta, NC; Sharma, VP.,1999.Determination of chloroquine and
desethylchloroquine in plasma and blood cells of Plasmodium vivax malaria cases
using liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 21,
199-205.
Dua, VK; Gupta, NC kar, PK., 2000.Chloroquine and desethylchloroquine concentrations
in blood cells and plasma fron Indian patients infected with sensitive or resistant
plasmodium falciparum. Annals of Tropical Medicine & Parasitology. 94. 6, 565-570.
Farmacopéia Brasileira., 1988. Atheneu. 4 , 1; & UNITED-states Fharmacopeia 29, 4811789.
Hellgren, U., Kihamia, C. M., Mahikwano, L. F., Bjorkman, A. B. Erikson, O. Rombo, L.,
1989Response of Plasmodium falciparum to chloroquine treatment: relation to whole
blood concentrations of chloroquine and desethylchloroquine. Bulletin of the World
Health Organization, 67, 197-202.
Karim, E. A., Ibrahim, K. E., Hassbalrasoul, M. A., Saeed, B. O., Bayoumi, R. A., 1992. A
study of chloroquine and desethylchloroquine plasma levels in patients infected with
sensitive and resistant malaria parasites. Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis. 108, 219-223.
Mendis, K; Sina, BJ; Marchesini, P; Carter, R., 2001.The Neglected Burden of
Plasmodium vivax malaria. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 64,
97-106.
OPAS. Organización Pan-americana de la Saúde. Normas de protocolos genéricos para
la eficácia de la cloroquina para el tratamento de la malaria causada pelo P. vivax.
Washington, Organización Pan-americana da la Saude, 2004.
Patchen, L.C., Mount, D.L., Schwartz, I.K, Churchill, F.C., 1983. Analysis of filter-paperabsorbed, finger-stick blood samples for cloroquine and its major metabolite using
high-performance liquid chromathography with fluorescence detection. Journal of
Chromathography. 278, 81-89.
Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown,K.N., 1993. Identification of
the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain
reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Mol. Biochem.
Parasitol. 58, 283–292.
Ruebush, T. K; Zegarra, J; Cairo, J; Andersen, E; Green, M; Pillai, DR; Marquino, W;
Huilica, M; Arevalo, E; Garcia, C; Solary, L; Kain, KC,. 2003. Chloroquine-resistant
Plasmodium vivax malaria in Peru. American Journal of Tropical Medicine and
Hygiene. 5, 69, 548-552.
World Health Organization. RAVREDA - Rede Amazônica de Vigilância da Resistência
às Drogas. Acessado em 26 de setembro de 2008. Disponível em
http://www.paho.org/spanish/AD/DPC. 2008.
43
Soto, J; Toledo, J; Gutierrez P; Luzz, M; Llinas, N; Cedeno, N; Dunne, M; Berman, J.,
2001. Plasmodium vivax clinically resistant to chloroquine in Colombia. American
Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 2, 65, 90-93.
Teka, H., Petros, B., Yamuah, L., Tesfaye, G., Elhassan, I., Muchohi, S., Kokwaro, G.,
Aseffa, A., Engers, H.,2008. Chloroquine-resistant Plasmodium vivax malaria in Debre
Zeit, Ethiopia. Malaria Journal. 10.1186, 1475-2875-7-220.
44
5 CONCLUSÃO
- A concentração sanguínea de cloroquina teve pico em D3, apresentando perfil de
eliminação superior a 28 dias. Portanto, foram mantidos níveis residuais do fármaco,
constituindo força seletiva para o surgimento da resistência a cloroquina.
- Houve diferença significativa nos teores de cloroquina+desetilcloroquina nos
grupos de estudo em D3, não sendo observado o mesmo nos outros dias de
seguimento.
- Observou-se nos pacientes sensíveis e resistentes, larga variabilidade interindividual nas concentrações sanguíneas de cloroquina e desetilcloroquina, em
concordância com outros estudos.
- Os resultados demonstram que houve absorção adequada de cloroquina tanto
para pacientes sensíveis assim como para pacientes resistentes.
- Em D28 todos os pacientes apresentaram concentrações sanguíneas superiores
aquela considerada a concentração inibitória mínima.
- O estudo evidência a existência de P. vivax resistente a cloroquina em Manaus,
Amazonas.
45
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alecrim MG, Alecrim W, Macêdo V, Korves CT, Roberts RD, Li J, Sullivan M,
Mccutchan TM. Description of a possible clonal expansion of Plasmodium vivax in
Manaus- Amazonas-Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical
1999a; 32: 303-305.
Alecrim MG, Alecrim W, Macêdo V. Plasmodium vivax resistance to chloroquine
(R2) and mefloquine (R3) in Brazilian Amazon Region. Revista da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical 1999b; 32 (1): 67-68.
Alecrim MG. Estudo clínico, resistência e polimorfismo parasitário na malária pelo
Plasmodium vivax, Manaus – AM. Brasília: UNB, 2000. [Tese de Doutorado],
Brasília (DF): Universidade de Brasília, 2000.
Andrade JG, Andrade ALSS, Araujo ESO. Ensaio clínico aleatório duplo cego com
cloroquina em dose alta para tratamento da malária por Plasmodium falciparum no
Brasil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo 1992; 34(5): 467-473.
