ANÁLISE DA EFICIÊNCIA DE KITS DE TUBO DE ELISA COMERCIAIS PARA A
DETECÇÃO DE MICROCISTINA EM ÁGUA BRUTA E TRATADA DE VÁRIAS
REGIÕES BRASILEIRAS
Soares, R.M.a; Azevedo S.M.F.O.a; Fan, T.S.b and Skoczenski, B.b
a- Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias (LETC)- Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho- Universidade Federal do Rio de
Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro, RJ-Brazil.
b- Beacon Analytical Systems Inc., Portland ME, USA.
Introdução
Análise direta
Florações de cianobactérias tem ocorrido com frequência em corpos
d’água utilizados para abastecimento. Após o incidente de Caruaru
em 1996, a preocupação quanto ao seu risco para a saúde humana
tem aumentado em todo o mundo. No Brasil, isso levou a revisão da
legislação sobre a qualidade da água e a adoção de cianobactérias e
microcistina como parâmetros de monitoramento obrigatórios.
Conseqüentemente, as companhias de água brasileiras são agora
cobradas a adaptar suas rotinas analíticas a fim de atender essas
exigências. O “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” (ELISA), tido
como a mais prática metodologia para detecção de microcistina na
água, tem se tornado uma importante ferramenta de análise para as
companhias de água. Entretanto, em países em desenvolvimento, o
uso de kits comerciais de ELISA tem enfretado três principais
problemas: preço, pouca disponibilidade de técnicos bem treinados
e, algumas vezes, condições laboratoriais inadequadas. Com o
objetivo de superar estes problemas e contribuir para um melhor e
mais fácil monitoramento de microcitina na água bruta e tratada,
assim como em água utilizada em clínicas de diálise, a Beacon e o
LETC-UFRJ cooperaram em um projeto para avaliar a eficiência de
kits de ELISA de tubos desenvolvidos pela Beacon na detecção e
quantificação de microcistina em amostras de água de dez estados
brasileiros e três clínicas de diálise.
Material e Métodos
brasileiros nas 5 diferentes (Norte, Nordeste, Centro-Oeste,
Sul).
As
amostras
apresentaram
as
tratada
ALD
107%
2
bruta
ALD
85%
2
tratada
ALD
83%
3.1 bruta
ALD
117%
3.1 tratada
ALD
104%
3.2 bruta
ALD
103%
3.2 tratada
ALD
111%
4
bruta
ALD
111%
4
tratada
ALD
105%
Centro
5
bruta
ALD
143%
- Oeste
5 tratada
ALD
126%
2 mL de cada amostra foram contaminados com 2ng de padrão
de MCYST-LR fornecido pela Beacon (concentração final = 1ng/mL) e
analisados utilizando-se o mesmo kit.
ELISA
O kit de ELISA de tubo para microcistina da Beacon utiliza
anticorpos policlonais que se ligam às microcistinas e ao conjugado
microcistina-enzima. Microcistina na amostra compete com o
conjugado microcistina-enzima por um número limitado de sítios de
ligação de anticorpos nos tubos. Todo o procedimento é feito em
poucas etapas e o kit pode ser fornecido com um mini
espectrofotômetro de fácil manuseio ( Hach ).
Nordeste
6.1 bruta
4.60
-
6.2 bruta
ALD
98%
6
tratada
ALD
88%
7
bruta
12.02
-
-- Conjugado microcistina-HRP
7
tratada
ALD
81%
-- Controle negativo, calibradores, amostras
8.1 bruta
ALD
108%
-- Solução de anticorpo anti-microcistina
8.2 bruta
ALD
117%
2. Incubação da mistura por 20 minutos.
8.2 tratada
ALD
101%
9
bruta
5.10
-
9
tratada
ALD
98%
10 bruta
1.71
104%
10 tratada
ALD
115%
1 pré-OR
ALD
106%
1 pós-OR
ALD
118%
Procedimento:
