Genome sequence
Genome size does not correlate well with gene
number or with apparent organism complexity
Closely related organisms can have
genome sizes that vary by 100x
Human genome is 30x smaller
than some plant genomes
Número de clones teoricamente
necessários para representar o genoma
Tamanho do genoma (pb)
Tamanho do
fragmento
clonado (pb)
2 X106
2 X107
3 X109
Bacteria
Fungo
mamíferos
5 X103
400
4.000
600.000
10 X103
200
2.000
300.000
20 X103
100
1.000
150.000
40 X103
50
500
75.000
N= ln (1-P)
ln (1 - f )
Seqüênciamento do genoma por “shotgun”
Genoma aberto
Clonagem e
seqüênciamento
Clones
“shotgun”
Bioinformática
Alinhamento dos clones
Genoma seqüênciado
5’...ATCGGTACCAGGCTCCTCAGAGT...3’
3’...TAGCCATGGTCCGAGGAGTCTCA...5’
Construção da biblioteca shotgun
• Fragmentos de DNA ramdômicos podem ser obtidos usando o
processo HydroShear (GeneMachines Inc., USA).
• DNA sonicado para construção biblioteca shotgun
kb
11,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,5
1,0
In shotgun
approach, DNA is
randomly broken
into fragments, and
each is sequenced
w/out knowing
where in the
genome the
fragment comes
from
Maria Aparecida Fernandez- DBC - UEM
SEQUENCIAMENTO DE DNA
Bancada
Bioinformática
1.cromossomo
ou cosmídeo
2.fragmentação
_ enzimática
_ nebulização
3.clonagem
_ pUC18
4.seqüenciamento
retro-alimentação
ACCTGATGCCGACGGG
5.montagem
6.finalização
Contig 1
Contig 2
Cosmídeo
7.anotação
Maria Aparecida Fernandez- DBC - UEM
iniciador
Automated DNA Sequencing
If the chain terminators are
labeled instead of the primers,
all four reactions can occur in
the same tube.
SEQUENCIAMENTO DE DNA
Maria Aparecida Fernandez- DBC - UEM
Typical output of an automated sequencer
Estrutura da Rede de Computadores
Laboratório de
bioinformática
PC1
INTERNET
Servidor
e-mail
Web
FTP
Firewall
Pentium III 750 MHz
PC2
PC3
Switcher
PCn
Instituições
participantes
do projeto
Maria Aparecida Fernandez- DBC - UEM
Sun 450 Enterprise
4 processadores
4 GB RAM
300 GB HD
Montagem do genoma
• Phred – identificação de bases (base
calling) e valores de qualidade
• Cross-match – identificação de
seqüências de vetor
• Phrap – montagem das seqüências
contíguas (contigs)
• Consed – análise e edição dos contigs
• Finalização – fechamento de falhas
(Scaffold), determinação de genes
(BLAST/Glimmer) e anotação
(Artemis/Sequin)
GENOMAS SEQUENCIADOS
Bacterial genome
Eukaryotic DNA: chromosome
Band pattern of human
chromosomes
Genes in genome
The organization of genes on a
human chromosome
Human genome sequence
Comparison of genomes
Dogma central da biologia molecular
Replicação do DNA
Reparo de DNA
5´
Recombinação genética
3´
DNA
3´
Transcrição
Síntese de RNA
Transcrição
5´
Tradução
5´
3´
RNA
Síntese protéica
Tradução
H2N
COOH
Proteína
Gene
Definição Molecular
Seqüência de DNA que codifica uma proteína
Não acredito que vocês estão
satisfeitos com esta
definição!!!
Gene
Falhas da definição molecular
Alguns genomas são constituídos de RNA e não de
DNA.
Alguns genes produzem RNA (tRNA e rRNA) e não
proteínas.
Algumas regiões não-codantes são importantes para
produção de RNA e proteínas.
Gene
“ Open Reading Frame” - ORF
É a seqüência de nucleotídeos que codifica os
aminoácidos de uma proteína.
A definição molecular de gene é mais ampla do que
apenas a seqüência codante.
Finding the regions in a DNA sequence that encode a
protein:
Computer programs designed to identify ORFs
Gene
Definição molecular atual
Toda seqüência de nucleotídeos necessária para a
síntese de uma cadeia polipeptídica ou de RNA
funcionais.
Gene
Regiões não-codantes
Regulatórias
Sítios de ligação da RNA polimerase
Sítios de ligação dos fatores transcricionais
Íntrons
Sítios de Poliadenilação - poliA
Gene
Seqüência codante
ATG
Promotor
E1
I1
E2
Cauda de poliadenina
I2
E3
PoliA
Interruptor do gene
Seqüência não-codante
Fatores transcricionais
RNA polimerase
Splicing
Introns can be recognized by conserved
sequences at the junctions that are required
for their removal
All parts of the genome are subject to mutation, but
not all parts are subject to natural selection
Sequences that do not encode protein are not under selective
pressure and thus diverge more rapidly
Comparative genomics is our most powerful
tool for identifying the exons of expressed
genes
Random mutations leads to extensive sequence variation between
humans and mice at all sites that are NOT under selection.
Because of functional constraints, the exons in genes stand out as
islands of conservation.
Distribution of sequence types in the human genome
Average human gene is about 20x larger than
genes in E. coli or even in yeast
Gene density is much higher in compact yeast
genome relative to human
The partly reflects the compression of gene regulatory sequences
into short regions just upstream of the gene.
Human regulatory elements can be spread out over tens of 1000s of basepairs
The C. elegans genome was completed in 1998 and is predicted to contain
19,000 genes; 3x more than the unicellular eukaryote, S. cerevisiae