Asawamahasakda W, Ittarat S, Chang CC, Mcelroy P, Meshnick SR. Effects of
antimalarials and proteinase inhibitors on plasmodial haemozoin production.
Molecular and Biochemical Parasitology; 1994, 67: 183–191.
Berliner RW, Earle JRDP, Taggart JV, Jubrod CG, Welch WJ, Conan NJ, Bauman E,
Scudder SI, Shannon JA. Studies on the chemotherapy of the human malarias. VI.
The physiological deposition , antimalarial activity, and toxicity of several derivatives
of 4-aminoquinlonine. Journal of Clinical Investigation 1948; 27: 98-107.
Baird JK, Caneta-Miguel ES, Masbar DB, Abrenica JA, Layawen AVO, Calulu T,
Leksana JMB, Wignall FS. Survey of resistance to chloroquine of falciparum and
vivax malaria in Palawan, the Philippines. Transaction of the Royal Society of
Tropical Medicine and Hygiene1996; 90: 413–414.
46
Baird JK, Leksana B, Masbar S, Fryauff DJ, Sutanihardja MA, Suradi Wignall FS,
Hoffman SL. Diagnosis of resistance to chloroquine by Plasmodium vivax: timing of
recurrence and whole blood chloroquine levels. American Journal of Tropical
Medicine and Hygiene 1997; 56(6): 621-626.
Baird JK, Tiwari T, Martin GJ, Tamminga CL, Prout TM, Tjaden J, Bravet PP,
Rawlins S, Ferrel M, Carucci D, Hoffman SL. Chloroquine for the treatment of
uncomplicated malaria in Guyana. Ann. Trop. Med. Parasitol 2002; 96:339–348.
Baird JK. Chloroquine resistance in Plasmodium vivax. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy 2004; 48(11): 4075–4083.
Blair S, Echeverri M, Tobon A, Álvarez G, Carmona J. Clinical and Laboratorial
findings of Plasmodium vivax malaria in Colombia, 2001. Revista do Instituto de
Medicina Tropical de São Paulo 2003.
Brasil . Ministério Da Saúde. Manual de Terapêutica da Malária. Brasília, 2001.
Brasil – Ministério Da Saúde / Fundação Nacional De Saúde / Centro Nacional De
Epidemiologia / Assesoria De Descentralização E Controle De Endemias / Centro
Nacional De Epidemiologia. Manual de Terapêutica da Malária. 6 ed., Brasil, 2001.
______ . _______ . Secretaria De Vigilancia Em Saúde. Sistema de Informação de
Vigilância
Epidemiológica
-
SIVEP.
Acessado
em
22.08.09
na
https://sis.funasa.gov.br/sivep_malaria. 2009
______ . _______ . Secretaria De Vigilancia Em Saúde. Situação Epidemiológica da
Malária no Brasil. Acessado em 22.08.09 na https://sis.funasa.gov.br/sivep_malaria.
2009.
Brocks
DR,
Mehvar
pharmacokinetics
of
2003;42(15):1359-82.
R.
Stereoselectivity
the
chiral
in
antimalarial
the
pharmacodynamics
drugs.
Clin
and
Pharmacokinet.
47
Cardoso CD, Bonato PS. Enantioselective analysis of the metabolites of
hydroxychloroquine and application to an in vitro metabolic study. Journal of
pharmaceutical and biomedical analysis 2005; 37: 703-08.
Castillo CM, Osorio LE, Palma GI. Assessement of therapeutic response of
Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum to chloroquine in a malaria
transmission-free area of Colombia. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2002; 97:559–562.
CDC – Centers for Disease Control and Prevention. Department of Health and
Human Services. Acessado em setembro de 2009. Disponível em: <http: // www.
cdc.gov/malaria/>. Acesso em: setembro de 2009.
Chevli R, Fitch CD. The antimalarial drug mefloquine binds to membrane
phospholipids. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1982; 21: 581–586.
Chotivanich KT, Pukrittayakamee S, Simpson JA, White NJ, Udomsangpetch R.
Characteristics of Plasmodium vivax-infected erythrocyte rosettes. American Journal
of Tropical Medicine and Hygiene 1198; 59: 73.
Chou AC, Chevli R, Fitch, CD. Ferriprotoporphyrin IX fulfills the criteria for
identification as the chloroquine receptor of malaria parasites. Biochemistry 1980;
19: 1543– 1549.
Chou AC, Fitch CD. Control of heme polymerase by chloroquine and other quinoline
derivatives. Biochemical and Biophysical Research Communications 1993; 195:
422–427.
Coatney GR, Ruhe DS, Cooper WC, Josepheson VS, Young MD. Studies in human
malaria. X. The protective and therapeutic action of chloroquine (SN 7619) against
St. Elizabeth strain of vivax malaria. American Journal of Tropical Medicine and
Hygiene 1949; 49: 49-59.
48
Collins
CH,
Princípios
básicos
de
cromatografia.
Introdução
a
métodos
cromatográficos. 4 ed. Campinas: Ed. da Unicamp 1990; 1: 13.
De Santana Filho FS, Arcanjo AR, Chehuan YM, Costa MR, Martinez-Espinosa FE,
Vieira JL, Barbosa MG, Alecrim WD, Alecrim MG. Chloroquine-resistant Plasmodium
vivax, Brazilian Amazon. Emerging Infectous Diseases 2007; 13:1125-1126.