1. Adição ao tubo de 500uL de cada:
Sudeste
Sul
5. Adição de 500uL de solução Stop.
6. Leitura em 450nm em espectrofotômetro.
Análises de PDA-HPLC das amostras positivas por ELISA
Temperatura(0C) pH Condutividade (uS) Estado Trófico
Cianobactérias
27.7
6.1
38
4.06 - 39.8%
3.88 - 76.2%
Clínicas
2 pré-OR
ALD
113%
Cartucho de C18 ( 500mg Bond Elut – Varian)
de diálise 2 pós-OR
ALD
122%
3 pré-OR
ALD
116%
3 pós-OR
ALD
116%
Eluição –MeOH 100% (seco e ressuspenso em in 1mL de MeOH 50% )
mesotrófico
HPLC (g/L)/ %ELISA
3.24 - 70.5%
Clean-up
Etapas de lavagem – H2O, MeOH 20%
Norte
Mcyst Conc.(g/L) Teste de recuperação
ALD
106%
1
seguintes
características gerais:
Região
Amostra
1 bruta
Teste de recuperação
4. Adição de 500uL de solução de substrato.
Amostras de água bruta e tratada foram obtidas de 10 estados
e
Região
Norte
3. Lavagem da moléculas não ligadas.
Coleta de água
Sudeste
Todas as amostras foram analisadas diretamente
quanto a presença de microcistina utilizando o kit de ELISA
de tubos comercial da Beacon.
Resultados
ALD
Chromatographic conditions (Shimadzu SPD-M10A)
7.8-8.5
338-465
eutrófico
Centro- Oeste
Sudeste 24-27.8
Planktothrix,
Cylindrospermopsis
Microcystis
Anabaena
ausente
6.5-8.17 34-1480
mesotrófico Planktothrix,Oscillatoria,
Pseudoanabaena,
eutrófico
Cylindrospermopsis
Microcystis, Anabaena,
Planktolyngbya, Radiocystis
Sul
23.5-25 7.1-7.5 47.8 umhos/cm
eutrófico
Limnothrix,
Cylindrospermopsis
Microcystis, Anabaena
Raphidiopsis, Aphanocapsa
Preparo da amostras
Todas as amostras foram submetidas a ciclos de gelo-degelo
para romper quaisquer células de fitoplâncton presentes e liberar as
toxinas, para que assim se fizesse a análise de microcistina total (
dissolvida e particulada) na água. As amostras foram em seguida
filtradas em filtros de borosilicato para remover material particulado.
Coluna – analítica de fase reversa - Lichrospher 100 RP-18 (5m - Merck)
Condições isocráticas – fase móvel de acetonitrila e acetato de amônio
20mM pH=5.0 (28:72v/v)
Tabela 1 – Resultados de ELISA da análise direta e do teste de recuperação e
resultados de HPLC das amostras positivas. ALD = abaixo do limite de detecção, OR=
osmose reversa.
Volume de injeção – 100uL
Detecção - 238nm e o espectro de absorção de cada pico analisado na
amplitude 190-300nm.
2
Quantificação – curva padrão de MCYST-LR (padrão Sigma-Aldrich).
Concentração expressa como equivalentes de MCYST-LR .
2000
1
Conclusões
1. Os kits de tubo de ELISA da Beacon foram eficientes na
detecção de microcistina em água bruta e tratada ao nível de
ppb.
2. Diferentes qualidades de água não interferiram na detecção de
MCYST-LR pelo kit de tubo.
3. O teste de recuperação ao nível de 1ppb de MCYST–LR mostrou
uma recuperação média de 109% na água bruta e de 106% na
água tratada.
4. Os kits de tubo de ELISA da Beacon provaram ser um método
eficiente, econômico e prático para o monitoramento de
microcistina na água.
m AU
Nordeste 29-30
mesotrófico
1000
MCYST-LR
3
4 5
6
7
8
9
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Minutes
Figura 1 – Cromatograma da amostra de água bruta 7.
Pico 3 (tempo de retenção = 4.2 min) indica MicrocystinLR.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer Erik Wiklund (Word Biotch Connnection) e Ricardo Nery
(Nery Representações) pelo apoio geral. Pela coleta e envio das amostras
gostaríamos de agradecer José Vieira (UFPA), Andréia Ferreira (UFC), Ivaneide
Soares (UFRN), Cristina Brandão (UnB), e as equipes do Instituto Ambiental do
Paraná, COMPESA, COPASA, SABESP, CORSAN, CDR – Centro de Nefrologia.