Deng H, Liu H, Krogstad FM, Krogstad DJ. Sensitive fluorescence HPLC assay for
AQ-13, a candidate aminoquinoline antimalarial, that also detects chloroquine and Ndealkylated metabolites. Journal of chromatography 2006; 833: 122-28.
Degani GLA, Cass QB, Vieira PC. Cromatografia um breve ensaio. Química nova
escola – cromatografia 1998; 7: 21-25.
Djimde AA, Doumbo Ok, Traore O, Guindo AB, Kayentao K, Diourte Y, NiareDoumbo S, Coulibaly D, Kone Ak, Cissoko Y, Tekete M, Fofana B, Dicko A, Diallo
DA, Wellems TE, Kwiatkowski D, Plowe CV. Clearance of drug-resistant parasites
as a model for protective immunity in Plasmodium falciparum malaria. American
Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2003; v. 69, p. 558-563.
Dorn A, Stoffel R, Matile H, Bubendorf A, Ridley RG. Malarial haemozoin/betahaematin supports haem polymerization in the absence of protein. Nature 1995; 374:
269-271.
Dorn A, Vippagunta SR, Matile H Jaquet C, Vennerstrom JL, Ridley RG. An
assessment of drug-haematin binding as a mechanism for inhibition of haematin
polymerisation by quinoline antimalarials. Biochemical Pharmacology 1998; 55: 727–
736,
Dua Vk, Kar Pk, Gupta NC, Sharma VP. Determination of chloroquine and
desethylchloroquine in plasma and blood cells of Plasmodium vivax malaria cases
using liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis
1999; n. 21, p. 199-205.
Dua VK, Gupta NC, Kar PK, Nand J, Edwards G, Sharma VP, Subbarao SK.
Chloroquine and desethylchloroquine concentrations in blood cells and plasma from
Indian patients infected with sensitive or resistant Plasmodium falciparum. Annals of
Tropical Medicine and Parasitology 2000; V. 94, n 6, p. 565 – 570.
49
Ducharme J, Farinotti R. Clinical pharmacokinetics and metabolism of chloroquine.
Focus on recent advancements. Clinical Pharmacokinetics 1996; 31 (4): 257-74.
Egan TJ, Ross DC, Adams PA. Quinoline anti-malarial drugs inhibit spontaneous
formation of beta-haematin (malaria pigment). Federation of European Biochemical
Societies Letters 1994; 352 – 354.
Egan TJ, Marques HM. The role of haem in the activity of chloroquine and related
antimalarial drugs. Coordination Chemistry Reviws 1999; 493: 190-192.
Farmacopéia Brasileira. 3ª ed: Organização Andrei Editora; 1977.
Ferraroni JJ. Malária falciparum resistente a cloroquina e ao Fansidar tratada com
minociclina. Revista de Saúde pública, S. Paulo 1983; 17: 328-31.
Forattini OP. Culicidologia Médica v. 2: Editora da Universidade de São Paulo, 2002.
Fda – Food And Drug Administration – Reviewer guidance Validation of
chromatographic methods, november 1994. Acessado em setembro de 2009.
Disponível em: <http: // www. fda.gov/cder/guidance>. Acesso em: setembro de
2009.
Fda – Food And Drug Administration-Guidance for industry. Bioanalitical Method
Validation, may 2001. Acessado em setembro de 2009. Disponível em: <http: //
www. fda.gov/cder/guidance>. Acesso em: setembro de 2009.
Foley M, Tilley L. Quinoline antimalarials: Mechanisms of action and resistance.
International journal for parasitology 1997; 27(2): 231-40.
Foley M, Tilley L. Quinoline Antimalarials: Mechanisms of actions and Resistance
Prospects for New agents. Pharmacology and Therapy 1998; 79: 55-87.
50
Fryauff DJ, Tuti S, Mardi A, Masbar S, Patipelohi R, Leksana B, Kain KC, Bangs
MJ, Richie TL, Baird JK. Chloroquine-resistant Plasmodium vivax in transmigration
settlements of West Kalimantan, Indonésia. American Journal of Tropical Medicine
and Hygiene 1998; 59 (4): 513-518.
Garavelli PL, Corti E. Chloroquine resistance in Plasmodium vivax: the first case in
Brazil. Transaction of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 1992; 86
(128).
Garg M, Gopinathan N, Bodhe P, Kshirsagar NA. Vivax malaria resistant to
chloroquine: case reports from Bombay. Transactions of the Royal Society of
Tropical Medicine and Hygiene 1995; 89: 656–657.
Gaudiano MC, Antoniella E, Bertocchi P, Valvo L. Development and validation of
reversed-phase LC method for analysing potentially counterfeit antimalarial
medicines. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 2006.
Garnham PCC. Malaria parasites of man:life-cycles and morphology (excluding
ultraestructure). In: Malaria – Principles and Practice of Malariology. London:
Churchill Livinstone 1998; 1: 61-85.
Gilles H. Malaria parasites. In: Gilles H, Warrell D, Bruce-Chwatt’s Essential
Malariology. 3ª ed London: Edward Arnold publishers 1998: 12-34.
Guimarães LFL, Collins CH. Cromatografia líquida de alta eficiência. In. : Introdução
a métodos cromatográficos. 4 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1990. cap. 9 p.
184.
Guzmán V, Carmona-Fonseca J. El citocromo P-450 y la respuesta terapéutica a los
antimaláricos. Revista Panamericana Salud Publica 2006; 19(1): 9–22.
51
Green MD, Nettey H, Rojas OV, Pamanivong C, Khounsaknalath L, Ortiz G, Newton
PN, Fernandez FM, Vongsack L, Manolin O. Use of refractometry and colorimetry as
field methods to rapidly assess antimalarial drug quality. Journal of pharmaceutical
and biomedical analysis, 2006; 52: 288-290.
Hamedi Y, Nateghpour M, Soonthornsata B, Tan-Ariya P, Kojima, Chindanond D
Looareesuwan S. Monitoring of Plasmodium vivax sensitivity to chloroquine in vitro
in Thailand. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene
2003; 97:435-437.
Hawley SR, Bray PG, Mungthin M, Atkinson JD, O’neill PM, Ward SA. Relationship
between
antimalarial
drug
activity,
accumulation,
and
inhibition
of
heme
polymerization in Plasmodium falciparum in vitro. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy 1998; 42: 682–686.
Hellgren U, Kihamia CM, Mahikwano LF, Bjorkman AB, Erikson O, Rombo L.
Response of Plasmodium falciparum to chloroquine treatment: relation to whole
blood concentrations of chloroquine and desethylchloroquine. Bulletin of the World
Health Organization 1989; 67: 197-202.
Holmberg MF, Bergquist Y, Termond E, Nyberg BD. The single dose kinetcs of
chloroquine and its major metabolite de desethylchloroquine in healthy subjects.
European journal of clinical pharmacology 1983; 26: 521-530.
Homewood CA, Warhurst DC, Peters W, Baggaley VC. Lysosomes, pH and the antimalarial action of chloroquine. Nature, 1972; 235 : 50-52.
Jacobs GH, Aikawa M, Milhous WK, Rabbege JR. An ultrastructural study of the
effects of mefloquine on malaria parasites. Annals of Tropical Medicine and
Parasitology, 1987;36: 9–14.
Looareesuwan S, Wilairatana P, Krudsood S, Treeprasertsuk S, Singhasivanon P,
Bussarati DV, Chokjindachai W, Viriyavejakul P, Chalermrut K, Walsh DS, White
52
J. Chloroquine sensitivity of Plasmodium vivax in Thailand. Annals of Tropical
Medicine and. Parasitology 1999; 93: 225–230.
Karim EA, Ibrahim KE, Hassabalrasoul MA, Saeed BO, Bayoumi RA. A study of
chloroquine and desethylchloroquine plasma levels in patients infected with sensitive
and resistant malaria parasites. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis
1992; 108: 219-223.
Krishna S, White NJ. Pharmacokinetics of Quinine, Chloroquine and Amodiaquine.
Clinical Implications. Clinical Pharmacokineti 1996; 30: 263-299.
Kochar DK, Das A, Kochar SK, Saxena V, Sirohi P, Garg S, Kochar A, Khatri MP,
Gupta V. Severe Plasmodium vivax malaria: a report on serial cases from Bikaner in
northwestern India. Am J Trop Med Hyg. 2009; 80 :194-198.
Krotoski W. Discovery of the hipnozoite and a new theory of malarial relapse.
Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene1985; 79: 1-11.
Karunajeewa HA, Ilett KF, Mueller I, Siba P, Law I, Page-Sharp M, Lin E, Lammey J,
Batty KT, Davis TM. Pharmacokinetics and efficacy of piperaquine and chloroquine
in Melanesian children with uncomplicated malaria. Antimicrob Agents Chemother.
2008; 52 : 237-243.
Kurcer MA, Simsek Z, Zeyrek FY, Atay S, Celik H, Kat I, Topluoglu A: Efficacy of
chloroquine in the treatment of Plasmodium vivax malaria in Turkey. Ann Trop Med
Parasitol 2004; 98: 447-451.
Lee SJ, McGready R, Fernandez C, Stepniewska K, Paw MK, Viladpai-nguen SJ,
Thwai KL, Villegas L, Singhasivanon P, Greenwood BM, White NJ, Nosten F.
Chloroquine pharmacokinetics in pregnant and nonpregnant women with vivax
malaria. Eur J Clin Pharmacol. 2008; 64 :987-992.
53
Lee KS, Kim TH, Kim ES, Lim HS, Yeom JS, Jun G, Park JW. Short Report:
Chloroquine-resistant Plasmodium vivax in the Republic of Korea. Am. J. Trop. Med.
Hyg., 2009; 80: 215–217.
Lopez-Antunano FJ. Malaria diagnosis. Genebra, World Health Organization 1990.
Looareesuwan S, Wilairatana P, Krudsood S, Treeprasertsuk S, Singhasivanon P,
Bussarati DV, Chokjindachai W, Viriyavejakul P, Chalermrut K, Walsh DS, White J.
Chloroquine sensitivity of Plasmodium vivax in Thailand. Annals of Tropical
Medicine and. Parasitology 1999; 93: 225–230.
Luxemburger C, Van Vugt M, Jonathan S, Mcgready R, Looareesuwan S, White
Nj, Nosten F. Treatment of vivax malaria on the western border of Thailand.
Transaction of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 1999; 24: 433438.
Mendis K, Sina BJ, Marchesini P, Carter R. The Negleted Burden of Plasmodium
vivax malaria. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2001; 64 Suppl 1
e 2 : 97-106.
Miller LH, Baruch DI, Marsh K, Doumbo OK. The pathogenic basis of malaria. Nature
2002; 415: 673-679.
Noedl H, Wongsrichanalai C, Wernsdorfer WH. Malaria drug-sensitivity testing: new
assays, news perspectives. Trends in Parasitology 2003; 19 (4): 175.
Vale N, Moreira R, Gomes P. Quimioterapia da malária – um século no
desenvolvimento de antimaláricos. Química, 2005; 99: 61-73.
54
Nosten F, McGready R, d'Alessandro U, Bonell A, Verhoeff F, Menendez C,
Mutabingwa T, Brabin B. Antimalarial drugs in pregnancy: a review. Curr Drug Saf.
2006 ;1:1-15.
Olliaro PL, Castelli F, Caligaris S, Druilhe P, Carosi G. Ultrastructure of Plasmodium
falciparum in vitro. II. Morphological patterns of different quinolines effects.
Microbiológica 1989; 12: 15–28.
OMS. Organização Mundial da Saúde. Chemotherapy of malaria and resistance to
antimalarials. Genebra, World Health Organization, 1973.
______ . ______ . Assessment and monitoring of antimalarial drug efficacy of
uncomplicated malaria. Genebra, World Health Organization, 2003.
_____ . ______ .World Malaria Report 2005 . World Health Organization. 2005.
OPAS. Organización Pan-americana de la Saúde. Normas de protocolos genéricos
para la eficácia de la cloroquina para el tratamento de la malaria causada pelo P.
vivax. Washington, Organización Pan-americana da la Saúde, 2004.
______ . ______ . Status of Malaria in the Americas: A series of data tables.
Acessado
em
janeiro
de
2008
na
http://www.paho.org/english/ad/dpc/cd/malaria.htm. 2008.
_____ . ______ . RAVREDA - Rede Amazônica de Vigilância da Resistência às
Drogas. Acessado em abril de 2008 na http://www.paho.org/spanish/AD/DPC. 2008.
Orjih AU, Ryerse JS, Fitch CD. Hemoglobin catabolism and the killing of
intraerythrocytic Plasmodium falciparum by chloroquine. Experientia 1994; 50: 34–
39.
Pagola S, Stephens PW, Bohle DS, Kosar AD, Madsen SK. The structure of malaria
pigment β-haematin. Nature 2000; 404: 307-310.
55
Papalexis V, Siomos MA, Campanale N, Guo XG,
Kocak G, Foley M, Tilley,
L.Histidine-rich protein 2 of the malaria parasite, Plasmodium falciparum, is involved
in detoxification of the by-products of haemoglobin degradation. Molecular and
Biochemical Parasitology 2001; 115: 77–86.
Paredes SF, Santana P, Moreira AB, Kubota LT, Sotomayor MDPT, Lanza MRV,
Dias ILT. Determinação Fluorimétrica de Cloroquina em Fase Sólida: Aplicação em
Amostras Farmacêuticas. 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química,
Poços de Caldas, 2002.
Patchen LC, Mount DL, Schwartz IK, Churchill FC. Analysis of filter-paper-absorbed,
finger-stick blood samples for cloroquine and its major metabolite using highperformance liquid chromathography with fluorescence detection. Journal of
Chromathography 1983; 278: 81-89.
Peres TB. Noções básicas de cromatografia. Biológico 2007; 64 : 227-229.
Peters W, Howells RE, Portus J, Robinson BL, Thomas S,
Warhurst DC. The
chemotherapy of rodent malaria, XXVII. Studies on mefloquine (WR 142,490).
Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 1977; 71: 407–418.
Peters, W. Drug resistance in malária parasites of animals and man. Advances in
Parasitology 1998; 41: 1-62.
Phillips EJ. Failure and combined therapy for P.vivax malaria adquired in Guyana,
South America. Clinical Infectious Diseases 1996; 23: 1171-1173.
Picot S, Brega S, Gerome P, Velut G, De Monbrison, F; Cheminel, V; Peyron, F.
Absence of nucleotide polymorphism in a Plasmodium vivax multidrug resistance
gene after failure of mefloquine prophylaxis in French Guyana. Transactions of the
Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 2005; 99 : 234-237.
56
Pinto AYN, Azevedo CH, Silva JB, Souza JM. Cloroquina em dose simples no
tratamento da malária por Plasmodium vivax na Amazônia brasileira. Revista do
instituto de medicina tropical de São Paulo 2003; 45 : 327-331.
Projean D, Baune B, Farinotti R, Flinois JP, Beaune P, Taburet AM, Ducharme J. In
vitro metabolism of chloroquine: identification of CYP2C8, CYP3A4, and CYP2D6 as
the main isoformas catalyzing n-desethylchloroquine formation. The American
society for pharmacology therapeutics 2003; 31 : 748-54.
Pukrittayakamee S, Chantra A, Simpson JA, Vanijanonta S, Clemens R,
Looareesuwan S, White NJ. Therapeutic Responses to Different Antimalarial Drugs
in Vivax Malaria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2000; 44 : 1680-1685.
Pukrittayakamee
S, Imwong
M, Looareesuwan
S, White
NJ. Therapeutic
responses to antimalarial and antibacterial drugs in vivax malaria. Acta Tropica
2004; 89: 351-356.
Raynes K, Foley M, Tilley L, Deady L. Novel bisquinoline antimalarials: synthesis,
antimalarial activity na The pfmdr1 gene of Plasmodium falciparum confers cellular
resistance to antimalarial drugs in yeast cells. Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of América 1999 ; 93: 9942–9947.
Ridley RG. Haemoglobin degradation and haem polymerization as antimalarial drug
targets. Journal of Pharmacy and Pharmacology 1997a; 49 : 43–48.
Ridley RG, Dorn A, Vippagunta SR, Vennerstrom JL. Haematin (haem)
polymerization and its inhibition by quinoline antimalarials. Annals of Tropical
Medicine and Parasitology 1997b; 91: 559–566.
Rieckmann KH. Plasmodium vivax resistant to chloroquine? The Lancet 1989: suppl
ll: 1183-1184.
57
Rogerson SJ, Carter R. Severe vivax malaria: newly recognized or rediscovered?
PLoS Med 2008; 5 (6) : 136.
Ruebush II, Zegarra J, Cairo J, Andersen E, Green M, Pillai DR, Marquiño W, Huilica
M, Arevalo E, Garcia C, Solary L, Kain KC. Chloroquine-resistant Plasmodium vivax
malaria in Peru. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2003a; 5 (69):
548-552.
Ruebush II, Zegarra J, Marquiño W, Neyra D, Villaroel R, Avila JC, Diáz C, Beltrán
E. Practical aspects of in vivo antimalarial drug efficacy testing in the Americas.
American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2003b; 4 (68): 391–397.
Samanidou VF, Evaggelopoulou EN, Papadoyannis IN. Simultaneous determination
of quinine and chloroquine anti-malarial agents in pharmaceuticals and biological
fluids by HPLC and fluorescence detection. Journal of pharmaceutical and
biomedical analysis 2005; 38: 21-28.
Villalobos-Salcedo IM, Tada MS, Kimura E, Menezes MJ, Pereira SLH. . In-vivo
sensitivity of Plasmodium vivax isolates from Rondonia (western Amazon region,
Brazil) to regimens including chloroquine and primaquine. Ann. Trop. Med. Parasitol
2000; 94:749–758.
Salcedo JMV, Camargo EP, Krieger H, Pereira LHP, Camargo LMA. Malaria control
in an agro-industrial settlement of Rondônia (western Amazon region, Brazil).
Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 2000; 95 :139-145.
Schuurkamp GJ. A mixed infection of vivax and falciparum malaria apparently
resistant to 4-aminiquinoline: a case report. Transactions of the Royal Society of
Tropical Medicine and Hygiene 1989; 83: 607-608.
Schuurkamp GJ, Spicer PE, Kereu, RK, Bulugol PK, Rieckmann KH. Chloroquineresistant Plasmodium vivax in Papua New Guinea. Transactions of the Royal Society
of Tropical Medicine and Hygiene 1992; 86: 121–122.
58
SIVEP- Sistema de Vigilância Epidemiológica. Boletim Epidemiológico da
Disponível em: URL:
http://portalweb04.saude.gov.br/sivep_malaria/default.asp > Acesso em 30 de
setembro 2009.
Snounou G, Viriyakosol S, Zhu XP, Jarra W, Pinheiro L, Do Rosario V, Thaithong
S, Brown KN. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of
nested polymerase chain reaction. Molecular and Biochemical Parasitology 1993;
61: 315-320.
Soto J, Toledo J, Gutierrez P, Luzz M, Llinas N, Cedeño N, Dunne M, Berman J.
Plasmodium vivax clinically resistant o chloroquine in Colombia. American Journal of
Tropical Medicine and Hygiene 2001; 2 (65): 90-93.
Sorportis S, Santos RCJ. Cromatografia líquida de ata eficiência aplicada a
terapêutica. Centro Avançado de Estudos em Farmacologia Clínica. São Paulo,
1990.
Slater AFG, Cerami A. Inhibition by chloroquine of a novel heme polymerase
enzyme activity in malaria trophozoites. Nature 1992 ; 355: 167–169.
Slater AFG. Chloroquine: mechanism of drug action and resistance in Plasmodium
falciparum. Pharmacology and Therapeutics 1993; 57: 203–235.
Storportos S, Santos RCJ. Cromatografia líquida de ata eficiência aplicada a
terapêutica. Centro Avançado de Estudos em Farmacologia Clínica. São Paulo,
1990.
Sugioka Y, Suzuki M. The chemical basis for the ferriprotoporphyrin IX-chloroquine
complex induced lipid peroxidation. Biochimica at Biophisyca Acta 1991; 1074:19-24.
59
Sullivan DJ, Matile H, Ridley RG, Goldberg DE. A common mechanism for blockade
of
heme
polymerization
by
antimalarial
quinolines.
Journal
of
Biological
Chemistry1998; 273: 31103–31107.
Sullivan DJ. Theories on malarial pigment formation and quinoline action
International Journal for Parasitology, 2002; 32: 1645–1653.
Tadei WP, Dutary – Thatcher B. Malaria vectors in the Brazilian Amazon: Anopheles
and the subgenerus Nyssorhynchus. Revista do Instituto de Medicina Tropical de
São Paulo 2000; 42 (2): 87- 94.
Taylor-Robinson AW. A model of development of acquired immunity to malaria in
humans living under unendemic conditions. Medical Hypotheses 2002; 58 (2): 148156.
Taylor WRJ, Doan HN, Nguye DT, Tran TU, Fryauff DJ, Gomez-Saladin E, Kain KC,
Le DC, Baird JK. Assessing drug sensitivity of Plasmodium vivax to halofantrine or
chloroquine in southern, central Vietnam using an extended 28-day in vivo test and
polymerase chain reaction genotyping. American Journal of Tropical Medicine and
Hygiene 2000; 62: 663-697.
Thailand. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 2003;
97 (4): 435-437.
Than M, Phone-Kyaw M, Soe AY, Gyi KK, Sabi M,
Oo, M. Development of
resistance to chloroquine by Plasmodium vivax in Myanmar. Transaction of the
Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 1995; 89; 307–308.
Thelu J, BurnodJ, Bracchi V, Ambroise-Thomas P. Identification of differentially
transcribed RNA and DNA helicase-related genes of Plasmodium falciparum. DNA
and Cell Biology 1994; 13: 1109–1115.
60
Tjitra E, Anstey NM, Sugiarto P, Warikar N, Kenangalem E. Multidrug-resistant
Plasmodium vivax associated with severe and fatal malaria: A prospective study in
Papua, Indonesia. PLoS Med 5(6): e128. doi:10.1371/journal.pmed.0050128, 2008
Tracy JW, Webster LTJ. Fármacos usados no tratamento das protozoonoses –
Malária In.: Goodman SL & Gilman A. As bases farmacológicas da terapêutica. 9ª ed
Rio de Janeiro: Guanabara Koogman 2002 ; 40 : 709-713.
Teka H, Petros B, Yamuah L, Tesfaye G, Elhassan I, Muchohi S, Kokwaro G, Aseffa
A, Engers H. Chloroquine-resistant Plasmodium vivax malaria in Debre Zeit,
Ethiopia. Malaria Journal 2008; 7: 220.
Ketema T, Ketema, B, Birhanu, T, Petros B. Chloroquine-resistant Plasmodium vivax
malaria in Serbo town, Jimma zone, south-west Ethiopia. Malaria Journal 2009;
8:177.
Ventura
AMR.
Malária
pelo
Plasmodium
vivax
na
criança
–
aspectos
epidemiológicos, clínico-laboratoriais e terapêuticos. Estudo clínico, resistência e
polimorfismo parasitário na Manaus – AM [Dissertação], Núcleo de Medicina
Tropical, Universidade Federal do Pará, 1997.
Warrell DA. Clinical features of malaria. In: Gilles H, Warrell D, editores. BRUCECHWATT’s Essential Malariology. 3ª ed. London: Edward Arnold publishers 1998;
35-45.
WARD SA, BRAY PG, HAWLEY SR. Quinoline resistance mechanisms in
Plasmodium falciparum: the debate goes on. Parasitology 1997; 114: 125–136.
Wiser MF. Mechanisms of Drug Action and Resistance.(Focus on Antimalarials),
2003. Disponível em < http:// www.tulane.edu
/wiser/protozzology/notes/drugs/.html#action. Acesso em maio, 2009.
61
Whitby M. Drug resistant Plasmodium vivax malaria. Journal of Antimicrobial
Chemotherapy 1997; 40: 749-752.
White NJ. Antimalarial drug resistance. The Journal of Clinical Investigation
2004;113:1084-1092.
_______. Drug resistance in malaria. British Medical Bulletin, v.54, n. 3, p. 703-715.
1998a.
_______. Why is it that antimalarial drug treatments do not always work? Annals of
Tropical Medicine and Parasitolology, v. 92, n. 4, p. 449-458. 1998b.
Yonemitsu K, Koreeda A, Kibayashi K, Ng'walali P, Mbonde M, Kitinya J, Tsunenari
S. HPLC analysis of anti-malaria agent, chloroquine in blood and tissue from forensic
autopsy cases in Tanzania. Legal Medicine 2005; 7 (2): 113-116.
62
7 ANEXOS
7.1 Termo de consentimento livre esclarecido - TCLE
MINISTÉRIO DA SAÚDE
Secretaria de Vigilância em Saúde
Projeto RAVREDA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
EFETIVIDADE CURATIVA DA CLOROQUINA EM ASSOCIAÇÃO À PRIMAQUINA
NO TRATAMENTO DA MALÁRIA VIVAX EM PACIENTES DA FMTAM
PROJETO MULTICÊNTRICO
PATROCINADOR: OPAS/MINISTÉRIO DA SAÚDE - SVS
COORDENADOR NACIONAL: Dr. Carlos José Mangabeira da Silva
COORDENADORA NO AMAZONAS E RORAIMA: Dra. Maria das Graças Costa
Alecrim
DESCRIÇÃO E OBJETIVO DO ESTUDO
Este estudo está sendo proposto pelo Ministério da Saúde e tem o objetivo de fazer
uma avaliação contínua do efeito dos medicamentos que são utilizados para tratar a malária
no município que você reside. Queremos saber se esses medicamentos estão sendo
capazes de curar complemente a doença ou se o parasito já apresenta resistência aos
remédios que estão sendo utilizados. Caso isso esteja ocorrendo com muita freqüência
neste município, o Ministério da Saúde poderá fornecer novos medicamentos para tratar a
malária na região.
Você, ou a pessoa pela qual é responsável, será tratado para malária com o mesmo
medicamento que está sendo usado pelo serviço de saúde de seu município
para o tratamento dessa doença. Com a sua autorização iniciaremos um acompanhamento
do tratamento no 1°, 2°, 3o , 7o, 14o, 21o e 28o dias após o paciente ter recebido a primeira
dose do medicamento.
63
As visitas de acompanhamento serão feitas por um profissional da equipe, o qual irá
pedir informações sobre o seu estado de saúde e coletará sangue da ponta do dedo para
fazer exames laboratoriais de controle do tratamento.
Serão coletados 10 ml de sangue da veia antes do tratamento e, eventualmente, no 3°
dia ou caso haja indicação de falha do tratamento, para outros exames de laboratório. No
momento da coleta o braço poderá ficar com uma mancha roxa que desaparecerá em um
curto espaço de tempo.
Depois que os resultados dos exames estiverem prontos, a pessoa que participar da
pesquisa poderá ver estes resultados. Esse sangue também poderá ser usado para outros
exames relacionados a malária.
Durante o acompanhamento do tratamento poderão surgir sinais ou sintomas da
malária grave, ou de alguma reação ao remédio. Caso isso aconteça, um profissional da
equipe na sua cidade irá encaminhar você (ou o paciente) ao serviço médico mais próximo
da sua casa.
Participando deste estudo você (ou o paciente) receberá cuidados médicos durante
todo o seguimento do seu tratamento, e, em caso de qualquer complicação decorrente da
malária e do uso dos medicamentos, estaremos disponíveis para qualquer problema.
Também você estará contribuindo com essa pesquisa para o conhecimento científico da
malária no nosso estado.
Os nomes e todas as informações obtidas por nós, serão utilizados pelo Ministério da
Saúde e serão mantidas em segredo. Nesse município, existe um profissional do Ministério
da Saúde, da Secretaria Estadual de Saúde e/ou da Secretaria Municipal de Saúde, que é o
responsável por este estudo. Qualquer informação a mais pode ser solicitada a qualquer
momento pelo pesquisador responsável pelas informações contidas neste consentimento
livre e esclarecido, cujo número de telefone encontra-se junto a sua assinatura.
A PARTICIPAÇÃO É VOLUNTÁRIA. ISTO QUER DIZER QUE O PACIENTE TEM
TODO O DIREITO DE NÃO PARTICIPAR OU SE RETIRAR DO ESTUDO, EM
QUALQUER FASE DA PESQUISA, e isto não trará nenhum prejuízo, e que terá garantido
o seu tratamento, conforme a rotina do serviço local.
A pessoa que aceitar participar da pesquisa guarda uma cópia deste documento que
será assinado duas vezes, uma cópia fica com o pesquisador e a outro com o paciente.
CONSENTIMENTO PÓS-INFORMAÇÃO:
Eu, .................................................................................................................,
64
[ ] participante do estudo, recebi a explicação de que serei um(a) dos(as) participantes
dessa pesquisa. Se eu não souber ler ou escrever, uma pessoa de minha confiança lerá
este documento para mim e depois escreverá nesta página o meu nome.
[ ] responsável pelo participante do estudo, recebi a explicação sobre a metodologia e
objetivo do estudo do qual o menor ..............................................................................., será
participante.
E por estar devidamente informado (a) e esclarecido (a) sobre o conteúdo deste
termo, livremente, sem qualquer pressão por parte dos pesquisadores, expresso meu
consentimento para minha inclusão nesta pesquisa.
.....................................................................
Assinatura do paciente ou representante legal
Impressão do polegar direito do paciente,
caso este não saiba escrever seu nome.
.......................................................................................
LOCAL E DATA
PESQUISADOR RESPONSÁVEL PELO ACOMPANHAMENTO E INFORMAÇÕES
AO PACIENTE:
NOME LEGIVEL:.........................................................
FONE: .........................................................................
ASSINATURA: ............................................................
65
7.2 Certificado físico-químico da droga
7.2.1 Certificado físico-químico da droga
66
67
7.3 Autorização para uso das amostras
MINISTÉRIO DA SAÚDE
SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE
REMETENTE: Coordenação Geral do Programa Nacional de Controle da
Malária - CGPNCM
Ministério da Saúde
Secretaria de Vigilância em Saúde’
Esplanada dos Ministérios, Bloco. G Sobreloja, sala 151
CEP: 70.058-
900
FAX: (061) 3315-3277
TELEFONE: (061) 3315-3277
DATA: 28.04.2009
DESTINATÁRIO: Maria das Graças Costa Alecrim
FAX: (92) 3643-2113
N.º DE PÁGINAS: 1
Senhora Professora,
Em atenção à solicitação constante de sua correspondência s/nº,
datada de 13 de abril de 2009, informo que esta CGPNCM, autoriza Vossa
Senhoria, utilizar as amostras e informações obtidas com o Estudo de Avaliação da
Eficácia da Associação de Cloroquina com Primaquina, parte integrante das
atividades da RAVREDA, na dissertação de mestrado da orientanda Marly Marques
de Melo, aluna de pós-graduação do Mestrado em Doenças Tropicais e infecciosas
da Universidade do Estado do Amazonas.
Atenciosamente,
Edmar Cabral da Silva
68
7.4 Ofício a conep
Coordenador Geral do PNCM - Substituto
69
7.4.1 Aprovação da CONEP